CN102349959B

CN102349959B - 芫花总黄酮苷元有效部位的制备及其在抗免疫性炎症药物中的应用

Info

Publication number: CN102349959B
Application number: CN 201110315273
Authority: CN
Inventors: 张春凤; 何欣; 何建廷
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2011-10-18
Filing date: 2011-10-18
Publication date: 2013-07-10
Anticipated expiration: 2031-10-18
Also published as: CN102349959A

Abstract

本发明涉及芫花总黄酮苷元有效部位的制备方法，其主要由芫花素、羟基芫花素、芹菜素、木犀草素和其他苷元组成，可单独或与药学上可接受载体混合，用于制备治疗免疫性炎症药物，尤其适于制备治疗类风湿关节炎的药物。

Description

芫花总黄酮苷元有效部位的制备及其在抗免疫性炎症药物中的应用

技术领域：

本发明涉及芫花总黄酮苷元有效部位的制备，及该总黄酮苷元有效部位及其药物组合物在抗免疫性炎症药物中的应用。

背景技术：

类风湿关节炎是一种病因尚未明了的慢性异质性疾病，属自身免疫性疾病。目前，对于类风湿关节炎的治疗主要采用非甾体类抗炎药(NSAIDs)、改善病情的抗风湿药(DMARDs)、糖皮质激素药和植物药。非甾体类药(NSAIDs)虽常作为治疗类风湿关节炎的一线药物，但均具有明显的不良反应，其缓解症状是由于具有抗炎作用，因此，不能防止组织损伤、关节破坏和畸形。改善病情的抗风湿药(DMARDs)尽管能改善症状，需要长期使用且毒副作用大。对于常规治疗无效时，可以采用糖皮质激素与一、二线药物合用，但长期大量使用糖皮质激素会产生毒副作用。植物药临床主要应用雷公藤多苷片、白芍总苷片、青藤碱等制剂，但各自均有一定的缺陷和局限性。中药具有多成分、多靶点、多环节，且毒副作用小等优势，因此，从中药中开发有效成分明确、质量可控、安全高效的抗类风湿关节炎的新一代有效部位药物是非常必要的。

芫花为瑞香科(Thymelaeaceae)植物芫花(Daphne genkwa sied.etZucc)的干燥花蕾。具有泻水逐饮，行气通脉，解毒消肿的功效，临床主要用于水肿胀满，胸腹积水，痰饮积聚，气逆喘咳，二便不利；外治疥癣秃疮，冻疮。主要分布于长江流域以南各省区及山东、河南、陕西等地。

芫花条与绿豆为民间治疗风湿病的验方，已作为一种中成药在临床上应用，但单味芫花及其中化学成分用于治疗类风湿关节炎并未见相关文献报道。

目前国内对芫花中化学成分的研究较多，文献报道其中含有4’，7-二甲氧基-5-羟基黄酮(4’，7-dimethoxy-5-hydroxyflovone)、芫花素(genkwanin)、木犀草素(luteolin)、芹菜素(apigenin)、羟基芫花素(3’-hydroxy-genkwanin)等黄酮苷元成分，除此之外，芫花中含量比较高的黄酮苷包括羟基芫花素-3′-O-β-D-葡萄糖苷、芫花素-5-O-β-D-葡萄糖苷和木犀草素-7-甲氧基-3′-O-β-D-葡萄糖苷等，但这些苷的溶解性与苷元有较大的区别，很难采用溶剂将苷与苷元同时提取出来，因此有必要采用水解法将苷转化为苷元，增加苷元的提取量，然后进一步提取纯化获得芫花总黄酮苷元有效部位。目前这方面的研究较少，董倩等(芫花及其炮制品的质量评价，辽宁中医药大学(硕士论文).董倩，2010.3)尽管采用公知技术对芫花总黄酮苷元的酸水解工艺进行了研究，但其仅仅以芫花素、芹菜素、木犀草素为考察对象，对酸水解条件进行了考察，并无进一步提取、纯化研究。

本发明采用酶解法、酸水解法、自酶解法使芫花总黄酮苷尽可能的转化为芫花总黄酮苷元，并进一步提取纯化获得芫花总黄酮苷元有效部位，其主要成分为芫花素、羟基芫花素、木犀草素、芹菜素和其他苷元。迄今为止，尚未发现本发明涉及的采用酶解法、自酶解法水解芫花总黄酮苷的文献报道，未发现本发明涉及的芫花总黄酮苷元的提取纯化获得芫花总黄酮苷元有效部位的文献报道，也未发现本发明所涉及的芫花总黄酮苷元有效部位及其药物组合物在抗免疫性炎症(如类风湿关节炎)药物中的应用，也未见采用酸水解水解芫花总黄酮苷后再进一步纯化得到本发明涉及的芫花总黄酮苷元有效部位的文献报道，因此，本发明具有创造性。

发明内容：

本发明解决的技术问题是采用水解法获得芫花总黄酮苷元，并进一步提取纯化获得芫花总黄酮苷元有效部位，以及研究该有效部位在抗免疫性炎症药物的应用，尤其在治疗类风湿关节炎方面的用途。

本发明解决的技术问题还包括芫花总黄酮苷元可供工业化生产的制备方法，以及芫花总黄酮有效部位的组成，鉴于该有效部位的主要化学成分清楚明确，这将有利于工业化生产中的质量控制，从而保证疗效和制剂质量的稳定性。

为解决上述问题，提供如下技术方案：

一种抗免疫性炎症的芫花总黄酮苷元有效部位，芫花总黄酮苷元有效部位主要由芫花素、羟基芫花素、木犀草素、芹菜素及其他苷元组成，按重量百分比计，含有总黄酮苷元50-99％，其制备方法如下：

方法1：

芫花、芫花根、芫花条或了哥王采用酶解或酸水解或自酶解后，再以水溶性溶剂提取，回收溶剂，得芫花总黄酮苷元提取物，所述的水溶性提取物选自水、乙醇的一种溶剂或两种溶剂组成的混合溶剂；

将芫花总黄酮苷元提取物上样于层析柱，再分别以水、20-80％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂后得芫花总黄酮苷元，其中所述的层析柱为大孔树脂或聚酰胺柱；或将芫花总黄酮苷元提取物采用合适极性的溶剂提取，回收溶剂获得芫花总黄酮苷元部位；

方法2：

芫花、芫花根、芫花条或了哥王以水溶性溶剂提取，回收溶剂，得芫花总黄酮提取物，所述的水溶性提取物选自水、乙醇的一种溶剂或两种溶剂组成的混合溶剂；

将芫花总黄酮提取物采用酶解或酸水解后，干燥，得黄酮苷元提取物，上样于层析柱，再分别以水、20-80％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂后得芫花总黄酮苷元，其中所述的层析柱为大孔树脂或聚酰胺柱；或将芫花总黄酮苷元提取物采用合适极性的溶剂提取，获得芫花总黄酮苷元有效部位；

方法3：

芫花、芫花根、芫花条或了哥王以水溶性溶剂提取，回收溶剂，得芫花总黄酮提取物，上样于层析柱，再分别以水、20-80％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂后得芫花总黄酮苷元，其中所述的层析柱为大孔树脂或聚酰胺柱；或将芫花总黄酮苷元提取物采用合适极性的溶剂提取，获得芫花总黄酮苷元有效部位。

所述的芫花总黄酮苷元有效部位，来源于含芫花素、羟基芫花素的药材，优选瑞香科植物芫花、芫花根、芫花条、了哥王。

所述的芫花总黄酮苷元有效部位的制备方法，包括以下步骤：

方法1：

方法2：

方法3：

所述的自酶解优选：

将芫花、芫花根、芫花条或了哥王药材加入0.01-30倍量的水，在20-60℃的条件下，PH为3-9，酶解1-72h，利用其自身酶使其中的苷水解为苷元。

所述的酶解优选：

纤维素酶、蜗牛酶、混合酶、β-D-葡萄糖苷酶或α-D-葡萄糖苷酶，酶解温度20-50℃，酶解Ph值3-9，酶用量0.1-20mg，酶解时间为0.1-72h。

所述的方法，其中经酶解后得到的芫花总黄酮苷元提取物需进一步精制，便能得到纯度更高的芫花总黄酮苷元有效部位，所述的精制方法为上样于层析柱纯化，或者将芫花总黄酮苷元提取物以合适极性的溶剂进行提取，回收溶剂，浓缩干燥后即得到芫花总黄酮苷元有效部位，所述合适极性的溶剂选自70-100∶30-0乙醇∶水、丙酮∶水或甲醇∶水。

所述的芫花总黄酮苷元有效部位在制备抗免疫性炎症药物中的应用。

所述的抗免疫性炎症优选类风湿关节炎、哮喘或鼻炎。

一种药用组合物，含有所述芫花总黄酮苷元有效部位，以及含有药学上可接受的载体。

所述的有效部位或药用组合物可制备成口服制剂、注射剂、吸入制剂或外用制剂。

本发明经进一步研究发现该有效部位主要含芫花素、羟基芫花素、木犀草素、芹菜素及其他苷元，采用该部位50mg/kg口服给药，明显抑制大鼠佐剂关节炎大鼠的原发和继发性足跖肿胀，80mg/kg角叉菜胶所致小鼠足跖肿胀及醋酸所致小鼠扭提反应，说明该有效部位抑制急慢性炎症和疼痛。因此，可用该有效部位制备治疗类风湿关节炎及其他炎症相关疾病的药物。

本发明的芫花总黄酮苷元用于临床时，建议剂量范围为50mg/次，也可以根据剂型的不同和疾病的严重程度，使用剂量超出该范围。

本发明所涉及的芫花总黄酮苷的酶解、自酶解，芫花总黄酮苷元的提取纯化及芫花总黄酮苷元有效部位在抗免疫性炎症药物中的应用均为首次发明，该方法涉及的芫花总黄酮苷元有效部位的酶解、自酶解可以使芫花中的黄酮苷转化为黄酮苷元，可提高芫花中总黄酮苷元的提取率，从而可降低药材的用量，节省药材，降低成本，尤其自酶解转化苷元的方法，不需要另外添加酶，利用芫花自身的酶使其中相应的苷发生水解，因此该方法更简便，快捷，成本更低；本发明采用无毒、安全的溶剂、材料提取纯化该有效部位，更适合于工业化生产。

本发明以帕夫林(白芍总苷胶囊，批号110405，宁波立华制药有限公司)和雷公藤多苷片(批号091202，上海复旦复华药业有限公司)为阳性对照药，采用大鼠佐剂关节炎模型、角叉菜胶致小鼠足跖肿胀模型、醋酸致小鼠扭体反应模型研究发现，芫花总黄酮苷元有效部位明显抑制佐剂大鼠关节炎的原发肿胀和继发肿胀，减轻大鼠足跖的继发性病变，明显抑制角叉菜胶所致小鼠足跖肿胀，明显抑制醋酸致小鼠的扭体反应，且药效均优于帕夫林和雷公藤多苷片，同时佐剂大鼠关节炎大鼠踝关节滑膜病理切片表明80mg/kg的芫花总黄酮苷元有明显的修复关节的作用。

下面通过实施例对本发明进一步描述，但本发明并不限于实施例所述的范围。

具体实施方式：

实施例1.芫花总黄酮苷元的制备

取干燥芫花2kg粉碎，加入含有16g纤维素酶的PH为4.5的缓冲液20L于45℃放置2h后，弃去缓冲液，以90％乙醇20L回流提取2次，提取时间为2h。合并提取液，减压浓缩得浸膏，干燥。将干浸膏以溶剂溶解，溶解液与50g聚酰胺(200-300目)粉末拌匀，干法上样，进行聚酰胺柱层析，先后以水、15％、30％、50％的乙醇洗脱，合并30-50％乙醇洗脱液，减压回收，得干浸膏，经高效液相色谱法测定其中总黄酮苷元含量为87.72％，其中芫花素、羟基芫花素、芹菜素、木犀草素的含量分别为：30.05％、30.45％、19.47％、7.75％。

实施例2.芫花总黄酮苷元的制备

取干燥芫花1kg粉碎，加入含有10g蜗牛酶的PH为5的缓冲液10L于45℃放置2h后，弃去缓冲液，以90％乙醇10L回流提取2次，提取时间为每次2h，合并提取液，减压浓缩得浸膏，干燥。将干浸膏以溶剂溶解，溶解液与20g聚酰胺(200-300目)粉末拌匀，干法上样，进行聚酰胺柱层析，先后以水、15％、30％、50％的乙醇洗脱，合并30-50％乙醇洗脱液，减压回收，得干浸膏，经高效液相色谱法测定其中总黄酮苷元含量为76.60％，其中芫花素、羟基芫花素、芹菜素、木犀草素的含量分别为：27.81％、27.89％、16.51％、4.39％。

实施例3.芫花总黄酮苷元的制备

取干燥芫花1kg粉碎，加入6％盐酸5L，于沸水浴中水解3小时后，弃去酸溶液，以90％乙醇10L回流提取2次，提取时间为每次2h，合并提取液，减压浓缩得浸膏，干燥。将干浸膏以溶剂溶解，溶解液与20g聚酰胺(200-300目)粉末拌匀，干法上样，进行聚酰胺柱层析，先后以水、15％、30％、50％的乙醇洗脱，合并30-50％乙醇洗脱液，减压回收，得干浸膏，经高效液相色谱法测定其中总黄酮苷元含量为65.60％，其中芫花素、羟基芫花素、芹菜素、木犀草素的含量分别为：23.83％、23.67％、13.52％、4.48％。

实施例4.芫花总黄酮苷元的制备

取干燥芫花1kg粉碎，加入Ph为6.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液13L，于45℃下放置28h，，以80％乙醇20L回流提取2次，提取时间为每次2h，合并提取液，减压浓缩得浸膏，干燥。将干浸膏以溶剂溶解，溶解液与20g聚酰胺(200-300目)粉末拌匀，干法上样，进行聚酰胺柱层析，先后以水、15％、30％、50％的乙醇洗脱，合并30-50％乙醇洗脱液，减压回收，得干浸膏，经高效液相色谱法测定其中总黄酮苷元含量为78.92％，其中芫花素、羟基芫花素、芹菜素、木犀草素的含量分别为：29.28％、29.17％、16.82％、3.65％。

实施例5.芫花总黄酮苷元的制备

取干燥芫花1kg粉碎，加入Ph为6.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液13L，于45℃下放置28h，，以80％乙醇20L回流提取2次，提取时间为每次2h，合并提取液，减压浓缩得浸膏，干燥。将干浸膏以溶剂溶解，溶解液与20g大孔树脂(200-300目)粉末拌匀，干法上样，先后以水、15％、30％、50％、60％的乙醇洗脱，合并30-60％乙醇洗脱液，减压回收，得干浸膏，经高效液相色谱法测定其中总黄酮苷元含量为61.77％，其中芫花素、羟基芫花素、芹菜素、木犀草素的含量分别为：22.87％、22.79％、13.72％、2.39％。

实施例6.芫花总黄酮苷元的制备

取干燥芫花1kg粉碎，加入Ph为6.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液13L，于45℃下放置28h，，以80％乙醇20L回流提取2次，提取时间为每次2h，合并提取液，减压浓缩得浸膏，干燥。将干浸膏粉加加入500ml丙酮∶水(8∶2)提取3次，减压回收溶剂，得干浸膏，经高效液相色谱法测定其中总黄酮苷元含量为51.07％，其中芫花素、羟基芫花素、芹菜素、木犀草素的含量分别为：19.35％、19.16％、9.22％、4.34％。

实施例7.芫花总黄酮苷元的制备

取干燥芫花1kg粉碎，加入Ph为6.4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液13L，于45℃下放置28h，，以80％乙醇20L回流提取2次，提取时间为每次2h，合并提取液，减压浓缩得浸膏，干燥。将干浸膏粉加入500ml丙酮∶水(7∶3)提取3次，减压回收溶剂，得干浸膏，经高效液相色谱法测定其中总黄酮苷元含量为59.25％，其中芫花素、羟基芫花素、芹菜素、木犀草素的含量分别为：26.35％、22.16％、6.24％、4.50％。

实施例8.芫花总黄酮苷元的制备

取干燥芫花1kg粉碎，加入80％乙醇20L回流提取2次，提取时间为每次2h，合并提取液，减压浓缩得浸膏，在浸膏粉中加入含8g纤维素酶的PH4.5的缓冲液20L于45℃放置2h后，干燥，得干浸膏，将干浸膏以溶剂溶解，溶解液与20g聚酰胺(200-300目)粉末拌匀，干法上样，进行聚酰胺柱层析，先后以水、15％、30％、50％的乙醇洗脱，合并30-50％乙醇洗脱液，减压回收，得干浸膏，经高效液相色谱法测定其中总黄酮苷元含量为70.56％，其中芫花素、羟基芫花素、芹菜素、木犀草素的含量分别为：26.53％、28.66％、8.94％、6.43％。

实施例9.芫花总黄酮苷元对大鼠佐剂关节炎的影响

将热灭活的乳酪分枝杆菌加入高压灭菌的液体石蜡中，充分研磨均匀，配制成浓度为10mg/ml的混悬液，混匀，作完全弗氏佐剂使用。致炎前，用10％的水合氯醛按0.3ml/100g的剂量麻醉大鼠，用75％酒精擦拭将进行致炎的各大鼠右后足足趾部位，避开大鼠足趾血管部位，为避免致炎剂溢出，1ml注射针头进入大鼠右后足跖皮内3/4左右，进而注射弗氏完全佐剂0.1ml致炎。各组大鼠均于继发性足趾肿胀出现后第21天灌胃给予供试药物，实验组给予本发明芫花总黄酮苷元12.5、25、50mg/kg，对照组给药帕夫林(白芍总苷)155mg/kg，连续给药10天，每天一次，给药至致炎后第31天，测定足跖肿胀的程度。

由表1、表2可见，芫花总黄酮苷元50mg/kg口服给药，连续给药10天，显著抑制佐剂大鼠关节炎的原发肿胀和继发肿胀，减轻大鼠足跖的继发性病变，且明显优于帕夫林组和雷公藤多苷片组。

表1芫花黄酮苷元部位对佐剂性大鼠继发性足趾肿胀的影响(x±SD，n＝8)

与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001vs control group)

与中药阳性药帕夫林组比较：^#P＜0.05，^##P＜0.01，^###P＜0.001(^#P＜0.05，^##P＜0.01，^###P＜0.001vs controlgroup)

表2芫花黄酮苷元部位对佐剂性大鼠原发性足趾肿胀的影响(x±SD，n＝8)

实施例10.芫花总黄酮苷元对小鼠角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响

取小鼠60只，随机分6组，分别口服给予芫花总黄酮苷元20.0、40.0、80.0mg/kg，阳性对照组帕夫林(白芍总苷)225mg/kg，阳性对照组雷公藤多苷片11.25mg/kg，对照组给药生理盐水，给药1h后，用10％水合氯醛，按3mL/kg剂量将小鼠麻醉，将小鼠右后肢拉直，局部消毒，于后足跖腱膜皮下注入1％角叉菜胶0.02ml致炎。分别于注射前和注射后1、4h测定足趾肿胀的厚度，计算足跖肿胀率。

由表3可知，芫花总黄酮苷元80mg/kg(与大鼠50mg/kg相当)明显抑制角叉菜胶所致小鼠足跖肿胀，抑制作用优于帕夫林组，优于雷公藤多苷片。

表3.芫花黄酮苷元部位对佐剂性小鼠角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响(x±SD，n＝10)

实施例11.芫花总黄酮苷元对醋酸致小鼠扭体反应的影响

取小鼠60只，随机分为6组，分别口服给予本发明的芫花总黄酮苷元20.0、40.0、80.0mg/kg，阳性对照组帕夫林(白芍总苷)225mg/kg，阳性对照组雷公藤多苷片11.25mg/kg，对照组给药生理盐水，1小时后，腹腔注射1％醋酸生理盐水0.2mg/只，观察15分钟内的小鼠扭体反应次数。

由表4可见，芫花总黄酮苷元80mg/kg(与大鼠50mg/kg相当)明显抑制醋酸所致小鼠扭体反应，抑制作用与帕夫林组相当，优于雷公藤多苷片。

表4芫花黄酮苷元部位对醋酸致小鼠扭体反应的影响(x±SD，n＝10)

与白芍总苷组比较：^#P＜0.05，^##P＜0.01，^###P＜0.001(^#P＜0.05，^##P＜0.01，^###P＜0.001vs control group)

与雷公藤多苷片组比较：^&P＜0.05，^&&P＜0.01，^&&&P＜0.001(^&P＜0.05，^&&P＜0.01，^&&&P＜0.001vs controlgroup)

Claims

1.一种抗免疫性炎症的芫花总黄酮苷元有效部位，其特征是芫花总黄酮苷元有效部位主要由芫花素、羟基芫花素、木犀草素、芹菜素及其他苷元组成，按重量百分比计，含有总黄酮苷元50-99％，其制备方法如下：

方法1：

方法2：

方法3：

2.如权利要求1所述的芫花总黄酮苷元有效部位，其特征在于其来源于含芫花素、羟基芫花素的药材，瑞香科植物芫花、芫花根、芫花条、了哥王。

3.权利要求1所述的芫花总黄酮苷元有效部位的制备方法，其特征是包括以下步骤：

方法1：

方法2：

方法3：

4.如权利要求3中所述的芫花总黄酮苷元有效部位的制备方法，其特征是所述的自酶解为：

将芫花、芫花根、芫花条或了哥王药材加入0.01-30倍量的水，在20-50℃的条件下，PH为3-8，酶解1-72h，利用其自身酶使其中的苷水解为苷元。

5.如权利要求3中所述的芫花总黄酮苷元有效部位的制备方法，其特征是所述的酶解采用的酶为纤维素酶、蜗牛酶、混合酶、β-D-葡萄糖苷酶或α-D-葡萄糖苷酶，酶解温度为20-60℃，酶解Ph值3-8，酶用量0.01-20mg/g，酶解时间为0.1-72h。

6.如权利要求3中所述的方法，其中经酶解或酸水解后得到的芫花总黄酮苷元提取物或直接从药材提得芫花总黄酮后需进一步精制，便能得到纯度更高的芫花总黄酮苷元有效部位，所述的精制方法为上样于层析柱纯化，或者将芫花总黄酮苷元提取物以合适极性的溶剂进行提取，回收溶剂，浓缩干燥后即得到芫花总黄酮苷元有效部位，所述合适极性的溶剂选自70-100∶30-0乙醇∶水、丙酮∶水或甲醇∶水。

7.权利要求1所述的芫花总黄酮苷元有效部位在制备抗免疫性炎症药物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的抗免疫性炎症为类风湿关节炎、哮喘或鼻炎。

9.一种药用组合物，其特征在于含有权利要求1所述芫花总黄酮苷元有效部位，以及含有药学上可接受的载体。

10.如权利要求1和9所述在抗免疫性炎症药物中的应用，其特征在于所述的有效部位或药用组合物可制备成口服制剂、注射剂、吸入制剂或外用制剂。