CN1313109C - 三子汤新制剂及其制备 - Google Patents

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本发明涉及一种治疗慢性支气管炎和哮喘的中药三子汤新制剂及其制备方法，特别是用白芥子、紫苏子和莱菔子三味中药制成的中药复方制剂及其新的用水提醇沉方法提取有效成分的制备工艺。

Description

三子汤新制剂及其制备
技术领域：
本发明涉及一种治疗慢性支气管炎和哮喘的中药制剂及其制备，特别是用白芥子、紫苏子和莱菔子三味中药制成的中药复方制剂及其新的制备工艺。
背景技术：
慢性支气管炎和哮喘是临床常见而又复杂的慢性疾病。在临床上多表现为咳嗽、咯痰，并伴有气喘、气促、呼吸困难等症状。此类疾病在发病初期对心肺功能影响不大，病人仍能保持正常活动，但待病情持续恶化发展，并发慢性阻塞性肺气肿，甚至慢性肺源性心脏病时，就会严重影响病人的身心健康，从而引起心肺功能紊乱障碍，甚至导致死亡。此类疾病一般在中老年人中发病率较高，特别是老年人群体中尤为严重，约占老年人总数的15％左右。据统计，中国大约有98％的肺心病是由慢性支气管炎、哮喘及阻塞性肺气肿所造成的。近年来研究发现，在整个世界范围内，其发病率和严重程度都呈上升和提高的趋势。以美国为例，仅受哮喘困扰者就达900万到1200万人口之多，约占总人口的5％，美国哮喘患者的发病率在1980年至1987年间已提高了29％。而且调查还发现，慢性支气管炎和哮喘还是美国最常见的儿童慢性病。
目前，这类疾病的治疗药物，主要有抗生素类、糖皮质激素类及β2受体激动剂和中成药等。临床实践证明，单纯使用抗生素治疗效果不理想，糖皮质激素类虽有较好的抗炎作用，但因不良反应多而受到限制。β2受体激动剂虽能暂时缓解症状，但对炎症反应不能给予有效控制。
中医药因其在治疗常见病、多发病及疑难病症等方面的独特疗效和因毒副作用低等特点越来越受到世人的普遍关注。目前，用于治疗痰多、气喘、咳嗽的中药成药也有不少，如贝羚散、川贝枇杷糖浆和冲剂、蛇胆川贝散及冲剂等，但多数为清化热痰剂，对于湿热蕴肺而致的肺热咳嗽、痰多、气喘等呼吸道疾病具有一定的治疗效果，而用于寒痰引起的支气管炎症和哮喘等疾病的中成药较为少见。
本发明选自明代医典《韩氏医通》的古方三子养亲汤(简称三子汤)，不仅是防治慢性支气管炎和哮喘的传统方药，而且《中成药名方药理与临床》将其列为温化寒痰剂第一方剂。三子养亲汤原方不着分量，“看何证多，则以所主者为君，余次之，每剂不过三钱，用生绢小袋盛之，煮作而饮”。合方和拆方研究表明，紫苏子、白芥子均有明显的平喘和祛痰作用，紫苏子的平喘作用较白芥子强，但白芥子的祛痰作用较紫苏子强，镇咳则以莱菔子作用最强。白芥子还能显著提高小鼠血浆CAMP/CGMP比值，由白芥子、紫苏子和莱菔子组成的三子汤其平喘作用优于各单味药。三药经配伍组方后可取各药之所长协同发挥作用。现代临床上应用一般等量使用，即处方中各药味比例为1∶1∶1，如《新编中医学概要》所载三子汤组成为“紫苏子三钱，白芥子三钱，莱菔子三钱”，《全国中草药汇编》(上册)也附方组成为“紫苏子、白芥子、莱菔子各3钱，水煎服”，另有试验也采用各药比例为1∶1∶1，这也是本品的特色之处。另外，三子养亲汤的组方简单而又严谨，由紫苏子、白芥子和莱菔子三味中药组成。《韩氏医通》曰：“白芥子主痰，下气宽中；紫苏子主气，定喘止咳；莱菔子主食，开痞降气。”三药配伍组方，互有所长，互为所用，具有降气行痰，止咳平喘，消食导滞之功。
三子汤用于治疗慢性支气管炎、哮喘等呼吸道疾病依据充分、疗效确切。但目前三子汤的应用仅限于传统汤剂，一方面，这与三子汤治疗哮喘、咳嗽等急症的要求很不相称，另一方面，在临床上难以推广使用而受到限制，有必要按现代新药研究开发的需要，应用现代科学技术方法，提取其中的有效成分，将其开发成稳定性好、质量可控、生物利用度高、便于携带且服用方便的胶囊剂，使三子汤这一传统古方发挥其更好的作用。
发明内容：
本发明提供了一种新的用紫苏子、白芥子、莱菔子制成的中药复方制剂。
本发明在于在传统工艺的基础上，对提取工艺进行了改进，将传统的三子汤制成为胶囊剂、片剂等易于服用的剂型，同时提高了疗效。
本发明的中药制剂，其配方组成为紫苏子、白芥子、莱菔子，优选采用1∶1∶1等量配伍，紫苏子、白芥子、莱菔子三者用量也可在此基础上加减，加减量不超过1倍。上述配方组成通过以下提取工艺得到新型药物制剂的活性成分。
活性成分的制备：
主要步骤如下：
1、将三味药用水煮提，得提取液，
2、提取液用醇沉淀，除去沉淀，
3、上清液分离出脂肪油A，
4、分离出脂肪油A后的上清液除醇，
5、除醇后的药液过层析柱，水和醇为洗脱溶剂，
6、洗脱后的药液除醇，浓缩，干燥得干浸膏B，
浸膏B和脂肪油A为药物的活性成分：
以上步骤具体可以按如下方法操作：
称取(炒)紫苏子、(炒)白芥子、(炒)莱菔子各等份，共5公斤，混匀，击碎，置于适宜的提取容器中，以等量水搅拌均匀，放置浸泡两小时，再加三倍量水加热煮沸，沸腾煎煮提取一小时后，停止加热，放置冷却至室温，绸布过滤得滤液，药渣再加入三倍量水，煎煮提取两次，每次一小时，过滤，合并三次滤液，离心取上清液，得三子提取液，提取液减压浓缩至生药量与药液体积比为2∶1(W/V)浓度，离心去除沉淀，加入95％乙醇使醇浓度达70％，离心去除沉淀后，得上清液，静置分取下层脂肪油A，得25ML，计算得率为5‰；然后减压回收乙醇至无乙醇为止，减压浓缩至生药量与药液体积比为2∶1浓度，将此溶液上已处理好的AB-8型大孔树脂柱吸附过夜，以一定量去离子水洗脱，并检查洗脱液至α-萘酚试验呈阴性为止，再以70％乙醇为洗脱溶剂进行分离，洗脱液减压回收乙醇后，恒温水浴上浓缩得干浸膏B，称重100g，计算得率为2％。
上述提取工艺中得到的脂肪油A和干浸膏B为本发明药物制剂的活性成分，将该活性成分通过常规的制剂方法即可制成可服用的药物制剂。
如胶囊剂的制备，可按如下步骤制备：
1.上述干浸膏B和辅料分别过60目筛，备用。
2.取三份磷酸氢钙(75克)和一份二氧化硅(25克)，混匀，加入处方量的干浸膏B，混合均匀。
3.取三份磷酸氢钙(75克)，加入一份脂肪油A(25毫升)，混匀，使吸收完全，60℃真空干燥4小时，粉碎，过60目筛。
4.取步骤3得到的物料与步骤2得到的物料，混合均匀。
5.灌装1号胶囊，即得。
本发明的中药制剂，在制备成药剂时可加入药物可接受的载体，所述药物可接受的载体可以是：淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、磷酸氢钙、二氧化硅、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。
本发明的中药制剂可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。本发明的制剂，优选的是口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等，更优选的是胶囊剂、片剂。
本发明的制剂在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服三次，每次1-20剂，如：1-20袋或粒或片。
本发明还包括鉴别本发明的中药制剂的方法，以及药物有效成分含量测定的方法，特别是对本发明的胶囊剂型进行鉴别和测定含量的方法。
本发明的药物制剂由白芥子、紫苏子、莱菔子三味中药制成。白芥子主要含白芥子甙及其水解产物芥子碱、白芥子油等化学成分，同为十字花科植物的莱菔子也含有芥子碱等成分，芥子碱在碱性水溶液中进一步分解为芥子酸和胆碱，我们在综合文献报道和自己试验基础上，确定以芥子碱作为本发明胶囊含量测定的指标性成分。
鉴别方法为：
芥子碱为季胺类生物碱，在白芥子和莱菔子中都以硫氰酸盐的形式存在。易溶于水、甲醇及热乙醇，不溶于氯仿、乙醚、苯等，能与碘化铋钾试液生成桔红色沉淀，与硅钨酸试液生成白色沉淀，与硫氰酸铬胺试液生成粉红色沉淀。将之点于硅胶薄层板上于254nm紫外灯下呈兰色荧光斑点，斑点上加1％氯化钴溶液与亚铁氰化钾试液1-2滴显持久的绿色环，根据以上性质我们对三子咳喘胶囊进行鉴别试验。
含量测定方法为：
采用色谱法，色谱条件与系统适用性试验：
用Alltima phenyl5μ，250×4.6mm，色谱柱；乙腈-0.08mol/L磷酸二氢钾溶液(15∶85)为流动相；检测波长326nm；柱温为室温。理论塔板数按芥子碱硫氰酸盐峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备：
精密称取芥子碱硫氰酸盐对照品适量置于量瓶中，加入0.08mol/L磷酸二氢钾溶液溶解并定量稀释至每1ml中含芥子碱硫氰酸盐0.05mg的溶液作为对照品溶液。供试品溶液的制备：
取本品内容物适量，研细后过60目筛，取约0.2g，精密称定，置于100ml三角瓶中，加甲醇50ml，超声(200v，250w)提取3次，每次30分钟，合并提取液，过滤，并用少量甲醇洗涤滤器，洗液并入滤液，回收甲醇至干，残渣用0.08mol/L磷酸二氢钾溶液转移至50ml容量瓶中，并加0.08mol/L磷酸二氢钾溶液稀释至刻度，摇匀，过微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。
测定法：
分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品每粒胶囊含芥子碱，以芥子碱硫氰酸计算(C16H24NO5.SCN)应不得少于2.4mg。
本发明的中药制剂，经过药效学实验，表明其具有优良的治疗效果，以下为实验内容。
药效学试验：
使用实施例1方法制备的胶囊进行实验，该胶囊在此称为：三子咳喘胶囊。
1.受试药物
三子咳喘胶囊，每粒胶囊含药粉0.3g，相当于4.5g生药，样品批号为：20000306，由江苏正大天晴制药有限公司提供；桂龙咳喘宁胶囊(阳性对照药)，每粒胶囊含药粉0.3g，批号为：990414，由中外合资山西桂龙医药有限公司生产。实验前，所有药物均用1％CMC配制成所需浓度溶液。
2.实验动物
实验选用昆明种小鼠，SD大鼠及豚鼠进行，所有动物均由本所实验动物室提供，合格证号为：苏动质97011，动物饲料由江苏省药品检验所监制，南京市江浦实验动物饲料厂生产的“实验动物全价颗粒饲料”及“兔饲料”。
3.实验方法与结果
3.1三子咳喘胶囊小鼠镇咳作用
取经预试验敏感(咳嗽＞15次/5min)的小鼠70只，体重为20±1g，雌雄各半，分为五组，分别灌胃给予三子咳喘胶囊10.00g生药/kg、5.00g生药/kg、2.50g生药/kg，桂龙咳喘宁胶囊500mg胶囊粉/kg，以及等容量1％CMC，每天一次，连续10天，最后一次给药后1h按小鼠氨水引咳法进行试验，然后观察其引咳潜伏期及5min内咳嗽次数，并比较组间差异，结果见表1：
表1三子咳喘胶囊小鼠镇咳作用
组别 给药量(g生药/kg)   动物数(只)   引咳潜伏期(S)(X±SD) 5min咳嗽次数(X±SD) P值**
  三子咳喘胶囊   10.00   14   30.27±10.70   8.43±6.59   ＜0.01
  三子咳喘胶囊   5.00   14   25.36±6.68   10.57±7.90   ＜0.01
  三子咳喘胶囊   2.50   14   23.86±6.13   12.79±5.27   ＜0.05
  桂龙咳喘宁胶囊   500mg*   14   26.08±6.42   10.07±5.26   ＜0.01
  空白对照组   ---   14   19.00±4.50   20.29±8.58
*为胶囊药粉，**与空白对照组比较
由表1可见，小鼠口服三子咳喘胶囊2.5g生药/kg时具有延长引咳潜伏期及明显的镇咳作用。5g生药/kg时呈非常显著差异。
3.2三子咳喘胶囊豚鼠镇咳作用
取经预试验敏感(咳嗽＞10次/5min)的豚鼠50只，体重为155±15g，雌雄不拘，分为五组，分别灌胃给予三子咳喘胶囊4.00g生药/kg、2.00g生药/kg、1.00g生药/kg，桂龙咳喘宁胶囊500mg胶囊粉/kg，以及等容量1％CMC，每天一次，连续10天，最后一次给药后1h将豚鼠逐只放入钟罩(4L)，以.600mmHg恒压喷入17.5％枸橼酸1min，然后观察其引咳潜伏期及5min内的咳嗽次数，并比较组间差异，结果见表2。
            表2三子咳喘胶囊豚鼠镇咳作用
组别   给药量(g生药/kg)   动物数(只)   引咳潜伏期(S)(X±SD)   5min咳嗽次数(X±SD)   P值**
  三子咳喘胶囊   4.00   10   92.5±18.09   6.6±3.04   ＜0.01
  三子咳喘胶囊   2.00   10   70.5±16.70   7.9±3.86   ＜0.05
  三子咳喘胶囊   1.00   10   63.9±17.01   8.2±3.89   ＜0.05
  桂龙咳喘宁胶囊   500mg*   10   78.1±19.87   6.7±4.12   ＜0.01
  空白对照组   ---   10   53.8±15.90   12.3±3.13
*为胶囊粉**与空白对照组比较
由表2可见，豚鼠口服三子咳喘胶囊1.0g生药/kg时有延长引咳潜伏期及明显的镇咳作用，4.0g生药/kg时呈非常显著差异。
3.3三子咳喘胶囊小鼠祛痰作用
取小鼠75只，体重21±1g，雄性，随机分为五组，每组15只。分别灌胃给予三子咳喘胶囊10.00g生药/kg、5.00g生药/kg、2.50g生药/kg，桂龙咳喘宁胶囊500mg胶囊粉/kg，以及等容量1％CMC。每天一次，连续10天。末次给药后0.5h，分别于各鼠腹腔注射5％酚红生理盐水0.2ml/20g体重，0.5h后处死动物，分离气管，将特制注射针插入气管，用含1mol/LNaOH生理盐水(1∶10)冲洗呼吸道，每次0.4ml，共三次，合并洗液，于751型分光光度计546nm处测定光密度，用标准酚红曲线查得酚红含量(ug/ml)，进行组间比较，结果见表3：
表3三子咳喘胶囊对小鼠气管酚红排泄量的影响
组别   给药量(g生药/kg)   动物数(只)   酚红量(ug/ml)(X±SD) P值**
  三子咳喘胶囊   10.00   15   8.43±1.47   ＜0.01
  三子咳喘胶囊   5.00   15   6.77±1.37   ＜0.05
  三子咳喘胶囊   2.50   15   6.37±1.20   ＜0.05
  桂龙咳喘宁胶囊   500mg*   15   7.65±1.20   ＜0.01
  空白对照组   ---   15   5.45±0.84
*为胶囊粉 **与空白对照组比较
由表3可见，小鼠口服三子咳喘胶囊2.5g生药/kg时，具有明显的祛痰作用。10.0g生药/kg时呈非常显著差异。
3.4三子咳喘胶囊对大鼠的祛痰作用
取SD大鼠50只，体重205±10g，雌雄各半，均分为五组，每组10只。分别灌胃给予三子咳喘胶囊6.00g生药/kg、3.00g生药/kg、1.50g生药/kg，桂龙咳喘宁胶囊500mg胶囊粉/kg，以及等容量1％CMC。每天一次，连续10天。最后一次给药后1h，麻醉动物，切开颈部皮肤，暴露气管，于甲状软骨下缘正中两软骨环之间用注射针头扎一小孔，然后插入毛细管(内径0.8mm，长5-6cm)。当痰液充满时立即更换，连续收集2h中各鼠痰液的排出量(以痰液充满毛细管的长度为准)，并进行组间比较，结果见表4。
表4三子咳喘胶囊大鼠祛痰作用(毛细管法)
  组别   给药量(g生药/kg)   动物数(只)   充痰毛细管长度(X±SDcm)   P值**
  三子咳喘胶囊   6.00   10   3.40±0.87   ＜0.01
  三子咳喘胶囊   3.00   10   2.91±0.61   ＜0.05
  三子咳喘胶囊   1.50   10   2.29±0.70   ＞0.05
  桂龙咳喘宁胶囊   500mg*   10   3.27±0.70   ＜0.01
  空白对照组   ---   10   2.19±0.87
*胶囊粉 **与空白对照组比较
由表4可见，大鼠口服三子咳喘胶囊3.0g生药/kg具有明显的祛痰作用。6.0g生药/kg时呈非常显著差异。
3.5三子咳喘胶囊对整体豚鼠药物性喘息的保护作用
将豚鼠逐只放入钟罩(4L)，以400mmHg恒压喷入0.1％磷酸组胺和2％氯化乙酰胆碱等容积混合液45S，记录动物从吸入气雾至产生严重喘息(以抽搐翻倒为指征)的时间，为喘息发作潜伏期。
取合格豚鼠(潜伏期＜120S)50只，体重148.5±6.8g，雌雄不拘，均分为五组，每组10只，分别灌胃给予三子咳喘胶囊4.00g生药/kg、2.00g生药/kg和1.00g生药/kg，以及桂龙咳喘宁胶囊500mg胶囊粉/kg，空白对照组给予适量1％CMC，每天一次，连续10天。最后一次给药后1h，同前法再次喷雾组胺和乙酰胆碱混合液，喷雾后6min动物仍不翻倒者按360S计算，结果见表5：
表5三子咳喘胶囊对整体豚鼠药物性喘息的保护作用
组别   给药量(g生药/kg)   动物数   引喘潜伏期(X±SD) P值***
  (只)   给药前   给药后
  三子咳喘胶囊   4.00   10   59.10±14.28   169.20±19.58   ＜0.01
  三子咳喘胶囊   2.00   10   60.70±14.45   81.20±20.03   ＜0.05
  三子咳喘胶囊   1.00   10   58.20±14.04   71.80±13.62   ＞0.05
  桂龙咳喘宁胶囊   500mg*   10   62.40±21.56   122.10±30.95   ＜0.01
  空白对照组   -   10   61.90±21.31   66.30±14.21
*为胶囊粉 ***给药后与给药前比较
由表5可见，豚鼠口服三子咳喘胶囊2.0g生药/kg对药物引起的整体豚鼠喘息具有明显的保护作用。4.0g生药/kg时，作用更强，呈一定的量效关系。
3.6三子咳喘胶囊对豚鼠离体气管条的解痉作用
将制备好的豚鼠离体气管条置于含克-亨氏液的浴槽(30ML)中(通氧、37℃恒温)，下端固定于玻璃支架U型管上，上端固定于毛细吸管上，待气管收缩稳定后，分别往浴槽中加入致痉剂(0.05％His、1％Ach、0.5％5-HT各0.2ML)，观察记录5min内变化情况，再加入被试药物，同样观察记录5min内毛细管变化情况。并计算其拮抗百分率。结果见表6-1，6-2，6-3。
表6-1三子咳喘胶囊对豚鼠离体气管条的解痉作用
组别   浴槽药浓度(g生药/ml)   n数   毛细管容积量(mm)   拮抗百分率(％)
  给His   给药
  三子咳喘胶囊   1×10-2   8   17.5±3.0   5.4±1.3   69.14
  三子咳喘胶囊   5×10-3   8   19.0±2.2   9.5±1.3   50.00
  桂龙咳喘宁胶囊   5×10-4*   8   19.1±2.1   6.5±1.1   65.97
表6-2  三子咳喘胶囊对豚鼠离体气管条的解痉作用
组别   浴槽药浓度(g生药/ml)   n数   毛细管容积量(mm)   拮抗百分率(％)
  给Ach   给药
  三子咳喘胶囊   1×10-2   8   18.5±2.1   7.6±1.3   58.92
  三子咳喘胶囊   5×10-3   8   19.5±2.2   12.0±1.7   38.46
  桂龙咳喘宁胶囊   5×10-4*   8   19.8±2.6   10.9±1.8   45.00
表6-3三子咳喘胶囊对豚鼠离体气管条的解痉作用
组别   浴槽药浓度(g生药/ml)   n数   毛细管容积量(mm)   拮抗百分率(％)
  给5-HT   给药
  三子咳喘胶囊   1×10-2   8   20.1±3.1   6.6±1.2   67.16
  三子咳喘胶囊   5×10-3   8   18.9±2.1   13.3±2.1   29.63
  桂龙咳喘宁胶囊   5×1-6*   8   19.1±2.2   10.1±2.7   47.12
*为胶囊粉
由表6-1、6-2、6-3可见，三子咳喘胶囊对由His、Ach和5-HT引致的豚鼠离体气管条平滑肌具有一定的解痉作用。且呈一定的量效关系。
3.7三子咳喘胶囊对小鼠非特异性免疫功能的影响
取小鼠50只，体重20±1g，雄性，均分为五组，分别灌胃给予三子咳喘胶囊10.00g生药/kg、5.00g生药/kg、2.50g生药/kg和桂龙咳喘宁胶囊500mg胶囊粉/kg，以及等容量1％CMC，每天一次，连续给药20天。于末次给药后尾静脉注射印度墨汁(80mg/ml)0.1ml/10g。于2、10min各眼眶取血20ul，加至4ml蒸馏水中，用751型分光光度计(600nm)测定光密度。计算单位时间内血清碳粒清除速度(廓清指数K＝lgC1-lgC2/T2-T1)。结果见表7。
表7三子咳喘胶囊对小鼠吞噬功能的影响
组别   给药量(g生药/kg)   动物数(只)   廓清指数K(X±SD) P值**
  三子咳喘胶囊   10.00   10   0.0316±0.0057   ＜0.05
  三子咳喘胶囊   5.00   10   0.0299±0.0040   ＜0.05
  三子咳喘胶囊   2.50   10   0.0264±0.0033   ＞0.05
  桂龙咳喘宁胶囊   500mg*   10   0.0316±0.0050   ＜0.05
  空白对照组   10   0.0254±0.0048
*为胶囊粉 **与空白对照组比较
由表7可见，小鼠口服三子咳喘胶囊5.0g生药/kg时能明显提高其清除碳粒廓清指数，但量效关系不明显。
3.8三子咳喘胶囊对小鼠耐疲劳作用
取小鼠40只，体重19±1g，分为四组，雌雄各半，分别灌胃给予三子咳喘胶囊10.00g生药/kg、5.00g生药/kg、桂龙咳喘宁胶囊500mg胶囊粉/kg及等容量1％CMC，每天一次，连续给药20天。末次给药后1h，测定各小鼠负重(1/10体重)游泳持续时间。见表8。
表8三子咳喘胶囊对小鼠游泳时间的影响
组别   给药量(g生药/kg)   动物数(只)   游泳持续时间min(X±SD)   P值
  三子咳喘胶囊   10.00   10   48.40±12.40   ＜0.05
  三子咳喘胶囊   5.00   10   40.62±12.62   ＞0.05
  桂龙咳喘宁胶囊   500mg*   10   54.39±11.79   ＜0.01
  空白对照组   ---   10   38.07±9.36
*为胶囊粉 **与空白对照组比较
由表8可见，小鼠口服三子咳喘胶囊10.0g生药/kg时能延长小鼠游泳时间。
3.9三子咳喘胶囊的抑菌作用
药物：三子咳喘胶囊，0.3g/胶囊，相当于4.5g生药；注射用青霉素G钾，批号：990605，北京制药厂生产；硫酸链霉素，批号：990420，上海第三制药厂生产。
菌种：金黄色葡萄球菌(26001)、乙型溶血性链球菌(32172)、肺炎双球菌(31002)、伤寒沙门氏菌(50087)、福氏志贺氏杆菌(51536)、致病性大肠杆菌(44155)绿脓杆菌(10104)。以上菌株均由卫生部生物制品检定所提供。
培养基：营养琼脂，上海医学化验所试剂厂生产。以营养琼脂配制10％羊血琼脂，血琼脂+小牛血清肉汤及营养肉汤+10％小牛血清肉汤。
方法：
(1)平皿抑菌法：
将青霉素、链霉素稀释成100u/ml，三子咳喘胶囊以蒸馏水配制成0.1000、0.0500、0.0250、0.0125、0.0063、0.0031、0.0016g生药/ml的浓度溶液，然后用上述浓度的药液制成含药纸片。
将培养基按20ml/皿制成平板。
将试验菌株分别接种于肉汤培养液中，37℃培养18h后，用接种环分别取菌株接种于平板上，随后将上述含药纸片(直径为6mm)贴于平板培养基上，每一浓度药液用2张纸片，再经37℃培养18h后，观察并测定各纸片周围的抑菌圈，以抑菌圈的大小比较药物对不同菌株的抑制强度。
结果显示，在平皿抑菌试验中，青霉素对26001、32172、31002、菌株高度敏感；链霉素对26001、31002、50087、51536、44155、菌株高度敏感，对32172菌株中度敏感；10104菌株抗药，表明试验所用菌株符合标准。三子咳喘胶囊最低抑菌浓度为：26001、32172、31002、10104菌株0.0031g/ml；50087、44155菌株0.0063g/ml；51536菌株0.0125g/ml，结果见表9、11。
表9三子咳喘胶囊的抑菌作用(纸片法、mm)
  药物浓度   0.1000   0.0500   0.0250   0.0125   0.0063   0.0031   0.0016   青霉素   链霉素
  菌株金葡菌链球菌肺炎球菌沙门氏菌志贺氏菌大肠杆菌绿脓杆菌 13.4811.2012.359.858.2810.4012.68 11.758.4510.867.605.768.659.75 9.565.887.644.383.555.906.40 6.804.054.952.561.883.574.18 4.302.763.051.200.1.852.32 1.751.101.500.0.0.1.05 00000.0.0. 25.3821.4526.758.20--------- 12.8510.2011.4615.8512.4013.78---
(2)试管法：
牛肉汤培养基制备：称取牛肉膏、蛋白栋、氯化钠各适量，放入烧杯内，先加少量蒸馏水，待其溶化后再加蒸馏水至刻度，并用氢氧化钠溶液调PH至7.4，过滤后高压灭菌。
药物液体培养基制备：取小烧杯10只，依次编号，按无菌操作方法，用移液管吸取牛肉汤培养基加入烧杯内，每杯15ml，然后用移液管吸取三子咳喘胶囊药液(1g生药/ml)15ml放入第一个烧杯，摇匀后，再从第一个烧杯中吸取15ml放入第二个烧杯，以此逐杯稀释，使药物浓度分别为：0.5000、0.2500、0.1250、0.0625、0.0313、0.0156、0.0078、0.0039、0.0020、0.0010g/ml。另取无菌小试管编号，每个菌株用11支试管，其中1--10管加入已稀释的药物，1ml/管，第11管加入不含药物的牛肉汤培养基1ml，作为空白对照管。
菌株的接种与培养：先将各试验用菌株接种于牛肉汤培养基中，放37℃孵箱内培养18h，再用牛肉汤培养基稀释至10-3浓度，然后于上述含药试管中各加入0.1ml，于37℃孵箱培养24h，取出观察细菌生长情况。倘若管内澄清，表示无细菌生长；如为混浊，表示已有细菌生长。
在试管法抑菌试验中，三子咳喘胶囊对各菌株的最低抑菌浓度为：26001、32172、31002、50087菌株0.0078g/ml；51536、44155、10104菌株0.0156g/ml，结果见表10、11。
          表10三子咳喘胶囊的抑菌作用(试管法)
  药物浓度   0.5000   0.2500   0.1250   0.0625   0.0313   0.0156   0.0078   0.0039   0.0020   0.001
  菌株金葡菌链球菌肺炎球菌沙门杆菌志贺氏菌大肠杆菌绿脓杆菌 --------------------- --------------------- --------------------- --------------------- --------------------- --------------------- ------------+++ ++++++++++ +++++++++++++++ +++++++++++++++++++++
表11三子咳喘胶囊最低抑菌浓度(g/ml)
  菌株   纸片法   试管法
  金葡菌链球菌肺炎球菌沙门杆菌志贺氏菌大肠杆菌绿脓杆菌   0.00310.00310.00310.00630.01250.00630.0031   0.00780.00780.00780.00780.01560.01560.0156
以上平皿法与试管法抑菌试验结果表明，三子咳喘胶囊对呼吸系统常见致病菌具有较好的抑菌作用。
3.10三子咳喘胶囊对小鼠耳肿胀的抑制作用
取小鼠40只，20±1g，雌雄各半，均分为4组，其中三子咳喘胶囊二组，分别按10.0、5.0g生药/kg灌胃；阳性对照药桂龙咳喘宁胶囊一组，按500mg药粉/kg灌胃；空白对照一组，灌胃给予等容量1％CMC。每天给药一次，连续给药10天，末次给药后1h，每鼠左右耳两面涂巴豆油20ul，1h后处死动物，用直径为9mm的打孔器打下相同部位的耳片，逐片称重，并与空白对照组比较，以判断三子咳喘胶囊对巴豆油引致的耳肿胀有无抑制作用，结果见表12。
表12三子咳喘胶囊对小鼠耳肿胀的抑制作用
  组别   给药量(g生药/kg)   耳片数(只)   耳片重mg(X±SD)   P值**
  三子咳喘胶囊   10.0   20   24.72±5.49   P＜0.05
  三子咳喘胶囊   5.0   20   27.43±2.53   P＞0.05
  桂龙咳喘宁胶囊   500mg*   20   24.51±4.21   P＜0.05
  空白对照组   ---   20   28.75±5.30
*为胶囊粉 **与空白对照组比较
由表12结果可见，三子咳喘胶囊对由巴豆油引致的小鼠耳肿胀，仅10g生药/kg组具有一定抑制作用。
4.小结
上述实验结果表明，三子咳喘胶囊对豚鼠(1.0g生药/kg)和小鼠(2.5g生药/kg)由药物引起的咳嗽具有较强的止咳作用、能明显增加小鼠(2.5g生药/kg)呼吸道酚红排泄量和大鼠(3.0g生药/kg)呼吸道痰液排出量、对整体豚鼠(2.0g生药/kg)药物性喘息具有明显的保护作用和对豚鼠离体气管条具有一定地解痉作用。同时，对小鼠(5.0g生药/kg)的吞噬功能也有一定的提高，对呼吸系统的常见致病菌具有明显的抑制作用。对小鼠抗疲劳及抑制由巴豆油引致的小鼠耳肿胀仅大剂量(10g生药/kg)组具有一定作用。
急性毒性试验：
三子咳喘胶囊经小鼠灌胃和腹腔注射两种途径给药，分别测得：小鼠灌胃给药最大给药量为100g生药/kg(相当于临床用量的200倍)，腹腔注射LD50＝20g生药/kg(相当于临床用量的40倍)，95％可信限为17.84-22.43g生药/kg。
长期毒性试验：
本实验按“新药临床前研究指导原则”要求进行大鼠重复给药毒性试验，设低、中、高三个给药剂量组和空白对照，药物剂量分别为10、20、40g生药/kg体重(相当于临床成人用剂量的20、40、80倍)，灌胃给药，每天一次，每周给药6天，停药1天，连续给药三个月，给药结束后观察两周。结果表明，40生药g/kg/d高剂量组给药结束出现体重减轻，脏器系数相对增加，但各组血液生化、生理指标未见明显改变，病理学检查高剂量组出现肝细胞肿胀、颗粒变性现象，肾脏出现炎性细胞浸润现象，而恢复期结束后无明显异常，提示大鼠连续口服三子咳喘胶囊(40g生药/kg)三个月，对肝、肾具有一定的毒性反应，但其毒性是可恢复的；20、10g生药/kg/d两个剂量组均未观察到与药物有关的明显毒性反应。故认为大鼠三子咳喘胶囊连续灌胃三个月的安全剂量为20g生药/kg/d，相当于临床上成人用剂量的40倍，所以本实验提示三子咳喘胶囊临床治疗咳喘时0.45g生药/kg/d是安全的。
本发明应用现代科学技术方法，使三子汤这一传统古方发挥其更好的作用，所得产品稳定性好、质量可控、生物利用度高、疗效优良，因为减少了杂质，副作用更少，而且便于携带、服用方便。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例1
胶囊的制备
称取(炒)紫苏子、(炒)白芥子、(炒)莱菔子各等份，共5公斤，混匀，击碎，置于适宜的提取容器中，以等量水搅拌均匀，放置浸泡两小时，再加三倍量水加热煮沸，沸腾煎煮提取一小时后，停止加热，放置冷却至室温，绸布过滤得滤液，药渣再加入三倍量水，煎煮提取两次，每次一小时，过滤，合并三次滤液，离心取上清液，得三子提取液，提取液减压浓缩至生药量与药液体积比为2∶1(W/V)浓度，离心去除沉淀，加入95％乙醇使醇浓度达70％，离心去除沉淀后，得上清液，静置分取下层脂肪油A，得25ML，计算得率为5‰；然后减压回收乙醇至无乙醇为止，减压浓缩至生药量与药液体积比为2∶1浓度，将此溶液上已处理好的AB-8型大孔树脂柱吸附过夜，以一定量去离子水洗脱，并检查洗脱液至α-萘酚试验呈阴性为止，再以70％乙醇为洗脱溶剂进行分离，洗脱液减压回收乙醇后，恒温水浴上浓缩得干浸膏B，称重100g，计算得率为2％。
1.上述干浸膏B和辅料分别过60目筛，备用。
2.取三份磷酸氢钙(75克)和一份二氧化硅(25克)，混匀，加入处方量的干浸膏B，混合均匀。
3.取三份磷酸氢钙(75克)，加入一份脂肪油A(25毫升)，混匀，使吸收完全，60℃真空干燥4小时，粉碎，过60目筛。
4.取步骤3得到的物料与步骤2得到的物料，混合均匀。
5.灌装1号胶囊，即得。
实施例2
片剂的制备
称取(炒)紫苏子、(炒)白芥子、(炒)莱菔子各等份，共5公斤，混匀，击碎，置于适宜的提取容器中，以等量水搅拌均匀，放置浸泡两小时，再加三倍量水加热煮沸，沸腾煎煮提取一小时后，停止加热，放置冷却至室温，绸布过滤得滤液，药渣再加入三倍量水，煎煮提取两次，每次一小时，过滤，合并三次滤液，离心取上清液，得三子提取液，提取液减压浓缩至生药量与药液体积比为2∶1(W/V)浓度，离心去除沉淀，加入95％乙醇使醇浓度达70％，离心去除沉淀后，得上清液，静置分取下层脂肪油A，得25ML，计算得率为5‰；然后减压回收乙醇至无乙醇为止，减压浓缩至生药量与药液体积比为2∶1浓度，将此溶液上已处理好的AB-8型大孔树脂柱吸附过夜，以一定量去离子水洗脱，并检查洗脱液至α-萘酚试验呈阴性为止，再以70％乙醇为洗脱溶剂进行分离，洗脱液减压回收乙醇后，恒温水浴上浓缩得干浸膏B，称重100g，计算得率为2％。
1.上述干浸膏B和辅料分别过60目筛，备用。
2.取三份磷酸氢钙(75克)和一份二氧化硅(25克)，混匀，加入处方量的干浸膏B，混合均匀。
3.取三份磷酸氢钙(75克)，加入一份脂肪油A(25毫升)，混匀，使吸收完全，60℃真空干燥4小时，粉碎，过60目筛。
4.取步骤3得到的物料与步骤2得到的物料，混合均匀。
5.加入淀粉50克，乙醇为润湿剂，制颗粒，整粒后加入硬脂酸镁20克，压片，包衣，即得。
实施例3
含量测定方法
色谱条件与系统适用性试验：
用Alltima phenyl 5μ，250×4.6mm，色谱柱；乙腈-0.08mol/L磷酸二氢钾溶液(15∶85)为流动相；检测波长326nm；柱温为室温。理论塔板数按芥子碱硫氰酸盐峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备：
精密称取芥子碱硫氰酸盐对照品适量置于量瓶中，加入0.08mol/L磷酸二氢钾溶液溶解并定量稀释至每1ml中含芥子碱硫氰酸盐0.05mg的溶液作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：
取实施例1胶囊内容物适量，干燥至恒重，研细后过60目筛，取约0.2g，精密称定，置于100ml三角瓶中，加甲醇50ml，超声(200v，250w)提取3次，每次30分钟，合并提取液，过滤，并用少量甲醇洗涤滤器，洗液并入滤液，回收甲醇至干，残渣用0.08mol/L磷酸二氢钾溶液转移至50ml容量瓶中，并加0.08mol/L磷酸二氢钾溶液稀释至刻度，摇匀，过微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。
测定法：
分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品每粒胶囊含芥子碱，以芥子碱硫氰酸计算(C16H24NO5.SCN)应不得少于2.4mg。

Claims (4)

1.一种用于治疗慢性支气管炎和哮喘的紫苏子、白芥子、莱菔子三味中药提取物的制剂，其中中药提取物的提取方法包括：
a.将紫苏子、白芥子、莱菔子三味药按1∶1∶1配伍，用水煮提，得提取液，
b.提取液用乙醇沉淀，除去沉淀，
c.从用乙醇沉淀后的上清液中静置分离出脂肪油A，
d.分离出脂肪油A后的上清液除乙醇，
e.除乙醇后的药液过AB-8型大孔树脂柱，水和70％乙醇为洗脱液，
f.洗脱后的药液除乙醇，浓缩，干燥得干浸膏B。
2.权利要求1所述的制剂，为胶囊或片剂。
3.权利要求2所述的胶囊的制备方法，包括以下步骤：
a.将浸膏B和辅料分别过筛，备用，
b.取辅料，加入干浸膏B，混合均匀，
c.取磷酸氢钙，加入脂肪油A，混匀，干燥，粉碎，过筛，
d.取步骤b得到的物料与步骤c得到的物料，混合均匀，
e.装入胶囊。
4.权利要求2的胶囊剂的含量测定方法，其特征在于，采用色谱法，色谱条件为：
用Alltima phenyl 5μ，250×4.6mm，色谱柱；乙腈-0.08mol/L磷酸二氢钾溶液为15∶85作为流动相；检测波长326nm；柱温为室温，理论塔板数按芥子碱硫氰酸盐峰计算应不低于3000，
该方法包括：
a.对照品溶液的制备，方法为，精密称取芥子碱硫氰酸盐对照品适量置于量瓶中，加入0.08mol/L磷酸二氢钾溶液溶解并定量稀释至每1ml中含芥子碱硫氰酸盐0.05mg的溶液作为对照品溶液，
b.供试品溶液的制备，方法为，取权利要求1的药物制剂内容物适量，研细后过60目筛，取约0.2g，精密称定，置于100ml三角瓶中，加甲醇50ml，以200v，250w超声提取3次，每次30分钟，合并提取液，过滤，并用少量甲醇洗涤滤器，洗液并入滤液，回收甲醇至干，残渣用0.08mol/L磷酸二氢钾溶液转移至50ml容量瓶中，并加0.08mol/L磷酸二氢钾溶液稀释至刻度，摇匀，使用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得，
c.测定方法为，分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得，本品每粒胶囊含芥子碱，以芥子碱硫氰酸计算应不得少于2.4mg。
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