CN101032571A - 一种中药组合物及其制备方法和质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中药组合物，尤其是一种以中药水蔓菁为原料而制成的中药组合物，该发明属中药领域。该中药组合物是将水蔓菁药材经水提醇沉后，又经碱沉、水沉、酸沉等精制步骤后制成所需的制剂，发明人优选为注射剂。该制剂具有清热解毒、止咳化痰、利尿之功效，可用于痈肿疮毒，肺痈，咳嗽气喘，久咳不止，热淋涩痛，小便不利等症，且基本无毒副作用。本发明为临床提供了一种纯度更高、安全性更强的药用物质。

Description

一种中药组合物及其制备方法和质量控制方法

技术领域

本发明涉及一种中药组合物，尤其是一种以中药材水蔓菁为原料药制成的中药组合物，属中药领域。

背景技术

中药水蔓菁，为玄参科植物水蔓菁Veronica linariifolia Pall.Ex Link subsp.dilatata(Nakai et Kitag.)Hong的干燥全草，又名蜈蚣草、斩龙剑、追风草、一支香、细叶婆婆纳。该药主要有效成分为甘露醇和黄酮甙。本品全草入药，味苦，性微寒，有清热解毒、利尿、止咳化痰的功能，具有清热解毒、利尿、止咳化痰之功效，主要用于治疗支气管炎、肺脓疡、急性肾炎、尿路感染、疖肿。曾有将该药水煎醇沉后用于肌肉注射，但该制备方法制得的产品纯度较低、杂质较多、每次给药量有限，且易产生刺激反应。临床需要一种纯度更高、安全性更强的药用物质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种中药组合物，可以治疗痈肿疮毒、肺痈、咳嗽气喘、久咳不止、热淋涩痛、小便不利等症；同时还提供该中药组合物的制备方法和质量控制方法。

本发明的目的是这样实现的。

该中药组合物是通过如下方法制备而得的：

a.取水蔓菁药材，加水煎煮，得水煎液；

b.水煎液浓缩后，加乙醇至含醇量达50～85％进行醇沉，滤过，得滤液；

c.将b中滤液用氢氧化钠溶液调节pH值至7.0～8.0进行碱沉，滤过沉淀，得滤液；

d.将c中滤液回收乙醇，水液继续加蒸馏水至当前生药浓度与最终产品的生药浓度相同，进行水沉，滤过沉淀，得滤液；

e.将d中滤液浓缩后再以盐酸溶液调节pH值至3～4进行酸沉，滤过沉淀，得滤液；

f.将e中滤液经调PH值、加活性炭煮沸后，制成注射剂或冻干粉针剂。

以上制备方法中，也可以细化某些具体参数，其产品的品质更佳，这些具体参数包括：

(1)步骤b中要经过两次醇沉，第一次加入乙醇至含醇量为60％，冷藏滤过，回收乙醇，第二次在水液中再加乙醇至含醇量为85％，冷藏滤过，取滤液。

(2)步骤b中第一次加乙醇前，水煎液应浓缩至每ml含生药1g；第二次加乙醇前，水液应加水至每ml含生药3g。

(3)步骤c中所用氢氧化钠溶液的配制方法为：先配制40％氢氧化钠水溶液，再加5倍量乙醇稀释，即得。

(4)步骤e中酸沉前应将水液浓缩至每ml含原生药2g。

(5)步骤f的具体过程为：将步骤e中滤液用氢氧化钠溶液调节pH值至6.5～7.0，冷藏，滤过，滤液加热煮沸，加0.1％活性炭，搅拌，保温30分钟，滤过，滤液加注射用水至所需总量，用氢氧化钠溶液调节pH值至6.8～7.0，加入0.1％亚硫酸氢钠，滤过，灌封，于100℃加热煮沸30分钟，即得注射剂。

相应的，制备以上产品的方法，也属本发明的保护范围，具体讲该方法包括如下步骤：

a.取水蔓菁药材，加水煎煮三次，第一次加10倍量水煎煮2小时，第二次家8倍量水煎煮1小时，第三次加8倍量水煎煮0.5小时，合并煎液；

b.将a中煎液浓缩至每1ml含原生药1g，放冷，加入乙醇至含醇量为60％，冷藏48小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水至每1ml含原生药3g，再加入乙醇至含醇量为85％，冷藏，滤过，得滤液；

c.将b中滤液用氢氧化钠溶液调节pH值至7.0～7.2，冷藏，滤过，得滤液；

d.将c中滤液回收乙醇至无醇味，加水至其生药浓度最终产品的生药浓度相同，冷藏，滤过，得滤液；

e.将d中滤液浓缩至每1ml含原生药2g，用盐酸溶液调节pH值至3.3～3.5，冷藏，滤过，得滤液；

f.将e中滤液用10％氢氧化钠溶液调节pH值至6.7，冷藏，滤过，滤液加热煮沸，加0.1％活性炭，搅拌，保温30分钟，滤过，滤液经中间体检查合格后再加注射用水至所需总量，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，加入0.1％亚硫酸氢钠，滤过，精滤，灌封，于100℃加热煮沸30分钟，即得注射液。

在上述步骤c中，其氢氧化钠溶液的配制方法为：先配制40％氢氧化钠水溶液，再加5倍量乙醇稀释而得。

由于本发明方法采用了水提醇沉、酸沉、碱沉等精制步骤，最大程度地保留了有效成分、去除了杂质成分，所得产品的成分组合已不同于现有产品。新产品不但可以用于肌肉注射，还可以用于静脉注射，大大方便了使用。

在研究本发明产品和方法的过程中，必须要有相应的方法来控制质量，因而发明人还建立了一套质量控制方法，应与本发明产品及方法属同一发明构思。该质量控制方法包含定性鉴别和含量测定两部分，下面分别叙述。

定性鉴别：

取注射液20ml，加盐酸2ml，加热回流30分钟，放冷，用乙酸乙酯40ml振摇提取，取乙酸乙酯液，用水洗涤3次，每次30ml，取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取水蔓菁对照药材1g，加水30ml，加热回流30分钟，取出，放冷，滤过，取滤液同法制成对照药材溶液；再取木犀草素对照品，加无水乙醇制成每1ml含0.1mg的对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以容积比为20∶2∶0.6的三氯甲烷-甲醇-甲酸混合液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，热风吹干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

含量测定，可以通过如下一种或二种方法实现：

a.紫外-可见分光光度法测定总黄酮

对照品溶液的制备取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品30mg，精密称定，置100ml量瓶中，加60％乙醇适量，温热使溶解，放冷，用60％乙醇稀释至刻度，摇匀，即得；

标准曲线的制备  精密量取对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，使混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在510nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；

测定法  精密量取本品2ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，使混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在510nm的波长处测定吸光度；从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量，计算，即得；

b.高效液相色谱法测定原儿茶酸

色谱条件与系统适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以容积比为13∶87的甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相；检测波长为260nm；理论板数按原儿茶酸峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备  取原儿茶酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml中含40μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备  精密吸取注射液5ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得；

测定方法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

将以上方法测定的结果与药品标准规定的限度相比较，即可作为药品是否合格的标准。

本发明产品具有清热解毒、止咳化痰、利尿之功效，可用于痈肿疮毒，肺痈，咳嗽气喘，久咳不止，热淋涩痛，小便不利等症，且基本无毒副作用。以下通过动物药效学和毒理学实验来证实其效果。

1实验材料

1.1药物与试剂：

水蔓菁注射液(SMQ，下同)，按本发明最优技术方案制得，棕褐色澄明液体，由浙江省药品分析研究所生产提供，规格：10ml/支，每ml含生药0.5g，批号：20050301。拟用法用量：静脉滴注，一次10-20ml，一日2次。

鱼腥草注射液，无色澄明液体，正大青春宝药业有限公司产品，规格：50ml/瓶，批号：0410268。用法用量：静脉滴注，一次20-100ml。

注射用双黄连，黄棕色冻干粉，哈药集团中药二厂产品，规格：600mg/瓶，批号：0501006。用法用量：静脉滴注，每次每kg体重60mg，一日1次。

阿司匹林，上海九福药业有限公司产品，批号：20040810。

戊巴比妥钠，中国医药(集团)上海化学试剂公司进口分装，批号：F20020913。

氨水，杭州长征化工厂产品，批号：20040210。

苯酚红，上海三爱思试剂有限公司产品，批号：20020906。

酵母，中澳合资梅山-马利酵母有限公司产品，批号：083E。

巴豆油合剂，配方为巴豆油∶无水乙醇∶蒸馏水∶乙醚＝0.2∶2∶0.5∶7.3，临用新配。

伊文思蓝，中国医药(集团)上海化学试剂公司进口分装，批号：F20020913。

大肠杆菌内毒素(标准品)，由中国药品生物制品检定所提供，批号：2002-7。

1.2菌种及培养基：

菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、链球菌、肺炎球菌、肺炎克雷伯菌和淋球菌各10株临床分菌株，由杭州市中医院检验从病人中分离鉴定。质控菌株大肠埃氏菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853，由本实验室保存。

培养基：MH琼脂培养基、MH肉汤培养基、淋病奈瑟氏菌琼脂培养基，均由杭州天和微生物试剂有限公司生产，绵羊血40ml/瓶，由金华市大康试剂经营部提供。

1.3动物及饲养环境：

ICR小鼠，SD大鼠，雌雄兼用，均由浙江省实验动物中心提供，合格证：SCXK(浙)2003-0001号，饲养于本院动物房(清洁级)，温度18-24℃，相对湿度60-80％，全价颗粒饲料来源于浙江省实验动物中心；新西兰家兔，由浙江中医学院实验动物中心提供，合格证：SYHK(浙)2003-0003号，饲养于普通级环境，温控18-24℃，饲料来源于浙江省实验动物中心。

1.4仪器：

ZRY-2智能热原仪，天津大学精密仪器厂产品。

AEL-200电子天平，日本SHIMADZU公司产品。

721可见分光光度计，上海分析仪器厂产品。

1.5统计方法：

所有计量数据均表示为mean±SD，检验方法为t检验，计数数据采用X²检验。

2方法与结果

2.1清热作用

2.1.1对大肠杆菌内毒素致热家兔的解热作用

健康新西兰家兔，雌雄兼用，体重1.8-2.4kg，试验前1天用ZRY-2智能热原仪进行预选，选择体温在38.0-39.0℃之间，3小时内体温变化＜0.3℃者40只用于实验。试验当天，上述家兔在20℃室温环境下稳定2小时，间隔30min预测两次肛温，取平均值为给药前体温，然后静脉注射50EU/ml/kg的大肠杆菌内毒素，注射后每半小时记录体温1次，1小时后按升温值搭配分成5组，分别为对照组、鱼腥草注射液阳性组、SMQ原剂型肌注对照组、SMQ注射液低、中、高剂量组，每组8只，按表1所示剂量静脉、肌肉注射给予相应药物，给药体积静脉注射均为8ml/kg，肌肉注射均为2ml/kg，对照组给予等体积生理盐水，给药后再继续每隔半小时记录体温1次，连续5小时。以各时段的升温值、最大升温值为指标比较各组对内毒素所致发热家兔体温的影响，结果见表2-3。

表1  SMQ注射液内毒素法家兔清热试验的给药方法

组别	药物及给药方法(给内毒素后1小时注射)
			静脉注射(8ml/kg)	肌肉注射(2ml/kg)
	对照组	生理盐水			生理盐水
阳性组			鱼腥草注射液	生理盐水
	SMQ高剂量组	SMQ注射液			生理盐水
SMQ中剂量组			SMQ注射液二倍稀释	生理盐水
	SMQ低剂量组	SMQ注射液四倍稀释			生理盐水

表2  SMQ注射液对内毒素所致家兔体温升高的影响( X±SD)

组别	剂量	0时体温	注射内毒素后不同时间体温升高值(℃)
						℃	1h	1.5h	2.0h
		对照	--	38.41±0.26	0.72±0.31					1.03±0.49	0.99±0.32
鱼腥草注射液	8ml/kg，iv					38.50±0.32	0.66±0.24	0.82±0.35	1.00±0.43
		SMQ注射液	4g/kg，iv	38.54±0.15	0.75±0.25					0.79±0.30	0.95±0.41
SMQ注射液	2g/kg，iv					38.51±0.37	0.68±0.31	0.73±0.52	0.87±0.58
		SMQ注射液	1g/kg，iv	38.44±0.49	0.71±0.24					0.82±0.37	0.90±0.45

续上表

组别	注射内毒素后不同时间体温升高值(℃)
					3h	4h	5h	6h
	对照	0.73±0.41	0.65±0.35	0.43±0.29					0.28±0.22
鱼腥草注射液					0.70±0.34	0.50±0.29	0.31±0.30	0.21±0.32
	SMQ注射液	0.57±0.31	0.41±0.28	0.24±0.24					0.06±0.16
SMQ注射液					0.63±0.43	0.38±0.33	0.29±0.30	0.18±0.24
	SMQ注射液	0.58±0.58	0.37±0.48	0.29±0.31					0.19±0.26

注：n＝8

表3  SMQ注射液对内毒素所致发热家兔最大升温值的影响( X±SD)

组别	剂量	最大升温值(℃)
			对照	--	1.46±0.39
鱼腥草注射液	8ml/kg，iv	1.25±0.40
			SMQ肌注	1g/kg，im	1.23±0.24
SMQ注射液	4g/kg，iv	1.17±0.27
			SMQ注射液	2g/kg，iv	1.22±0.37
SMQ注射液	1g/kg，iv	1.27±0.45

注：n＝8

由表2、3结果可见，水蔓菁注射液各剂量组对内毒素所致家兔发热有一定的抑制作用，表现在使用药后各时段家兔升温值有所下降，并使最大升温值也有所下降。

2.1.2对酵母致热大鼠的解热作用

选择体温正常的雄性SD大鼠60只，体重180-220g，随机分为6组，每组10只，分别为对照组、阿司匹林阳性组(剂量0.1g/kg)、鱼腥草注射液阳性对照组(剂量10ml/kg)、SMQ高、中、低剂量组(剂量分别为5、2.5、1.25g/kg)，阿司匹林采用灌胃给药，其余均静脉注射给药，中、低剂量组用生理盐水稀释2倍、4倍后使用，静脉给药体积均为10ml/kg，对照组给予等容积生理盐水，给药后立即于大鼠背部皮下注射20％酵母生理盐水混悬液10ml/kg致热，测定致热前(三次，取平均值为正常体温)及致热后2、4、6、8、24h的体温，以各时段的升温值以及最大升温值为指标比较各组酵母致热大鼠体温的影响，结果见表4。

表4  SMQ注射液对酵母所致大鼠体温升高的影响( X±SD)

组别	剂量	0时体温	注射酵母后不同时间体温升高值(℃)
						(℃)	2h	4h	6h
		对照	--	37.49±0.20	0.85±0.34					1.48±0.34	2.57±0.20
阿司匹林	0.1g/kg，ig					37.67±0.37	-0.18±0.65*	0.59±0.51*	0.58±0.78*
		鱼腥草注射液	10ml/kg，iv	37.57±0.21	0.82±0.33					1.19±0.41	1.97±0.43*
SMQ注射液	5g/kg，iv					37.58±0.23	0.23±0.42*	1.03±0.32*	1.72±0.63*
		SMQ注射液	2.5g/kg，iv	37.50±0.28	0.40±0.23*					1.06±0.28*	2.01±0.53*
SMQ注射液	1.25/kg，iv					37.53±0.52	0.39±0.47*	1.23±0.37	1.95±0.30*

续上表

组别	注射酵母后不同时间体温升高值(℃)		最大升温值(℃)
				8h	24h
	对照	2.64±0.17				1.28±0.40	2.72±0.15
阿司匹林			1.02±0.65*	1.39±0.55	1.49±0.67*
	鱼腥草注射液	2.59±0.33				1.31±0.42	2.61±0.29
SMQ注射液			2.41±0.17*	1.10±0.34	2.41±0.17*
	SMQ注射液	2.44±0.37				1.32±0.61	2.52±0.33
SMQ注射液			2.34±0.39	1.22±0.41	2.40±0.31*

注：n＝10

由表4结果可见，水蔓菁注射液各剂量组对酵母所致大鼠发热有一定的解热作用，其中高剂量组用药后2-8h内各时段升温值以及最大升温值与对照组相比明显降低，有统计学差异(p＜0.05)，中剂量组用药后2-6h内各时段升温值与对照组相比明显降低(p＜0.05)。

2.2利尿作用

2.2.1对家兔导尿管法尿量的影响⁽¹⁾

健康新西兰家兔，体重1.8-2.4Kg，试验前禁食不禁水24小时，随机分5组，每组6只。用戊巴比妥钠麻醉后背位固定，由尿道插入导尿管至膀胱，轻压下腹部排空膀胱，各组按表1所示剂量静脉、肌肉注射给予相应药物，给药体积静脉注射均为8ml/kg，肌肉注射均为2ml/kg，对照组给予等体积生理盐水，给药后收集每30min尿量，共4次，以各时段尿量以及总尿量为指标比较各组药物对家兔尿量的影响。结果见表5。

表5  SMQ注射液对家兔导尿管法尿量的影响( X±SD)

组别	剂量	给药后不同时间尿量(ml)				总尿量(ml)
							0-30min	30-60min	60-90min	90-120min	2h
		对照	--	4.9±4.0	1.9±0.9	2.7±2.7						3.9±5.6	13.9±9.7
鱼腥草注射液	8ml/kg，iv						6.5±9.1	7.0±4.7*	6.0±6.8	3.1±2.9	22.6±19.5
		SMQ注射液	4g/kg，iv	11.3±8.5	11.8±7.3*	13.5±8.7*						10.4±1.8*	47.0±21.7*
SMQ注射液	2g/kg，iv						13.8±0.4*	11.0±3.5*	7.9±4.7*	8.6±6.3	41.3±7.7*
		SMQ注射液	1g/kg，iv	4.6±3.4	5.7±1.6*	4.0±1.8						10.5±7.3*	24.9±7.3*

注：n＝6，*p＜0.05(与对照组比较)

由表5结果可见，水蔓菁注射液各剂量不同程度地增加给药后各时段家兔尿量以及总尿量，并且有明显的量效关系。

2.2.2对大鼠代谢笼法尿量的影响⁽¹⁾

雄性SD大鼠50只，体重180-220g，随机分为5组，每组10只，分别为正常对照组、鱼腥草注射液10ml/kg组，SMQ 5、2.5、1.25g/kg剂量组，中、低剂量组用生理盐水稀释2倍、4倍后使用，静脉给药体积均为10ml/kg，对照组给予等容积生理盐水，给药后立即轻压大鼠下腹部排空膀胱，将大鼠单个置于代谢笼中收集6h尿液，以各时段的尿量以及总尿量为指标比较各组药物对大鼠尿量的影响，结果见表6。

表6  SMQ注射液对代谢笼法大鼠尿量的影响( X±SD)

组别	剂量	给药后不同时间尿量(ml)			总尿量(ml)
						0-2h	2-4h	4-6h	0-6h
		对照	--	1.7±1.1	0.7±0.8					0.5±0.5	2.8±1.0
鱼腥草注射液	10ml/kg					2.3±1.4	1.2±0.7	1.4±1.1	4.9±1.8*
		SMQ注射液	5g/kg	2.0±1.5	1.8±1.0*					1.3±0.9*	5.0±2.1*
SMQ注射液	2.5g/kg					1.2±1.0	1.1±0.5	1.7±1.1*	4.0±1.1*
		SMQ注射液	1.25g/kg	0.8±1.0	1.1±0.8					1.2±0.7*	3.1±1.4

注：n＝10，*p＜0.05(与对照组比较)

由表6结果可见，水蔓菁注射液各剂量给药后前2h尿量增加不明显，中、低剂量甚至有减少，但给药2h后各时段大鼠尿量均有不同程度的增加，总尿量也明显增加，量效关系明确，其中高剂量给药2h后各时段尿量以及总尿量与对照组相比均有显著性差异(p＜0.05)，中剂量给药后4-6h尿量以及总尿量与对照组相比有显著性差异(p＜0.05)，低剂量仅在给药后4-6h尿量与对照组相比有显著性差异(p＜0.05)。

2.3止咳作用-对氨水引咳小鼠的影响

雄性ICR小鼠50只，体重18-22g，随机分组，按表7所示，分别静脉注射给予SMQ注射液高、中、低剂量(分别为10g/kg、5g/kg、2.5g/kg)，给药容积均为20ml/kg，中、低剂量分别用生理盐水稀释2倍、4倍使用，阳性对照组静脉注射鱼腥草注射液20ml/kg，对照组注射等容积生理盐水，给药后15min，将小鼠单个置于倒扣的500ml烧杯中，迅速放入含0.1ml浓氨水的棉球，观察小鼠咳嗽反应，记录首次咳嗽时间以及2min内的咳嗽次数。以咳嗽潜伏期(浓氨水棉球放入时间至首次咳嗽时间)以及咳嗽次数为指标比较各组差异，结果见表7。

表7  SMQ注射液对氨水引咳小鼠的影响( X±SD)

组别	剂量	动物数(只)	咳嗽潜伏期(sec)	咳嗽次数(次/2min)
					对照	--	10	17.2±5.0	40±15
鱼腥草注射液	20ml/kg	10	24.2±7.1*	32±14
					SMQ注射液	10g/kg	10	24.0±10.3	30±10
SMQ注射液	5g/kg	10	19.2±6.4	32±19
					SMQ注射液	2.5g/kg	10	17.6±10.6	39±15

注：*p＜0.05(与对照组比较)

由表7结果可见，SMQ各剂量组对氨水引咳小鼠的咳嗽潜伏期有延长趋势，对2min内的咳嗽次数有减少的趋势。

2.4祛痰作用

2.4.1对小鼠气管酚红排泌量的影响(2)

雌性ICR小鼠50只，体重18-22g，随机分组，实验前禁食约20h，按表8所示，分别静脉注射给予SMQ注射液高、中、低剂量(分别为10g/kg、5g/kg、2.5g/kg)，给药容积均为20ml/kg，中、低剂量分别用生理盐水稀释2倍、4倍使用，阳性对照组静脉注射鱼腥草注射液20ml/kg，对照组注射等容积生理盐水，给药后30min，腹腔注射0.25％的酚红生理盐水溶液0.7ml/鼠，30min后处死小鼠，仰位固定于手术板上，剪开颈中皮肤，分离气管，于喉头下插入插管，用丝线结扎固定，用5％的NaHCO₃冲洗，共洗涤3次。每次0.5ml，合并3次洗涤液，加50％乙醇溶液5ml，3000rpm离心10min，取上清液在546nm比色测定光密度。结果见表8。

表8  SMQ注射液对小鼠气管酚红排泄的影响( X±SD)

组别	剂量	动物数(只)	酚红排泄OD值
				对照	--	10	0.028±0.014
鱼腥草注射液	20ml/kg	10	0.052±0.008*
				SMQ注射液	10g/kg	10	0.048±0.006*
SMQ注射液	5g/kg	10	0.045±0.018*
				SMQ注射液	2.5g/kg	10	0.038±0.013

注：*p＜0.05(与对照组比较)

由表8结果可见，SMQ各剂量组使小鼠气管酚红排泄OD值有不同程度的提高，其中高、中剂量组与对照组相比有显著性差异(p＜0.05)，而且有明显的剂量关系，表明SMQ有一定的祛痰作用。

2.4.2对大鼠毛细管法排痰量的影响⁽³⁾

雄性SD大鼠50只，体重180-220g，实验前禁食不禁水12h，以戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉，仰位固定，剪开颈中部皮肤，暴露气管，在甲状腺软骨下缘正中两软骨环之间，先用注射针头扎一小孔，插入玻璃毛细管一根，使其刚好接触气管后壁表面以吸取痰液，当毛细玻管内充满痰液后立即更换，以毛细管内液柱长度作为排痰量指标，记录给药前2h的正常分泌量，然后按表9所示随机分为5组，分别静脉注射给予SMQ注射液高、中、低剂量(分别为5g/kg、2.5g/kg、1.25g/kg)，给药容积均为10ml/kg，中、低剂量分别用生理盐水稀释2倍、4倍使用，阳性对照组静脉注射鱼腥草注射液10ml/kg，对照组注射等容积生理盐水，给药后记录4h的分泌量，并均计算成每h的分泌量，结果见表9。

表9  SMQ注射液对大鼠毛细管法排痰量的影响( X±SD)

组别	剂量	动物数(只)	排痰量(cm/h)
					给药前	给药后
			对照	--			10	1.42±0.41	1.68±0.72
鱼腥草注射液	10ml/kg	10			1.54±0.56	2.25±0.74
			SMQ注射液	5g/kg			10	1.34±0.31	2.04±0.53
SMQ注射液	2.5g/kg	10			1.47±0.45	1.95±0.70
			SMQ注射液	1.25g/kg			10	1.44±0.42	1.83±0.55

由表9结果可见，SMQ各剂量组用药后使大鼠毛细管法排痰量有所提高，且有一定的剂量关系趋势，但与对照组相比均无显著性差异，表明SMQ在该模型上的祛痰作用较弱。

2.5抗炎作用

2.5.1对巴豆油所致小鼠耳肿胀的影响

雄性ICR小鼠50只，体重25-30g，随机分为5组，每组10只；分别静脉注射给予SMQ注射液高、中、低剂量(分别为10g/kg、5g/kg、2.5g/kg)，给药容积均为20ml/kg，中、小剂量分别用生理盐水稀释2倍、4倍使用，阳性对照组静脉注射鱼腥草注射液20ml/kg，对照组注射等容积生理盐水，给药后立即在小鼠左耳涂以巴豆油合剂0.05ml/只致炎，右耳作对照；4h后脱颈臼处死，沿耳廓基线剪下双耳，用6mm角膜环钻在左右耳相同位置冲下耳片，在电子分析天平上称重(精确到0.1mg)，左耳重量减去右耳重量之差值(单位：mg)即为肿胀度，计算各组平均肿胀度并求出肿胀抑制率(％)，结果见表10。

肿胀抑制率＝(对照组平均肿胀度-用药组平均肿胀度)/对照组平均肿胀度×100％。

表10  SMQ对巴豆油所致小鼠耳肿胀的影响(X±SD)

组别	剂量	动物数(只)	肿胀度(mg)	抑制率(％)
					对照	--	10	26.7±3.5	--
鱼腥草注射液	20ml/kg	10	21.2±5.8*	20.6
					SMQ大剂量	10g/kg	10	20.8±3.7*	22.1
SMQ中剂量	5g/kg	10	20.4±3.6*	23.6
					SMQ小剂量	2.5g/kg	10	22.6±4.5	15.4

注：*p＜0.05(与对照组比较)

表10结果显示SMQ注射液中、高剂量使巴豆油所致小鼠耳廓肿胀明显减轻，肿胀度与对照组相比有显著性差异(p＜0.05)，提示有一定的抗炎作用。

2.5.2对蛋清所致大鼠足趾肿胀的影响

SD大鼠50只，雄性，体重170-210g，按体重平均分成5组，每组10只，分别为正常对照组、鱼腥草注射液10ml/kg组，SMQ 10、5、2.5ml/kg剂量组，中、低剂量组用生理盐水稀释2倍、4倍后等容积静脉注射给药，对照组给予等容积生理盐水，用自制测量尺测定左后足背周长；第2天给药后立即在大鼠左后足趾腱膜下注射75％新鲜鸡蛋清生理盐水溶液100ul/足致炎，致炎后4小时再给药1次，对照组给予10ml/kg的蒸馏水。测量致炎后1、3、5和7小时致炎足足背周长，按下列公式计算各时段的肿胀度。结果见表11。

肿胀度＝(致炎后周长-致炎前周长)/致炎前周长×100％

表11  SMQ注射液对蛋清致大鼠足趾肿胀的影响( X±SD)

组别	剂量	致炎前周长	致炎后不同时间的肿胀度(％)
							(mm)	1h	3h	5h	7h
		对照	--	21.6±0.9	46.4±3.4	45.2±5.2						43.1±3.8	34.8±4.2
鱼腥草注射液	10ml/kg						21.8±0.5	42.1±6.0	43.2±3.7	34.3±6.5*	23.4±8.7*
		SMQ大剂量	5g/kg	21.4±0.5	33.9±8.2*	28.0±5.7*						27.5±5.9*	13.3±4.7*
SMQ中剂量	2.5g/kg						21.4±0.9	36.3±5.8*	35.1±4.1*	26.9±5.0*	16.0±5.8*
		SMQ小剂量	1.25g/kg	21.5±0.7	40.3±6.0*	38.9±6.3*						36.4±9.0*	27.0±5.4*

注：n＝10，*：p＜0.05(与对照组比较)。

表11结果显示，SMQ 5、2.5、1.25g/kg剂量静脉注射均明显抑制蛋清所致大鼠足趾肿胀，致炎后1-7h肿胀度与对照组相比均有显著性差异(p＜0.05)，并且存在一定的剂量关系。

3结论

本试验结果证实，SMQ注射液静脉注射给药具有一定的清热、利尿、止咳、化痰和抗炎作用，该结果可为水蔓菁注射液临床应用于肺痈，咳嗽气喘，久咳不止，热淋涩痛，小便不利等疾病提供部分实验依据。

毒理研究综述

(一)、急性毒性试验

ICR小鼠一日内3次静脉注射水蔓菁注射液共120ml/kg，剂量相当于60g(生药)/kg，除每次给药后小鼠出现短暂的静伏、少动、闭眼等现象外，其余未见明显毒性反应，14天内无小鼠死亡，该剂量相当于拟用静脉给药临床日用剂量的180倍。

(二)、长期毒性试验

1、大鼠长期毒性试验

(1)试验方法：

SD大鼠80只，雌雄各半，体重90～110克。按体重分成4组，分别为生理盐水对照组、水蔓菁注射液5、10、20g/kg组，每组20只，雌雄各半，每笼5只饲养于不锈钢笼具中，经常规饲养1周后，采取不同浓度等容积尾静脉注射给药，每天上、下午各给药1次，每次2ml/100g体重，对照组注射等容积的生理盐水，连续1个月(5周)。在给药1个月后，每组雌雄各取7只大鼠检测相关指标；剩余大鼠在停药2周后检测相关指标。

(2)试验结果

<1>对大鼠一般状态的影响：

试验初期，大鼠给予水蔓菁注射液后均出现抓耳、四肢、耳部红肿等现象，约半小时后恢复，3天后症状有所减轻，中、低剂量组仅出现抓耳，未见四肢、耳部红肿现象，10天后仅高剂量组给药后出现抓耳现象，中、低剂量组给药后已无明显异常；其余一般状态如运动、呼吸、眼、鼻、粪、尿等试验期间均未见异常现象。

<2>对大鼠血常规和凝血时间的影响：

给药1个月，水蔓菁各剂量组淋巴细胞(LYM)比例增加、中性粒细胞(MID)及单核细胞(GM)比例减少，停药2周，水蔓菁各剂量组淋巴细胞(LYM)比例增加、中性粒细胞(MID)比例减少，上述变化虽然大多与对照组相比有统计学差异(p＜0.05)，但变化幅度较小，且未见与剂量相关，仍属于正常范围波动。其余仍存在一些散在变化，如用药1个月高剂量组PLT下降，中剂量组HGB升高、RET比例下降，但变化幅度大多较小，未见与药物剂量的明显相关性，其余血常规指标以及凝血时间等均未见明显改变

<3>血液生化指标：用药1个月时高剂量组CREA、ALB、低剂量组ALT、TBI略下降，停药2周时高剂量组TC、中剂量组AST、低剂量组TC略有升高，上述变化幅度大多较小，无明显的病理意义，且没有剂量关系，应与药物无关；其余血液生化指标未见明显改变。

<4>对大鼠脏器系数的影响

大鼠巨检和镜检结果表明，用药组个别大鼠出现肝脏、肾脏、前列腺及子宫等脏器组织病变，但由于上述病变仅见于个别大鼠，发生率低，病变程度均极轻微，且在各组、用药或恢复期均有发生，与用药与否及剂量无关，因此，可以认为这些病变系动物自身病变，与药物无关。

<5>结论：

水蔓菁注射液5、10、20g(生药)/kg剂量给大鼠连续静脉注射1个月(5周)，高剂量组试验初期使大鼠出现给药后短暂抓耳、四肢、耳部红肿等现象，中后期对大鼠体重增长略有抑制，使淋巴细胞比例增加、中性粒细胞及单核细胞比例减少，并使雌雄大鼠脾脏系数增加，雄鼠睾丸、附睾系数增加，雌鼠肝脏系数增加，中、低剂量对大鼠一般状况、血常规、凝血时间、血液生化、脏器系数和组织病理学等方面影响较小，未见与药物相关的明显的毒性反应。提示水蔓菁注射液的安全剂量为10g(生药)/kg。

(三)、过敏性、溶血性和局部刺激性试验

1、水蔓菁注射液按0.5ml/只给豚鼠腹腔注射致敏，隔日1次，共3次，首次注射后第14天和第21天，按2ml/只静脉注射攻击，结果过敏反应均呈阴性；

2、水蔓菁注射液原液作为高浓度供试液，稀释10倍、100倍作为中、低浓度供试液，分别与2％兔红细胞生理盐水混悬液温浴，结果各浓度供试液均不产生溶血反应，也不使兔红细胞发生凝聚。

以上说明水蔓菁注射液具有良好的临床疗效，且无明显地毒副作用，是临床上用于治疗解热、咳嗽气喘，久咳不止，热淋涩痛，小便不利，痈肿疮毒，肺痈等的一个较为满意的一个新的中成药。

具体实施方式

以下以实施例来具体说明本发明的技术方案，但本专利所要保护的内容并不局限于实施例所述内容。本发明技术方案所用技术术语及符号，如在本申请文件中有解释，则以该解释为准；如没有，则以中国药典相关解释为准。

实施例1：注射液的制备

取水蔓菁药材500g，切成小段，加水煎煮三次，第一次加10倍量水煎煮2小时，第二次加10倍量水煎煮1小时，第三次加8倍量水煎煮0.5小时，合并煎液，浓缩至每1ml含原生药1g，放冷，逐渐搅拌加入乙醇至含醇量为70％，冷藏24小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水至每1ml含原生药3g，逐渐搅拌加入乙醇至含醇量为85％，冷藏48小时，滤过，滤液用氢氧化钠溶液调节pH值至7.0～7.2(pH计测定)，冷藏24小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加入蒸馏水至每1ml含原生药0.5g，冷藏24小时，滤过，滤液浓缩至每1ml含原生药2g，用盐酸溶液(1→2)调节pH值至3.3～3.5，冷藏48小时，滤过，滤液用10％氢氧化钠水溶液调节pH值至6.7，冷藏24小时，滤过，滤液加热煮沸，加0.1％活性炭，搅拌，保温30分钟，滤过，滤液经中间体检查合格后再加注射用水至1000ml，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，加入0.1％亚硫酸氢钠，滤过，精滤，灌封，于100℃加热煮沸30分钟，即得。

实施例2：注射液的质量检验

取实施例1所制注射液，按如下项目进行检验：

【性状】本品为黄棕色至棕色的澄明液体。

【鉴别】取本品20ml，加盐酸2ml，加热回流30分钟，放冷，用乙酸乙酯40ml振摇提取，取乙酸乙酯液，用水洗涤3次，每次30ml，取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取水蔓菁对照药材1g，加水30ml，加热回流30分钟，取出，放冷，滤过，取滤液同法制成对照药材溶液。再取木犀草素对照品，加无水乙醇制成每1ml含0.1mg的对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(20∶2∶0.6)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，热风吹干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

【检查】pH值应为6.0～7.0。

蛋白质  取本品1ml，加新配制的30％磺基水杨酸试液1ml，混匀，放置5分钟，未出现浑浊。

鞣质  取本品1ml，加新配制的含1％鸡蛋清的生理氯化钠溶液5ml，放置10分钟，未出现浑浊或沉淀。

树脂  取本品5ml，加盐酸1滴，放置30分钟，未出现沉淀。

草酸盐  取本品，依中国药典检验，符合规定。

钾离子  取本品，依中国药典检验，符合规定。

总固体  精密量取本品10ml，置已恒重的蒸发皿中，蒸干，在105℃干燥3小时，移置干燥器中，冷却30分钟，迅速精密称定重量，计算。1ml遗留残渣不少于18mg。

热原  取本品，依中国药典检查，剂量按家兔体重每1kg注射10ml，符合规定。

异常毒性  取本品，依中国药典检验，按静脉注射给药，符合规定。

降压物质  取本品，依中国药典检验，剂量按每1kg 0.1ml给药，符合规定。

【含量测定】总黄酮  对照品溶液的制备  取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品30mg，精密称定，置100ml量瓶中，加60％乙醇适量，温热使溶解，放冷，用60％乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

标准曲线的制备  精密量取对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，使混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在510nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。

测定法  精密量取本品2ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6ml……”起依法测定吸光度。从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量，计算，即得。

本品每1ml含总黄酮以无水芦丁(C₂₇H₃₀O₁₆)计，不少于4.5mg。

原儿茶酸  照高效液相色谱法测定。

色谱条件与系统适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1％磷酸溶液(13∶87)为流动相；检测波长为260nm。理论板数按原儿茶酸峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备  取原儿茶酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml中含40μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备  精密吸取本品5ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

测定方法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每1ml含原儿茶酸(C₇H₆O₄)不少于0.22mg。

综上，本发明产品符合规定，产品合格。

Claims (11)

1、一种中药组合物，其特征在于该中药组合物是按如下方法制备而得的：

a.取水蔓菁药材，加水煎煮，得水煎液；

b.水煎液浓缩后，加乙醇至含醇量达50～85％进行醇沉，滤过，得滤液；

c.将b中滤液用氢氧化钠溶液调节pH值至7.0～8.0进行碱沉，滤过沉淀，得滤液；

d.将c中滤液回收乙醇，水液继续加蒸馏水至当前生药浓度与最终产品的生药浓度相同，进行水沉，滤过沉淀，得滤液；

e.将d中滤液浓缩后再以盐酸溶液调节pH值至3～4进行酸沉，滤过沉淀，得滤液；

f.将e中滤液经调PH值、加活性炭煮沸后，制成注射剂或冻干粉针剂。

2、如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于步骤a中水蔓菁药材要经过三次水煎煮，每次加水8～10倍量，煎煮时间分别为2小时、1小时和0.5小时。

3、如权利要求2所述的中药组合物，其特征在于步骤b中要经过两次醇沉，第一次加入乙醇至含醇量为60％，冷藏滤过，回收乙醇，第二次在水液中再加乙醇至含醇量为85％，冷藏滤过，取滤液。

4、如权利要求3所述的中药组合物，其特征在于步骤b中第一次加乙醇前，水煎液应浓缩至每ml含生药1g；第二次加乙醇前，水液应加水至每ml含生药3g。

5、如权利要求4所述的中药组合物，其特征在于步骤c中所用氢氧化钠溶液的配制方法为：先配制40％氢氧化钠水溶液，再加5倍量乙醇稀释，即得。

6、如权利要求5所述的中药组合物，其特征在于步骤e中酸沉前应将水液浓缩至每ml含原生药2g。

7、如权利要求1至6中任一所述的中药组合物，其特征在于步骤f为：将e中滤液用氢氧化钠溶液调节pH值至6.5～7.0，冷藏，滤过，滤液加热煮沸，加0.1％活性炭，搅拌，保温30分钟，滤过，滤液加注射用水至所需总量，用氢氧化钠溶液调节pH值至6.8～7.0，加入0.1％亚硫酸氢钠，滤过，灌封，于100℃加热煮沸30分钟，即得注射剂。

8、如权利要求7所述的中药组合物的制备方法，其特征在于该方法含有如下步骤：

a.取水蔓菁药材，加水煎煮三次，第一次加10倍量水煎煮2小时，第二次家8倍量水煎煮1小时，第三次加8倍量水煎煮0.5小时，合并煎液；

b.将a中煎液浓缩至每1ml含原生药1g，放冷，加入乙醇至含醇量为60％，冷藏48小时，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，加水至每1ml含原生药3g，再加入乙醇至含醇量为85％，冷藏，滤过，得滤液；

c.将b中滤液用氢氧化钠溶液调节pH值至7.0～7.2，冷藏，滤过，得滤液；

d.将c中滤液回收乙醇至无醇味，加水至其生药浓度最终产品的生药浓度相同，冷藏，滤过，得滤液；

e.将d中滤液浓缩至每1ml含原生药2g，用盐酸溶液调节pH值至3.3～3.5，冷藏，滤过，得滤液；

f.将e中滤液用10％氢氧化钠溶液调节pH值至6.7，冷藏，滤过，滤液加热煮沸，加0.1％活性炭，搅拌，保温30分钟，滤过，滤液经中间体检查合格后再加注射用水至所需总量，用10％氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，加入0.1％亚硫酸氢钠，滤过，精滤，灌封，于100℃加热煮沸30分钟，即得。

9、如权利要求8所述的中药组合物的制备方法，其特征在于步骤c中所用氢氧化钠溶液的配制方法为：先配制40％氢氧化钠水溶液，再加5倍量乙醇稀释，即得。

10、如权利要求7所述中药组合物的质量控制方法，该方法包含定性鉴别和含量测定两部分，其特征在于定性鉴别方法为：取注射液20ml，加盐酸2ml，加热回流30分钟，放冷，用乙酸乙酯40ml振摇提取，取乙酸乙酯液，用水洗涤3次，每次30ml，取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加无水乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取水蔓菁对照药材1g，加水30ml，加热回流30分钟，取出，放冷，滤过，取滤液同法制成对照药材溶液；再取木犀草素对照品，加无水乙醇制成每1ml含0.1mg的对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以容积比为20∶2∶0.6的三氯甲烷一甲醇-甲酸混合液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，热风吹干，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。11、如权利要求10所述的中药组合物的质量控制方法，其特征在于其中的含量测定方法可以是如下的任一种或二种：

a.紫外-可见分光光度法测定总黄酮

对照品溶液的制备  取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品30mg，精密称定，置100ml量瓶中，加60％乙醇适量，温热使溶解，放冷，用60％乙醇稀释至刻度，摇匀，即得；

标准曲线的制备  精密量取对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5m1、6ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，使混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在510nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；

测定法  精密量取本品2ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，使混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在510nm的波长处测定吸光度；从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量，计算，即得；

b.高效液相色谱法测定原儿茶酸

色谱条件与系统适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以容积比为13∶87的甲醇-0.1％磷酸溶液为流动相；检测波长为260nm；理论板数按原儿茶酸峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备  取原儿茶酸对照品适量，精密称定，加水制成每1ml中含40g的溶液，即得；

供试品溶液的制备  精密吸取注射液5ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得；

测定方法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

12、水蔓菁药材在制备用于治疗痈肿疮毒、肺痈、咳嗽气喘、久咳不止、热淋涩痛、小便不利等症的药物中的应用。