CN1915335A - 芫花根总黄酮及其提取方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种芫花根总黄酮及其提取方法与应用。其目的是提供一种芫花根总黄酮及其提取方法与其在制备预防和/或治疗性肿瘤药物中的应用。该提取方法包括以下步骤：1)将芫花根粉碎；2)将芫花根与体积百分含量为80－100％乙醇按体积比为1∶3－5混合，在40－70℃下浸提12－48小时；3)去除提取液中的沉淀物；4)将提取液过大孔吸附树脂，然后用水洗涤树脂，再用体积百分含量为80－100％乙醇对树脂进行洗脱，得到洗脱液；5)将洗脱液减压蒸馏后过200－300目硅胶柱，再用体积比为1∶1的氯仿∶甲醇混合液洗脱，对洗脱物进行浓缩，得到芫花根总黄酮。
Description
技术领域
本发明涉及化合物及其提取方法与应用，特别是涉及芫花根总黄酮及其提取方法与其在制备预防和/或治疗性抗肿瘤、提高机体免疫力及抗衰老药物中的应用。
背景技术
肿瘤是一种常见、多发病，其中恶性肿瘤是目前严重危害人类健康的疾病之一。据统计，全世界每年死于恶性肿瘤的人数达到690万。20世纪70年代以来，我国的肿瘤发病率一直呈上升趋势，目前我国每年肿瘤的发病人数约为200万，死于肿瘤的人数超过140万。
肿瘤是机体在各种致癌因素作用下，局部组织细胞过度增生和异常分化而形成的新生物，具有失去控制性生长、浸润及转移的特点。在现代医学中，肿瘤的治疗方法主要有三种：化学疗法、放射线疗法及手术，其中化学疗法被认为是最好的治疗方法，但是大多化学药物对机体的正常细胞也会产生破坏作用。而来源于植物的抗肿瘤药物与化学合成药物相比有着不可替代的优越性，如毒副作用小、制药过程的污染较少等。因此，从药用植物中寻找预防和治疗性恶性肿瘤药物始终是药物化学家的研究目标。传统中药中存在许多抗癌有效成分，我国利用中草药治疗肿瘤历史悠久，一些古籍(如《黄帝内经》等)中已有一些肿瘤的症状及防治方法的记载。而且，中药的抗肿瘤活性已得到国际认可。我国药用植物资源丰富，据统计，当前已对药用植物中的28个科(属)，3000种以上的中草药进行了抗癌筛选，其中含有抗癌活性成分的中草药约为200种(吕秀娟；王琴；吕圭源抗肿瘤中药的研究进展。中国现代中药2006，8(5)34-35)。
芫花为瑞香科植物，广泛分布于我国长江流域各省和黄河流域的部分地区。芫花作为民间传统用药始载于《神农本草经》，至今已有2000余年的药用历史。芫花根具有消炎、镇痛、镇静等多种药理作用。芫花根在民间曾被用来治疗多种癌肿，疗效显著。现代药理研究表明：芫花根具有抗肿瘤、治疗腹水的作用。化学成分研究表明：芫花根主要含有黄酮、香豆素和二萜原酸酯类化合物，其中黄酮类化合物除了芫花素、芫花苷等少数单黄酮外，主要为毛瑞香素系列的双黄酮，种类多且含量高，为芫花根次生物质的主要成分(Zheng W，Shi F.Three Biflavonoids from Ethanol Extractof the Roots of Daphne Genkwa.Acta Pharmaceutica Sinica 2005.40：438-442.)。黄酮类化合物是中药中一类主要的有效成分，具有多方面的药理活性。该类化合物对心血管疾病、癌症、免疫系统疾病等均具有显著的药理作用，并且毒性较低(曹纬国等，黄酮类化合物药理作用的研究进展。西北植物学报，2003，23，(12)：2241-2247)。大量研究结果也证实了黄酮类化合物能诱生和增强机体的免疫功能、保护正常细胞、抑制肿瘤细胞、诱导肿瘤细胞凋亡以及调节细胞因子等(曹纬国等，黄酮类化合物药理作用的研究进展。西北植物学报，2003，23，(12)：2241-2247)。黄酮类化合物在天然抗肿瘤药物的研究中显得日益重要，具有较广阔的开发和利用前景，因此，迫切需要一种简单易行且经济适用的芫花根总黄酮的提取方法。
发明内容
本发明的目的是一种芫花根总黄酮及其简单易行且经济适用的提取方法。
本发明所提供的芫花根总黄酮的提取方法，包括以下步骤：
1)将芫花根粉碎；
2)将芫花根与体积百分含量为80-100％乙醇按体积比为1∶3-5混合，在40-70℃下浸提12-48小时；
3)去除提取液中的沉淀物；
4)将提取液过大孔吸附树脂，然后用水洗涤树脂，以除去水溶性杂质，再用体积百分含量为80-100％乙醇对树脂进行洗脱，得到黄色的洗脱液；
5)将洗脱液减压蒸馏后过200-300目硅胶柱，再用体积比为1∶1的氯仿∶甲醇混合液洗脱，对洗脱物进行浓缩，得到芫花根总黄酮。
在上述提取方法中，步骤2)中芫花根与乙醇混合的体积比优选为1∶4，浸提温度优选为60℃，浸提时间优选为24小时。
步骤3)中可用离心或过滤的方法去除提取液中的沉淀物。
步骤4)中所用的大孔吸附树脂的型号优选为ADS-17，用于洗涤树脂的水优选为去离子水。
为获得更好的提取效果，可将步骤4)重复1-3次，合并洗脱液。
步骤5)中的减压蒸馏可在50-60℃下进行。
此外，用上述方法获得的芫花根总黄酮也属于本发明的保护范围。
同时，可以用上述方法获得的芫花根总黄酮为活性成分制备成肿瘤的预防和/或治疗性药物，提高机体免疫力药物及抗衰老药物。
需要的时候，在本发明所述应用中还可以加入一种或多种药学上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂等，必要时还可加入香味剂、甜味剂及色素等。
本发明所述应用除制成胶囊剂外，还可以制成片剂、粒剂、粉剂、口服剂、注射液等多种药物形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
上述药物的成人口服用量一般为50-100mg/kg/d，可以一次或多次使用，疗程为10至20天。
本发明提供了一种有效的芫花根总黄酮的提取方法。该提取方法具有以下优点：1、操作简单，易于进行工业化应用；2、提取成本低廉；3、所用提取溶剂的毒性较小，提取周期短；4、提取液中芫花根总黄酮含量高，含量可达9.7％。同时，可以用本发明方法获得的芫花根总黄酮为活性成分制备成预防和/或治疗性抗肿瘤，增强机体免疫力和抗衰老药物。实验证明，用本发明方法获得的芫花根总黄酮具有抗肿瘤、抗转移、抗氧化和增强机体免疫功能等药理活性，给小鼠连续灌胃不会引起肝脏、肾脏和脾脏等脏器的生化指标的明显变化，对正常细胞的毒副作用较弱，此外，对因长期用药可能导致的免疫抑制而诱发的细菌、真菌感染也有抵抗作用。本发明为芫花根总黄酮的大规模生产奠定了基础，并将在芫花根总黄酮的有效利用中发挥巨大作用，在医药领域的应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为用本发明方法提取的芫花根总黄酮的HPLC指纹图谱
图2为不同组小鼠的瘤体积变化情况
图3为用本发明方法提取的芫花根总黄酮对S180荷瘤小鼠NK细胞活性影响的检测结果
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、芫花根总黄酮的提取及其HPLC检测
一、提取芫花根总黄酮
选择符合2005年版《中国药典》标准的芫花根药材，用下述方法从中提取芫花根总黄酮，包括以下步骤：
1)将芫花根粉碎；
2)将芫花根与无水乙醇按体积比为1∶4混合，在60℃下浸提24小时；
3)离心去除提取液中的沉淀物；
4)将提取液过大孔吸附树脂ADS-17(购自天津大学树脂研究所)，然后用去离子水洗涤树脂，以除去水溶性杂质，再用无水乙醇对树脂进行洗脱，得到黄色的洗脱液；
5)将洗脱液在60℃下减压蒸馏后过200目硅胶柱，再用体积比为1∶1的氯仿∶甲醇混合液洗脱，最后对洗脱物进行浓缩，得到芫花根总黄酮。
二、HPLC检测
对步骤一提取的芫花根总黄酮用HPLC色谱仪(Waters 600E)进行鉴定，具体方法为：取芫花根总黄酮1mg，溶解于4mL甲醇溶液作为样品液。取样品液6μl进样。以甲醇/水(pH 5.0)(V/V)作为流动相，按下列梯度进行洗脱：0-10min 25/75；11-20min 33/67；21-58min 41/59；59-79min 55/45；80-100min 85/15。检测波长275nm。色谱柱：Inertsil，4.6×250mm；柱温：30℃。按上述色谱条件对各已知各种黄酮类化合物进行色谱分析确定其保留时间，并根据各种黄酮类化合物的保留时间对芫花根总黄酮HPLC指纹图谱中各峰所代表的化合物进行归属。
步骤一提取的芫花根总黄酮的HPLC指纹图谱如图1所示(图A：芫花根总黄酮检测样品；图B：标准化合物1.芫花苷，2.芫花醇A，3.毛瑞香素H-3-甲醚，4.毛瑞香素H-3”-甲醚，5.毛瑞香素G 3”-甲醚，6.毛瑞香素H，7.毛瑞香素G，8.毛瑞香素B，9.芫花素)，共出现12个色谱峰(编号1-12)，其中2、6、7、8为主要峰。根据已知的各种黄酮类化合物色谱峰的保留时间，确定图A中的峰1为芫根苷，峰2为芫花醇A，峰3为毛瑞香素H-3-甲醚，峰4为毛瑞香素H-3”-甲醚，峰5为毛瑞香素G-3”-甲醚，峰6为毛瑞香素H，峰7为毛瑞香素G，峰8为毛瑞香素B，峰9为芫花素，芫花根总黄酮中各化合物的相对保留时间见表1，证明用本发明的方法得到了芫花根总黄酮，含量达9.7％；其中峰8具有最大的峰面积，其次为峰7、6、2、1、9，表明毛瑞香素B为所提取的芫花根总黄酮的主要成分。
表1 芫花根总黄酮中各化合物的相对保留时间
| 峰数 | 保留时间(min) | 相对含量(％) | 化合物 |
| 1234567891011 | 44.7746.7448.6950.6152.5954.0756.8060.2876.6883.0885.69 | 2.315.580.200.242.1614.5823.6442.791.980.772.76 | 芫根苷芫花醇A毛瑞香素H-3-甲醚毛瑞香素H-3”-甲醚毛瑞香素G-3”-甲醚毛瑞香素H毛瑞香素G毛瑞香素B芫花素未知未知 |
| 12 | 87.89 | 1.18 | 未知 |
实施例2、芫花根总黄酮的提取及其HPLC检测
一、提取芫花根总黄酮
选择符合2005年版《中国药典》标准的芫花根药材，用下述方法从中提取芫花根总黄酮，包括以下步骤：
1)将芫花根粉碎；
2)将芫花根与80％乙醇(V/V)按体积比为1∶5混合，在70℃下浸提36小时；
3)离心去除提取液中的沉淀物；
4)将提取液过大孔吸附树脂ADS-17(购自天津大学树脂研究所)，然后用去离子水洗涤树脂，以除去水溶性杂质，再用80％乙醇(V/V)对树脂进行洗脱，得到黄色的洗脱液；
5)将洗脱液在50℃下减压蒸馏后过300目硅胶柱，再用体积比为1∶1的氯仿∶甲醇混合液洗脱，最后对洗脱物进行浓缩，得到芫花根总黄酮。
用与实施例1相同的方法对所提取的芫花根总黄酮进行HPLC鉴定，鉴定结果表明用本发明的方法得到了芫花根总黄酮，含量达9.7％，其中毛瑞香素B为所提取的芫花根总黄酮的主要成分。
实施例2、芫花根总黄酮的细胞毒活性实验
定量称取实施例1提取的芫花根总黄酮，用二甲基亚砜(DMSO)溶解后，再用DMEMF/12培养基(HYCLONE，USA)稀释成5个浓度梯度(1、0.5、0.25、0.125、0.0625mg·mL-1)，加入预先培养48h的人宫颈癌Hela细胞、Walk-250细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、HA-116细胞(均购自中国医学科学院)、小鼠肉瘤S180细胞(购自购自中山医科大学肿瘤研究所)和胎鼠成纤维细胞的96孔板中，每个浓度梯度重复5次，然后将上述细胞继续在37℃、含5％CO2的培养箱中培养24h。培养结束后，用MTT法测定芫花根总黄酮对肿瘤细胞和成纤维细胞的毒性。
生长抑制率统计结果如表2所示，表明芫花根总黄酮对实验肿瘤细胞株和胎鼠成纤维细胞表现出不同的细胞毒活性。在设定的5个剂量中，芫花根总黄酮对Hela细胞、S180细胞显示出显著的细胞毒活性，在浓度为0.125mg·mL-1时，对这两种肿瘤细胞株的抑制率分别达到66.35％和45.39％。芫花根总黄酮对HA-116、MCF-7和Walk-250细胞株也表现出较强的细胞毒活性，在浓度为0.25mg·mL-1时，对这三种肿瘤细胞株的抑制率分别为37.32％、42.27％和38.96％。与之对比，芫花根总黄酮对胎鼠成纤维细胞则表现出较低的细胞毒活性，在同等剂量下，芫花根总黄酮对胎鼠成纤维细胞的抑制率仅为肿瘤细胞的1/2-1/10。上述实验结果表明用本发明方法提取的芫花根总黄酮对肿瘤细胞具有显著的抑制作用，而对正常细胞的毒性作用较小。
表2 对肿瘤细胞与胎鼠成纤维细胞的生长抑制率(n＝10，
x±s)
| 剂量/mg·mL | 成纤维细胞 | 肿瘤细胞 | ||||
| Hela | S180 | Walk-250 | MFC-7 | HA-116 | ||
| 10.50.250.1250.0625 | 35.17±2.23a24.27±3.17a15.14±1.45b5.98±038b1.79±0.11b | 84.05±3.9877.67±5.1470.96±6.2266.35±4.1927.27±1.62 | 79.04±3.3360.18±4.1561.13±3.4545.39±1.8916.21±2.37 | 56.43±5.1438.29±2.3937.32±6.7719.43±1.4416.18±2.31 | 53.94±4.4749.47±3.1647.27±3.5923.53±2.996.89±0.91 | 43.83±5.1143.62±2.6538.96±1.7936.35±2.3130.45±0.49 |
注：与实验组细胞相比较，aP＜0.01，bP＜0.001
实施例3、检测芫花根总黄酮对小鼠荷瘤S180细胞的抑制作用
检测实施例1提取的芫花根总黄酮对小鼠荷瘤S180细胞的抑制作用，实验方法为：取小鼠120只，分为12组，每组10只，雌雄各半，其中11组小鼠按每鼠5×107细胞数将S180细胞接种于小鼠后肢腋下部位作为实验动物模型。给药组(LLC+TFRD)：将芫花根总黄酮用蒸馏水匀浆成浓度确定的悬浮液，按25、50和75mg·kg-1三个剂量对9组模型小鼠灌胃(ig)给药，其中3组在肿瘤接种前7天给药，3组在肿瘤接种的同时给药，3组在肿瘤接种后7天给药，每天1次，连续ig 14天；另设，正常对照组：对正常组小鼠每天ig等体积的蒸馏水，空白对照组(LLC)：ig与肿瘤接种等体积的蒸馏水，阳性对照组(LLC+5-FU)：在肿瘤接种的同时按30mg·kg-1注射(ip)5-氟尿嘧啶(5-FU)。每天记录小鼠体重，并在接入肿瘤的第7天开始用游标卡尺量取肿瘤体积，每2天测量1次。根据公式：肿瘤体积＝长×宽2/2计算瘤体积。末次给药24小时后，先眼眶取血0.5mL，加入含有约1mL 2％肝素钠的指形管中，再小心移入盛有2mL淋巴细胞分离液(购自中国医学科学院)的指形管中，用水平离心机1000g离心15min，吸出淋巴细胞层，台盼蓝染色，用血球计数板计数统计活细胞数。然后处死小鼠，取肿瘤称重，按公式：抑瘤率＝(模型组瘤重-给药组瘤重)/模型组瘤重×100％。同时取胸腺、脾脏，计算胸腺指数与脾指数。
不同组小鼠的瘤体积变化情况如图2所示(A，接种前7天给药；B，接种同时给药；C，接种后7天给药)，表明3个剂量的芫花根总黄酮对肿瘤均表现出不同程度的抑制作用，并随给药时间的延长和给药剂量的增加而呈增强的趋势。3个不同时间给药对实验肉瘤的生长的抑制作用略有差异。接种肿瘤前7天给药或后7天给药，高剂量给药组(75mg·kg-1)和中剂量组(50mg·kg-1)对实验肿瘤的生长均表现出显著的抑制作用。而与接种肿瘤同时给药的高剂量组则显示出相对较弱的抑制作用。肿瘤接种前7天和肿瘤接种后7天的三个剂量组以及与肿瘤接种同时给药的中剂量组对肿瘤生长的抑制作用均明显地高于阳性对照组。
各组小鼠体重、免疫器官、血液中淋巴细胞细胞数的影响以及对肿瘤抑制率的统计结果见表3，荷瘤小鼠体重增长明显低于正常小鼠(P＜0.05)。芫花根总黄酮在肿瘤接种同时给药或提前7天给药则使荷瘤小鼠体重恢复至正常水平以上。肿瘤接种7天后给药小鼠只有低剂量组小鼠的体重恢复至正常水平，中高剂量组小鼠体重则低于正常组。荷瘤小鼠的脾指数、胸腺指数显著低于正常小鼠(P＜0.05，P＜0.01)。芫花根总黄酮3种不同时间给药可使荷瘤小鼠脾指数恢复正常水平。与接种肿瘤同时给药的3个剂量组、提前7天给药的高剂量组和肿瘤接种后7天给药的中剂量组可使荷瘤小鼠胸腺指数恢复至正常水平。荷瘤小鼠淋巴细胞数量显著减少(P＜0.01)。与肿瘤接种同时给药的芫花根总黄酮可使小鼠血液淋巴细胞数量恢复至正常水平，提前7天给药或接种肿瘤7天后给药的小鼠血液淋巴细胞数量显著高于阳性对照组小鼠。3种不同时间给药对实验肿瘤的抑制率均在45％以上。其中，提前7天给药和种后7天给药的芫花根总黄酮对肿瘤的抑制作用呈现出一定的量效关系。与肿瘤接种同时给药或提前7天给药的3个剂量组以及肿瘤接种后给药的中高剂量组对实验肿瘤的抑制作用均显著地高于阳性对照。上述实验结果表明用本发明方法提取的芫花根总黄酮对肿瘤细胞具有显著的抑制作用。
表3 对小鼠体重、免疫器官、血液中淋巴细胞细胞数的影响以及对肿瘤的抑制率统
计结果(n＝10，
x±s)
| 组别 | 剂量/mg·kg-1 | 体重增加/g | 脾指数/mg·g | 胸腺指数/mg·g | 淋巴细胞数/1×106mL-1 | 抑制率/％ |
| 正常组空白对照组5-FU提前给药组 | --30 | 7.27±0.235.36±0.35a2.69±0.01 | 6.64±0.045.01±0.05a4.96±0.09 | 4.03±0.062.89±0.05b0.97±0.05* | 10.90±0.126.17±1.14b4.84±0.31 | --46.20±1.12 |
| TFRD同时给药组TFRD接种后给药组TFRD | 255075255075255075 | 7.58±1.02c8.26±0.73c6.40±0.357.85±1.14d8.15±0.57d6.67±0.677.06±0.07c4.61±0.334.11±0.06 | 4.58±0.025.92±0.826.09±0.12c7.12±0.02c7.91±0.03c5.51±0.045.43±0.035.84±0.084.70±0.08 | 2.64±0.702.79±0.203.39±0.06c3.36±0.08*3.68±0.02c2.98±0.192.49±0.123.39±0.02c1.93±0.08 | 6.32±1.207.11±1.076.55±0.239.47±0.91d9.69±1.02d10.58±1.22d5.67±1.326.03±0.016.42±1.21 | 54.56±6.7755.06±8.9159.81±4.8158.77±2.4667.49±3.1553.06±2.8745.8±1.1962.9±7.3372.1±5.99 |
注：与正常对照组相比，aP＜0.05，bP＜0.01；与空白对照组相比，cP＜0.05，dP＜0.01
实施例4、检测芫花根总黄酮对S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞增值的影响
检测实施例1提取的芫花根总黄酮对S180荷瘤小鼠脾淋巴细胞增值的影响，实验方法为：取小鼠120只，分为12组，每组10只，雌雄各半，其中11组小鼠按每鼠5×107细胞数将S180细胞接种于小鼠后肢腋下部位作为实验动物模型。给药组：将芫花根总黄酮用蒸馏水匀浆成浓度确定的悬浮液，按25、50和75mg·kg-1三个剂量对9组模型小鼠ig给药，其中3组在肿瘤接种前7天给药，3组在肿瘤接种的同时给药，3组在肿瘤接种后7天给药，每天1次，连续ig14天；另设，正常对照组：对正常组小鼠每天ig等体积的蒸馏水，空白对照组：ig与肿瘤接种等体积的蒸馏水，阳性对照组：在肿瘤接种的同时按30mg·kg-1ip 5-氟尿嘧啶。末次给药24h后处死小鼠，无菌制备小鼠脾淋巴细胞，台盼蓝检测细胞活力。用RMPI1640完全培养基(Hyclone，USA)调整细胞浓度为1×106mL-1，加入96孔板，每孔100μl。将各处理组小鼠淋巴细胞分为3组，其中2组分别加入刀豆蛋白A(ConA，Sigma，St.Louis MO，USA)，使其终浓度为5μg·mL-1，或加入脂多糖(LPS，Sigma，St.Louis MO，USA)，使其终浓度为10μg·mL-1。另1组作为平行对照，不加Con A或LPS。每组重复5次。在37℃、5％CO2的培养箱中培养68h，再向每孔加入5mg·mL-1MTT溶液(Sigma，St.LouisM0，USA)10μl，继续培养4h。弃去上清液后，每孔加入DMSO 150μl，静置20min。用酶标仪在570nm测定吸光值(A)。淋巴细胞增值能力以刺激指数(StimulationIndex，SI)表示，即SI＝ACon A或ALPS/A。
实验结果见表4，荷瘤小鼠淋巴细胞对ConA引起的增值反应略低于正常小鼠，而对LPS引起的增值反应则明显低于正常小鼠。芫花根总黄酮预给药的荷瘤小鼠淋巴细胞增值反应显著地高于阳性对照组小鼠，其中中剂量组可使荷瘤小鼠的淋巴细胞增值反应水平超过正常小鼠。与肿瘤接种同时给药或接种7天后给药的小鼠淋巴细胞增值随剂量的增加呈上升趋势。其中经中高剂量组处理的荷瘤小鼠淋巴细胞增值水平高于正常小鼠。
表4 对荷瘤小鼠淋巴细胞增值的影响(n＝10，
x±s)
| 组别 | 剂量/mg·kg-1 | 刺激指数 | |
| Con A | LPS | ||
| 正常组空白组5-Fu提前给药组TFRD同时给药组TFRD接种后给药组TFRD | --30255075255075255075 | 1.10±0.021.05±0.01a1.02±0.001.07±0.031.44±0.13d1.25±0.04c1.03±0.011.09±0.01c1.13±0.00c1.02±0.001.22±0.00c1.26±0.00c | 1.14±0.011.03±0.01a1.02±0.001.05±0.001.22±0.00c1.07±0.181.09±0.00c1.12±0.02c1.22±0.00c1.08±0.121.15±0.00c1.29±0.00c |
注：与正常组相比较，aP＜0.05；与空白对照组相比较，cP＜0.05，dP＜0.01
实施例5、检测芫花根总黄酮对S180荷瘤小鼠NK细胞杀伤活性的影响
检测实施例1提取的芫花根总黄酮对S180荷瘤小鼠NK细胞杀伤活性的影响，实验方法为：取小鼠120只，分为12组，每组10只，雌雄各半，其中11组小鼠按每鼠5×107细胞数将S180细胞接种于小鼠后肢腋下部位作为实验动物模型。给药组：将芫花根总黄酮用蒸馏水匀浆成浓度确定的悬浮液，按25、50和75mg·kg-1三个剂量对9组模型小鼠ig给药，其中3组在肿瘤接种前7天给药，3组在肿瘤接种的同时给药，3组在肿瘤接种后7天给药，每天1次，连续ig14天；另设，正常对照组：对正常组小鼠每天ig等体积的蒸馏水，空白对照组：ig与肿瘤接种等体积的蒸馏水，阳性对照组：在肿瘤接种的同时按30mg·kg-1ip 5-氟尿嘧啶。末次给药24h后处死小鼠，无菌条件下取小鼠脾淋巴细胞作为效应细胞，用DMEM完全培养基(Hyclone，USA)调整细胞浓度为5×106mL-1，加入96孔板，每孔100μl。另取Hela细胞作靶细胞，用完全DMEM培养基调整细胞浓度为1×105mL-1，加入含有小鼠脾细胞的96孔板中，每孔100μl。同时设效应细胞对照组(淋巴细胞200μl)与靶细胞对照组(Hela细胞200μl)。将上述细胞在37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养4h。培养结束后向每孔中加入5mg·mL-1的MTT溶液10μl。继续培养4h，弃去上清液。每孔加入DMSO 150μl，静置20min，用酶标仪测定570nm吸光值。按公式：NK细胞杀伤率＝1-(实验组A值-效应细胞对照组A值)/靶细胞对照组A值测定NK细胞的杀伤活性。
各剂量组的检测结果如图3所示(A，接种前7天给药；B，接种同时给药；C，接种后7天给药)，荷瘤小鼠NK细胞杀伤活性显著低于正常小鼠(P＜0.01)。芫花根总黄酮的3个剂量在3个不同时间给药均能使荷瘤小鼠NK细胞杀伤活性恢复到正常水平以上，并显著地高于阳性对照组小鼠的NK细胞杀伤活性。其中3种不同给药时间的中剂量组(50mg·kg-1)和肿瘤接种7天给后药的高剂量组使荷瘤小鼠NK细胞杀伤活性显著地高出正常小鼠(P＜0.05，P＜0.01)。
实施例6、检测芫花根总黄酮对Lewis肺癌的抑制作用
检测实施例1提取的芫花根总黄酮对Lewis肺癌的抑制作用，实验方法为：选C57BL/6小鼠50只，随机分为5祖，每组10只，分为空白对照组、5-Fu组30mg·kg-1、芫花根总黄酮50mg·kg-1组、100mg·kg-1组和200mg·kg-1组，每只小鼠无菌接种Lewis肺癌细胞(2×107/mL)悬液0.2mL；同时设正常对照组，灌胃等体积的生理盐水。于接种后24h开始灌胃，灌胃21天，最后一次灌胃24h后处死，剥取瘤块，称重，计算抑瘤率，抑瘤率＝(模型组平均瘤重-给药组平均瘤重)/模型组平均瘤重×100％。同时取胸腺与脾脏，称重，计算胸腺指数与脾脏指数。切离肺脏，称重，以实验组小鼠肺重与正常小鼠肺重的差值作为瘤重，计算抑瘤率。将称重后的肺按其原始5叶切开，以Bouin’s液固定24h，再用95％乙醇冲洗，计数肉眼可见各组肺癌转移结节总数。
芫花根总黄酮对Lewis肺癌的抑制作用检测结果见表5，3个剂量组的芫花根总黄酮对Lewis荷瘤小鼠的肿瘤均表现较好的抑制作用，其中以100mg·kg-1组的效果最为显著，抑瘤率为45.51％，高于阳性对照组5-Fu组(36.71％)。与空白对照组的瘤重相比，给药组的各组瘤重均有显著的减轻，且100mg·kg-1组有极显著性差异(p＜0.01)。荷瘤小鼠体重增长明显低于正常小鼠(P＜0.05，P＜0.01)，芫花根总黄酮给药组小鼠体重水平有恢复，其中100mg·kg-1剂量组能恢复至正常水平。空白组荷瘤小鼠的脾指数、胸腺指数与正常组相比均有显著降低(P＜0.05，P＜0.01)，芫花根总黄酮给药组的Lewis肺癌小鼠的脾指数、胸腺指数与空白对照组相比有显著提高，且高于阳性对照组(5-Fu组)
芫花根总黄酮对Lewis肺癌小鼠转移影响的检测结果见表6，表明芫花根总黄酮对Lewis肺癌转移有抑制作用，各剂量均能明显减少肺癌转移结节数，特别是100mg·kg-1组表现最为突出(p＜0.01)。而且对转移后的肿瘤生长有明显抑制作用，给药组各组肺重显著低于空白组的肺重，以50mg·kg-1组效果最好(p＜0.01)。
表5 对Lewis肺癌的抑制作用(n＝10，
x±s)
| 组别 | 体重增加/g | 脾指数/mg·g-1 | 胸腺指数/mg·g-1 | 瘤重/g | 抑瘤率/％ |
| 正常组空白组5-Fu50mg·kg-1100mg·kg-1200mg·kg-1 | 8.21±1.17d4.97±0.77a5.33±0.915.18±1.028.78±0.86d7.87±1.03c | 13.87±0.88d10.71±1.09a9.81±0.7311.76±1.19c12.80±0.84d10.02±0.99 | 2.14±0.12d1.17±0.15a1.15±0.391.42±0.37c1.45±0.84d1.33±0.25c | 2.53±0.421.58±0.23c1.74±0.27c1.38±0.23d1.57±0.07d | 36.7131.1245.4137.23 |
注：与正常对照组相比aP＜0.01；与空白对照组相比cP＜0.05，dP＜0.01
表6 对Lewis肺癌小鼠转移的影响(n＝10，
x±SD)
| 组别 | 肺重(g) | 肺结节数 | 瘤重(mg) | 抑瘤率(％) |
| 正常组空白组5-Fu50mg·kg-1100mg·kg-1200mg·kg-1 | 121.21±9.56d161.48±31.81a141.16±7.09c128.72±10.87c138.31±19.81c136.28±10.58c | 17.5±0.719.10±0.23*13.5±0.62c4.60±0.71d10.8±0.55d | 40.27±11.8519.95±2.86c7.51±9.85c17.1±0.63d15.07±3.31c | 50.4581.3557.5362.57 |
注：与正常对照组相比，aP＜0.01；与空白对照组相比，cP＜0.05，dP＜0.01
实施例7、检测芫花根总黄酮对Lewis肺癌小鼠CTL细胞活性的影响
检测实施例2提取的芫花根总黄酮对Lewis肺癌小鼠CTL细胞活性的影响，实验方法为：选C57BL/6小鼠50只，随机分为5组，每组10只，分为空白对照组、5-Fu组30mg·kg-1、芫花根总黄酮50mg·kg-1组、100mg·kg-1组和200mg·kg-1组，每只小鼠无菌接种Lewis肺癌细胞(2×107/mL)悬液0.2mL；同时设正常对照组，灌胃等体积的生理盐水。于接种后24h开始灌胃，灌胃21天。最后一次灌胃24h后处死，无菌取脾，制成单细胞悬液作为效应细胞，用完全1640培养基调整脾细胞浓度为2×106mL-1。按效/靶比为20∶1的比例分别加入活的Lewis细胞作为靶细胞，同时设效应细胞对照孔和靶细胞对照孔。继续培养8h，用MTT法测其570nmA值。计算CTL杀伤活性，CTL细胞杀伤率＝1-(实验组A值-效应细胞对照组A值)/靶细胞对照组A值。
实验结果见表7，空白组荷瘤小鼠的CTL细胞活性与正常组相比显著降低(p＜0.01)，给药组荷瘤小鼠CTL细胞活性与空白对照组相比有显著的提高，特别是50mg·kg-1剂量组与正常水平相接近，CTL细胞活性随着给药剂量的增加有逐渐减少的趋势。
表7 对Lewis肺癌小鼠的CTL细胞活性的影响(n＝10，
x±s)
| 组别 | 杀伤率％ |
| 正常组空白组5-FU50mg·kg-1100mg·kg-1200mg·kg-1 | 78.3248.37a64.66c72.37d56.77c50.70 |
注：与正常对照组相比，aP＜0.01；与空白对照组相比，cP＜0.05，dP＜0.01
实施例8、检测芫花根总黄酮对Lewis肺癌小鼠LAK细胞杀伤活性的影响
检测实施例2提取的芫花根总黄酮对Lewis肺癌小鼠CTL细胞活性的影响，实验方法为：选C57BL/6小鼠50只，随机分为5祖，每组10只，分为空白对照组、5-Fu组30mg·kg-1、芫花根总黄酮50mg·kg-1组、100mg·kg-1组和200mg·kg-1组，每只小鼠无菌接种Lewis肺癌细胞(2×107/mL)悬液0.2mL；同时设正常对照组，灌胃等体积的生理盐水。于接种后24h开始灌胃，灌胃21天。最后一次灌胃24h后处死，无菌取脾，制成单细胞悬液作为效应细胞，用RMPI1640完全培养基调整脾细胞浓度为5×106mL-1。移入培养瓶中，加入IL-2使其终浓度为1000u·mL-1，将培养瓶置37℃、5％CO2孵箱中培养3d，更换含IL-2为1000u·mL-1的RMPI1640完全培养基，继续培养3d即孵化成LAK细胞。使用前用RMPI1640培养基洗两遍，调浓度为2×106mL-1。按效/靶比为10∶1的比例分别加入K293细胞作为靶细胞，同时设效应细胞对照孔和靶细胞对照孔。继续培养8h，用MTT法测其570nm A值。LAK细胞杀伤率(％)＝{1-[A(效+靶)-A(效)]/A(靶)}×100％。
检测结果见表8，空白组荷瘤小鼠的LAK细胞杀伤活性与正常组相比显著降低(p＜0.01)，芫花根总黄酮给药组的LAK细胞活性与空白对照组相比有显著的提高，特别100mg·kg-1剂量组与正常水平相接近。
表8 对Lewis肺癌小鼠的LAK细胞杀伤活性的影响(n＝10，
x±s)
| 组别 | 杀伤率％ |
| 正常组空白组5-Fu50mg·kg-1100mg·kg-1200mg·kg-1 | 79.3440.11a63.11d65.22c75.09d42.67 |
注：与正常对照组相比，aP＜0.01；与空白对照组相比，cP＜0.05，dP＜0.01
实施例9、检测芫花根总黄酮对Lewis肺癌小鼠淋巴细胞增值的影响
检测实施例2提取的芫花根总黄酮对Lewis肺癌小鼠淋巴细胞增值的影响，实验方法为：C57BL/6小鼠50只，随机分为5组，每组10只，分为空白对照组、5-Fu组30mg·kg-1、芫花根总黄酮50mg·kg-1组、100mg·kg-1组和200mg·kg-1组，每只小鼠无菌接种Lewis肺癌细胞(2×107/mL)悬液0.2mL；同时设正常对照组，灌胃等体积的生理盐水。于接种后24h开始灌胃，灌胃21天。最后一次灌胃24h后处死，无菌取脾，制成单细胞悬液，用RMPI1640完全培养基调整脾细胞浓度为1×106mL-1。加入96孔板，每孔100μl。将各处理组小鼠淋巴细胞分为3组，其中2组分别加入ConA，使其终浓度为5μg·mL-1，或加入LPS，使其终浓度为10μg·mL-1。另1组作为平行对照，不加Con A或LPS。每组重复5次。在37℃、5％CO2的培养箱中培养68h，再向每孔加入5mg·mL-1的MTT溶液10μl，继续培养4h。弃去上清液后，每孔加入DMSO150μl，静置20min。用酶标仪在570nm测定吸光值(A)。淋巴细胞增值能力以刺激指数(Stimulation Index，SI)表示，即SI＝ACon A或ALPS/A。
实验结果见表9，荷瘤小鼠淋巴细胞对ConA引起的增值反应略低于正常小鼠(P＜0.05)，而对LPS引起的增值反应则明显低于正常小鼠(P＜0.05)。芫花根总黄酮给药组淋巴细胞增值反应显著高于荷瘤小鼠组。ConA诱导的淋巴增值以中剂量效果最好，高于正常水平。LPS诱导的淋巴增值以低剂量效果最好，接近正常水平，且随用药剂量的增加而减少。
表9 对Lewis肺癌小鼠淋巴细胞增值的影响(n＝10，
x±s)
| 组别 | 刺激指数 | |
| ConA | LPS | |
| 正常组空白组5-Fu50mg·kg-1100mg·kg-1200mg·kg-1 | 1.34±0.031.19±0.09a1.18±0.0331.22±0.033c1.37±0.020d1.13±0.10 | 1.28±0.050.89±0.07b1.01±0.01c1.18±0.04d0.93±0.06c0.87±0.06 |
注：与正常对照组相比，aP＜0.01，bP＜0.01；与空白对照组相比，cP＜0.05，dP＜0.01
实施例10、检测芫花根总黄酮对超氧自由基的清除作用
采用邻苯三酚自氧化法检测实施例2提取的芫花根总黄酮对超氧自由基的清除作用，检测方法为：取0.05mol·L-1，pH8.2的Tris·HCl缓冲液4.5mL于试管中，4.2mL蒸馏水，置25℃水浴中预热20min。分别加入不同浓度(0.5、0.25.0.125.0.0625、0(空白对照)mg·mL-1)的芫花根总黄酮0.1mL，立即加入在25℃水浴中预热的3mmol·L-1邻苯三酚(由10mmol·L-1HCL配制)0.4mL，混匀后25℃水浴中准确反应4min，立即加入8mol·L-1HCl 2滴终止反应，蒸馏水调零，在420nm处测定吸光度。空白组以0.1mL蒸馏水代替样品试液。按以下公式计算清除率。清除率＝(A空白-A样品)/A空白×100％。
结果见表10，O2 -清除剂能抑制邻苯三酚自氧化过程，使体系的A420特征吸收峰减弱，加入芫花根总黄酮溶液后A420值变小，与对照管比较有显著性差异(P＜0.05)。根据A420值变化，表明各浓度的芫花根总黄酮对O2 -具有清除能力。
表10 对O2 -自由基的清除作用(n＝5，
x±s)
| 组别 | A420值 | 清除率(％) |
| 空白0.5mg·mL-10.25mg·mL-10.125mg·mL-10.0625mg·mL-1 | 0.58±0.020.37±0.00b0.37±0.00b0.43±0.01a0.46±0.01a | 36.39±0.9135.64±0.8226.57±0.8320.52±0.60 |
注：与空白对照组相比，aP＜0.05，bP＜0.01
实施例11、检测芫花根总黄酮对羟基自由基的清除作用
用邻二氮菲-Fe2+氧化法检测实施例2提取的芫花根总黄酮对Fe2+/H2O2体系中产生的羟基(·OH)自由基的清除作用，检测方法为：依次加入邻二氮菲1.5mL，pH7.4的磷酸缓冲溶液及芫花根总黄酮溶液(对照管及未损伤管不加芫花根总黄酮，用蒸馏水补充体积)混匀，再加FeSO4立即混匀，最后加H2O2(未损伤管不加)。最终浓度邻二氮菲0.75mmol·L-1、FeSO40.75mmol·L-1、H2O2 0.01％，总体积9mL。各管置恒温水浴箱37℃保温60min，分别测各管A536。OH清除率％＝(A样品-A损伤)/(A未损-A损伤)×100％。
实验结果见表11，加入芫花根总黄酮后与对照组相比有显著性差异，表明用本发明方法获得的芫花根总黄酮对Fe2+/H2O2体系中产生的羟基自由基具有清除作用，且在0.5-0.0625mg·mL-1范围内随芫花根总黄酮浓度的降低清除率下降。
表11 对·OH自由基的清除作用(n＝5，
x±s)
| 组别 | A420值 | 清除率(％) |
| 对照管(损伤管)未损伤管0.5mg·mL-10.25mg·mL-10.125mg·mL-10.0625mg·mL-1 | 0.64±0.000.76±0.010.71±0.00b0.69±0.00a0.68±0.00a0.65±0.00 | 56.41±0.4348.28±0.6531.51±0.359.47±0.27 |
注：与对照管比较，ap＜0.05，bp＜0.01
实施例12、检测芫花根总黄酮含药血清对自由基的清除作用
检测实施例2提取的芫花根总黄酮含药血清对自由基的清除作用，检测方法为：取正常小鼠50只，灌胃200mg·kg-1的芫花根总黄酮溶液，一天2次，7次后分别在15min、30min、60min、90min、120min取血，分离血清。正常组灌胃生理盐水，制备正常血清。用与实施例10、11相同的方法测定芫花根总黄酮含药血清对超氧自由基、羟基自由基的清除作用。
实验结果见表12，灌胃3天后，血清中药物浓度具有一定的积累，芫花根总黄酮含药血清对超氧自由基具有较强的清除作用。与正常血清组相比，15min的含药血清不能增强清除能力，30min之后随着血药浓度的降低对超氧自由基的清楚率逐渐增加(p＜0.01)。与正常血清组相比，芫花根总黄酮含药血清对羟基有显著的清除作用(P＜0.01)，且与血清中血药浓度变化一致，30min血药浓度最大时清除作用效果最好。
表12 芫花根总黄酮含药血清对自由基的清除作用(n＝5，
X±s)
| 组别 | 清除率(％) | |
| 对超氧自由基清除 | 对羟基自由基清除 | |
| 正常血清组15min30min60min90min120min | 4.81±0.493.25±0.1324.65±0.37a55.91±0.46a75.68±0.34a80.32±0.19a | 16.74±0.3944.29±0.18a58.22±0.52a57.78±0.76a48.15±0.35a44.88±0.13a |
注：与正常血清组，aP＜0.01
实施例13、检测芫花根总黄酮含药血清中的酶活性
检测实施例2提取的芫花根总黄酮含药血清中的酶活性，检测方法为：取正常小鼠50只，灌胃200mg·kg-1的芫花根总黄酮溶液，一天2次，7次后分别在15min、30min、60min、90min、120min取血，分离血清。正常组灌胃生理盐水，制备正常血清。根据试剂盒说明测定血清中SOD活性、GSH-PX活性、CAT活性。
实验结果见表13，与正常血清组相比，芫花根总黄酮含药血清中SOD活性有显著的增加(P＜0.05，P＜0.01)，血药浓度在灌胃后0-30min逐渐上升，30-60min逐渐下降。含药血清中SOD活性在血药浓度达到高峰时最大。含药血清中GSH-PX活性随着给药后时间的延长而逐渐增加，与正常血清组相比有显著增加(P＜0.05，P＜0.01)。与正常血清组相比，给药后血清中CAT活性有显著的提高(P＜0.01，P＜0.01)，CAT活性随着给药后时间的延长而逐渐减弱。
表13 血清中SOD、GSH-PX、CAT活性的测定(n＝5，
X±s)
| 组别 | SOD/u/mgprot | GSH-PX/u/mgprot | CAT/u/mgprot |
| 正常组15min30min60min90min120min | 234.98±9.26365.16±8.75a405.76±11.35a451.37±7.76b436.36±10.39a348.25±12.21 | 752.43±10.21753.53±17.821008.64±9.75b1067.02±6.07b1264.86±13.29b1287.57±14.16b | 12.39±1.3221.03±0.97b17.09±0,78b16.33±1.24b15.15±1.11a13,98±0.94 |
注：与正常血清组相比，aP＜0.01，bP＜0.01
实施例14、检测芫花根总黄酮对H2O2诱导的红细胞氧化溶血能力
检测实施例2提取的芫花根总黄酮对H2O2诱导的红细胞氧化溶血能力，检测方法为：正常小鼠眼眶取血，制成抗凝血，1000g离心10min，移弃血浆和白细胞，向沉淀的红细胞中加入等渗的生理盐水，混匀，1000g离心10min，弃上清液，如此反复2次洗涤红细胞，将红细胞制成0.5％的悬浮液。取红细胞悬液1mL，实验组加不同浓度的芫花根总黄铜溶液，同时设未诱导溶血的空白对照管与模型溶血管，最后加100mmol/L的H2O2，混匀，37℃温浴60min，用生理盐水稀释5倍，1000g离心10min，取上清液，于415nm处测定吸光度值。计算溶血抑制率，抑制率＝(模型组溶血率-实验组溶血率)/(模型组溶血率-空白组溶血率)×100％。
结果见表14，与空白组相比，加入芫花根总黄酮后，H2O2诱导的红细胞氧化溶血能力被明显抑制(p＜0.05，p＜0.01)，且随着给药剂量的减小，溶血抑制率也逐渐降低。
表14 对H2O2诱导的红细胞氧化溶血影响(n＝5，
X±s)
| 组别 | 空白组 | 1mg·mL-1 | 0.5mg·mL-1 | 0.25mg·mL-1 | 0.125mg·mL-1 | 0.0625mg·mL-1 |
| 抑制率 | 26.21±3.42 | 56.95±2.16b | 53.64±2.81b | 41.72±9.70b | 34.43±8.47a | 29.80±1.79 |
注：与空白组相比，aP＜0.01，bP＜0.01
实施例15、检测芫花根总黄酮给药后对离体组织脂质过氧化产物的抑制作用
检测实施例2提取的芫花根总黄酮对离体组织脂质过氧化产物的抑制作用，检测方法为：小鼠禁食12h，处死，取肝、脑脏器，在0-4℃下用生理盐水制成10％的组织匀浆，各管4℃下离心10min，4000r·min-1，取上清液。用MDA试剂盒(购自南京建成生物技术研究所)并根据试剂盒说明书进行检测不同浓度的芫花根总黄酮(1、0.5、0.25.0.125.0.0625、0(空白对照)mg·mL-1)对离体组织脂质过氧化产物的抑制作用，在535nm处测吸光度值(A)。
结果见表15，芫花根总黄酮不同剂量给药组的A值均显著低于空白组，对离体组织肝脏脂质过氧化抑制作用先是随浓度降低增加，然后再逐渐减少，浓度为0.125mg·mL-对离体组织肝脏脂质过氧化抑制作用最为显著(p＜0.01)。对离体脑组织脂质过氧化抑制作用是随浓度的增加而逐渐增强的，浓度为1mg·mL-1效果最为明显(P＜0.01)。
表15 对离体组织脂质过氧化产物MDA的测定(n＝5，
x±s)
| 组别 | MDA肝/nmol/mgprot | MDA脑/nmol/mgprot |
| 空白组1mg·mL-10.5mg·mL-10.25mg·mL-10.125mg·mL-10.0625mg·mL-1 | 5.91±0.784.07±0.82a3.87±0.75b2.78±0.89b1.72±0.63b2.94±0.97b | 16.51±2.313.73±1.12b4.03±0.74b4.48±1.05b5.27±0.6b11.35±1.06a |
注：与空白对照相比较，ap＜0.05；bp＜0.01
实施例16、检测芫花根总黄酮对荷瘤小鼠组织匀浆与血清中MDA、SOD、GSH-Px、CAT活性的影响
检测芫花根总黄酮对荷瘤小鼠组织匀浆与血清中MDA含量、SOD、GSH-Px、CAT活性的影响，实验方法为：ICR小鼠分为正常组、空白组、芫花根总黄酮25mg·kg-1、50mg·kg-1和75mg·kg-1剂量组，每组10只，ig14d，眼球取血，分离血清。脱颈处死，取肝、脑，用冷的生理盐水洗净血液，在冷的生理盐水中剪碎，加冷生理盐水作10％组织匀浆。各管4℃下离心10min，4000r·min-1，取上清液，用氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及过氧化氢酶(CAT)试剂盒(南京建成生物技术研究所)并根据试剂盒说明书进行检测上清液中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及过氧化氢酶(CAT)的活性。MDA含量采用考马斯亮兰法测定。
荷瘤小鼠脑组织中的MDA含量、SOD、GSH-Px、CAT活性检测结果见表16，显著低于空白组(p＜0.01)，接近或低于正常组的水平，其中75mg·kg-1剂量组MDA含量低于正常组；SOD、GSH-PX、CAT的活性较空白组有显著的提高(p＜0.05，p＜0.01)，50mg·kg-1剂量组中三者活性均是最高。荷瘤小鼠肝脏组织中的MDA含量、SOD、GSH-Px、CAT活性检测结果见表17，与空白组相比，给药组的肝脏中MDA含量显著降低(p＜0.01)，其中50mg·kg-1剂量组表现最为显著、接近正常水平；SOD、GSH-PX、CAT的活性较空白组有显著的提高(p＜0.05，p＜0.01)，SOD、GSH-PX均是75mg·kg-1剂量组的效果最好，而CAT却是25mg·kg-1剂量最好。芫花根总黄酮给药组小鼠血清中的MDA含量、SOD、GSH-Px、CAT活性检测结果见表18，给药组小鼠血清中的MDA含量较空白组有显著降低，且随着给药量的增加MDA含量逐渐减少(p＜0.05，p＜0.01)；与空白组相比，给药组小鼠血清中的SOD、GSH-PX、CAT活性均有显著提高(p＜0.05，p＜0.01)。
表16 荷瘤小鼠脑组织中MDA含量、SOD活性、GSH-Px活性及CAT活性的检测结
果(n＝5，
x±s)
| 组别 | MDA(nmol/mgprot) | SOD(u/mgprot) | GSH-Px(u/mgprot) | CAT(u/mgprot) |
| 正常组空白组25mg·kg-150mg·kg-175mg·kg-1 | 16.51±5.31d38.26±3.35a19.63±5.01d18.24±1.21d11.26±2.24d | 557.09±10.12d257.05±6.54b346.87±13.24c469.61±7.21d267.45±4.18 | 211.11±16.78d55.39±14.09a98.52±12.24c171.75±15.05d59.54±6.25 | 35.04±4.86d12.23±2.77a13.30±5.4621.67±3.01d14.44±2.82c |
注：与正常对照相比较，ap＜0.01，bp＜0.001；与空白对照组相比，cp＜0.05，dp＜0.01
表17 荷瘤小鼠肝组织中MDA含量、SOD活性、GSH-Px活性及CAT活性的检测结果
(n＝5，
x±s)
| 组别 | MDA(nmol/mgprot) | SOD(u/mgprot) | GSH-Px(u/mgprot) | CAT(u/mgprot) |
| 正常组 | 5.91±0.78d | 202.69±13.65d | 602.68±13.38d | 11.36±0.78d |
| 空白组25mg·kg-150mg·kg-175mg·kg-1 | 13.54±1.05b9.17±1.34c6.48±0.86d8.74±0.79d | 169.81±15.43a174.29±10.88177.25±20.76c212.61±12.45d | 416.55±12.41a489.28±9.86518.96±20.33c571.56±11.37d | 6.66±1.05a8.65±1.34c10.03±0.86d11.84±0.79d |
注：与正常对照相比较，ap＜0.01，bp＜0.001；与空白对照组相比，cp＜0.05，dp＜0.01
表18 荷瘤小鼠血清中MDA含量、SOD活性、GSH-Px活性及CAT活性的检测结果(n＝5，
x±s)
| 组别 | MDA(nmol/mL) | SOD(u/mL) | GSH-Px(u/mL) | CAT(u/mL) |
| 正常组空白组25mg·kg-150mg·kg-175mg·kg-1 | 1.45±0.34d2.91±0.17a2.54±0.272.18±0.31c1.82±0.13d | 589.99±7.87d420.94±15.68a562.95±9.04d549.42±10.08c464.90±14.17 | 814.55±20.20d503.6±13.34b512.73±11.61661.81±14.42c745.45±10.61d | 11.11±2.48d5.60±1.06b7.36±2.86c12.60±1.61d8.98±1.79c |
注：与正常对照相比较，ap＜0.05，bp＜0.01；与空白对照组相比，cp＜0.05，dp＜0.01
实施例17、芫花根总黄酮含药血清的淋巴细胞增殖实验
制备正常小鼠脾淋巴细胞悬液2×106mL-1，加入96孔板中。实验设正常血清组、含药血清组(芫花根总黄酮含量为0.279μg·mL-1，获得方法参见实施例16)、含药血清+ConA组和含药血清+LPS组，血清的添加量都分别为10％、20％、30％、40％和50％，每孔终体积为200μl，每组5复孔。放入37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养68h，每孔加入5mg·mL-1的MTT溶液10μl，继续培养4h。培养结束后，弃上清，加入150μl的DMSO，用酶标仪测定570nm处的OD值。
结果见表19，表明芫花根总黄酮含药血清对正常小鼠的脾淋巴细胞增值反应有促进作用。与相等添加量正常血清组相比，20％芫花根总黄酮含药血清对脾淋巴细胞增值有显著的促进作用(P＜0.05)；在Con A的诱导下，仅有芫花根总黄酮含药血清添加量为30％时有显著性促进作用(P＜0.05)，在LPS的诱导下，芫花根总黄酮含药血清添加量为20-40％对淋巴细胞增值有显著(P＜0.05)。
表19 含药血清对淋巴细胞增信的影响(A570，n＝5，
x±s)
| 组别 | 正常血清 | 含药血清 | 含药血清+ConA | 含药血清+LPS |
| 10％20％30％40％50％ | 0.32±0.020.37±0.050.56±0.020.74±0.010.83±0.03 | 0.32±0.020.47±0.02a0.60±0.010.74±0.020.84±0.05 | 0.29±0.020.39±0.040.65±0.00a0.74±0.030.69±0.01 | 0.35±0.030.43±0.01a0.71±0.06a0.83±0.03a0.85±0.03 |
注：与正常血清组相比，aP＜0.05
实施例18、芫花根总黄酮含药血清对NK、LAK细胞杀伤活性的影响
无菌制备脾淋巴细胞(效应细胞)2×106mL-1，人慢性髓系白血病K562细胞(靶细胞)浓度为2×105mL-1，以每孔50μl分别加入96孔板。实验孔分别加入不同量的含药血清(芫花根总黄酮含量为0.279μg·mL-1，获得方法参见实施例16)或正常血清，效应细胞与靶细胞对照孔分别加入相同体积的正常血清，每组5个复孔，最终每孔加入RMPI1640完全培养基补足至200μl，血清添加量为10％、20％、30％、40％和50％。放入37℃、5％CO2恒温培养箱中培养4h，每孔加入5mg·mL-1MTT溶液10μl，继续培养4h，弃去上清液。每孔加入150μl的DMSO，静置20min，充分溶解晶体。用酶标仪在570nm处测定OD值，计算杀伤率(％)＝{1-[A(效+靶)-A(效)]/A(靶)}×100％。另无菌制备小鼠脾细胞悬液，调细胞浓度为5×106mL-1，移入培养瓶中，加入IL-2使其终浓度为1000u·mL-1，将培养瓶置37℃、5％CO2孵箱中培养3d，更换含IL-2为1000u·mL-1的培养基，培养3d即孵化成LAK细胞。使用前用RMPI1640完全培养基洗两遍，调浓度为2×106mL-1。LAK细胞活性的检测参照NK杀伤活性的测定方法，LAK细胞杀伤率(％)＝{1-[A(效+靶)-A(效)]/A(靶)}×100％。
检测结果见表20，芫花根总黄酮含药血清能显著提高NK、LAK细胞的杀伤活性。与相等添加量的正常血清对照组相比，含药血清添加量为30％的作用表现最为显著(p＜0.01)；其次是含药血清添加量为20％和40％的(p＜0.05)。
表20 含药血清对NK、LAK细胞的杀伤作用(n＝5，
x±S)
| 组别 | NK杀伤活性(％) | LAK杀伤活性(％) |
| 含药血清 | 正常血清 | 含药血清 | 正常血清 | |
| 10％20％30％40％50％ | 35.32±2.6759.84±0.71a71.11±2.67b62.21±4.24a60.87±2.68 | 27.54±10.0128.91±.1.3830.53±0.6530.00±3.2436.57±6.5 | 55.32±0.76a79.43±2.9a84.57±0.42b77.67±1.28a59.97±5.64 | 30.70±1.3733.44±0.4639.19±0.5238.57±3.3140.34±9.8 |
注：与正常血清组相比，aP＜0.05，bP＜0.01
实施例19、检测芫花根总黄酮含药血清对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
采用中性红吞噬试验检测芫花根总黄酮含药血清对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响，试验方法为：按文献(Zhang S；Wang Q，Li W F，et al.Enhanced antitumorimmunity by murine cytokine activated T lymphocytes after cocultured with bonemarrow derived dendritic cells pulsed with whole tumor lysates.Leukemia Res2004，28(10)：1085-1088.)制备腹腔巨噬细胞悬液，调细胞浓度为1×106mL-1，每孔100μl，再加入10％、20％、30％、40％和50％的含药血清或正常血清，用DMEM完全培养基补足200μl，每组设5个复孔，37℃、5％CO2培养箱培养24h。每孔加入0.075％无菌中性红生理盐水溶液50μl后，继续培养30min，离心后弃去上清液，PBS洗3遍，每孔加细胞裂解液(乙酸∶乙醇＝1∶1)200μ1，用酶标仪测定540nm的OD值。
实验结果见表21，表明含药血清对正常小鼠的腹腔巨噬细胞的吞噬功能具有增强作用，但是与相等添加量的正常血清组相比，只有含药血清添加量为30％时有显著性差异(P＜0.05)。
表21 含药血清对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(A540，n＝5，
x±S)
| 组别 | 含药血清 | 正常血清 |
| 10％20％30％40％50％ | 0.17±0.010.19±0.010.21±0.01a0.21±0.010.20±0.02 | 0.17±0.010.18±0.000.18±0.010.20±0.010.20±0.01 |
注：与正常血清组相比，aP＜0.05
Claims (10)
1、一种芫花根总黄酮的提取方法，包括以下步骤：
1)将芫花根粉碎；
2)将芫花根与体积百分含量为80-100％乙醇按体积比为1∶3-5混合，在40-70℃下浸提12-48小时；
3)去除提取液中的沉淀物；
4)将提取液过大孔吸附树脂，然后用水洗涤树脂，再用体积百分含量为80-100％乙醇对树脂进行洗脱，得到洗脱液；
5)将洗脱液减压蒸馏后过200-300目硅胶柱，再用体积比为1∶1的氯仿∶甲醇混合液洗脱，对洗脱物进行浓缩，得到芫花根总黄酮。
2、根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述步骤2)中芫花根与乙醇混合的体积比为1∶4，浸提温度为60℃，浸提时间为24小时。
3、根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述步骤3)中用离心或过滤的方法去除提取液中的沉淀物。
4、根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述步骤4)中的大孔吸附树脂的型号为ADS-17，用于洗涤树脂的水为去离子水。
5、根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：将所述步骤4)重复1-3次，合并洗脱液。
6、根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述步骤5)中的减压蒸馏在50-60℃下进行。
7、用权利要求1-6任一项所述方法得到的芫花根总黄酮。
8、权利要求7所述的芫花根总黄酮在制备预防和/或治疗性抗肿瘤药物中的应用。
9、权利要求7所述的芫花根总黄酮在制备提高机体免疫力药物中的应用。
10、权利要求7所述的芫花根总黄酮在制备抗衰老药物中的应用。
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|---|---|---|---|
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