发明内容
本发明的一个目的在于公开一种半枝莲总黄酮的制备方法;本发明目的还在于公开一种半枝莲总黄酮的质量控制方法;本发明的第三个目的在于公开一种半枝莲总黄酮的制药新用途。
半枝莲总黄酮的制备方法为:
取半枝莲粗粉,加6-10倍沸水煮1-3小时,过滤,药渣用6-8倍水煮提1-2小时,过滤,合并两次滤液,浓缩至3倍药材量,离心,取上清液加盐酸调pH2~6,离心,取上清液将同样药材量的大孔树脂,预处理,装柱,将上述提取液过柱吸附,树脂与生药重量比为1∶2-8,水洗再以85%以上乙醇洗脱,洗脱溶剂的体积为树脂重量的4-8倍,回收乙醇、干燥,即得半枝莲总黄酮;加3-5倍水稀释,10%氢氧化钠调PH值8-10,离心,上清液用盐酸调PH值1-3,静置1-4小时,离心,沉淀物干燥,即得总黄酮含量80%以上半枝莲总黄酮,其中野黄芩苷含量为10%。
本发明质量控制方法含有如下含量测定方法中的一种或两种:
含量测定方法为:
a、总黄酮
取野黄芩苷对照品,加甲醇制成每1ml含0.20mg的溶液,摇匀,即得对照品溶液;精密吸取对照品溶液0.4,0.6,0.8,1.0,1.2ml,分别加甲醇至10ml,以甲醇为空白,照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VI A),在285nm的波长处测定吸收度,以浓度为横坐标,吸收度为纵坐标,绘制标准曲线;取于80℃干燥至恒重的本半枝莲总黄酮20mg,置10ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,超声处理30分钟,摇匀,滤过,精密吸取续滤液1ml,置10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,精密吸取1ml,置10ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,以甲醇为空白,照分光光度法(中国药典2000年版一部附录VI A),在285nm的波长处测定吸收度,计算,即得;本半枝莲总黄酮含总黄酮以野黄芩苷(C21H18O12)计,不得少于51%。
b、野黄芩苷
照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,38∶62∶0.05的甲醇-水-甲酸为流动相,检测波长为335nm;理论板数按野黄芩苷峰计算,不低于1500;精密称取野黄芩苷对照品,加流动相制成每1ml中含野黄芩苷0.20mg的溶液,摇匀,即得对照品溶液;取本半枝莲总黄酮20mg,精密称定,置10ml量瓶中,加甲醇适量,超声20-40分钟溶解后补加甲醇至刻度,摇匀,即得供试品溶液;分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,计算,即得;本半枝莲总黄酮含野黄芩苷不得少于2%。
本发明制备方法采用大孔树脂吸附工艺提取中药有效部位入药,工艺过程简便,不存在技术难题,生产过程容易控制,从一定意义上保证了产品质量的可控性;采用工艺植物中黄酮类化合物一次收率高,提取溶剂可反复利用,能源消耗低,并且原料药材价格较低廉,保证产品具有了较低的生产成本,因此较目前医药市场同类产品具有了较大的市场价格可调节空间,保证了产品在未来市场竞争中具有了产品价格方面的竞争优势;本发明方法稳定,且其提取物质量可控。
对半枝莲总黄酮进行了体外抗病毒试验、体内抗病毒试验、体外抗菌实验、体内抗菌实验,结果显示:半枝莲总黄酮对副流感病毒(HVJ)、呼吸道合胞病毒(RSV)、疱疹病毒1、2型(HSV-I、II)、腺病毒3、7型(Adr3、Adr7)等病毒的致细胞病变作用有明显抑制作用;半枝莲总黄酮对流感病毒引起的小鼠肺炎有明显抑制作用,且呈现良好的量效相关;并对流感病毒感染致小鼠死亡有明显的保护作用;半枝莲总黄酮对所试10种27株细菌的25个菌株表现了不同程度的抑菌作用,对19个菌株表现了不同程度的杀菌作用;其中,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度范围(MIC)在0.20~0.80mg/ml,最小杀菌浓度(MBC)可达0.40mg/ml。以MIC50为指标测算的抑菌作用强度排序为:绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、卡它布郎汉姆氏菌、葡萄球菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、变形杆菌,杀菌作用强度排序基本相近;半枝莲总黄酮灌胃给药对金黄色葡萄球菌感染所致的小鼠死亡有明显的保护作用。在其他相关实验中,同时表明70-280mg·kg-1半枝莲总黄酮灌胃给药均可不同程度的抑制酵母菌致大鼠的发热反应,并呈一定剂量相关性;100-400mg·kg-1半枝莲总黄酮灌胃给药均可显著抑制醋酸所致的小鼠扭体疼痛反应,剂量相关性明显。
下述实验例用于进一步说明本发明:
实验例1 水煎工艺的加水量、提取时间、次数等条件确定试验
1、加水量的确定:半枝莲三份(各100g),按表1加水进行提取试验,煮提1小时,浓缩,干燥得干膏,称重,并用紫外分光光度法测定其总黄酮含量。
表1
序号 |
药材量(g) |
加水量(倍) |
出膏(g) |
含量% |
对药材收率% |
123 |
100100100 |
6810 |
11.4512.3112.50 |
17.9717.2517.24 |
2.052.122.16 |
2、提取时间的确定:半枝莲三份(各100g),加10倍水进行试验,,提取时间按表2,浓缩,干燥得干膏,称重,并用紫外分光光度法测定其总黄酮含量。
表2
序号 |
药材量(g) |
提取时间(小时) |
出膏(g) |
含量% |
对药材收率% |
123 |
100100100 |
123 |
12.6012.3212.77 |
17.3516.9416.38 |
2.192.092.09 |
3、提取次数的确定:半枝莲三份(各100g),加10倍水进行试验,,提取时间1小时,提取次数按表3,浓缩,干燥得干膏,称重,并用紫外分光光度法测定其总黄酮含量。
表3
序号 |
药材量(g) |
提取次数 |
出膏(g) |
含量% |
对药材收率% |
123 |
100100100 |
123 |
12.6714.1514.86 |
17.4216.0315.66 |
2.212.272.33 |
4、结论:由上述实验,确定最佳加水量为10倍,最佳提取时间为1小时,最佳提取次数为2次。
实验例2 大孔树脂吸附试验
1、工艺的正交设计
根据大孔树脂的性能和半枝莲总黄酮的性质,选定考察四个因素(A、B、C、D)以及每个因素的3个水平(表4)
表4因素水平表
A药材重量与吸附时溶液的体积比(g/ml)
B吸附时提取液pH值
C树脂与药材重量比
D树脂重量与洗脱剂体积比(g/ml)
2、实验过程:
取半枝莲粗粉900g,加10倍沸水煮提,过滤,药渣再加8倍水煮提,过滤。合并二次滤液,平均分成9份,分别按正交表浓缩,调pH值,过大孔树脂柱,吸附后水洗至流出水液无色,树脂再用85%乙醇洗脱,回收乙醇、干燥、称重,紫外分光光度法在285nm处测定吸收度,按质量标准中所制标准曲线计算总黄酮含量,并折合成药材收率。
总黄酮含量=(A-0.005093)×10×10×100%/45.41189×样重
表5试验设计表
试验结果与方差分析
表6、L9(34)计算表
因素 |
A |
B |
C |
D |
总黄酮 |
列号 | 1 | 2 | 3 | 4 |
收膏率(%) |
含量(%) |
对药材收率(%) |
试验号 |
123456789 |
111222333 |
123123123 |
123231312 |
123312231 |
1.230.640.600.410.232.870.231.331.82 |
44.4951.1255.2540.5444.2155.2138.1353.2555.34 |
0.5470.3270.3320.1660.1021.5850.0880.7081.007 |
IjIIjIIIjI2jII2jIII2jRj=I2j+II2j+III2jSj=RJ/3-CT | |
1.2061.8531.8031.4543.4343.2518.1390.086 |
0.8011.1372.9240.6421.2938.55010.4850.868 |
2.8401.5000.5228.0662.2500.27210.5880.902 |
1.6562.0001.2062.7424.0001.4548.1960.105 | | |
G=4.862CT=G2/9=2.627SE=0.086 |
表7方差分析表
来源 |
平方和 |
自由度 |
均方和 |
F比值 |
显著性 |
ABCD误差e | Sa=0.086SB=0.868SC=0.902SD=0.105 |
2222∞ | 0.0430.4340.4510.053 | 110.09310.4881.233 | **** |
F1-0.01(2,∞)=4.61 F1-0.05(2,∞)=3.0 F1-0.10(2,∞)=2.3
3、结果与分析
从试验结果和方差分析表上看,因素B、C对结果有非常显著的影响即吸附液pH和吸附药材的树脂用量,D和A对结果有一定影响,影响顺序为B>C>D>A,经综合考虑得出最佳工艺条件:A2 B3 C1 D2即:药材重量与吸附时溶液的体积比为1∶3。吸附液调pH2-3。树脂与生药重量比为1∶2,为充分吸附可用1∶1。洗脱溶剂的体积为树脂重量的6倍。
4、大孔树脂型号的优选:
将购自天津南开大学化工厂的几种大孔树脂,用本发明工艺提取总黄酮,每份实验用100g半枝莲,以质量标准中方法测定膏中总黄酮含量,取其平均值,并折合成药材收率,比较结果如下表:
表8
树脂型号 |
D101 |
AB-8 |
ZTC-2 |
NKA-9 |
出膏率(%)总黄酮含量总黄酮对药材收率(%) |
1.75240.810.715 |
2.8355.241.563 |
1.16441.100.478 |
1.14239.070.446 |
可见AB-8型大孔树脂最为适合半枝莲总黄酮的提取。
实验例3 半枝莲总黄酮的含量测定
1、方法及测定条件的选择
本半枝莲总黄酮为中药注册5类新药的原料,以总黄酮为有效部位,故含量测定的对象为总黄酮及其主要有效单体。据药典及文献报道,曾用以野黄芩苷为对照品的分光光度法,在335nm处测定,因与本半枝莲总黄酮最大吸收波长285nm不一致,有一定误差而弃用。最后选定以野黄芩苷为对照品的紫外分光光度法,在285nm处测定吸收度。因为野黄芩苷有两个最大吸收波长285nm和335nm,而本半枝莲总黄酮最大吸收波长也是285nm,在此波长测定,灵敏度好,误差较小。
2、方法学考察
2.1精密称取野黄芩苷(80℃干燥至恒重)4.25mg,用甲醇超声定溶于25ml容量瓶中,即得0.17mg/ml的对照品储备液。取本半枝莲总黄酮20mg精密称定,置10ml容量瓶中,加甲醇至刻度,超声30分钟,摇匀,精密吸取1ml,置10ml容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,精密吸取1ml,置10ml容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,作为供试品溶液。
2.2测定 准确量取0.40,0.60,0.80,1.00,1.20ml对照品储备液分别置于10ml容量瓶中,甲醇定容至刻度,即得系列对照品溶液。以甲醇为空白,照分光光度法(中国药典2000版一部附录VI A)在285nm处测定吸收度,以浓度为横坐标,吸收度为纵坐标,绘制标准工作曲线。
2.3线性关系考察(见附图1)
表9 线性关系测定结果
序号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
对照溶液浓度(mg/ml)吸收度 |
0.0067840.3173 |
0.0101760.4799 |
0.0135680.6192 |
0.0169600.7553 |
0.0203520.9096 |
其回归方程为:
A=44.401112Cx+0.011521 r=0.9995
2.4精密度的测定将同一浓度的野黄芩苷标准溶液,用上述方法重复检测5次。
表10
序号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
吸收度 |
0.9006 |
0.9008 |
0.9010 |
0.9012 |
0.9011 |
平均(%) | | |
0.9009 | | |
RSD | | |
0.027% | | |
2.5再现性试验 将批号为2002111201的半枝莲总黄酮样品液用上述方法重复操作5次,并测定。结果见下表:
表11 再现性测定结果
序号 |
取样量(mg) |
吸收度 |
样品中总黄酮含量(%) |
平均含量(%) |
RSD(%) |
12345 |
20.5920.5820.4120.0320.67 |
0.50870.50210.51370.48860.4990 |
57.1556.4458.2356.4355.85 | 56.82 | 1.61 |
2.6样品稳定性试验:取批号为2002111201的样品溶液,放置3,6,9,12小时后,经分光光度法测定,其总黄酮含量变化不大,说明样品溶液在12小时内稳定。
表12
时间(小时) |
0 |
3 |
6 |
9 |
12 |
总黄酮含量(%) |
56.42 |
56.73 |
57.05 |
57.03 |
55.91 |
平均值(%) | | |
56.628 | | |
RSD(%) | | |
0.84 | | |
2.7加样回收率试验:精密称取一定量的野黄芩苷对照品,加到批号为2002111201的本半枝莲总黄酮中,按上述方法测定加样回收率。
结果见表13。
表13加样回收率试验测定结果
序号 |
样品总黄酮量(mg) |
对照品加入量(mg) |
总黄酮测出量(mg) |
回收率(%) |
平均值(%) |
RSD(%) |
12345 |
0.00.12830.058080.057980.056910.05872 |
0.066880.066880.066880.066880.06688 |
0.12830.12600.12320.12130.1257 |
100.37101.5697.5296.28100.15 | 99.176 | 2.21 |
2.8样品测定 取三批半枝莲总黄酮干粉约20mg,精密称定,按本草案方法制备样品液,将样品液在285nm处测定吸收度,根据回归方程按下式计算半枝莲药材中总黄酮含量。
结果如下:表14
批号 |
取样量(mg) |
吸收度 |
总黄酮含量(%) |
2002111201 |
20.02 |
0.5087 |
57.15 |
20.46 |
0.5423 |
57.82 |
2002111301 |
20.54 |
0.5361 |
56.93 |
20.58 |
0.5021 |
56.44 |
2002111401 |
20.17 |
0.5186 |
56.06 |
20.25 |
0.5243 |
56.46 |
根据以上测定结果,限度暂定为本半枝莲总黄酮含总黄酮以野黄芩苷记不得少于51%。
实验例4 野黄芩苷的含量测定
为了准确的控制半枝莲总黄酮质量,含量测定项目除总黄酮含量测定外还拟定了总黄酮中主要有效成份野黄芩苷的含量测定方法,用高效液相色谱法作为定量方法。
1.仪器与试剂:日本分光LC-1500型高效液相色谱仪,惠普HP-8453型紫外分光光度计,梅特勒AG-254型电子分析天平,试剂均为优级纯,野黄芩苷对照品(承德医学院中药研究所自制,含量98%以上)。
2.色谱条件:色谱柱:Discovery C18(4.6×250mm)
流动相:甲醇∶水∶甲酸(38∶62∶0.05)
流量:0.50ml/min
柱温:25℃
检测波长:335nm
3.供试品溶液与对照品溶液的制备,取本品约20mg,精密称定,置10ml量瓶中,加少量甲醇使溶,补加甲醇至刻度,作为供试品溶液,取野黄芩苷对照品4.15mg,精密称定,置25ml容量瓶中,加甲醇至刻度,作为对照品溶液。
4.线性关系的考察:精密称取野黄芩苷对照品6.40mg,置50ml量瓶中,作为对照品储备液,(其浓度为0.0694mg/ml)。吸取浓度为0.0694mg/ml的野黄芩苷对照品储备液2.0,4.0,6.0,8.0,10,12ml依次移至另外5个10ml容量瓶中,加甲醇至刻度,各取10μl进样,在前述色谱条件下测定野黄芩苷峰面积。
结果见下表:表15
序号 |
野黄芩苷量(μg) |
野黄芩苷峰面积积分值 |
123456 |
0.260.510.771.021.281.54 |
16151.31536932.57059547.44179285.91499226.836118191.281 |
以对照品进样量(X)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标,回归处理得直线方程如下:
Y=80000.3*X-3455.04 r=0.9992
表明野黄芩苷进样量在0.256μg~1.536μg范围内具有良好的线性关系(标准曲线见附图2)
5.精密度试验:精密吸取上述4号对照品溶液,重复进样(n=6),结果见下表
表16
序号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
RSD(%) |
野黄芩苷峰面积积分值 |
32689 |
32317 |
32455 |
32884 |
32855 |
32336 |
0.781% |
6.再现性 取批号为2002111201的半枝莲总黄酮5份,按本草案方法制备供试品溶液,结果见下表:表17
样品序号 |
称样量 |
峰面积 |
野黄芩苷含量(%) |
X |
RSD(%) |
1.2.3.4.5. |
19.7720.9120.5921.0720.35 |
26092279792725829622 |
2.9342.9752.9433.1252.965 | 2.994 | 2.97 |
7.回收率试验:采用加样回收法,取批号为2002111201的半枝莲总黄酮5份(2.994%),分别加入野黄芩苷对照品,制备供试品溶液,依法测定,
结果如下:表18
序号 |
野黄芩苷取样量(mg) | 已知量(mg) | 加入量(mg) | 检出量(mg) | 回收率(%) | X(%) | RSD% |
12345 |
10.2410.5910.449.8129.289 |
0.30660.31710.31260.29380.2781 |
0.26240.26240.26240.26240.2624 |
0.56730.56790.58020.54700.5288 |
99.3595.58101.9696.4995.54 | 97.78 | 2.80 |
8.样品的测定 取半枝莲总黄酮干粉约20mg,按本草案方法制备样品液,分别吸取对照品溶液和样品溶液各10μl进样,以外标面积法计算半枝莲原料中野黄芩苷的百分含量。结果如下:表19
批号 |
野黄芩苷含量(%) |
2002111201 |
2.5 |
2002111301 |
2.2 |
2002111401 |
2.3 |
标准品浓度为0.0694mg/ml,峰面积为31222
根据以上测定结果,限度暂定本品含野黄芩苷不得少于2%。
实验例5 体外抗病毒试验
取已长成单层细胞的96孔细胞培养板,倒掉培养液,分别接种100TCID50的不同病毒液50ul/孔,置37℃、5%CO2培养箱中吸附1小时,倒掉病毒液,用不含小牛血清的Engle’s维持液洗细胞面二次,然后加入相应稀释度的药液,100ul/孔,每个稀释度做4个复孔。同时设病毒对照、正常细胞对照及阳性药对照。置37℃、5%CO2培养箱中培养,每日倒置显微镜下观察细胞病变,当病毒对照组细胞病变为++++时记录实验结果。
细胞病变程度(CPE)的判断按以下6级分类标准:
-:细胞生长正常,无病变出现;
±:细胞病变少于整个单层细胞的10%;
+(1):细胞病变约占整个单层细胞的25%以下;
++(2):细胞病变约占整个单层细胞的50%以下;
+++(3):细胞病变约占整个单层细胞的75%以下;
++++(4):细胞病变约占整个单层细胞的75%以上;
按Reed-Muench计算50%有效浓度(IC50)。
治疗指数(TI)=TC50/IC50。
结果采用秩和检验进行统计学处理,结果见表20、21。
表20、21结果显示,半枝莲总黄酮在体外对副流感病毒、RSV、HSV-I、HSV-I、A3、A7病毒的致细胞病变作用有明显抑制作用,其IC50分别为0.72、0.35、3.31、3.31、0.57和0.55mg/ml,TI分别为6.32、13.10、1.38、1.38、7.96和8.33。对CoxB病毒未显示出明显的抑制作用。
表20 半枝莲总黄酮对病毒致细胞病变的影响
药物 |
药物浓度 |
细胞病变程度(CPE) |
副流感 |
CoxB4 |
CoxB5 |
RSV |
Adr-3 |
Adr-7 |
HSV-1 |
HSV-2 |
半枝莲 |
1.60.80.40.20.1 |
1112**1121**2222*33333333 |
43344243434344434444 |
14243223**322434444444 |
±111**11±1**1212**23444443 |
1111**1122**2112**32333333 |
1121**1121**2112**33223333 |
2212**2312*344344444444 |
2221**2311*334444444444 |
病毒唑 |
0.50.25 |
11±1**1111** |
11±1**1112** |
1111**1111** |
1111**1111** |
1121*2321* |
1111**2223* |
1111**2121** |
11122211 |
病毒对照组 |
3333 |
4444 |
4444 |
4444 |
3333 |
3333 |
4444 |
4444 |
注:与病毒对照组比较*p<0.05,**p<0.01。
表21半枝莲总黄酮体外抗病毒的IC50和TI
药液 |
病毒种 |
IC50 |
TI |
半枝莲 |
副流感RSVCoxB4CoxB5HSV-1HSV-2A3A7 |
0.720.35--3.313.310.570.55 |
6.3213.10--1.381.387.968.33 |
注:“-”表示对所试病毒无抑制作用,单位:mg/ml。
实验例6 体内抗病毒试验
1、对小鼠流感病毒性肺炎的治疗作用
取小鼠按体重随机分成6组。分别为半枝莲总黄酮三个剂量组;病毒唑(0.07g·kg-1/d)组;病毒感染对照组及正常动物对照组。除正常对照组外,将小鼠用乙醚轻度麻醉,以15个LD50流感病毒液滴鼻感染,每只0.05ml。感染前1天开始灌胃给药,每天2次,每次0.25ml/10g,连续5天,对照组在同等条件下蒸馏水灌胃。第6天称取小鼠体重后解剖,摘取全肺称重,计算肺指数值,并求出肺指数抑制率。
肺指数=[肺重(g)/体重(g)]×100
肺指数抑制率=(病毒对照组肺指数均值-试验组肺指数均值)/病毒对照组肺指数均值×100%
结果采用组间t检验进行统计学处理。
表22 半枝莲总黄酮对小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用
组别 |
剂量mg/kg/d |
鼠数(只) |
肺指数值(g肺重/100g体重) |
抑制率(%) |
正常对照组病毒对照组病毒唑组大剂量组中剂量组小剂量组 |
--0.07400200100 |
101010101010 |
0.92±0.061.88±0.41##1.04±0.10**1.39±0.37**1.55±0.361.86±0.30 |
--4526181 |
注:与正常对照组比较:##P<0.01,与病毒对照组比较:*P<0.05。
表22结果显示,半枝莲总黄酮400mg/kg/d剂量组的肺指数值明显低于病毒对照组,与病毒对照组比较有显著性差异(P<0.05);200mg/kg/d剂量组的肺指数值明显低于病毒对照组,但统计学无显著性差异。表明半枝莲总黄酮对流感病毒引起的小鼠肺炎有明显抑制作用,且呈现良好的量效相关。
2、对流感病毒所致小鼠死亡的保护作用
(1)病毒引起小鼠死亡最小毒力的测定:将病毒用生理盐水稀释成0.5-4LD50的不同病毒液,取小鼠50只,每个稀释度10只,0.05ml/只滴鼻感染。观察动物的死亡情况,取感染后7-9天动物死亡率在90%以上的浓度,为实验时的感染量。实验结果显示:2LD50感染时,小鼠的死亡率为90%,故将其定为实验时的感染量。
(2)药物的保护作用:取小鼠100只,按体重随机分成5组。分别为半枝莲总黄酮三个剂量组、病毒唑(0.07g·kg-1/d)组及病毒感染对照组。各给药组灌胃给药,每天2次,每次0.25ml/10g,连续7天,病毒对照组在同等条件下给予蒸馏水。给药第二天各组小鼠用乙醚轻度麻醉后,以2个LD50流感病毒液滴鼻感染,每只0.05ml。记录感染后小鼠的死亡数,计算死亡率、死亡保护率及生命延长率。
死亡率%=死亡动物数/动物总数
死亡保护率=(对照组死亡率-实验组死亡率)/对照组死亡率
生命延长率=(实验组平均存活天数-感染组平均存活天数)/感染组平均存活天数
结果见表23、24。
表23、24结果显示,小鼠感染病毒15天内,半枝莲总黄酮三个剂量组动物的死亡数均少于感染对照组;死亡保护率分别为27.78%、33.33%和11.11%(但统计学无意义);且小鼠的存活天数较感染组明显延长,与对照组比较有显著性差异(P<0.01>。生命延长率分别为18.97%和17.94%和8.20%。表示半枝莲总黄酮在此剂量时对流感病毒感染致小鼠死亡有明显的保护作用。
表23 半枝莲总黄酮对流感病毒致小鼠死亡的保护作用
组别 |
剂量mg/kg/d |
动物数(只) |
死亡数 |
死亡率% |
保护率% |
病毒感染组病毒唑大剂量组中剂量组小剂量组 |
--0.07400200100 |
2020202020 |
188131216 |
9040656080 | 55.56**27.7833.3311.11 |
注:与对照组比较**P<0.05。
表24 半枝莲总黄酮对流感病毒致小鼠死亡的保护作用
组别 |
剂量g/kg/d |
动物数(只) |
平均存活天数 |
生命延长率(%) |
病毒感染组病毒唑大剂量组中剂量组小剂量组 |
--0.07400200100 |
2020202020 |
9.75±1.9212.85±1.49**11.60±2.13**11.50±2.13**10.55±1.96 | 31.7918.9717.948.20 |
注:与对照组比较**P<0.01。
实验例7 体外抗菌试验
1、试验菌液的配制
甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌分别以10%FCS-营养肉汤培养基37℃18小时增菌培养,相同培养基10-1稀释为试验菌液。其它细菌分别以营养肉汤培养基37℃18小时增菌培养,相同培养基10-3稀释为试验菌液。
2、最小抑菌浓度(MIC)的测定
灭菌半枝莲总黄酮25.64mg/ml(原料50mg/ml)浓度起始,甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎球菌试验采用10%FCS-营养肉汤培养基,其它细菌试验采用营养肉汤培养基倍比稀释药液至10个浓度,每孔1ml加入24孔细胞培养板,每稀释度药液设2个复孔,分别加入以上试验菌液50μl,并设各菌液不加药物的对照孔,37℃培养18小时,肉眼和倒置显微镜下观察有无细菌生长。
灭菌双黄连口服液对倍稀释浓度(40mg/ml)浓度起始,相应培养基倍比稀释药液至10个浓度,以上同样条件加入试验菌液、观察细菌生长现象。
以无细菌生长的的药物最高稀释度为最小抑菌浓度(MIC)。
3最小杀菌浓度(MBC)的测定
以上观察无细菌生长培养物50μl接种于普通琼脂平板培养基(甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎球菌接种于血液琼脂平板培养基,变形杆菌接种于SS琼脂平板培养基),37℃培养18小时,计数菌落。
以菌落数少于5个(2复孔平均值)的药物最高稀释度为药物对该细菌的最低杀菌浓度(MBC)。实验结果见表25、26、27。
表25 半枝莲总黄酮的体外抗菌作用(1)稀释度·浓度(mg/ml)
菌种 |
菌批号号 |
半枝莲总黄酮 |
双黄连口服液 |
细对菌照 |
稀释度/MIC | 稀释度/MBC | 稀释度/MIC | 稀释度/MBC |
金黄色葡萄球菌葡萄球菌肺炎链球菌甲型溶血性链球菌乙型溶血性链球菌大肠埃希氏菌绿脓假单胞菌变形杆菌卡它布郎汉姆氏菌肺炎克雷伯氏菌 |
26112-626003-2026010-18临25923临2-18临2-2026101-18临11临14临2232213-632209-1332210-1732210-18临10临11临12临23临24临25临5临5549109临1临122910846101 |
1∶256(0.20)1∶64(0.80)1∶64(0.80)1∶256(0.20)1∶256(0.20)1∶256(0.20)1∶32(1.60)1∶4(12.82)1∶128(0.40)1∶4(12.82)1∶64(0.80)1∶64(0.80)1∶16(3.21)1∶4(12.82)1∶16(3.21)1∶64(0.80)1∶16(3.21)1∶8(6.41)1∶4(12.82)1∶4(12.82)1∶256(0.20)1∶256(0.20)1∶4(12.82)>1∶2(25.64)>1∶2(25.64)1∶64(0.80)1∶4(12.82) |
1∶64(0.80)1∶16(3.21)1∶16(3.21)1∶64(3.21)1∶128(0.40)1∶128(0.40)1∶16(3.21)>1∶2(25.64)1∶4(12.82)>1∶2(25.64)1∶16(3.21)1∶4(12.82)1∶2(25.64)1∶4(12.82)1∶2(25.64)1∶4(12.82)1∶4(12.82)1∶4(12.82)>1∶2(25.64)>1∶2(25.64)1∶128(0.40)1∶128(0.40)1∶2(25.64)>1∶2(25.65)>1∶2(25.64)1∶16(3.21)>1∶2(25.64) |
1∶256(0.31)1∶64(1.25)1∶64(1.25)1∶128(0.63)1∶256(0.31)1∶128(0.63)1∶128(0.63)1∶4(20.0)1∶16(5.00)1∶16(5.00)1∶16(5.00)1∶8(10.0)1∶16(5.00)1∶8(10.0)1∶8(10.0)1∶8(10.0)1∶16(5.00)1∶8(10.0)1∶4(20.0)1∶4(20.0)1∶128(0.63)1∶64(1.25)1∶32(2.50)1∶16(5.00)1∶16(5.00)1∶16(5.00)1∶4(2.50) |
1∶32(2.50)1∶32(2.50)1∶32(2.50)1∶16(5.00)1∶32(2.50)1∶32(2.50)1∶32(2.50)>1∶2(40.0)1∶4(20.0)1∶4(20.0)1∶2(40.0)1∶2(40.0)1∶16(5.00)>1∶2(40.0)>1∶2(40.0)>1∶2(40.0)1∶2(40.0)>1∶2(40.0)1∶2(40.0)>1∶2(40.0)1∶16(5.00)1∶16(5.00)1∶16(5.00)1∶4(20.0)1∶16(5.00)>1∶2(40.0)>1∶2(40.0) |
++++++++++++++++++++++++++++ |
注:“+”为液体培养基有细菌生长,琼脂平板培养基生长为菌苔。
表26 半枝莲总黄酮的体外抗菌作用(2)—抑菌浓度范围(mg/ml)
菌种 |
(株数) |
半枝莲总黄酮 |
双黄连口服液 |
MIC范围 |
MIC50 |
MIC范围 |
MIC50 |
金黄色葡萄球菌葡萄球菌肺炎链球菌甲型溶血性链球菌乙型溶血性链球菌大肠埃希氏菌绿脓假单胞菌变形杆菌卡它布郎汉姆氏菌肺炎克雷伯氏菌 |
(6)(1)(4)(2)(5)(3)(2)(3)(1)(1) |
0.20-0.801.600.40-12.820.800.80-12.826.41-12.820.2012.82->25.640.8012.82 |
0.341.601.600.801.807.140.200.8012.82 |
0.31-1.250.635.00-20.005.00-10.005.00-10.0010.00-20.000.63-1.251.25-5.005.002.50 |
0.540.638.565.005.3411.130.631.785.002.50 |
表27 半枝莲总黄酮的体外抗菌作用(3)—杀菌作用强度比较(MBC值)
MBC(mg/ml) |
稀释度 |
菌种 |
菌号-批号 |
比例 |
0.400.803.2112.8225.64>25.64 |
1∶1281∶641∶161∶41∶2>1∶2 |
金黄色葡萄球菌绿脓假单胞菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌葡萄球菌甲型溶血性链球菌卡它布郎汉姆氏菌肺炎链球菌甲型溶血性链球菌乙型溶血性链球菌大肠埃希氏菌乙型溶血性链球菌变形杆菌肺炎链球菌大肠埃希氏菌变形杆菌肺炎克雷伯氏菌 |
临18、临20临5、临5526112-6、临2592326003-20、26010-1826101-1832213-629108临1432209-1332210-18、临11、12临2332210-17、临1049109临11、临22临24、临25临1、临1246101 |
2/62/22/62/61/11/21/11/31/23/51/32/51/32/32/32/31/1 |
实验结果,本实验10种27株细菌对照孔均有细菌生长,琼脂平板培养基生长为菌苔。半枝莲总黄酮对所试27株细菌中的25菌株表现了不同程度的抗菌作用。
在本实验所试菌株条件下,以MIC50和药物稀释度分别测算,半枝莲总黄酮对所试细菌的抑菌作用强度,除肺炎克雷伯氏菌、变形杆菌、葡萄球菌等少数菌株外,多数高于双黄连口服液;相近方法测算的杀菌作用强度高于双黄连口服液。在本实验所试菌株条件下,半枝莲总黄酮的抑菌作用强度排序为:绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、卡它布郎汉姆氏菌、葡萄球菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、变形杆菌。在本实验所试菌株条件下,半枝莲总黄酮的杀菌作用强度排序为:绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌、葡萄球菌、卡它布郎汉姆氏菌、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌、大肠埃希氏菌、变形杆菌。
以上实验结果表明,半枝莲总黄酮对与临床上呼吸道感染有关的金黄色葡萄球菌、葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌等革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性的卡它布郎汉姆氏菌等具有较强的抗菌作用。
实验例8 半枝莲总黄酮对致死性金黄色葡萄球菌感染的死亡保护作用
1、细菌感染最小致死量(浓度)的确定
金黄色葡萄球菌(临床株2-18)37℃18小时增菌培养,以0.5%MC配制5%酵母悬液10-1~10-3稀释,给小鼠腹腔注射0.5ml/只,每个稀释度感染5只小鼠,观察各组小鼠的死亡情况,连续观察5天,确定3日内可引起小鼠80~100%死亡的菌液浓度为细菌感染最小致死浓度。
实验结果,5%酵母MC悬液10-1稀释金黄色葡萄球菌(临床株2-18)感染小鼠,3日内死亡率达80%,确定为本实验细菌感染最小致死浓度。
2、对致死性金黄色葡萄球菌感染的死亡保护作用
昆明种小鼠110只,随机分为6组。实验组小鼠(各20只)分别给予半枝莲总黄酮400、200、100mg·kg-1,阳性药物和感染对照组小鼠(各20只)分别给予双黄连胶囊624mg·kg-1和同体积蒸馏水,0.2ml·10g-1w容积灌胃给药,12小时(±2小时)1次,连续3天。第4天以上小鼠以最小致死浓度金黄色葡萄球菌0.5ml/只腹腔注射作致死性攻击,感染后继续给药4次(2天)。剩余10只小鼠腹腔注射细菌稀释液(无细菌加入)作为对照。感染小鼠后6小时1次观察各组小鼠死亡情况,累计48小时内小鼠死亡数,计算死亡率(%)。
死亡率(%)=小鼠死亡数/小鼠总数×100%
X2检验比较组间动物死亡率差异的显著性。
实验结果见表28。
实验结果,小鼠感染金黄色葡萄球菌后24、48小时,感染对照组分别有85%和95%死亡。半枝莲总黄酮3个剂量组和双黄连口服液24、48小时2个时间点的小鼠死亡率均低于感染对照组。其中,双黄连口服液24小时的死亡率最低,但与半枝莲总黄酮差异无显著性(P>0.05)。大剂量半枝莲总黄酮与感染对照组比较差异有显著性(P<0.05),中剂量组24小时与感染对照组比较差异有显著性(P<0.05),表明其对致死性金黄色葡萄球菌感染造成的小鼠死亡有明显的保护作用,并有一定剂量相关性。5%酵母MC悬液腹腔注射小鼠无死亡。
表28 半枝莲总黄酮对致死性金黄色葡萄球菌感染的死亡保护作用
组别 |
剂量(mg·kg-1) |
例数(n) |
24小时死亡情况 |
48小时死亡情况 |
例数 |
死亡率(%) |
例数 |
死亡率(%) |
感染对照组双黄连对照组黄酮大剂量组黄酮中剂量组黄酮小剂量组稀释液对照组 |
-624400200100- |
202020202010 |
1791010140 |
8545**50*50*700 |
19141316170 |
9570*65*80850 |
注:与感染对照组比较**P<0.01;*P<0.05。
实验例9 抗炎作用试验
1、半枝莲总黄酮对二甲苯致小鼠耳廓肿胀反应的影响
26~30g雄性昆明种小鼠60只,随机分组,实验组小鼠分别给予半枝莲总黄酮400、200、100mg·kg-1,阳性药对照和溶媒对照组小鼠分别给予阿斯匹林100mg·kg-1、双黄连胶囊624mg·kg-1和同体积蒸馏水,0.2ml·10g-1w容积灌胃给药,12小时(±2小时)1次,连续3次。
末次给药后60分钟,以棉球蘸取二甲苯50μl接触试验小鼠右耳双面5秒,15分钟脱颈椎处死小鼠,用直径6mm打孔器将双耳同部位等面积切下,称取左右耳片重量,计算耳廓肿胀率(%)和肿胀抑制率(%)。
耳廓肿胀率(%)=(右耳片重量-左耳片重量)/左耳片重量×100%
肿胀抑制率(%)=(对照组肿胀率-实验组肿胀率)/对照组肿胀率×100%
t检验比较耳廓肿胀率(%)组间差异的显著性。实验结果见表29。
表29 半枝莲总黄酮对二甲苯致小鼠耳廓急性炎症的抑制作用(X±s)
组别 |
剂量(mg·kg-1) |
例数(n) |
肿胀率(%) |
炎症抑制率(%) |
溶媒对照组阿斯匹林对照组双黄连对照组大剂量组中黄酮组小剂量组 |
-100624400200100 |
101010101010 |
177.42±40.91104.31±48.63**122.86±42.94**111.11±27.29**120.65±64.24*136.67±40.91*△ |
-41.4230.7537.3732.0022.97 |
注:与溶媒对照比较**P<0.01,*P<0.05;△与阿斯匹林组比较P<0.05。
实验结果,100~400mg·kg-1半枝莲总黄酮灌胃给药对二甲苯所致小鼠耳廓急性炎症反应有不同程度的抑制作用,与溶媒对照组比较差异有显著性或高度显著性(P<0.05或0.01),剂量依赖关系较明显。其中,大剂量组作用强度高于所试剂量双黄连胶囊,与阿斯匹林相近,但差异无显著性;中剂量组作用强度与所试剂量双黄连胶囊相近。
2、半枝莲总黄酮对组胺致大鼠皮肤毛细血管通透性增高反应的影响
Wistar大鼠60只,随机分组,实验组大鼠分别给予半枝莲总黄酮280、140、70mg·kg-1,阳性药物对照和溶媒对照组大鼠分别给予阿斯匹林100mg·kg-1、双黄连胶囊436.8mg·kg-1和同体积蒸馏水,1.0ml·100g-1w容积灌胃给药,12小时(±2小时)1次,连续3次。
末次给药后40分钟,各鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠0.133ml·100g-1w麻醉,20分钟后背部皮内注射0.01%组胺生理盐水溶液0.1ml,立即舌下静脉注射1%伊文思蓝生理盐水溶液0.4ml·100g-1w,30分钟后脱颈椎处死大鼠,量取蓝斑直径,用直径1.5cm打孔器切下背部蓝染皮片,剪碎后置7∶3丙酮生理盐水溶液5ml,45℃浸泡96小时直至皮肤蓝色完全消失,1500rpm/min离心15分钟,取上清液测定A620nm值,计算抑制率(%)。
蓝斑直径抑制率(%)=(实验组直径-对照组直径)/对照组直径×100%
渗出抑制率(%)=(对照组A620nm值-实验组A620nm)/对照组A620nm×100%
t检验比较组间蓝斑直径和皮片浸液A620nm值差异的显著性;方差齐性分析判断组间方差不齐者,t,检验比较组间差异的显著性。
实验结果见表30。
表30 半枝莲总黄酮对组胺致大鼠皮肤毛细血管通透性增高反应影响(
X±s)
组别 |
剂量(mg·kg-1) |
例数(n) |
蓝斑直径(cm) |
抑制率(%) |
蓝斑皮片浸液A620nm值 |
抑制率(%) |
溶媒对照组阿斯匹林组双黄连胶囊组大剂量组中剂量组小剂量组 |
-100436.828014070 |
101010101010 |
1.23±0.071.08±0.13**1.07±0.07**1.05±0.04**1.01±0.11**1.07±0.08** |
-12.2013.4115.0417.8913.01 |
0.78±0.260.50±0.16**0.53±0.19*0.47±0.15**0.50±0.19*0.71±0.17 |
-36.4031.7139.6635.928.97 |
注:与溶媒对照比较*P<0.05,**P<0.01。
实验结果,3个剂量的半枝莲总黄酮灌胃给药对组胺致大鼠皮肤毛细血管通透性增高反应均有不同程度的抑制作用,除小剂量组蓝斑皮片浸液A值外分别与溶媒对照组比较差异有显著性或高度显著性(P<0.05或0.01),蓝斑皮片浸液A值有剂量相关性。其中,黄酮大剂量组作用强度高于所试剂量阿斯匹林和双黄连胶囊,但差异无显著性(P>0.05);中剂量组作用强度与所试剂量阿斯匹林相近,高于双黄连胶囊。
实验例10 解热作用试验
Wistar大鼠80只,20±1℃室温适应7天;实验前3天适应性测量大鼠直肠温度,选基础体温正常、温差<0.3℃合格大鼠60只,随机分组,每组12只,实验组大鼠分别给予半枝莲总黄酮70、140、280mg·kg-1,阳性药物对照组和溶媒对照组大鼠分别给予阿斯匹林100mg·kg-1或同体积蒸馏水,1.0ml·kg-1w灌胃给药,间隔12小时(±2小时)1次计3次(第3次给药时间为致热后6小时);实验当日间隔1小时测温2次,取平均值为致热前(基础)体温;每鼠背部皮下注射10%酵母MC悬液5.0ml·kg-1;致热后6小时时测温,剔除温度升高<0.8℃大鼠后,各组大鼠再次(第3次)同上剂量、容积给药,药后每隔1小时测温1次计3次。
各组数据经正态性检验后,以t检验比较各组药后各时间点与同组致热6小时体温差值差异的显著性,方差齐性分析判断组间方差不齐者,改用t,检验。
实验结果见表31。
实验结果,70~280mg·kg-1半枝莲总黄酮灌胃给药对酵母菌所致大鼠的发热反应有不同程度的抑制作用,并有一定的剂量相关性,其中大剂量组各时间点和中剂量组药后1、3小时与溶媒对照组比较差异有显著性(P<0.05);大剂量组作用强度高于所试剂量的阿斯匹林,但无显著性差异(P>0.05)。
表31 半枝莲总黄酮对大鼠酵母菌致热的解热作用(
x±s)
组别 |
剂量(mg·kg-1) |
例数(n) |
基础体温(℃) |
致热后6h(℃) |
药后体温(℃)/与致热后6小时差值(℃) |
药后1h |
药后2h |
药后3h |
溶媒对照组阿斯匹林对照组黄酮大剂量组黄酮中剂量组黄酮小剂量组 |
-10028014070 |
1091088 |
38.09±0.4037.87±0.4137.94±0.2437.83±0.4438.03±0.94 |
39.22±0.4238.94±0.3639.34±0.3639.05±0.5139.51±0.63 |
39.42±0.500.20±0.6638.22±0.37-0.71±0.38**38.39±1.16-0.95±1.22*38.48±0.68-0.58±0.72*39.20±0.63-0.31±0.56 |
39.25±0.490.03±0.6538.47±0.49-0.48±0.6638.34±0.96-1.00±1.03*38.53±0.68-0.53±0.6039.56±0.820.05±0.84 |
39.28±0.300.06±0.3738.22±0.25-0.72±0.38**38.52±1.11-0.82±1.21*38.76±0.54-0.30±0.30*39.56±0.400.05±0.46 |
注:与溶媒对照组比较*p<0.05,**p<0.01。
实验结果,半枝莲总黄酮3个剂量组均有不同程度的解热作用,并呈剂量相关,大剂量组强度高于所试剂量阿斯匹林,作用持续时间在药后3小时以上。