CN1139387C - 淫羊藿多糖及其制备方法和该多糖在制备提高机体免疫功能药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种淫羊藿多糖及其制备方法和该多糖在制备提高机体免疫功能药物中的应用,属于多糖类的医药配制品、制备方法及该制品的医药用途。该多糖是由A部分和B部分组成,包括鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖七种单糖。淫羊藿多糖具有明显的促免疫作用,是一种很有发展前途的生物调节剂。适用于乳腺癌、小细胞肺癌、非何杰金淋巴病、非腺癌、胃癌等癌症患者化疗、放疗需要辅助治疗者。
Description
本发明涉及一种多糖类的医药配制品、制备方法及其医药用途,特别是一种淫羊藿多糖及其制备方法和该多糖在制备提高机体免疫功能药物中的应用。
淫羊藿(Epimedium)又名仙灵脾,为小蘖硷科(Berberidaceae)植物,是传统的补肾壮阳、祛风除湿、益气类中药,并有镇咳、去痰、平喘、抑菌等作用,已在中医药组方中广泛应用。使用含有淫羊藿的复方煎剂、制剂、中成药和各类粗提剂多有报道。
淫羊藿的化学成分主要有黄酮类化合物、木酯素、生物碱、多糖类和微量元素。
目前,临床应用和药理实验的大量报道认为,淫羊藿有效成分主要为黄酮类,多年来,人们一直集中精力对黄酮类的分离和应用研究。且在确认化学结构的基础上,发现其具有调节免疫等多种功能。如《中成药研究》1987;(2):27-28介绍了“淫羊藿总黄酮促进免疫功能的实验”。
国内外对其它植物中提取多糖的方法,以及多糖作为生物调节剂的研究颇多。淫羊藿多糖对人体免疫功能的影响也曾有报道。
《中国免疫学杂志》1986年第2卷第2期报道了“淫羊藿多糖和淫羊藿甙对抑制性T细胞的作用”,对没有说明制备方法的自制淫羊藿多糖进行抑制性T细胞诱导和检测实验。结果表明淫羊藿多糖和淫羊藿甙对抑制性T细胞具有相反的调节作用,提示中药淫羊藿可能对机体免疫功能具有双向调节作用。
《中国免疫学杂志》1985年第1卷第6期报道了“淫羊藿多糖促进小鼠T和B细胞3H-TdR掺入和诱生干扰素作用的研究”,以自备但没有公开制备方法的淫羊藿多糖进行实验。认为是有效的免疫增强剂,并有诱生干扰素的作用。
通过加强肿瘤病人的免疫反应作为治疗肿瘤的一个途径的尝试,在临床肿瘤学中已有几十年的历史。能引起对移植肿瘤排斥的肿瘤特异性抗原已在啮齿类动物中得到证实。在体外实验中,业已证明人的免疫效应细胞具有杀死人肿瘤细胞的能力。
肿瘤免疫学认为,肿瘤患者的预后与本人的免疫功能有关,利用非特异性的免疫治疗剂能帮助其它根治疗法延长病人的缓解期或生存期。从天然产物中提取生物反应调节剂及抗肿瘤药物一直是受人重视的研究领域。在许多复杂的高分子化合物中,多糖类就是最引人注目的成分之一。在具有药理活性多聚物的研究中,免疫激活性多糖是一个相对较新的领域,也已发现多糖能够激活巨嗜细胞。如香菇多糖和云芝多糖已在临床上用于肿瘤的免疫治疗。
但对淫羊藿多糖的成分、理化特性、制备方法及其医药用途尚无系统和明确的研究报道。
本发明的目的是为了提供一种淫羊藿多糖(EPS)及其制备方法;本发明的另一个目的是为了提供一种医药配制品的医药用途,即淫羊藿多糖在制备提高机体免疫功能药物中的应用。因此,本发明是有区别于现有技术的。
淫羊藿多糖的特征。
理化性质:该多糖为淡棕色粉末,气微、味淡、比旋度[α]D 23+6°(C=0.1H2O);多糖A为棕色粉末,比旋度[α]D 23+24°;多糖B浅黄色粉末,比旋度[α]D 23+66°(C=0.1 H2O);均易溶于水,不溶于乙醚、氯仿等有机溶剂,莫利施(Molishi)反应阳性,蒽酮反应阳性,茚三酮反应阴性。
分子量测定:
淫羊藿多糖为A、B两部分组成,A部分的平均分子量为A=1063009;B部分的平均分子量为B=5522;总多糖的分子量为MW=684710。
淫羊藿多糖的组成单糖分析及克分子比:
总多糖是由岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖七种单糖组成的杂多糖,克分子比为:1∶6.91∶19.27∶2.6∶3.67∶12.12∶18.51。
多糖A的单糖组成是岩藻糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖七种单糖,克分子比:1∶2.6∶3.7∶6.9∶12.1∶18.5∶19.3。
多糖B的单糖组成是鼠李糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖六种单糖,克分子比:1∶2.7∶1∶3.6∶1.3∶19.1。
淫羊藿多糖的制备方法:
淫羊藿生药1kg,加水10、8、6倍,加热80-100℃,三次提取,浓缩成1∶3的浸膏,加入乙醇,使含醇量达70%,搅匀放置,过滤得沉淀物溶于5-10倍的蒸馏水中,搅匀放置,滤液浓缩到一定体积后,加入乙醇再重复沉淀一次,得固体沉淀物,溶于15-20倍蒸馏水中,搅匀、放置、过滤,滤液薄膜浓缩至小体积,向滤液中加入乙醇,使含醇量达85%,搅匀放置,抽滤得沉淀物即棕色粗多糖;
取粗多糖溶于500ml蒸馏水中,加入氯仿∶正丁醇为5∶1的混合溶剂100ml,离心除去蛋白质,水层流水透析,透析液薄膜减压浓缩至小体积,加入4倍量95%乙醇使之沉淀,放置,抽滤,无水乙醇洗涤,抽干,置入五氧化二磷的干燥器中减压干燥,得淫羊藿总多糖;
取总多糖3g溶于50ml蒸馏水中转入透析袋中,以蒸馏水透析,透析后,浓缩,醇沉,抽滤,沉淀物用无水乙醇洗涤,抽干,放入五氧化二磷的干燥器中减压干燥,得棕色粉末为淫羊藿多糖A。
将前24小时透析液,薄膜低温浓缩至小体积,冷冻干燥得浅黄色粉末为多糖B。
淫羊藿多糖的医药用途。
淫羊藿多糖在制备提高机体免疫功能药物中的应用,
淫羊藿多糖口服给予100~200mg/kg,对肺癌实体瘤和胸腹水型白血病均有一定的抑瘤趋势,适用于乳腺癌、小细胞肺癌、非何杰金淋巴病、非腺癌、胃癌等癌症患者化疗、放疗需要辅助治疗者。
制备淫羊藿多糖的分离方法简单,价格便宜,提取物纯度高。可为临床提供多糖类医药配置品的原料药,用EPS多糖制备的胶囊剂型在癌症患者放疗、化疗前后应用,以及免疫功能低下患者使用,取得了满意的临床效果。
下面结合实施例对淫羊藿多糖的制备方法、多糖的理化性质、分子量测定、以及该多糖在制备提高机体免疫功能药物中的应用,详细描述:
图1为测定EPS的A、B分子量曲线图。
图2为测定EPS的A分子量曲线图。
图3为测定EPS的B分子量曲线图。
图4为EPS和MAF在体外对鼠Mφ吞噬功能的影响。
图5为EPS和ConA在体外对鼠淋巴细胞转化的影响。
表1为不同剂量EPS对鼠Mφ吞噬功能的影响(半体内)。
表2为EPS在体内对小鼠淋巴细胞转化率的影响。
表3为EPS对正常鼠DHR的影响。
表4为EPS对免疫抑制态鼠DHR的影响。
表5为EPS对荷瘤鼠DHR的影响。
表6为EPS在体外对ConA的“解毒”作用(OD值)
表7为EPS在体内对鼠实体型S180的作用。
表8为EPS在体内对腹水型S180的作用。
表9为EPS与化疗药联合应用对鼠实体型S180的作用。
表10为EPS与化疗药联合应用对鼠实体型HepA的作用。
表11为EPS对鼠肺腺癌LA-795的作用。
表12为EPS对鼠白血病L845的作用。
表13为EPS及ADM在体外对几种肿瘤细胞的作用。
表14为EPS对人NK细胞活性的影响。
表15为EPS腹腔给药引起的T739鼠死亡数。
表16为临床病人分类情况。
表17为口服EPS 200-1000mg/日功能指标测定结果。
本发明采用朝鲜淫羊藿(Epimdium Koreanum Nakai由东北采集)的茎、叶入药提取总多糖。
淫羊藿生药1kg,加水10、8、6倍,加热80-100℃,三次提取,首次2小时,后两次各1小时,过滤,合并三次提取液,浓缩成1∶3(按生药计)的浸膏。向内加入95%乙醇,使含醇量达70%,搅匀,放置12-24小时,过滤得沉淀物。将沉淀物溶于5-10倍的蒸馏水中,搅匀,放置2-4小时,过滤,除去不溶物,滤液浓缩到一定体积后,加入95%乙醇再重复沉淀一次,得固体沉淀物,将其溶于15-20倍蒸馏水中,搅匀,放置2-4小时,过滤,滤液薄膜浓缩至小体积。向滤液中加入95%乙醇,使含醇量达85%,搅匀放置12-24小时,抽滤得沉淀物即棕色粗多糖。
取粗多糖溶于500ml蒸馏水中,加入氯仿∶正丁醇为5∶1的混合溶剂100ml,剧烈振摇片刻,然后离心除去蛋白质,水层重复三次(2%茚三酮液检查阴性)水层逆向流水透析24小时,透析液薄膜减压浓缩至小体积,加入4倍量95%乙醇使之沉淀,放置4-6小时侯,抽滤,无水乙醇洗涤,抽干,置入五氧化二磷的干燥器中减压干燥,得淫羊藿总多糖7g;
取总多糖3g溶于50ml蒸馏水中转入透析袋中,以蒸馏水透析36小时,取出透析袋内液体,浓缩,醇沉,抽滤,沉淀物用无水乙醇洗涤,抽干,放入五氧化二磷的干燥器中减压干燥,得棕色粉末为淫羊藿多糖A1.2g。
将前24小时透析液,薄膜低温浓缩至小体积,冷冻干燥得浅黄色粉末为多糖B 0.4g。
淫羊藿多糖的成分及特征:
理化性质:该多糖为淡棕色粉末,气微、味淡、比旋度[α]D 23+6°(C=0.1H2O);多糖A为棕色粉末,比旋度[α]D 23+24°;多糖B浅黄色粉末,比旋度[α]D 23+66°(C=0.1 H2O);均易溶于水,不溶于乙醚、氯仿等有机溶剂,莫利施(Molishi)反应阳性,蒽酮反应阳性,茚三酮反应阴性。
含量测定:
采用苯酚-硫酸法测定淫羊藿多糖含量为20.42%。
采用蒽酮-硫酸法测定淫羊藿多糖含量为31.25%。
按葡萄糖计算不低于18%。
纯度检查:
经HPLC检查和HPGPC检查A为均一体。
元素分析:
取少量总多糖进行元素分析,分析结果不含氮。
红外光谱分析:
淫羊藿多糖以BrK压片,在400-4000cm1处扫描,结果淫羊藿多糖具有多糖的特征吸收峰:3366,2491,1601,1422,1324,1254,1097,605cm1;多糖A的吸收峰3400(OH),2920,1612,1422,1242,1024,892,763,617,582cm1。
紫外光谱分析:
淫羊藿多糖水溶液在200-400区间进行紫外扫描,在260,280nm出均未见到有核酸和蛋白质的吸收峰。
分子量测定:
应用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定分子量(BECKMAN332-HPLC,流动相:水流速0.7ml/min,温度;室温,检测器UV-NM柱子:waters(1)Bondagel E-Linear TM.②Bondagel E-1000 TM;③Ц Bondagel E-1251TM。三根柱子串联使用。)以T系列标准葡萄糖T-10、T-20、T-40、T-80、T-500(由中国医科院血研所提供)为标准品,进样,得标准曲线。多糖样品以相同样品进样,与标准曲线对照得分子量。
图1、2、3分子量曲线显示的测定结果:淫羊藿多糖为A、B两部分组成,二者比例为3∶1,A部分的平均分子量为A=1063009;B部分的平均分子量为B=5522;总多糖的分子量为MW=684710。
淫羊藿多糖的组成单糖分析及克分子比
①纸层析:
多糖20mg.2 N H2SO4水解6小时,Ba(OH)2中和,过滤,滤液减压浓缩至2ml,进行纸层析,以七种单糖作对照。
展开剂:乙酸乙酯∶吡啶∶醋酸∶水为5∶5∶1∶3
结果显示出六种主要单糖。
②以气相色谱法(GC)测定单糖组成:
总多糖30mg.以2 N的H2SO4水解6小时,以Ba(OH)2中和,过滤,滤液减压浓缩至干,加入40mg盐酸羟胺,加0.7ml吡啶,在90℃甘油浴上回流30min,冷至室温后再加0.7ml醋酐,同样温度下再继续反应30min,减压蒸去溶剂,加2ml氯仿,溶解后作气相色谱分析;以木糖醇为内标;用七种标准单糖经同样处理。相同条件下进行气相层析定性,以面积归一化法计算多糖中各单糖的相对含量。
总多糖是由岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖七种单糖组成的杂多糖,克分子比为:1∶6.91∶19.27∶2.6∶3.67∶12.12∶18.51。
多糖A的单糖组成是岩藻糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖七种单糖,克分子比:1∶2.6∶3.7∶6.9∶12.1∶18.5∶19.3。
多糖B的单糖组成是鼠李糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖六种单糖,克分子比:1∶2.7∶1∶3.6∶1.3∶19.1。
淫羊藿多糖在制备治疗促免疫作用药物中的应用,其特征在于淫羊藿多糖具有明显的促免疫作用:
药效学研究
一.淫羊藿多糖对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响
1.半体内实验
淫羊藿多糖:配成5mg/ml溶液,供小鼠灌胃用。
阳性对照物:卡介苗(BCG)冻干皮上划痕用卡介苗,批号8623,北京生物制品研究所。实验动物:昆明小白鼠,体重20g±2g
按照《药理实验方法学》小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验方法进行:实验前6-8天,将小鼠随机分组:I-III组分别给不同剂量的EPS,连续灌胃6天,IV组为阳性对照,给BCG125mg/kg腹腔注射,V为阴性对照,口服灌胃同量的水。6天后,取2%鸡红细胞悬液0.5ml给每鼠腹腔注射,半小时后,抽腹腔洗液滴于玻片孵箱温育,漂洗、固定、染色,镜下计数巨噬细胞,并按吞噬百分率和吞噬指数计算。
吞噬百分率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/200个巨噬细胞×100%
吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞数/200个巨噬细胞÷2
如表1所示,口服给予75-100mg/kg/d×6天的淫羊藿多糖对小鼠巨噬细胞的吞噬功能具有非常明显的促进作用。
2.体外实验
淫羊藿多糖用磷酸缓冲液PBS溶液制成2mg/ml溶液,高压灭菌,4℃备用。
动物选用DBA/2小鼠,8-12周龄,由医科院肿瘤医院动物室提供。
腹腔巨噬细胞的制备:经腹腔注射1ml/只鼠1%巯基乙醇酸钠(TG北京化工厂)。3-6天后用PBS冲洗腹腔收集腹腔渗出细胞(PEC)。洗涤后重悬于含15%小牛血清的RPMI1640(Nissui Tokyo)液中,调浓度至2×106/ml。按0.1ml/孔接种于96孔平底组织培养板内,于37℃,5%CO2孵箱中温育1-2小时后用温PBS洗涤去除非粘附细胞,贴壁者即为所需Mφ。
巨噬细胞活化因子(MAF)的制备:根据Meltzer的方法。无菌摘去小鼠脾脏并在无血清中制成单细胞悬液,调有核细胞浓度至10×106/ml,加入3μg/ml刀豆蛋白A,置37℃,5%CO2孵箱培养48小时,结束后于3000-4000rpm离心20分钟,收集上清,再于0.25微孔滤纸过滤,-20℃冻存备用。
EPS和MAF处理Mφ分别以500、250、125、63、31、16、0μg/ml(终浓度)的EPS加入各实验孔,其中0μg/ml为空白对照,另设EPS+MAF(35%终浓度)和EPS+MAF(17.5%终浓度)两组以资比较。
Mφ吞噬中性红实验:上述培养板内的Mφ经EPS或MAF处理24小时后,每孔加入0.4%中性红(上海试剂三厂)0.1ml,半小时后吸去全部培养液,PBS洗三遍,加入0.1ml75%乙醇,振荡5分钟,在酶联免疫测定仪上用490nm波长测各孔光密度(OD)。值。
统计学处理,每实验组设三个平行孔,每实验至少重复三次,结果以平均值±标准差的形式根据一次有代表性的实验给出,用Student′s检验决定处理的显著性。
图4结果表明,EPS在体外促进小鼠腹腔巨噬细胞功能的最佳剂量是125μg/ml(31-250μg/ml)。EPS与巨噬细胞活化因子MAF合用时有协同作用出现,使巨噬细胞吞噬中性红的能力增加1-3倍。
二EPS对小鼠淋巴细胞功能的影响
1.体内实验
①小鼠淋巴细胞转化实验
EPS同上。左旋咪唑(LMS,广州第七制药厂)作为阳性对照物。
实验动物采用昆明种小鼠。
实验分为III组,I组连续五天每天口服灌胃100mg/kg的EPS,观察待测药的活性,II组为阳性对照药,分别在1、3、5各天共三次腹腔注射0.5mg/kg的LMS,III组给水作阴性对照。于给药前和给药后1-7天,每天剪尾取血推片,瑞士染色油镜下数100个淋巴细胞,按以下标准观察淋巴细胞及过渡型细胞所占的百分率:
淋巴母细胞的形态:胞体比正常大3-4倍,呈圆形或椭圆形,胞浆常有伪足突出,染色淡蓝,常有空泡,胞核增大,核质疏松,常呈细丝网状结构,可见核分裂象。
过渡型细胞的形态:介于上述母细胞与正常淋巴细胞之间,体积稍大,多在12-15μm之间,胞浆稍多,淡兰色,核稍大,核质疏松,与大淋巴细胞的区别是后者核较致密,胞浆较少,噬碱性强,各组淋巴细胞的转化率为两种细胞之和,最后按均值进行T检验。
表2结果表明,经口服给予EPS 100mg/kg/d×5天可以非常明显地提高小鼠淋巴细胞的转化率。
②小鼠迟发超敏反应实验
本实验采用左旋咪唑(LMS,广州第七制药厂)作为提高细胞免疫功能的对照药,用2.4-二硝基氯苯(DNCB,北京化工三厂)作为迟发超敏反应(DHR)的致敏原,实验动物采用T739近交系小鼠,雌雄兼用,体重20±1g。实验拟观察正常鼠,免疫抑制态鼠和荷瘤鼠三种情况,因此采用环磷酰胺(CTX,上海第十二制药厂)作为免疫抑制剂,小鼠荷瘤用细胞系为肺癌LA-795。
小鼠迟发超敏反应测定方法按照Lundy等人报道的方法进行。实验共分V组进行,I-III组为隔日共5次口服灌胃分别给予75、100、125mg/kg的EPS,IV组为口服灌胃7.5mg/kg×5剂量的LMS作为阳性对照组,V组为口服灌胃同容积的水作为空白对照组。首次致敏在正常鼠或荷瘤鼠的背部皮下每只注入2.5%DNCB丙酮溶液10μl。然后在第9-10天进行攻击,用0.5%DNCB丙酮溶液在小鼠一后足掌上皮内注射10μl,另一足同法注射10μl丙酮作为对照。攻击后48小时,将DNCB攻击足及对照足于踝关节处切下,放入Lundy测量装置,测出足肿胀程度,用μl表示,DNCB攻击足与丙酮攻击足(对照)的μl之差值为DHR值,然后分别求出其均值及标准差,并进行组间的比较和显著性检验。
观察免疫抑制状态DHR反应时,前述I-V组均用CTX处理,方法是在致敏后第1、7天分别腹腔注射15mg/kg的CTX,使之造成免疫抑制状态,另外设一第VI组,不给CTX,作为正常对照组。
观察荷瘤鼠的DHR时,方法同上,但要在首次致敏前4天首先接种小鼠肺腺癌LA-795,接种细胞数3×106/只,位置为右腋皮下。
表3结果表明,口服灌胃给予75mg/kg/d×5的EPS对正常鼠的迟发超敏反应有明显的增强作用。
表4所示50-75mg/kg/d的EPS对免疫抑制状态小鼠的迟发超敏反应有明显的免疫恢复作用,且可使之恢复到正常水平。
表5结果表明,合适剂量(约50mg/kg×7)的EPS可以使荷瘤小鼠的细胞免疫水平恢复至正常状态。2体外实验
—体外小鼠淋巴细胞转化实验
取DBA/2小鼠脾,剪碎、研磨、过网,洗一遍,0.83%Tris-NH4CI处理2分,洗三遍,将细胞悬浮于RPMI 1640(Nissui Tokyo)培养液中,内含10%小牛血清,调浓度5×106/ml。将细胞分种在96孔板中,每孔0.1ml。分组,每组三复孔,按组加入不同浓度的淫羊藿多糖和刀豆球蛋白(Con A.Sigma),于37℃,5%CO2孵箱培养60-70小时,结束前4小时加入浓度为5mg/ml的MTT(3-〔4,5-dimethylthiazol-2-yl〕-2,5-diphenyltetrazolium bromide,Sigma)10μl/孔,终浓度1mg/ml,4小时后,吸去全部培养液,加入0.2ml/孔的DMSO(北京化工厂),振荡5分钟,于酶联免疫测定仪(DG3022,华东电子管厂)的490~510nm处测定光密度(OD)值。
由图5可见,125~250μg/ml的EPS可以使小鼠淋巴细胞在体外的转化增加一倍左右。如果加用ConA,则在250μg/ml处出现细胞转化增加2.5倍的现象,中效公式证明,合并指数小于1,说明运用合适的EPS和ConA,在中效剂量处出现协同作用。
如表6所示,EPS促进淋巴细胞转化的最佳剂量为250μg/ml,过高时,转化率降低,文献记载,ConA作为细胞分裂原也具有上述特点,即超过一定剂量时,细胞转化出现抑制。由图3可以看到,EPS能够在一定限度内,扭转ConA剂量过大时所出现的抑制作用。
三.淫羊藿多糖的抑瘤作用
1.体内实验
①.EPS对实体型小鼠肉瘤S180的作用
取腹腔传代的小鼠肉瘤细胞S180(腹水),用生理盐水按1∶4稀释接种于BALB/c小鼠右前肢腋下,每只0.2ml。接种后24小时,随机分组,每组7只,并开始以不同剂量的淫羊藿多糖灌胃7天,对照组给予同体积的生理盐水。第8天处死小鼠,分别称小鼠体重和瘤重,比较实验组与对照组瘤重的差异,按下式算出肿瘤抑制率22:
肿瘤抑制率=(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%
由表7结果可见,50mg/kg的EPS连续饲药7天,对实体型S180的抑制率可达32%,P值<0.05。
②对腹水型S180的作用
材料和方法同实验(1),区别仅在于小鼠荷瘤为腹水型S180,观察指标为生命延长率,按下式计算:
生命延长率=(治疗组平均存活天数-对照组平均存活天数)/对照组平均存活天数×100%
由表8结果可见,淫羊藿多糖对腹水型S180无明显抑制作用。
③EPS与化疗药联合应用对鼠实体瘤的作用
材料和方法同实验①,随机分组如下:I.空白对照组;II.EPS组,50mg/kg,连续8天,灌胃;III.阿霉素(ADM,Farmitalia Carloerba Italy)组,4mg/kg,第1、6天静脉注射;IV.环磷酰胺(CTX,上海第十二制药厂)组,50mg/kg,第1、6天腹腔注射;V.EPS+ADM组,用药方法同II、III组;VI.EPS+CTX组,用药方法同II、IV组。
由表9结果可见,EPS对实体型S180有明显抑制作用(P<0.01),但与CTX或ADM联合应用时未见抑瘤作用增加。
由表10可见,EPS对HepA有明显抑制作用,但与ADM或CTX按上述剂量应用时,未见抑瘤作用增加。
④EPS对实体型鼠肺腺癌LA-795的作用
将鼠肺腺癌细胞接种于鼠T-739右前肢腋下,饲以EPS 15天,表11可见EPS对鼠肺腺癌LA-795有一定抑瘤作用,但P>0.05。
⑤EPS对鼠白血病L845的作用
将小鼠白血病细胞L845接种于T-739近交系小鼠的胸腔或腹腔,分别获得胸水型或腹水型L845,按前述实验②的方法,饲以EPS,以生命延长率为指标,得结果如下:
如表12所示,EPS对鼠白血病L845有一定抑制作用,以对腹水型L845为著(P<0.05)。
2.体外实验
将EPS与肿瘤细胞直接置于体外培养系统,以期观察EPS是否对肿瘤细胞有直接抑制作用。
选用V79、L929、Hela和K562四种常规培养的肿瘤细胞作为实验用细胞株,用前先消化使之成为单细胞悬液,调细胞浓度至25,000~50,000/ml。接种于96孔板内,0.1ml/孔,于37℃,5%CO2孵箱内培养24小时后取出,加入不同浓度的淫羊藿多糖或阿霉素(阳性对照),每组三孔,继续培养48小时,结束前4小时加入浓度为5mg/ml的溴化二甲噻唑联苯四唑盐(MTT)10μl/孔,终浓度1mg/ml。3-4小时后,抽去全部培养液,加入0.1ml/孔的盐酸异丙醇,微量振荡器振荡5分,于酶联免疫测定仪的570μm处测定各孔光密度(OD)值,按下式计算增殖抑制率:
增殖抑制率=(对照组OD-实验组OD)/对照组OD×100%
如表13结果所示,1,000μg/ml的EPS在体外对K562细胞的抑制作用为34%,(P<0.05),其作用机制尚不清楚。EPS对其他三种肿瘤细胞在体外无任何抑制作用。
四.淫羊藿多糖对NK细胞的作用
根据王长安改进的Korzeniewski的乳酸脱氢酶(LDH)法测定人的NK细胞对K562细胞的杀伤作用。
试剂盒购自上海第二医科大学免疫研究所免疫II室。
效应细胞制备:取肿瘤病人或正常人静脉血10ml,枸缘酸钠抗凝,1,500rpm离心10分钟,吸弃上清,取中间白细胞层,磷酸缓冲液(PBS)稀释一倍,小心置于4ml Ficoll淋巴细胞分离液(上海荣盛生物制剂厂)上,3,000rpm离心25分钟,吸弃上清,轻轻吸出单个核细胞层,另管RPMI1640洗两遍,继用0.5%牛血清白蛋白(BSA)-RPMI1640液洗一遍,调细胞浓度至5×106/ml备用。
靶细胞准备:细胞系K562用含15%小牛血清的RPMI1640液于实验前一天传代,实验当天用RPMI1640培养液将K562洗两遍,0.5%BSA-RPMI1640液洗一遍,调细胞浓度至1×105/ml备用。
细胞毒实验:实验在96孔板内进行,先加靶细胞K5621×104/孔,后加效应细胞10~100×104/孔,实验组按不同浓度加入淫羊藿多糖,另设组测定自然释放和最大释放值,用NP-40(Nonidet P40 Fluka)破坏靶细胞作最大释放测定(使用浓度为1%,即1ml NP-40溶于99ml RPMI1640中)。置37℃,5%CO2孵箱培养4小时,小心吸取每孔上清液100μl,置另一96孔板,随后在每孔内加入100μl LDH底物混合液0.2M PH8.2 Tris缓冲液内含5.4×10-2ML(+)乳酸钠、6.6×10-4M碘硝基氯化四氮唑(INT、Fluka)、2.8×10-4M吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS、Serra)及1.3×10-3M氧化型辅酶I(NDA、Sigma),3分钟后加IN HCI 50μl/孔中止反应,酶标仪上于490nm处测定每孔光密度值(OD),按下式换算NK细胞杀伤活性:
NK细胞杀伤活性=(T-S)/(M-S)×100%
式中T为测定孔OD值,S为靶细胞自然释放值,M为靶细胞最大释放值。
由表14结果可见EPS对NK细胞活性无明显影响。
毒理学研究
1.急性毒性实验:
动物选用T739近交系小鼠,体重20±2g。将动物分成6组,分别腹腔注射不同剂量的淫羊藿多糖,然后在给药的24、48、72小时,直到第7天分别记录动物中毒死亡情况,分别记录动物中毒死亡情况,用Karber氏法计算淫羊藿多糖LD50值及95%平均可信限L95。
表15可见实验中,大剂量组(如I、II组)在给药后6小时,动物开始出现闭目、少动、心跳加快,24小时开始出现死亡。死亡后解剖未发现各脏器异常,经计算淫羊藿多糖LD50值为2275±402mg/kg。
淫羊藿多糖经口服灌胃的LD50未能测出,因为用5倍于腹腔用药量的淫羊藿多糖经灌胃给药7天未发现有动物死亡,因此,只知口服用药的LD50大于11.375g/kg。
腹腔注射LD50=2303mg±296mg/kg。
无论口服或腹腔注射给药,其毒性剂量与有效剂量相距20-100倍,因此安全性很高。
2长期毒性实验
①.一般毒性实验。
分别给大鼠灌胃EPS35、65、100mg/kg剂量。对照组灌以生理盐水,连续90天,最后作血常规生化指标及病理学检查。结果是:红细胞计数及血红蛋白含量,白细胞计数及其分类,血小板计数及凝血时间均在正常范围内,生化指标中除血糖有升高趋势外,(仍在正常范围内),余均未见异常。给药期间,各组大鼠外观,行为也未见异常。病理组织学检查,各给药组与对照组比较,未见药物所致的明显病理改变。
②特殊毒性实验。
经生物回复突变实验,哺乳动物培养细胞染色体畸变试验和啮齿类动物微核试验三种方法检查,未见其具有致突变性。经致畸敏感期毒性实验未见生殖毒性。
淫羊藿多糖对BALB/c鼠所荷实体型肉瘤S180有明显抑制作用;对鼠实体型肝癌有明显抑制作用,而对鼠肺腺癌LA-795的抑制作用P值大于0.05,淫羊藿多糖对腹水型白血病L845也有明显抑制作用。
淫羊藿多糖胶囊剂型的制备:
称取淫羊藿多糖50克,加入淀粉赋形剂150克,混合均匀,分装于胶囊内,使胶囊内含药200mg/粒,装瓶备用。这样制备的医药配置品,可供临床应用。
适应症:免疫功能低下者;
乳腺癌、小细胞肺癌、非何杰金淋巴病、非腺癌、胃癌等
癌症患者化疗、放疗需要辅助治疗者;
用法及用量:口服给药200mg/kg/次。 1.6g/kg/日
反应及毒副作用:毒性低,无不良反应。
临床试用情况
I期临床试验目的:研究人体对淫羊藿多糖所能耐受的最大计量及毒副反应,并提出安全有效的给药方案。
病人收治标准:①有或无病理或细胞学证实的恶性肿瘤患者。
②在本院进行综合治疗的休息期住院病人中的志
愿者。
③化疗后恢复期,未服用其他药物的患者。
④肝、肾心功能无明显异常。
⑤Karnofsky评分大于40分,预计生存期大于
3个月。
⑥能长期随诊的病人。
方法:从初始剂量200mg/日口服开始,设为第一组,逐步经200、300、400、600、800、1000mg/日过度到高剂量,每组病人3例,并根据反应情况决定增量幅度,直至达到最大耐受量或最适给药剂量。
观察指标:①一般情况与活动能力。②免疫指标。③肝肾功能。
④心电图。
表16、17说明筛选30例病人分类方法,及各项观察指标的检测结果。
对乳腺癌、小细胞肺癌、非何杰金淋巴病、非腺癌、胃癌等30例癌症患者临床I期试用,并进行免疫功能、肝功能、肾功能及其它指标检测,病人情况确有改善。而且发现,癌症患者对1.6g/日剂量耐受性很好,30例病人中有一例发现乏力,不适和肌肉酸痛,占3%,发生在400mg/日组,而1.6g/日组未见此现象。
动物实验和临床试用证明淫羊藿多糖是一种很有发展前途的生物调节剂。
Claims (6)
1.一种淫羊藿多糖,由多糖组成,其特征在于:
a.理化性质:该多糖为淡棕色粉末,气微、味淡、比旋度[α]D 23+6°(C=0.1 H2O);其中多糖A为棕色粉末,比旋度[α]D 23+24°;多糖B浅黄色粉末,比旋度[α]D 23+66°(C=0.1 H2O);均易溶于水,不溶于乙醚、氯仿类有机溶剂,莫利施反应阳性,蒽酮反应阳性,茚三酮反应阴性;
b.总多糖组成:
淫羊藿多糖为A、B两部分组成的总多糖,是由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖七种单糖组成的杂多糖;
其中多糖A的单糖组成是鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖七种单糖;
多糖B的单糖组成是鼠李糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖六种单糖。
2.根据权利要求1所述的淫羊藿多糖,其特征在于该多糖A部分的平均分子量为A=1063009,B部分的平均分子量为B=5500,总多糖的分子量为MW=684710。
3.根据权利要求1所述的淫羊藿多糖,其特征在于岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖七种单糖组成的杂多糖,克分子比为:1∶6.91∶19.27∶2.6∶3.67∶12.22∶18.51。
多糖A的单糖组成是岩藻糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖七种单糖,克分子比:1∶2.6∶3.7∶6.9∶12.1∶18.5∶19.3。
多糖B的单糖组成是鼠李糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖六种单糖,克分子比:1∶2.7∶1∶3.6∶1.3∶1.91。
4.淫羊藿多糖的制备方法,其特征在于:
a.淫羊藿生药1kg,加水10、8、6倍,加热80-100℃,三次提取,浓缩成1∶3的浸膏,加入乙醇,使含醇量达70%,搅匀放置,过滤得沉淀物溶于5-10倍的蒸馏水中,搅匀放置,滤液浓缩到一定体积后,加入乙醇再重复沉淀一次,得固体沉淀物,溶于15-20倍蒸馏水中,搅匀、放置、过滤,滤液薄膜浓缩至小体积,向滤液中加入乙醇,使含醇量达85%,搅匀放置,抽滤得沉淀物即棕色粗多糖;
b.取粗多糖溶于500ml蒸馏水中,加入氯仿∶正丁醇为5∶1的混合溶剂100ml,离心除去蛋白质,水层流水透析,透析液薄膜减压浓缩至小体积,加入4倍量95%乙醇使之沉淀,放置,抽滤,无水乙醇洗涤,抽干,置入五氧化二磷的干燥器中减压干燥,得淫羊藿总多糖;
c.取总多糖3g溶于50ml蒸馏水中转入透析袋中,以蒸馏水透析,透析后,浓缩,醇沉,抽滤,沉淀物用无水乙醇洗涤,抽干,放入五氧化二磷的干燥器中减压干燥,得棕色粉末为淫羊藿多糖A;
d.将前24小时透析液,薄膜低温浓缩至小体积,冷冻干燥得浅黄色粉末为多糖B。
5.根据权利要求1所述的淫羊藿多糖在制备提高机体免疫功能药物中的应用,其特征在于该多糖适用于免疫功能低下者,适用于乳腺癌、小细胞肺癌、非何杰金淋巴病、肺腺癌、胃癌患者化疗、放疗需要辅助治疗者。
6.根据权利要求1所述的淫羊藿多糖在制备抗肿瘤药物中的应用,其特征在于淫羊藿多糖口服给予100-200mg/kg,对肺癌实体瘤和胸腹水型白血病均有一定的抑瘤趋势。
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