CN106107550A - 一种淡豆豉纯种发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种淡豆豉纯种发酵方法，属于淡豆豉发酵技术领域，本发明的淡豆豉纯种发酵方法包括以下步骤：(1)发酵菌株活化、(2)黄豆的制备、(3)发酵菌液的制备、(4)黄豆接菌与发酵和(5)淡豆豉的回收。本发明的淡豆豉纯种发酵方法具有简单、方便、易于操作的优点，并且本发明的方法制备的淡豆豉相对于现有的生产方法极大的提高了异黄酮的含量，本发明的方法值得大力推广，具有重大的经济意义和社会意义。

Description

一种淡豆豉纯种发酵方法

技术领域

本发明涉及淡豆豉发酵技术领域，尤其涉及一种淡豆豉纯种发酵方法。

背景技术

淡豆豉是我国特产的以大豆为原料的发酵类中药，根据我国历代医书记载，其性味苦寒，具有解表，除烦，宣郁，解毒之功效。用于伤寒热病，寒热，头痛，烦躁，胸闷。现代研究表明，其还具有降血糖、调血脂、抗氧化、体外康肝癌细胞的作用。

淡豆豉中含有大量的异黄酮。异黄酮是黄酮类化合物中的一种，主要存在于豆科植物中，大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类次级代谢产物。由于是从植物中提取，与雌激素有相似结构，因此称为植物雌激素。大豆异黄酮的雌激素作用影响到激素分泌、代谢生物学活性、蛋白质合成、生长因子活性，是天然的癌症化学预防剂。益生大豆异黄酮是从非转基因大豆精制而成的生物活性物质，是一种具有多种重要生理活性的天然营养因子，是纯天然的植物雌激素，容易被人体吸收，能迅速补充营养。在每100克大豆样品中，含异黄酮128毫克，传统方法生产的分离蛋白含异黄酮102毫克，而豆乳中含9.65毫克，因为豆乳含水93.27％，相当于干物质中每100克也含异黄酮100毫 克以上。豆腐中含异黄酮27.74毫克，其干物质含异黄酮200毫克以上。异黄酮是一种弱的植物雌激素，大豆是人类获得异黄酮的惟一有效来源。在雌激素生理活性强的情况下，异黄酮能起抗雌激素作用，降低受雌激素激活的癌症如乳腺癌的风险，而当妇女绝经时期雌激素水平降低，异黄酮能起到替代作用，避免潮热等停经期症状发生。异黄酮的抗癌特性十分突出，能阻碍癌细胞的生长和扩散，而且只对癌细胞有作用，对正常细胞并无影响。异黄酮还是一种有效的抗氧化剂，能阻止氧自由基的生成，而氧自由基是一种强致癌因素。可见异黄酮的抗癌作用有多种方式和途径。

中国药典中记载的现有淡豆豉的炮制方法是：取桑叶、青蒿各70～100g，加水煎煮，滤过，煎液拌入净大豆1000g中，俟吸尽后，蒸透，取出，稍晾，再置容器内，用煎过的桑叶、青蒿渣覆盖，闷使发酵至黄衣上遍时，取出，除去药渣，洗净，置容器内再闷15～20天，至充分发酵、香气溢出时，取出，略蒸，干燥，即得。

中国专利CN1994116A中公开了一种利用纯种制曲生产淡豆豉的工艺，以中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号为CGMCC NO.1863的枯草芽孢杆菌(BACILLUS SUBTILIS)为制曲菌种，大豆为主料，桑叶和青蒿为辅料生产淡豆豉。具体工艺包括煎煮,过滤,将吸尽滤液的大豆蒸煮，按蒸煮大豆∶种子液＝100∶1～3(W/V)的量接种活菌，发酵，干燥等过程。由于本发明在工艺中使用了纯种菌，生产的淡豆豉具有稳定的营养和功能品质，且安全卫生。

提高淡豆豉中异黄酮的含量，可以提高淡豆豉的药效，但是现有的淡豆豉制备方法中都存在淡豆豉产物中异黄酮的产量低的问题，因此如何通过优化改进淡豆豉的制备工艺，提高淡豆豉中异黄酮的含量具有十分重要的意义。

发明内容

为了解决现有的淡豆豉生产方法中存在的不足，本发明目的在于提供一种具有更高异黄酮含量的淡豆豉纯种发酵方法。

本发明采取的技术方案是：

本发明的淡豆豉纯种发酵方法的具体步骤如下：

(1)发酵菌株活化：

将发酵菌株进行酒精消毒后，接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，轻摇混匀发酵菌，存放至22-28℃生化培养箱培养，培养12-24h；

(6)黄豆的制备：

将干黄豆中加入纯水，没过黄豆，浸泡10-15h，于100-120℃灭菌10-20min，冷却备用；

(7)发酵菌液的制备：

将步骤(1)培养后的发酵菌液取出，观察液体培养基表面是否覆盖灰白色菌膜，液体是否浑浊、有悬浮物，确认发酵菌活化情况良好后，用已灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基，对发酵菌液进行5-15倍稀释；

(8)黄豆接菌与发酵：

往步骤(2)制备好的黄豆中加入步骤(3)稀释后的发酵菌液，黄豆与稀释菌液的重量比为1-5:1，混匀后，放入生化培养箱内，在20-37℃下培养1-11天；

(9)淡豆豉的回收：

将步骤(4)发酵后的产物取出，放入干燥箱中进行干燥，干燥至淡豆豉无粘液附着，则得到淡豆豉成品。

步骤(1)中，所述的发酵菌株是蜡样芽孢杆菌CAK-05，保藏编号：CCTCC NO:M2016283。

保藏信息如下：

分类命名：蜡样芽孢杆菌CAK-05(Bacillus cereus CAK-05)

保藏该生物材料样品的单位名称：中国典型培养物保藏中心

地址：中国武汉武汉大学

保藏日期：2016年5月26日

保藏编号：CCTCC NO:M2016283

步骤(1)中，优选将发酵菌株存放至25℃生化培养箱培养，培养18h。

步骤(1)中，所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基的制备方法如下：每蛋白胨10g，牛肉膏10g，氯化钠5g，加纯水混合后加热至完全溶解，加纯水定容至1000mL，调定pH值于7.4至7.6，121℃高压消毒25min，至4℃冰箱保存。

步骤(2)中，优选黄豆浸泡12h，于115℃高压灭菌15min。

步骤(3)中，优选用已灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基，对发酵菌液进行10倍稀释。

步骤(4)中，优选黄豆与稀释菌液的重量比为3:1。

步骤(4)中，优选在25℃下培养9天。

步骤(4)中，发酵过程中，每隔1至2天需翻动黄豆，以使防止位于较上位置的黄豆与菌液分离，帮助与菌液混合，促进发酵。

步骤(5)中，优选干燥温度为60℃。

本发明的积极效果如下：

本发明的淡豆豉纯种发酵方法具有简单、方便、易于操作的优点，并且本发明的方法制备的淡豆豉相对于现有的生产方法极大的提高了异黄酮的含量，本发明的方法值得大力推广，具有重大的经济意义和社会意义。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。

实施例1

本发明的淡豆豉纯种发酵方法的具体步骤如下：

(1)发酵菌株活化：

将发酵菌株进行酒精消毒后，接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，轻摇混匀发酵菌，存放至22℃生化培养箱培养，培养24h；

(10)黄豆的制备：

将干黄豆中加入纯水，没过黄豆，浸泡10h，于120℃灭菌10min，冷却备用；

(11)发酵菌液的制备：

将步骤(1)培养后的发酵菌液取出，观察液体培养基表面是否覆盖灰白色菌膜，液体是否浑浊、有悬浮物，确认发酵菌活化情况良好后，用已灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基，对发酵菌液进行15倍稀释；

(12)黄豆接菌与发酵：

往步骤(2)制备好的黄豆中加入步骤(3)稀释后的发酵菌液，黄豆与稀释菌液的重量比为1:1，混匀后，放入生化培养箱内，在37℃下培养1天；

(13)淡豆豉的回收：

将步骤(4)发酵后的产物取出，放入干燥箱中进行干燥，干燥至淡豆豉无粘液附着，则得到淡豆豉成品。

步骤(1)中，所述的发酵菌株是蜡样芽孢杆菌，保藏编号：CCTCC NO:M2016283。

步骤(1)中，所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基的制备方法如下：每蛋白胨10g，牛肉膏10g，氯化钠5g，加纯水混合后加热至完全溶解，加纯水定容至1000mL，调定pH值于7.4至7.6，121℃高压消毒25min，至4℃冰箱保存。

步骤(4)中，发酵过程中，每隔1至2天需翻动黄豆，以使防止位于较上位置的黄豆与菌液分离，帮助与菌液混合，促进发酵。

实施例2

本发明的淡豆豉纯种发酵方法的具体步骤如下：

(1)发酵菌株活化：

将发酵菌株进行酒精消毒后，接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，轻摇混匀发酵菌，存放至28℃生化培养箱培养，培养12h；

(14)黄豆的制备：

将干黄豆中加入纯水，没过黄豆，浸泡15h，于100℃灭菌20min，冷却备用；

(15)发酵菌液的制备：

将步骤(1)培养后的发酵菌液取出，观察液体培养基表面是否覆盖灰白色菌膜，液体是否浑浊、有悬浮物，确认发酵菌活化情况良好后，用已灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基，对发酵菌液进行5倍稀释；

(16)黄豆接菌与发酵：

往步骤(2)制备好的黄豆中加入步骤(3)稀释后的发酵菌液，黄豆与稀释菌液的重量比为5:1，混匀后，放入生化培养箱内，在20℃下培养11天；

(17)淡豆豉的回收：

将步骤(4)发酵后的产物取出，放入干燥箱中进行干燥，干燥至淡豆豉无粘液附着，则得到淡豆豉成品。

步骤(1)中，所述的发酵菌株是蜡样芽孢杆菌，保藏编号：CCTCC NO:M2016283。

步骤(1)中，所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基的制备方法如下：每蛋白胨10g，牛肉膏10g，氯化钠5g，加纯水混合后加热至完全溶解，加纯水定容至1000mL，调定pH值于7.4至7.6，121℃高压消毒25min，至4℃冰箱保存。

步骤(4)中，发酵过程中，每隔1至2天需翻动黄豆，以使防止位于较上位置的黄豆与菌液分离，帮助与菌液混合，促进发酵。

实施例3

本发明的淡豆豉纯种发酵方法的具体步骤如下：

(1)发酵菌株活化：

将发酵菌株进行酒精消毒后，接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，轻摇混匀发酵菌，存放至25℃生化培养箱培养，培养18h；

(18)黄豆的制备：

将干黄豆中加入纯水，没过黄豆，浸泡12h，于110℃灭菌15min，冷却备用；

(19)发酵菌液的制备：

将步骤(1)培养后的发酵菌液取出，观察液体培养基表面是否 覆盖灰白色菌膜，液体是否浑浊、有悬浮物，确认发酵菌活化情况良好后，用已灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基，对发酵菌液进行10倍稀释；

(20)黄豆接菌与发酵：

往步骤(2)制备好的黄豆中加入步骤(3)稀释后的发酵菌液，黄豆与稀释菌液的重量比为3:1，混匀后，放入生化培养箱内，在25℃下培养9天；

(21)淡豆豉的回收：

将步骤(4)发酵后的产物取出，放入干燥箱中进行干燥，干燥至淡豆豉无粘液附着，则得到淡豆豉成品。

步骤(1)中，所述的发酵菌株是蜡样芽孢杆菌，保藏编号：CCTCC NO:M2016283。

步骤(1)中，所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基的制备方法如下：每蛋白胨10g，牛肉膏10g，氯化钠5g，加纯水混合后加热至完全溶解，加纯水定容至1000mL，调定pH值于7.4至7.6，121℃高压消毒25min，至4℃冰箱保存。

步骤(4)中，发酵过程中，每隔1至2天需翻动黄豆，以使防止位于较上位置的黄豆与菌液分离，帮助与菌液混合，促进发酵。

步骤(5)中，干燥温度为60℃。

对比例

现有淡豆豉的炮制方法如下：

取桑叶、青蒿各70～100g，加水煎煮，滤过，煎液拌入净大豆1000g中，俟吸尽后，蒸透，取出，稍晾，再置容器内，用煎过的桑叶、青蒿渣覆盖，闷使发酵至黄衣上遍时，取出，除去药渣，洗净，置容器内再闷15～20天，至充分发酵、香气溢出时，取出，略蒸，干燥，即得。

对实施例1-3以及对比例制备的淡豆豉进行如下鉴定和分析：

1、淡豆豉的鉴别与检查：

(1)淡豆豉成品的鉴别

根据中国药典[2015]对淡豆豉的鉴别方法，将发酵菌所发酵的产物，随机称取1g捣碎，用10mL纯水浸泡加热至沸腾状态，并保持约5～10min，过滤去渣，用移液器吸取0.5mL滴加到滤纸上，等待滤液晾干后，喷洒1％吲哚醌-醋酸试液，再次将其晾干，然后放入干燥箱内，将温度调至110℃，10min后取出观察滴加部分显色情况，显示为紫红色表明为淡豆豉。

(2)淡豆豉成品的合格检查

根据中国药典药典[2015]对淡豆豉的检查方法，随机称取发酵产物1g捣碎后，加入10mL纯水，60℃水浴1h，过滤去渣，用移液器取1mL滤液放入一洁净试管内，滴加1％硫酸铜溶液和40％氢氧化钾溶液各4滴后混匀，观察溶液颜色变化，合格淡豆豉溶液无紫红色出现。

2、HPLC法检测回收样品异黄酮含量：

(1)对照品溶液的制备

分别精密称取标准品大豆苷元2.4mg、标准品染料木素2.6mg，置入10ml容量瓶，加甲醇充分溶解后定容至指定刻度，得到0.24mg/mL大豆苷元对照品溶液，0.26mg/mL染料木素对照品溶液。

(2)供试品溶液的制备

将4组淡豆豉以及未发酵黄豆分别用中药粉碎机打粉分装，分别精密称取1g，置于烧瓶中，加入70％乙醇50mL，摇均后，水浴回流1h，水浴温度80℃，将余下液体过滤备用，滤渣用10mL 70％乙醇反复洗涤，与滤液合并后蒸干，残渣用乙醇定容至10mL，经0.45μm微孔滤膜过滤分装，并标记好。

(3)色谱条件

测定淡豆豉异黄酮含量方法条件如下：

色谱柱：ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；

柱温：25℃；

流速：1mL/min；

流动相：乙腈：水：乙酸(35：63：2)；

检测波长：260nm；

进样量：15μL。

(4)上机检测精密吸取各溶液15μL，注入高效液相色谱仪， 每样品至少3针，根据两种对照品的线性范围逐步调整样品浓度进行检测。

检测结果如表1所示：

表1

由表1可以看出，本发明方法制备的淡豆豉中异黄酮的含量是黄豆的10倍左右，是现有方法生产的淡豆豉的2倍左右，由此可以看出，本发明的方法通过合理的工艺优化，从而使值得的淡豆豉中的异黄酮含量得到了极大的提高，取得了预料不到的技术效果。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种淡豆豉纯种发酵方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：

(1)发酵菌株活化：

将发酵菌株进行酒精消毒后，接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，轻摇混匀发酵菌，存放至22-28℃生化培养箱培养，培养12-24h；

(2)黄豆的制备：

将干黄豆中加入纯水，没过黄豆，浸泡10-15h，于100-120℃灭菌10-20min，冷却备用；

(3)发酵菌液的制备：

将步骤(1)培养后的发酵菌液取出，观察液体培养基表面是否覆盖灰白色菌膜，液体是否浑浊、有悬浮物，确认发酵菌活化情况良好后，用已灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基，对发酵菌液进行5-15倍稀释；

(4)黄豆接菌与发酵：

往步骤(2)制备好的黄豆中加入步骤(3)稀释后的发酵菌液，黄豆与稀释菌液的重量比为1-5:1，混匀后，放入生化培养箱内，在20-37℃下培养1-11天；

(5)淡豆豉的回收：

将步骤(4)发酵后的产物取出，放入干燥箱中进行干燥，干燥至淡豆豉无粘液附着，则得到淡豆豉成品。

2.如权利要求1所述的淡豆豉纯种发酵方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的发酵菌株是蜡样芽孢杆菌CAK-05，保藏编号：CCTCC NO:M2016283。

3.如权利要求1所述的淡豆豉纯种发酵方法，其特征在于：步骤(1)中，将发酵菌株存放至25℃生化培养箱培养，培养18h。

4.如权利要求1所述的淡豆豉纯种发酵方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的牛肉膏蛋白胨液体培养基的制备方法如下：每蛋白胨10g，牛肉膏10g，氯化钠5g，加纯水混合后加热至完全溶解，加纯水定容至1000mL，调定pH值于7.4至7.6，121℃高压消毒25min，至4℃冰箱保存。

5.如权利要求1所述的淡豆豉纯种发酵方法，其特征在于：步骤(2)中，黄豆浸泡12h，于115℃高压灭菌15min。

6.如权利要求1所述的淡豆豉纯种发酵方法，其特征在于：步骤(3)中，用已灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基，对发酵菌液进行10倍稀释。

7.如权利要求1所述的淡豆豉纯种发酵方法，其特征在于：步骤(4)中，黄豆与稀释菌液的重量比为3:1。

8.如权利要求1所述的淡豆豉纯种发酵方法，其特征在于：步骤(4)中，在25℃下培养9天。

9.如权利要求1所述的淡豆豉纯种发酵方法，其特征在于：步骤(4)中，发酵过程中，每隔1至2天需翻动黄豆，以使防止位于较上位置的黄豆与菌液分离，帮助与菌液混合，促进发酵。

10.如权利要求1所述的淡豆豉纯种发酵方法，其特征在于：步骤(5)中，干燥温度为60℃。