CN101077341A - 橙黄决明素或其衍生物在制备降血脂药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了式I结构的化合物在制备治疗降血脂药物中的用途，其中：R₁为－H或－OCH₃；R₂为－H、－OH、－OCH₃、－COOH或－Oglu；R₃为－OH、或－Oglu。本发明还提供了含有该化合物的药物组合物。通过检测添加样品前后细胞内荧光素酶的活性，结果表明：化合物II能明显增加荧光素RLU，增加率为115.24％；其余化合物也能在一定程度上增加RLU，表明示化合物II具有显著降血脂活性，为临床降血脂提供了一种新的选择。

Description

橙黄决明素或其衍生物在制备降血脂药物中的应用

技术领域

本发明涉及橙黄决明素及其衍生物在制备降血脂药物中的应用，属于医药领域。

背景技术

高脂血症是一种常见疾病，系人体脂质代谢失调所致。临床检验为血清胆固醇(TC)或甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(β-脂蛋白)过高；高密度脂蛋白(α-脂蛋白)趋于下降或低于正常值。高脂血症易诱发冠心病、脑中风、高血压等心血管疾病，还可能引起胆结石、胰腺炎，导致男性性功能障碍、老年痴呆等疾病。

决明子为豆科植物决明Cassia obtusifolia L.或小决明C.tora.L.的干燥种子，为临床常用中药。性味甘、苦、咸，微寒。归肝、肾、大肠经。具有清肝明目，润肠通便的功效。现代研究证明决明子具有将血压，调血脂，保肝及抑菌等活性，同时又可作为保健食品。《中国药典》2000年版决明子项下，采用大黄素、大黄酚为对照品进行薄层色谱定性鉴别；《中国药典》2005年版增加了含量测定项(用大黄酚为对照品)。众所周知，大黄素、大黄酚并非决明子的专属成分(例如大黄、首乌、虎杖等中药均含有)，且大黄素、大黄酚并不具有降血脂活性。目前，决明子降血脂制剂也普遍采用上述方法对决明子进行质量控制。

【《中草药》，决明子蒽醌类化学成分的研究，郝延军，桑有黎，赵余庆，2003年1月，34(1)；p18-19】对决明子的化学成分进行的研究，公开了包括橙黄决明素在内的6个蒽醌类化合物。【决明子提取物降脂作用的研究[J].李楚华，李续娥，郭宝江.华南师范大学学报，2002，(4)：29】公开了决明子提取物蒽醌苷类有导泻作用，能减少肠道对胆固醇的吸收和增加排泄，通过反馈调节低密度脂蛋白代谢，从而降低血清胆固醇水平，延缓和抑制动脉粥样硬化斑块形成。但是，目前为止，还未见有关橙黄决明素及其衍生物能增强荧光素酶活性，对低密度脂蛋白受体基因转录水平有增强作用的报道和橙黄决明素及其衍生物在制备治疗降血脂药物中的应用的研究报道。

发明内容

本发明的技术方案是提供橙黄决明素及其衍生物在制备治疗降血脂药物中的应用。

其中，橙黄决明素及其衍生物具有式I结构：

R₁为-H或-OCH₃；

R₂为-H、-OH、-OCH₃、-COOH或-Oglu；

R₃为-OH、或-Oglu；

进一步地，R₁为-H或-OCH₃；R₂为-OH；R₃为-OH、或-Oglu。

更优选的方案是R₁为-OCH₃；R₂为-OH、R₃为-OH。

本发明提供的橙黄决明素及其衍生物的制备方法为：

取决明子粗粉石油醚除去脂溶性物质后用正丁醇提取，将正丁醇提取物上AB-8大孔吸附树脂，水或乙醇溶液洗脱，洗脱物上硅胶柱；(比如可以依次用水、20％乙醇、80％乙醇洗脱，取80％乙醇洗脱物上硅胶柱)用氯仿-甲醇梯度洗脱，分段收集：氯仿-甲醇(9∶1)、(4∶1)、(3∶1)，然后分别将各段洗脱物经硅胶柱层析(石油醚-丙酮梯度洗脱)、C18柱层析(甲醇-水梯度洗脱)和Sephadex LH-20柱层析(甲醇-水梯度洗脱)进行分离，得到6个单体化合物：化合物I、化合物II、化合物III、化合物IV、化合物V、化合物VI。分离流程如图1。

对分离得到的6个单体化合物进行重结晶，用薄层色谱法、高效液相色谱法对纯化后的化合物进行纯度检查。薄层色谱法检查均未见杂质斑点，高效液相色谱法测得6个单体化合物纯度(面积归一化法)均达95％以上。

本发明还提供了一种用于降血脂的药物组合物，它是由式I结构的化合物为活性成分加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂，

R₁为-H或-OCH₃；R₂为-H、-OH、-OCH₃、-COOH或-Oglu；R₃为-OH、或-Oglu。进一步地，所述化合物为橙黄决明素，其中，每制剂单位含有橙黄明素4.5～5.5mg。所述的每制剂单位是指片剂的每片、胶囊剂的每粒、丸剂的每10g、颗粒剂的每10g。

所述制剂是口服制剂、注射制剂。

通过检测添加样品前后细胞内荧光素酶的活性，结果表明：化合物II能明显增加荧光素RLU，增加率为115.24％；其余化合物也能在一定程度上增加RLU，表明化合物II具有显著降血脂活性，为临床降血脂提供了一种新的选择。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1橙黄决明素及其衍生物的分离流程图

具体实施方式

下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步详述，但不应理解为是对本发明的进一步限定，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，做出其它多种形式的修改、替换或变更所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1橙黄决明素的制备

取决明子粗粉1公斤，用石油醚1800毫升提取除去脂溶性物质，用1800毫升正丁醇提取，得正丁醇提取物38克。将正丁醇提取物上AB-8大孔吸附树脂，依次用水、20％乙醇、80％乙醇洗脱。取80％乙醇洗脱物上硅胶柱，用氯仿-甲醇梯度洗脱，分段收集：氯仿-甲醇(9∶1)、(4∶1)、(3∶1)洗脱液，然后分别将各段洗脱物经硅胶柱层析(石油醚-丙酮梯度洗脱)、C18柱层析(甲醇-水梯度洗脱)和Sephadex LH-20柱层析(甲醇-水梯度洗脱)进行分离，得到6个单体化合物：化合物I、化合物II、化合物III、化合物IV、化合物V、化合物VI。分离流程如图1。所述的分离过程为：

(1)运用大孔吸附树脂进行初分

将正丁醇提取物上AB-8大孔吸附树脂，用不同浓度的乙醇依次洗脱，以薄层层析为指导，按组分的分布情况确定乙醇的浓度和用量，最终确定用水、20％乙醇、80％乙醇依次进行洗脱，分段收集洗脱液，回收溶剂，得到各段洗脱物。

(2)80％乙醇洗脱物的硅胶柱层析

采用氯仿-甲醇进行梯度洗脱，分段收集。在洗脱剂的选择上，比较了氯仿-甲醇、乙酸乙酯-甲醇、正丁醇-乙酸-水等多个系统，结果发现氯仿-甲醇系统有较好的分离和洗脱能力，因此，确定采用氯仿-甲醇系统进行洗脱。分别得到氯仿-甲醇(9∶1)、氯仿-甲醇(4∶1)和氯仿-甲醇(3∶1)三个梯度洗脱组分。

(3)氯仿-甲醇(9∶1)洗脱物的成分分离

氯仿-甲醇(9∶1)洗脱物极性相对较低，采用硅胶柱层析进行分离。在洗脱剂的选择上，考察多个洗脱系统，结果氯仿-甲醇系统和石油醚-丙酮系统均有较好的分离度，从节约成本的角度考虑，确定采用石油醚-丙酮系统进行梯度洗脱。得到了2个单体化合物即化合物I和化合物II。

(4)氯仿-甲醇(4∶1)洗脱物的成分分离

氯仿-甲醇(4∶1)洗脱组分，在薄层色谱上，运用多个展开系统，分离度均较差。采用硅胶柱层析进行预试验，也未能得到单体成分。又采用Sephadex LH-20柱层析进行预试验，有较好的分离效果，因此，用Sephadex LH-20柱层析，以甲醇-水系统进行梯度洗脱。得到2个单体化合物，即化合物III和化合物IV。

(5)氯仿-甲醇(3∶1)洗脱物的成分分离

氯仿-甲醇(3∶1)洗脱物，在薄层色谱上，运用多个展开系统，均不能得到较好的分离度。采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析进行预试验，也未能得到单体成分，又采用反相柱层析(C₁₈)进行分离，得到2个单体化合物，即化合物V和化合物VI。

化合物I

黄色针晶(环己烷-丙酮)，mp：163～165℃，Borntrager反应呈阳性，Molish反应呈阴性。

UV：λ_max ^MeOH(nm)：224、275、401。

IR(KBr)cm^-1：3342(OH)；2973，2921，2850(C-H)；1657(游离C＝O)；1635(缔合C＝O)。

高分辨ESI-MS：m/z：307.0587[M+Na]^-，确定分子式为C₁₆H₁₂O₅。由分子式可知该化合物的不饱和度为11(与所推测的结构中3个环，6个C＝C键，2个C＝O键相吻合)。

¹³C-NMR(600MHz，CD₃COCD₃)δppm：147.2(C-1)、155.2(C-2)、132.5(C-3)、126.1(C-4)、118.3(C-5)、136.3(C-6)、123.5(C-7)、162.0(C-8)、188.8(C-9)、181.0(C-10)、133.3(C-11)、116.9(C-12)、123.7(C-13)、125.9(C-14)、61.2(-CH₃O)、15.8(-CH₃)。

DEPT(θ＝135°)：有10个季碳(C-1、C-2、C-3、C-8、C-9、C-10、C-11、C-12、C-13、C-14)，4个CH(C-4、C-5、C-6、C-7)，2个CH₃(1-CH₃O，3-CH₃)。

¹H-NMR(600MHz，CD₃COCD₃)δppm：7.93(1H，s，H-4)，7.31(1H，dd，J＝8.2，1.1Hz，H-5)，7.73-7.78(2H，m，H-6，H-7)，3.97(3H，s，1-OCH₃)，2.41(3H，s，3-CH₃)。

根据以上数据的分析，并且与文献对照一致，确定其为钝叶素，即2，8-二羟基-1-甲氧基-3-甲基蒽醌，结构如下：

                         obtusifolin

      (2，8-dihydroxy-1-methoxy-3-methylanthraquinone)

化合物II

黄色针晶(环己烷-丙酮)，mp：229～231℃，Borntrager反应呈阳性，Molish反应呈阴性。

UV：λ_max ^MeOH(nm)：285、313、393。

IR(KBr)cm^-1：3448(OH)；2951，2928，2851(C-H)；1656(游离C＝O)；1627(缔合C＝O)。

高分辨ESI-MS：m/z：329.0687[M-H]^-，确定分子式为C₁₇H₁₄O₇。由分子式可知该化合物的不饱和度为11(与所推测的结构中3个环，6个C＝C键，2个C＝O键相吻合)。

¹³C-NMR(600MHz，CD₃COCD₃)δppm：147.1(C-1)、155.1(C-2)、131.8(C-3)、126.1(C-4)、107.2(C-5)、156.9(C-6)、139.4(C-7)、156.1(C-8)、187.7(C-9)、180.5(C-10)、129.3(C-11)、111.9(C-12)、123.9(C-13)、125.9(C-14)、61.2(-CH₃O)、59.9(-CH₃O)、15.7(-CH₃)。

DEPT(θ＝135°)：有12个季碳(C-1、C-2、C-3、C-6、C-7、C-8、C-9、C-10、C-11、C-12、C-13、C-14)，2个CH(C-4、C-5)，3个CH₃(1-CH₃O，7-CH₃O，3-CH₃)。

¹H-NMR(600MHz，CD₃COCD₃)δppm：7.87(1H，s，H-4)，7.26(1H，s，H-5)，3.98(3H，s，1-OCH₃)，3.95(3H，s，7-OCH₃)，2.48(3H，s，3-CH₃)。

根据以上数据的分析，并且与文献对照一致，确定其为橙黄决明素，即2，6，8-三羟基-1，7-二甲氧基-3-甲基蒽醌，结构如下：

                  aurantio-obtusin

  (2，6，8-trihydroxy-1，7-dimethoxy-3-methylanthraquinone)

化合物III

黄色针晶(甲醇-水)，mp：255～256℃，Borntrager反应呈阳性，Molish反应呈阳性。

UV：λ_max ^MeOH(nm)：209、278、399。

IR(KBr)cm^-1：3395(OH)；2938(C-H)；1663(游离C＝O)；1629(缔合C＝O)。

高分辨ESI-MS：m/z：505.1361[M-H]^-，确定分子式为C₂₄H₂₆O₁₂。由分子式可知该化合物的不饱和度为12(与所推测的结构中4个环，6个C＝C键，2个C＝O键相吻合)。

¹³C-NMR(600MHz，MeOD)δppm：153.6(C-1)、154.6(C-2)、141.7(C-3)、125.5(C-4)、102.8(C-5)、157.9(C-6)、141.3(C-7)、156.2(C-8)、187.5(C-9)、181.1(C-10)、128.6(C-11)、112.8(C-12)、124.6(C-13)、130.1(C-14)、61.0(1-CH₃O)、59.8(6-CH₃O)、55.5(7-CH₃O)、16.7(-CH₃)、103.6(C-1’)、74.2(C-2’)、76.9(C-3’)、70.1(C-4’)、76.5(C-5’)、61.1(C-6’)。

DEPT(θ＝135°)：有12个季碳(C-1、C-2、C-3、C-6、C-7、C-8、C-9、C-10、C-11、C-12、C-13、C-14)，7个CH(C-4、C-5、C-1’、C-2’、C-3’、C-4’、C-5’)，4个CH₃(1-CH₃O、6-CH₃O、7-CH₃O，3-CH₃)，1个CH₂(C-6’)。

¹H-NMR(600MHz，MeOD)δppm：7.89(1H，s，H-4)，7.40(1H，s，H-5)，4.03(3H，s，6-OCH₃)，3.98(3H，s，1-OCH₃)，3.94(3H，s，7-O CH₃)，2.49(3H，s，3-CH₃)，5.22(1H，d，J＝7.44，H-1’，β构型)，3.24-3.80(6H，m，glucosyl-H)。

根据以上数据的分析，并且与文献对照一致，确定其为钝叶决明素苷。即2-O-β-D-葡萄糖-8-羟基-1，6，7-三甲氧基-3-甲基蒽醌，结构如下：

                    Gluco-obtusin

(2-O-β-D-glucopyranosyl-8-hydroxy-1，6，7-trimethoxy-3-methylanthraquinone)

化合物IV

黄色针晶(甲醇-水)，mp：246～249℃，Borntrager反应呈阳性，Molish反应呈阳性。

UV：λ_max ^MeOH(nm)：220、261、401。

IR(KBr)cm^-1：3576，3449(OH)；2996，2926，2847(C-H)；1669(游离C＝O)；1638(缔合C＝O)。

高分辨ESI-MS：m/z：445.1143[M-H]^-，确定分子式为C₂₂H₂₂O₁₀。由分子式可知该化合物的不饱和度为12(与所推测的结构中4个环，6个C＝C键，2个C＝O键相吻合)。

¹³C-NMR(600MHz，MeOD₃)δppm：153.6(C-1)、154.7(C-2)、142.2(C-3)、125.4(C-4)、118.3(C-5)、135.9(C-6)、123.9(C-7)、162.1(C-8)、188.3(C-9)、181.8(C-10)、132.8(C-11)、116.8(C-12)、124.6(C-13)、130.3(C-14)、61.0(-CH₃O)、16.7(-CH₃)，103.6(C-1’)、74.2(C-2’)、76.9(C-3’)、70.1(C-4’)、76.6(C-5’)、61.1(C-6’)。

DEPT(θ＝135°)：有10个季碳(C-1、C-2、C-3、C-8、C-9、C-10、C-11、C-12、C-13、C-14)，9个CH(C-4、C-5、C-6、C-7、C-1’、C-2’、C-3’、C-4’、C-5’)，2个CH₃(1-CH₃O、3-CH₃)，1个CH₂(C-6’)。

¹H-NMR(600MHz，MeOD₃)δppm：7.93(1H，s，H-4)，7.27(1H，d，J＝8.1Hz，H-5)，7.67-7.71(2H，m，H-6，H-7)，3.98(3H，s，1-OCH₃)，2.48(3H，s，3-CH₃)，5.21(1H，d，J＝7.44，H-1’，β构型)，3.22-3.78(6H，m，glucosyl-H)。

根据以上数据的分析，并且与文献对照一致，确定其为钝叶素苷。即2-O-β-D-吡喃葡萄糖-8羟基-1-甲氧基-3-甲基蒽醌，结构如下：

                     Gluco-obtusifoin

(2-O-β-D-glucopyranosyl-8-hydroxy-1-methoxy-3-methylanthraquinone)

化合物V

白色针晶(甲醇-水)，mp：235～237℃，Borntrager反应呈阴性，盐酸-镁粉反应呈阴性，Molish反应呈阳性。

UV：λ_max ^MeOH(nm)：249。

IR(KBr)cm^-1：3410，3260(-OH)；3034，1568，1594(苯环)；1515，1249(C-O-C)；2926，2889(C-H)；1634(C＝O)。

高分辨ESI-MS：m/z：415.1011[M-H]^-，确定分子式为C₂₁H₂₀O₉。由分子式可知该化合物的不饱和度为12(与所推测的结构中4个环，7个C＝C键，1个C＝O键相吻合)。

¹³C-NMR(600MHz，MeOD)δppm：153.7(C-2)、124.8(C-3)、176.7(C-4)、126.9(C-5)、115.6(C-6)、162.1(C-7)、103.6(C-8)、157.4(C-9)、118.8(C-10)、122.7(C-1’)、129.9(C-2’、C-6’)、114.9(C-3’、C-5’)、157.8(C-4’)、100.4(C-1”)、73.4(C-2”)、76.9(C-3”)、69.9(C-4”)、76.5(C-5”)、61.1(C-6”)。

DEPT(θ＝135°)：有7个季碳(C-3、C-4、C-7、C-9、C-10、C-1’、C-4’)，13个CH(C-2、C-5、C-6、C-8、C-2’、C-6’、C-3’、C-5’、C-1”、C-2”、C-3”、C-4”、C-5”)；1个CH₂(C-6”)。

¹H-NMR(600MHz，MeOD)δppm：8.21(1H，s，H-2)，8.14(1H，d，J＝8.8Hz，H-5)，7.38(2H，d，J＝8.7Hz，H-2’、H-6’)，7.25(1H，d，J＝2.1Hz，H-8)，7.21(1H，dd，J＝8.8，2.1Hz，H-6)，6.85(2H，d，J＝8.7Hz，H-3’、H-5’)，5.11(1H，d，J＝7.32，H-1”，β构型)，3.41-3.94(6H，m，glucosyl-H)。

根据以上数据的分析，并且与文献对照一致，确定其为大豆苷，即7-O-β-D-吡喃葡萄糖-4’-羟基异黄酮。结构如下：

                      Daidzin

       (7-O-β-D-glucopyranosyl-4’-hydroxyisoflavone)

化合物VI

浅黄色针晶(甲醇-水)，mp：249～251℃，Borntrager反应呈阴性，Molish反应呈阳性。

UV：λ_max ^MeOH(nm)：231、274、310、321、391。

IR(KBr)cm^-1：3421(OH)；2921，2888(C-H)；1634(C＝O)；1588(苯环)；1457，1376(CH₃)。

高分辨ESI-MS：m/z：555.1739[M-H]^-，确定分子式为C₂₅H₃₂O₁₄。由分子式可知该化合物的不饱和度为10(与所推测的结构中4个环，5个C＝C键，1个C＝O键相吻合)。

¹³C-NMR(600MHz，MeOD)δppm：161.5(C-1)、109.6(C-2)、159.0(C-3)、96.8(C-4)、102.8(C-5)、156.9(C-6)、96.6(C-7)、160.0(C-8)、107.1(C-9)、140.5(C-10)、99.3(C-1’)、77.3(C-2’)、77.2(C-3’)、70.1(C-4’)、76.9(C-5’)、61.2(C-6’)、109.4(C-1”)、76.7(C-2”)、79.3(C-3”)、74.1(C-4”)、64.7(C-5”)、55.3(1-OCH₃)、54.5(6-OCH₃)、204.1(2-COCH₃)、31.64(2-COCH₃)。

DEPT(θ＝135°)：有9个季碳(C-1、C-2、C-3、C-6、C-8、C-9、C-10、C-3”、2-COCH₃、)，10个CH(C-4、C-5、C-7、C-1’、C-2’、C-3’、C-4’、C-5’、C-1”、C-2”)；3个CH₂(C-6’、C-4”、C-5”)，3个CH₃(1-OCH₃、2-COCH₃、6-OCH₃)。

¹H-NMR(600MHz，MeOD)δppm：6.65(1H，s，H-4)、6.88(1H，d，J＝1.92Hz，H-5)、6.57(1H，d，J＝1.92Hz，H-7)、5.11(1H，d，J＝7.62Hz，H-1’，β构型)、3.68(1H，d，J＝7.62，H-2’)、3.63(1H，t，J＝9.0，H-3’)、3.37-3.41(1H，m，H-4’)、3.52-3.55(1H，m，H-5’)、3.69-3.71(1H，m，H-6’)、3.95(1H，m，H-6’)、5.49(1H，s，H-1”)、3.94(1H，s，H-2”)、3.82(1H，d，J＝9.54Hz，H-4”)、4.11(1H，d，J＝9.54Hz，H-4”)、3.56(2H，s，H-5”)、3.96(3H，s，1-OCH₃)、3.91(3H，6-OCH₃)、2.62(3H，s，2-COCH₃)。

根据以上数据的分析，并且与文献^[15]对照一致，确定其为cassitoroside，即2-乙酰基-3-O-β-D-呋喃芹菜糖-8-O-β-D-吡喃葡萄糖-1，6-二甲氧基奈。结构如下：

                          cassitoroside

(2-acetyl-3-O-β-D-apifuranosyloxy-8-O-β-D-glucopyranosyloxy-1，6-dimethoxynaphthalene)

实施例2本发明药物片剂的制备

[处方]橙黄决明素    5g

      辅料          适量

      制成          1000片

[性状]本品为黄色片。

[作用与用途]降脂药。用于高胆固醇、高甘油三酯血症。

[用法与用量]口服。一次1片，一日1～2次。

其中，每片含橙黄决明素(C₁₄H₁₄O₇)应为4.5～5.5mg。

实施例3本发明药物胶囊剂的制备

[处方]橙黄决明素    5g

      辅料          适量

      制成          1000粒

[性状]本品为胶囊剂，内容物为黄色粉末。

[作用与用途]降脂药。用于高胆固醇、高甘油三酯血症。

[用法与用量]口服。一次1粒，一日1～2次。

本品每粒含橙黄决明素(C₁₄H₁₄O₇)应为4.5～5.5mg。

根据标准动物的等效剂量折算系数法，药效学试验中能降低高脂血症大鼠TC和TG的高剂量为6.03mg/kg，中剂量为3.015mg/kg，折算成人用剂量为高剂量为7.6mg/日，中剂量为3.8mg/日，所以暂选择人用剂量为5mg/日。

以下通过药效学试验证明本发明药物的有益效果。

试验例1决明子降血脂有效成分的筛选

运用低密度脂蛋白受体(LDLR)报告基因模型对以上6个化合物进行了药效学筛选。

低密度脂蛋白(LDL)是胆固醇在人体血清中的一个重要存在形式，位于细胞膜上的低密度脂蛋白受体(LDLR)吸收血液中的低密度脂蛋白，在调节低密度脂蛋白代谢和保持血液中胆固醇正常浓度方面起着非常重要的作用^[16]。通过直接激活LDLR基因的表达来调节血液中的LDL被认为是一种很好的降低血液LDL及TC浓度的途径^[17]。

以控制LDLR基因表达的SRE(LDLR基因的启动子)为靶位点，构建LDLR启动子荧光素酶(luciferase)报告基因质粒，将此质粒转染人肝癌细胞系HepG2构建成LDLR报告基因模型，利用该模型研究决明子单体化合物的降血脂活性。由活性化合物造成的SRE活性状态的改变将影响到位于其下游的荧光素酶基因的表达。因此，通过检测添加样品前后细胞内荧光素酶的活性，可以直接筛选出具有增强LDLR基因表达的活性化合物。

实验材料与仪器

供试药品

(1)决明子单体化合物I-VI：自制(纯度＞95％)。

(2)普伐他汀：10mg×7片/盒，上海施贵宝制药有限公司，批号：0403063。

试剂

(1)荧光素酶检测试剂：promega，批号：195112。

(2)Sofast^TM基因转染试剂：Sunma Biotechnology Co.，Ltd，批号：20041201。

DMEM培养基invitogen corporation，批号：1208501。

细胞及质粒HepG2：ATCC；pGL3-Basic：Promega。

仪器Victor² 1420-012 multilabel counter：Perkin Elmer。

实验方法

LDLR启动子荧光素酶(luciferase)报告基因质粒的构建

提取正常肝组织基因组DNA，选取LDLR基因-166至+35这一片段^[18]，根据其序列设计引物，并分别在正义和反义引物中加入酶切位点Kpn I和Bgl II，经PCR反应，酶切，连接，克隆到pGL3-Basic质粒载体。

细胞培养

将HepG2细胞用含10％血清及100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的低糖DMEM培养基培养，置于37℃、5％CO₂孵箱。

基因转染

将一定量的质粒和转染试剂分别与一定量的低糖DMEM混合均匀，再将两种液体混匀，室温孵育20min后，与一定浓度的HepG2细胞悬液混合均匀，接种此细胞于96孔板上，使每孔中有3×10⁴个细胞。37℃培养24h，换新鲜DMEM培养基同时加入样品(初筛浓度为50μg/ml，复筛浓度为1-50μg/ml)。继续培养16h。反应均为双复孔，试验重复进行两次。以普伐他汀作为本实验的阳性药物(初筛浓度为150μmol/l，复筛浓度为20-150μmol/l)。

荧光素酶活性测定

参照荧光素酶检测试剂盒进行荧光素酶活性测定：吸弃培养细胞中的上清液，每孔加入PBS洗涤细胞两次，加入裂解液40μl，室温放置15min，使细胞充分裂解，加入20μl底物振荡后，在562nm波长下测定相对发光单位RLU(relative luciferase unit)，RLU强弱代表酶活性高低，即代表药物作用强弱。

由荧光素酶催化的以荧光素(Luciferin)为底物的发光反应的反应式为：

Luciferae+Luciferase·Luiferyl-AMP+O₂→Luciferase+oxyluciferin+AMP+CO₂+hv

实验结果

(1)化合物I-VI对LDLR报告基因的转录激活作用：见表1。

          表1化合物I-VI对LDLR报告基因的转录激活作用

组别	浓度	相对发光单位(RLU)	增加率(％)
				细胞对照转染对照普伐他汀IIIIIIIVVVI	--150μmol/l50μg/ml50μg/ml50μg/ml50μg/ml50μg/ml50μg/ml	15511422530114424581738159115271021	--121.540.18115.2452.1939.3233.71-

注：增加率(％)表示与转染对照组的RLU相比。

结果表明：(1)转染对照组与细胞对照组相比较，RLU显著增加，表明转染成功。

(2)与转染对照组相比较，化合物II显示阳性，能明显增加荧光素RLU，增加率为115.24％；其余化合物能在一定程度上增加RLU，但与相当浓度的普伐他汀(阳性药)相比较，没有显著活性，故均为阴性。为确证化合物II的药理活性，将化合物II再次进行药效学试验。

(3)化合物II对LDLR报告基因的转录激活作用：见表2。

表2化合物II对LDLR报告基因的转录激活作用

组别	浓度	RLU
			细胞对照转染对照普伐他汀普伐他汀普伐他汀普伐他汀化合物II化合物II化合物II化合物II	--20μmol/l50μmol/l100μmol/l150μmol/l1μg/ml10μg/ml20μg/ml50μg/ml	172112312111317183021201218169419342087

试验例2橙黄决明素对高脂血症大鼠血脂的影响

2.1实验材料

实验动物

SD大鼠，150～250g，雌雄各半，一级，动物合格证号：川实动管字04-11，由成都中医药大学实验动物中心提供，检疫后备用。

实验药物与试剂

橙黄决明素：自制(相当于生药量5g·kg^-1)；乙醇提取物、正丁醇提取物(相当于生药量5g·kg^-1)：取决明子粗粉，95％乙醇回流提取制得乙醇提取物，按系统溶剂提取法进行提取，决明子正丁醇提取物。

普伐他汀(10mg×7片/盒，批号：0403063)：上海施贵宝制药有限公司。

胆固醇(25g/瓶，进口分装(荷兰)批号：0001021)：天津市卫生材料厂经销；去氧胆酸钠(10g/瓶，进口分装(意大利)，批号：000213)：上海化学试剂采购供应站经销；丙硫氧嘧啶片(50mg×100片/盒，批号：20057193)：深圳市中联制药有限公司；猪油：自制。

总胆固醇测定试剂盒(规格：R₁：40ml×2 R₂：10ml×2，批号1105051)，甘油三酯测定试剂盒(规格：R₁：40ml×2 R₂：10ml×2，批号：1105031)，均由四川迈克科技有限责任公司。

其它试剂均为分析纯。

2.2实验方法

脂肪乳的配制

将1g丙硫氧嘧啶于乳钵中研细，备用。取25g猪油于40℃水浴加热融化，置于乳钵中，加入10g胆固醇，1g丙硫氧嘧啶，充分搅拌，溶解，再加入吐温-80、丙二醇各20ml，研磨混匀。然后徐徐加入2g去氧胆酸钠，研磨乳化。再加蒸馏水至100ml。装入密闭容器中，冷藏，使用时先于37℃水浴融化，即得。

实验方法

取健康大鼠96只，按体重随机分为8组，空白对照组(N＝12)、阳性对照组(N＝12)、模型对照组(N＝12)、乙醇提取物组(N＝12)、正丁醇提取物组(N＝12)、高剂量组(N＝12)、中剂量组(N＝12)、低剂量组(N＝12)。

空白对照组：上午灌胃2％吐温溶液15ml·kg^-1，下午灌胃蒸馏水15ml·kg^-1；模型对照组：上午灌胃2％吐温溶液，下午灌胃脂肪乳剂15ml·kg^-1；阳性对照组：上午灌胃普伐他汀的2％吐温溶液15ml·kg^-1，剂量为3mg·kg^-1，下午灌胃脂肪乳剂15ml·kg^-1；乙醇提取物组：每天上午灌胃各提取物的2％吐温溶液，下午灌胃脂肪乳剂15ml·kg^-1；各剂量组：每天上午灌胃橙黄决明素的2％吐温溶液，下午灌胃脂肪乳剂15ml·kg^-1；连续10天。各组动物最后一次灌胃后，禁食不禁水12h后，眼眶取血，分离血清。COD-CE-PAP法测定血清总胆固醇(TC)，GPO-PAP法测定血清甘油三脂(TG)。采用SPSS11.0统计软件进行方差分析。

2.3实验结果

结果表明：(1)高脂血症模型组与生理盐水对照组比较，能显著升高TC(^##P＜0.01)，TG(^#P＜0.05)，说明本方法造模成功。(2)与高脂血症模型组相比较，橙黄决明素高、中、低剂量组及正丁醇提取物组、乙醇提取物组均能显著降低高脂血症小鼠的TC，橙黄决明素高剂量组及正丁醇提取物组均能显著降低高脂血症小鼠的和TG，其中均以高剂量组效果最好，效果较普伐他丁组弱。(见表3)

                       表3橙黄决明素对高脂血症大鼠血脂的影响( x±s)

组别	动物只数(只)	TC(mmol/L)	TC降低率(％)	TG(mmol/L)	TG降低率(％)
						生理盐水对照组高脂血症模型组阳性对照组乙醇提取物组正丁醇提取物组低剂量橙黄决明素组中剂量橙黄决明素组高剂量橙黄决明素组	1010101010101010	1.52±0.444.04±.37##2.26±.59**3.60±0.36*3.09±.28**3.55±0.41*3.43±0.64**3.03±0.27**	47.1910.8923.5112.1215.1025.10	1.53±0.282.00±0.38#1.58±0.32*1.85±0.511.60±0.31*1.88±0.471.74±0.511.59±0.24*	21.007.5020.006.0013.0020.5

注：^#P＜0.05，^##P＜0.01，与正常对照组相比较；^*P＜0.05，^**P＜0.01，与高脂血症模型组比较。TC降低率、TG降低率：与高脂血症组相比较。

试验例3橙黄决明素对高脂血症小鼠血脂的影响

3.1实验材料

实验动物

昆明种小鼠，20g，雌雄各半，一级，动物合格证号：川实动管字04-11，由成都中医药大学实验动物中心提供，检疫后备用。

实验药物与试剂

同1.2.1.2实验药物与试剂

3.3实验结果

                      决明子各提取物对高脂血症小鼠血脂的影响( x±s)

组别	动物数(只)	TC(mmol/L)	TC降低率(％)	TG(mmol/L)	TG降低率(％)
						生理盐水对照组高脂血症模型组阳性对照组乙醇提取物组正丁醇提取物组低剂量橙黄决明素组中剂量橙黄决明素组高剂量橙黄决明素组	1010101010101010	2.04±0.409.57±2.23##4.02±1.18**8.50±2.054.69±2.54*8.03±1.57*5.21±2.57*3.85±0.71**	--57.9911.1850.9942.4245.5659.77	0.61±0.151.46±0.42##0.99±0.49*1.15±0.390.77±1.40**0.96±0.47*0.78±0.15**0.62±0.16**	--31.9920.7546.6434.3246.4456.99

注：^#P＜0.05，^##P＜0.01，与生理盐水对照组相比较；^*P＜0.05，^**P＜0.01，与高脂血症模型组比较。TC降低率、TG降低率：与高脂血症模型组相比较。

结果表明：(1)高脂血症模型组与生理盐水对照组比较，能显著升高TC(P＜0.01)，TG(P＜0.01)，说明本方法造模成功。(2)与高脂血症模型组相比较，高、中、低剂量组及正丁醇提取物组均能显著降低高脂血症小鼠的TC和TG，其中又以高剂量组效果最好，效果优于普伐他丁组，而乙醇提取物组则能在一定程度上降低TC和TG，但与模型组相比，差异无显著性意义(P＞0.05)。因此橙黄决明素具有降血脂活性。(见表4)

总之，本发明提供的化合物尤其化合物II能增强荧光素酶活性，对低密度脂蛋白受体基因转录水平有增强作用，具有显著降血脂活性，为临床降血脂提供了一种新的选择。

Claims (8)

1、式I结构的化合物在制备治疗降血脂药物中的用途：

R₁为-H或-OCH₃；R₂为-H、-OH、-OCH₃、-COOH或-Oglu；R₃为-OH、或-Oglu。

2、根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述化合物R₁为-H或-OCH₃；R₂为-OH或-OCH₃；R₃为-OH、或-Oglu。

3、根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述化合物为橙黄决明素或其衍生物：

化合物II：R₁为-OCH₃，R₂为-OH，R₃为-OH；

化合物III：R₁为-OCH₃，R₂为-OCH₃，R₃为-Oglu；

化合物IV：R₁为-H，R₂为-H，R₃为-Oglu。

4、根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述化合物为化合物II：R₁为-OCH₃；R₂为-OH、R₃为-OH，即橙黄决明素。

5、根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述橙黄决明素及其衍生物是由以下方法制备得到：

a、取决明子粗粉石油醚除去脂溶性物质后用正丁醇提取；

b、将正丁醇提取物上AB-8大孔吸附树脂，水或乙醇溶液洗脱，洗脱物上硅胶柱；

c、用氯仿—甲醇梯度洗脱，分段收集：氯仿—甲醇体积9∶1、4∶1洗脱液，

d、氯仿—甲醇9∶1洗脱液经石油醚—丙酮梯度洗脱，分离得化合物I、化合物II；氯仿—甲醇4∶1洗脱液经甲醇—水梯度洗脱分离得化合物III、化合物IV。

6、一种用于降血脂的药物组合物，它是由式I结构的化合物为活性成分加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂，

R₁为-H或-OCH₃；R₂为-H、-OH、-OCH₃、-COOH或-Oglu；R₃为-OH、或-Oglu。

7、根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：所述化合物为橙黄决明素，每制剂单位含有橙黄明素4.5～5.5mg。

8、根据权利要求6、7所述的药物组合物，其特征在于：所述制剂是口服制剂、注射制剂。

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