CN1907308A - 一种治疗肿瘤的中药组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种能有效的治疗肿瘤疾病药物组合,它由人参、灵芝、斑蝥和干蟾皮组成。它具有清热解毒、消瘀散结的功能,适用于原发性肝癌、肺癌、直肠癌、恶性淋巴癌、妇科恶性肿瘤等疾病的治疗,各类肿瘤术后的巩固治疗,也可以与放、化疗配合使用,增效减毒的药物制剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗治疗肿瘤的中药组合物,具体地说是由人参、灵芝、斑蝥和干蟾皮组成的药物组合物。
背景技术
近年来随着我国对中药抗肿瘤的重视和深入,如何利用现代医学研究手段探讨并寻找中药抗肿瘤活性成分和明确其肿瘤作用机制成为研究的重点和热点领域。传统医学对肿瘤的认识历史悠久,经典著作《黄帝内经》中对肿瘤有“除积之药,知在攻补之益”的论述,特别是对“毒、瘀、虚”理论在肿瘤方面的内在病理有广泛的应用,可见,中医理论对肿瘤治疗强调“扶正祛邪”、“解毒祛瘀”、“阴阳平衡”的辨证施治。从现代医学观点来看,扶正祛邪的根本目的在于改善和恢复机体神经—体液调节,增强免疫调节,从而杀死体内的恶性肿瘤细胞,手术、放疗、化疗虽然都是祛邪抗癌的有效手段,但着眼于消灭癌性病灶,势必会造成机体气血耗伤,脏腑功能紊乱失调,相反,中医着眼于整体,在祛邪抗癌同时给予扶正培本以达到攻补兼施。
扶正固本药,调节机体免疫功能状态,使机体的抗肿瘤免疫功能得以加强是中药抗肿瘤机制之一。众所周知,肿瘤的发生与机体的免疫状态密切相关,免疫力降低可以导致肿瘤的发生、恶化和转移、复发,祖国医学认为“正气不足,而邪气距之,积之成也”。对肿瘤的治疗也须祛邪与扶正并举,才能发挥更好的疗效,肿瘤患者机体免疫功能常常处于低下状态,而提高免疫功能能够提高机体识别异己能力,达到杀灭肿瘤的目的。
本类药物多具补益功能,毒性低,患者易耐受,对体质虚弱的中晚期癌症患者具有良好的临床效果。主要有人参、黄芪、淫羊藿、山茱萸、何首乌、黄精、甘草、肉苁蓉、杜仲等。目前研究较为深入的有人参皂甙Rg3,最近研究表明,Rg3不仅具有抑制肿瘤生长作用,而且还有抑制肿瘤血管生成、抗肿瘤转移和复发作用。另外还有许多近年来研究的热点中药提取物多糖,如灵芝、枸杞子、黄芪、冬虫夏草、猪苓、茯苓等,实验研究表明,云芝多糖对小鼠S180、腹水型肝癌等均有抑制作用,另有报道,云芝多糖还可以诱导IL-2、IL-6等多种细胞因子的产生;人参多糖、红芪多糖分别能增加特异性体液及细胞免疫功能,如INF、NK等。
活血祛瘀药,众多研究表明,大多数癌症患者均存在高凝状态,而且此种状态与肿瘤的复发转移有密切关系,活血化瘀药物是近几年被逐渐认同的肿瘤辅助用药,可以改善癌症患者的高凝状态,目前研究较多的是川芎、丹参、莪术、牛膝、姜黄、乳香、王不留行等。其中,川芎嗪可以明显抑制肿瘤的转移;乳香中的乙酰乳酸对人早幼白血病细胞HC-60有明显分化诱导作用,美国曾对302种中药进行筛选,发现很多活血化瘀药物(如红花、王不留行、苏木等)水提液对多种瘤株具有杀伤作用,其中以苏木作用最强,特别是对K562、L929、Yac-1具较强杀伤力,对EAC、P383、L2110具有明显生命延长率。但效果并不显著。
清热解毒药,诱导细胞凋亡是目前研究最为热点的中药抗肿瘤机制,越来越多的证据表明中药抗肿瘤的疗效与中药诱导肿瘤细胞凋亡有关。清热解毒类药物一方面可以具有抗癌特性,另一方面可以缓解患者肿瘤热症状、治疗并发的感染、提高免疫功能。如苦参、白花蛇舌草、山豆根、斑蟊、长春花、冬凌草、穿心莲、黄芩、天花粉、夏枯草等,这类药物作用于癌细胞生长的不同阶段,如苦参可以影响蛋白质合成、干扰癌细胞能量代谢;斑蟊可以促进癌细胞凋亡,破坏癌细胞膜,导致肿瘤细胞死亡;黄芩提取物黄芩新素,体外对L1201瘤株ED50为1.5μg/ml,黄芩的另一种成分白杨素对鼻咽癌细胞有明显的杀伤作用。有些植物中药在广泛临床和体内外动物实验研究基础上,经过提纯成为化疗药物,如长春花提取的长春碱、冬凌草提取的冬凌碱、紫杉树皮提取的紫杉醇(泰索帝)、砒霜中提取的亚砷酸等,成为目前临床常用的化疗药,引起国内外医学界的广泛重视。其毒性也是明显的。
泻下药,研究较多的中药有巴豆、大戟、芦荟、商陆等,这类中药是一组毒性较大的中药,而且在临床中也有一定的争议,如巴豆中提取的TPA是一种强促癌剂,但它对HL-60细胞却有显著的诱导分化作用,巴豆的另一抗癌有效成分为一糖蛋白moguin,分子量为9000,其中单链蛋白质专属抗癌活性,对正常细胞无效。另外,商陆多糖、芦荟甘露聚糖等均有研究证明具有明显的抗癌作用。
在中药中还有很多的中药如:山楂、真菌类多糖、紫菀、鲨鱼软骨素及其一些复方等均有研究证明具有抗癌活性成分。还有一些可以明显减轻放化疗的副作用及增敏作用。这些研究表明,以中医药理论为基础的中药抗癌研究是可行的,而且各类中药的抗癌活性成分与各类中药的药理药性密切相关。
在寻找有效的抗癌药物方面,世界范围内都投入了大量的人力、物力,但到目前为止,还没有一种药物能将某种肿瘤治愈,肿瘤的发生、发展的原因至今未明,这为中医药治疗肿瘤的研究带来极大的困难,因此中医药研究更注重的是辨证论治和现代医学的多靶向,近几年来研究证明,无论是在抑制、杀伤肿瘤细胞,调节机体免疫功能,改善症状和体征,还是减轻放化疗副作用,中医药均发挥了重要的作用。
植物中提取有效成分,包括长春碱类(长春碱、长春新碱、长春酰胺、长春瑞宾等)、喜树碱类(喜树碱、羟基喜树碱)、榄香烯、由苡米仁中提取的康莱特、猪苓多糖、仙灵多糖、黄芪多糖和人参皂甙等。从中药青黛中提取的有些成分对慢性白血病有效,以后又半合成了疗效进一步提高。从植物三尖杉中提取的三尖杉酯碱和高三尖杉碱对急性非细胞细胞白血病有突出疗效,目前在国际上作为三线药物应用。应用维甲酸制剂和三氧化二砷治疗白血病是我国临床肿瘤学家的创举,目前已经得到国际上承认广泛应用。我国在应用中药复方作为辅助治疗具有一定现实应用意义,也经国际同行广泛验证。近年来我国在研制具有自主知识产权的新药也有一些成绩,例如CN200410037110,cn200410051412,CN200410004443,CN03117114。上市产品如艾迪、康莱特、鸭胆子油、得力生注射液、复方苦参参注射液、复方斑蝥注射液等,单一成分如参一胶囊(人参皂甙Rg3)有较好的临床效果。
但是,上述产品的临床应用还不尽人意,如艾迪主要的毒性反应为肝、肾功能损害,对心脏毒性反应也有报道。临床发现有低热现象,对注射部位有一定的刺激或引起静脉炎,致使滴速减慢。个别患者可在输液过程中有恶心欲吐的胃肠道反应,另外极个别会出现面红、荨麻疹、胸闷等皮疹和呼吸困难的不良反应。得力生注射液主要的临床报道都是辅助放化疗。
本发明由人参、灵芝、斑蝥和干蟾皮组成,方中人参、灵芝扶正固本,增强肿瘤病人的抗癌能力,减轻放化疗的副作用及增敏作用。干蟾皮、斑蟊攻坚解毒,破瘀散结,为中药中的最强的抗癌中药,攻补相互配合,相得益彰。经动物药理实验证明比现有制剂有更好的疗效,更低的不良反应。
干蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍B.melanostictrs Sc-hneider等的皮。成分一般与蟾酥相似,华蟾素注射液临床应用多年。但其毒性大。
斑蝥为芫青科昆虫南方大斑蝥Mylabris phalerata Pallas或黄黑小斑蝥Mylabris cichorii Linnaeus的干燥体。具有抗癌作用的药物,抑制DNA和RNA合成,对肝脏和癌细胞有较强的亲和性,对原发性肝脏及其他癌症有效,且无骨髓抑制作用,同时还具有升高白细胞数,抗病毒,抗炎作用。但其毒性大。
人参为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根。栽培者为“园参”,野生者为“山参”。人参皂甙Rg3可作用于细胞生殖周期的G2期,抑制癌细胞有丝分裂前期蛋白质和ATP的合成,使癌细胞的增殖生长速度减慢,并且具有抑制癌细胞浸润、抗肿瘤细胞转移、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长等作用。人参皂甙Rh具有抑制中枢神经、催眠作用,镇痛、安神、解热、促进血清蛋白质合成作用,抑制中性脂肪分解、促进类胰岛素成分合成、促进胆固醇生物合成、活化、促进DNA合成作用。人参皂甙Rh2具有抑制癌细胞向其它器官转移,增强机体免疫力,快速恢复体质的作用。对癌细胞具有明显的抗转移作用,可配合手术服用增强手术后伤口的愈合及体力的恢复。人参多糖对环磷酰胺所致小鼠巨噬细胞吞噬功能抑制、溶血素形成抑制和迟发型超敏反应抑制均有恢复正常的作用,可使负荷S180小鼠脾脏溶血空斑形成细胞(PFC)、特异玫瑰花形成细胞(SRFC)、血清抗SRFC抗体和脾细胞抗体分泌量明显增加。人参多糖对受X射线一次全身照射的小鼠预防给药,有明显的抗辐射损伤作用,提高照射动物30天存活率。人参多糖还可明显抑制小鼠艾氏腹水癌细胞增生,对S180有显著体内抗肿瘤作用,尤其与化疗药物环磷酰胺合用效佳。人参多糖还具有清除超氧自由基及羟自由基作用。但目前还没有一种制剂含较高量二醇组皂苷和人参多糖。
灵芝为多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.或紫芝Ganoderma sinense Zhao,Xu et Zhang的干燥子实体。灵芝多糖能显著提高吞噬细胞的吞噬能力;增强细胞免疫功能,提高红细胞中超氧化物歧化酶SOD的活性;对人体具有显著的抑制肿瘤作用;增加人体器官细胞的活力,促进新陈代谢,排除体内毒素;现有灵芝多糖的制剂上市。三萜类化合物能抑制细胞组胺释放。但是现在还有一种制剂既含多糖,又含三萜类化合物。
本发明的药理实验证明:本发明的的制剂具有清热解毒、消瘀散结的功能,适用于原发性肝癌、肺癌、直肠癌、恶性淋巴癌、妇科恶性肿瘤等疾病的治疗,各类肿瘤术后的巩固治疗,也可以与放、化疗配合使用,增效减毒,与现有技术相比其治疗效果更明显,毒性更低。
发明内容
经过我们大量的科学研究,发现了人参、灵芝、斑蝥和干蟾皮组成的药物组合物有很强的治疗肿瘤疾病的作用,并对此发明做了进一步的完善,将这种组合物制成便于临床实施应用的药物制剂。
本发明的一个目的是提供一种具有清热解毒、消瘀散结的功能,适用于原发性肝癌、肺癌、直肠癌、恶性淋巴癌、妇科恶性肿瘤等疾病的治疗,各类肿瘤术后的巩固治疗,也可以与放、化疗配合使用,增效减毒,与现有技术相比其治疗效果更明显,毒性更低。
本发明的另一个目的是提供一种制备以上组合物的生产工艺。
人参提取物的制备:取人参粗粉500g,加5000ml 70%乙醇回流提取三次(第一次浸泡过夜),每次1小时,合并三次提取液,滤过,滤液回收乙醇,并浓缩至稠膏每1ml相当于原生药2g的溶液,用10%氢氧化钠溶液调节pH值至9.5,加乙醇溶液使含醇量达90%,取上清液,减压回收乙醇,浓缩至相当于生药材1∶1,加水稀释至1000ml,用10%盐酸溶液调pH值7左右,冷藏12小时,滤过,滤液上已处理好的D101大孔吸附树脂柱(树脂用量与药材比为1∶5),依次用4000ml水和25%乙醇4000ml洗脱,弃去洗脱液,再用70%乙醇溶液4000ml洗脱,收集洗脱液,滤过,回收乙醇,浓缩至每1ml相当于原生药5g的稠膏,于100℃减压干燥,即得人参提取物,备用。
灵芝提取物的制备:取灵芝5kg,超微粉碎,用水50L50℃超声提取2次,每次20分钟,合并提取液,过滤,滤液减压干燥,即得灵芝提取物,备用。
斑蝥提取物的制备:称取斑蝥2kg,加入20L倍量125mmol/L氢氧化钠溶液,超声波发生器中,功率600kHz超声提取2次(25,15min)。提取液滤过,合并滤液,以3000r/min离心10min,上清液水浴浓缩至20L,减压干燥即得。
干蟾皮提取物的制备:采用溶媒提取法,将蟾酥1kg粉碎成细粉,用90%乙醇渗漉至无色,残渣继续用80%乙醇渗漉至无色,合并渗漉液。减压浓缩至浸膏状。10L水溶解,静置48小时。取上清液,干燥即得。
本发明的药物组合物的配方如下:
人参1-98.6%、灵芝1-98.6%、斑蝥0.2-98.6%、干蟾皮0.2-98.6%。
采用现有的医药工业领域的制剂技术,可以将上述配方的药物组合物制成各种适合临床使用的药物剂型。以下内容为验证本发明药物组合物(组合物一为实例2,组合物二为实例3)的药理学结果:
一、免疫功能
1-1材料
1-1-1试剂
刀豆蛋白A(ConA)为美国SIGMA公司产品;RPMI-1640为美国GIBCO公司产品;3H-甲基胸腺嘧啶核苷(OH.TDR)由中国原子能科学研究院生产;IL-2试剂盒由北京东亚免疫技术研究所提供;
1-1-2动物分组及给药
昆明种小鼠50只,雌雄各半,体重18-22g,四川省医学科学院实验动物研究所提供,合格证号:川实动管质2004-15。所有动物随机分成正常对照组、本专利组合物一高、低剂量组(简称组合物一高、低剂量组)、艾迪注射液组;组合物一高、低剂量组小鼠分别注射本专利组合物一16.67、8.33mg/kg,分别为临床用量的10、5倍;组合物二组小鼠分别注射本专利组合物二20mg/kg,相当于拟定临床剂量的10倍;艾迪注射液组注射艾迪注射液16.67ml/kg,连续用药7d,正常对照组以等容积蒸馏水代替,于第8天处死,制备脾细胞悬液。
1-1-3营养液
RPMI-1640中加入体积分数为10%的小牛血清、25mmol/L HEPES、2g/L NaHCO3、100mg/L青霉素、100mg/L链霉素。
1-1-4细胞株
小鼠成纤维细胞(L929)由珠江医院血液科提供,连续4d常规方法传代培养,实验前1d换液,实验时用2.5g/L胰蛋白酶1~2mL消化1~2min,收集细胞,调细胞浓度至2×108/L,活细胞数大于95%,即为备用的NK靶细胞。
1-2方法
1-2-1小鼠脾细胞悬液制备
实验用小鼠摘眼球放血,颈椎脱位法处死后,无菌取脾,在100目铜网上轻轻挤压,制成脾细胞悬液,用低渗法除去红细胞,以不含血清的1640培养液洗涤2次,将细胞重悬于RPMI-1640完全培养液中,配成1×1010/L脾细胞悬液,作为效应细胞。
1-2-2小鼠脾细胞IL-2诱生
取小鼠脾细胞悬液接种在24孔培养板内,1ml/孔,再加ConA 5mg/L,置于37~C、体积分数为5%CO2培养箱中培养24h,离心后收集上清,于一20~C保存备用。
1-2-3IL-2活性测定
采用放射免疫测定(RIA)法,按试剂盒说明书操作。
1-2-4NK细胞活性测定
取上述靶细胞悬液,加入96孔平底培养板中,0.1ml/孔,放入37℃、体积分数为5%CO2孵箱中孵育4h,使靶细胞贴壁成一单层细胞,再向每孔加0.1mL效应细胞,同时设效应细胞对照孔,再放入37℃、体积分数为5%CO2孵箱中孵育24h,实验结束前1h倾去上清液,用牛理盐水轻轻灌满各孔,反复3次以除去效应细胞及被效应细胞杀伤而脱落下来的靶细胞,在滤纸上吸1孔内水份,每孔加入1g/L中性红染液0.1ml,37℃、体积分数为5%CO2孵箱中孵育1h,弃去染液,用生理盐水洗3遍。每孔加入0.1mL细胞溶解液(体积分数为50%冰醋酸和50%无水乙醇配制),溶解留下的靶细胞,5min后轻轻摇匀,用酶标仪在490nm处测定光密度(D),参考波长为450nm,以留下靶细胞的D值表示NK活性,并汁算NK细胞杀伤率:
Pnk=(I-D实验孔)/D对照孔×100%
1-2-5脾淋巴细胞增殖测定
取小鼠脾细胞悬液100ul/孔,同时加入浓度为5mg/L的ConA100uL,对照组加入200ul RPMI-1640,每孔设3个复孔,置37℃、体积分数为5%CO2培养箱内培养66h,每孔20ul掺入H-TDR 18 500Bq,继续培养至72h,收集细胞于49型玻璃纤维滤纸上,80℃烘干30min,在液体闪烁计数器上测每分钟计数(CPM),计算平均值,并以下列公式计算脾淋巴细胞增殖指数:
I=n实验孔/n对照孔
1-3结果
1-3-1本专利组合物一对小鼠NK活性的影响
结果见表1。
表1 本专利组合物一对小鼠NK细胞活性的影响
组别 | N | D(λ=490nm) | Pnk |
正常对照组组合物一低剂量组组合物一高剂量组组合物二组艾迪注射液组 | 1010101010 | 0.16±0.0210.11±0.012*0.09±0.033**0.10±0.028**0.10±0.029** | 32.5±3.4136.9±6.02*42.0±6.34**41.59±5.59**41.5±5.67** |
注:*与对照组比较P<0.05;**与对照组比较P<0.01
1-3-2本专利组合物一对小鼠IL-2生成能力及脾淋巴细胞增殖的影响结果见表2。
表2 本专利组合物一对小鼠IL-2生成能力及脾脏淋巴细胞增殖的影响
组别 | 动物数 | PIL-2 | I |
正常对照组组合物一低组组合物一高组组合物二组艾迪注射液 | 1010101010 | 1.25±0.4311.69±0.356*1.95±0.482**1.86±0.572**1.82±0.513** | 1.85±0.292.09±0.51*2.40±0.42**2.36±0.35**2.31±0.37** |
注:*与对照组比较P<0.05;**与对照组比较P<0.01
实验结果表明,本专利组合物一、组合物二能增强NK细胞活性和IL-2生成能力,促进脾淋巴细胞增殖,与对照组比较有显著统计学意义(P<0.05);增强NK细胞杀伤率,并呈剂量相关性,高剂量组稍优于阳性对照药艾迪注射液;表明本专利组合物一、组合物二均能促进机体免疫功能。
二、大鼠肝癌实验研究
1材料与方法
1.1材料 手术显微镜、显微外科手术包
1.2动物及瘤株 雄性SD大鼠,体重200~250g,购自四川省医学科学院实验动物研究所,合格证号:川实动管质2004-15。walker一256瘤株由上海医药工业研究院提供。
1.3大鼠移植性肝癌模型的建立
参照文献:大鼠移植性肝癌模型的制作(李琦,第二军医大学学报)建立大鼠移植性肝癌模型。
1.4给药
本专利组合物一低中高剂量组分别腹腔注射液本专利组合物一8.3mg/kg、16.7mg/kg、25mg/kg;阳性药物组给予艾迪注射液16.67ml/kg;空白对照组(模型组)给予等容量的生理盐水。
2实验结果
2.1疗效标准①生存时间:各组随机取大鼠6只,治疗后次日起观察生存天数,并以生理盐水组为对照计算生命延长率(%)。生命延长率(%)=(治疗组平均存活天数/生理盐水组平均存活天数-1)×100%。②肿瘤生长率:各组余下动物于治疗后第8天处死,测量肿瘤长径(a)和短径(b),按公式V=ab2/2计算肿瘤体积,根据治疗前后的肿瘤体积比,计算肿瘤生长率](Growth rates,GR)。GR=治疗后的肿瘤体积/治疗前的肿瘤体积。③肿瘤坏死程度:完整切取以上处死的大鼠瘤块,置10%福尔马林液中固定,常规石蜡包埋,取瘤体最大剖面作2~3处病理切片,HE染色,光镜下,根据坏死组织所占整个瘤体的比例分为三度:轻度(≤30 9/6)、中度(31 9/5~70%)及重度(71~100%),比较各组肿瘤坏死程度。统计方法:采用SPSS10.0统计软件进行统计分析。
2.2结果
2.2.1本专利组合物一对大鼠肿瘤坏死程度的影响
病理结果显示,治疗后空白对照组肿瘤坏死程度以中度、重度坏死为主,本专利组合物一组和阳性药物艾迪注射液组肿瘤坏死程度以轻中度为主,其中本专利组合物一高剂量组肿瘤坏死程度明显轻于其他各组,也轻于阳性药物艾迪注射液。
2.2.2本对荷瘤大鼠生存时间的影响
治疗后各组荷瘤大鼠平均生存时间有显著差异(P<0.05),本专利组合物一各组、阳性药物艾迪注射液组与生理盐水组组相比,生存时间明显延长(P<0.05)。
三、肺癌
1材料与方法
1.1材料
Lewis肺癌细胞株购于吉林省肿瘤研究所。健康C57BL/6小鼠,雌雄各半,4~6周龄,体重(20±2)g,购于北京军事医学科学院动物室。盐酸。第VII因子(F8)单克隆抗体、血管内皮细胞生长因子(VEGF)抗体及SP免疫组化试剂盒均购于福州迈新生物技术开发公司。
1.2方法
1.2.1Lewis肺癌自发转移模型的建立
制备1×10·mL-1Lewis肺癌细胞悬液,以每只0.2mL接种于小鼠左侧后腿皮下组织,制备传代荷瘤小鼠。在无菌条件下剥取原发瘤组织,以肿瘤(g):生理盐水(mL)为1∶3的比例制成细胞悬液,以每0.2mI接种于小鼠左侧后腿皮下组织内。
1.2.2实验动物分组及给药于接种后第2天,将55只小鼠随机分成4组。对照组(10只)给予等量生理盐水;小剂量给药组(15只)给予本专利组合物一8.3mg·kg_。;中剂量给药组(15只)给予本专利组合物一16.7mg·kg;大剂量给药组(15只)给予本专利组合物一25mg·kg_。采用i.p给药方式,每周连续给药5d,给药2周,停药1周后处死小鼠。
1.2.3绘制肿瘤体积生长曲线待对照组长出原发瘤后,用游标卡尺隔天测量肿瘤长轴(d。)及与之垂直的宽轴(d2),按公式V(t)=0.35[d1(t)×d2(t)]3/2。计算原发瘤体积,绘制肿瘤体积生长曲线引。
1.2.4计算原发瘤抑瘤率
取各组小鼠原发瘤称重,按下列公式分别计算各给药组小鼠原发瘤抑瘤率:原发瘤抑瘤率(%)=(1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100%。
1.2.5检测肿瘤组织微血管密度(MVD)
取部分肿瘤组织,4多聚甲醛固定,F8常规免疫组织化学染色。在显微镜下计数20个视野内肿瘤微血管数目,以平均每高倍镜(×200)视野微血管个数表示MVD。
1.2.6血管内皮细胞生长因子(VEGF)免疫组化染色及阳性表达结果的判定VEGF免疫组化染色采用SP法。以PBS代替一抗作为阴性对照,以已知VEGF阳性的乳腺癌作为阳性对照。阳性表达结果判定采用半定量记分方法,即每张组织切片染色强度:阴性为0分,浅棕黄色为1分,棕黄色为2分,深棕黄色为3分。阳性细胞比例:0%为0分,≤25%为1分,26~50%为2分,>50%为3分。两项打分相加≥2分为VEGF染色阳性(+)。
1.2.7统计学处理所有数据均采用SPSS10.0统计软件进行统计处理。肿瘤体积、肿瘤重量及MVD的组间比较采用t检验,VEGF阳性率的组间比较采用卡方检验。
2结果
2.1肿瘤体积生长曲线
对照组小鼠肿瘤生长曲线陡直,给药组生长曲线均位于对照组曲线下方,且中、大剂量组比小剂量组小鼠肿瘤生长曲线平缓,中、大剂量组与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。
2.2原发瘤抑瘤率
根据上述公式计算本专利组合物一大、中、小剂量组小鼠原发瘤抑瘤率分别为71.04%、49.89%及25.73%。本专利组合物一各剂量组平均原发瘤重与对照组比较,差异均有显著性(P<0.05)。
2.3肿瘤组织微血管密度
经统计学处理,本专利组合物一中、大剂量组与对照组比较,MVD差异有显著性(P<0.05),小剂量组MVD小于对照组,但差异无显著性(P>0.05)。
四、胃癌
1材料和方法
1.1动物与瘤种 近交系615小鼠,雄性,体重18~22g,四川省医学科学院实验动物研究所;小鼠前胃癌FC瘤种,四川省医学科学院实验动物研究所。
1.2药品 环磷酰胺CTX(上海华联制药厂),RPMI培养基,美国Sigma公司,DMSO,美国GIBO公司。
1.3仪器 二氧化碳培养箱6100型,日本SANYANG公司;倒置显微镜CDS-1型,重庆光学仪器厂;酶标仪MB3型,北京新技术应用研究所。
1.4实验方法
1.4.1体内抑瘤实验及毒性观察
取小鼠腹腔内传代7d的FC瘤细胞,无菌生理盐水洗涤2次,计数后调瘤细胞到1×106个/mL,于每鼠右腋皮下注射瘤细胞悬液0.2mL,于接种第2天,按性别和体重随机分为5组:①本专利组合物一高剂量组25mg/kg体重(生药量,下同;相当于I临床人用量的15倍)、②本专利组合物一中剂量组16.7mg/kg体重(相当于临床人用量的10倍)、③本专利组合物一小剂量组8.3mg/kg体重(相当于临床人用量的5倍),连续ip本专利组合物一14d,④生理盐水对照组,⑤以环磷酰胺、艾迪注射液为阳性对照药,于第1、第3、第5、第7、第9、第11、第13天ip。于给药前及给药后第15天尾静脉取血计数白细胞,并计算给药前后白细胞的变化。同时称取给药前及给药后第15天小鼠体重,计算给药前后体重的变化。第15天颈椎脱臼处死小鼠,测定瘤重、胸腺和脾脏重量,计算肿瘤生长抑制率(IR)和脏器系数。
1.4.2体外抑瘤实验
MTY法检测ZJF对FC瘤细胞增殖的抑制作用。取对数生长期细胞,制成1.0×109/L悬液,按每孔100uL,接种于96孔培养板(1×104cell.well)培养4h,分别为:本专利组合物一组(浓度为100,50,25,16.7,8.3mg/mL的加药培养基),空白对照组加100ul培养液,每组设5复孔,37℃、5%CO2继续培养48h后,每孔加入浓度为5g/L的MTY 20L,于培养箱中孵育4h,吸取上清,每孔加入150ul的DMSO,充分震荡,酶标仪检测各孔的光密度吸收值,计算肿瘤细胞生长抑制率。
1.5统计方法数据采用t检验。
2结果
2.1本专利组合物一的抗肿瘤作用及对免疫器官指数的影响与生理盐水组比较,本专利组合物一各剂量组都有一定的抗肿瘤作用(P<0.05,P<0.01),其中100mg/kg剂量组作用最为明显(P<0.01);本专利组合物一25mg/kg和本专利组合物一16.7mg/kg剂量组ip可明显降低脾指敷(P<0.05,P<0.01),其中25mg/kg剂量组作用较强(P<0.01);本专利组合物一25mg/kg和本专利组合物一16.7mg/kg剂量组、8.3mg/kg可增加胸腺指数,其中25mg/kg剂量组最为明显,且优于阳性药物艾迪注射液。表明本专利组合物一体内抗肿瘤作用与对免疫功能的影响有密切关系。本专利组合物一在8.3mg/L浓度范围内作用48h,对FC细胞的增殖有明显的抑制作用,并呈浓度依赖性,结果见表1和表2。
2.2本专利组合物一对荷小鼠前胃癌FC小鼠体重及外周血白细胞的影响
与给药前比较,各组体重有所增加,但无统计学意义(P>0.05);CTX组体重增加幅度明显低于生理盐水组(P<0.05);与给药前比较,本专利组合物一各给药组外周血白细胞有所增加,给药前后差值有统计学意义(P<0.01);盐水组和环磷酰胺、艾迪注射液组外周血白细胞有所降低,给药前后差值有统计学意义(P<0.01),表明本专利组合物一动物的毒副作用小,明显好于环磷酰胺和艾迪注射液。上述结果见表3和表4。
表1 本专利组合物一的抗肿瘤作用及对免疫器官指数的影响
组别 | 剂量 | 瘤重 | 脾指数 | 胸腺指数 |
空白组组合物一低剂量组组合物一中剂量组组合物一高剂量组环磷酰胺组 | -8.3mg/kg16.7mg/kg25.0mg/kg0.03 | 1.20±0.370.70±.32*0.39±0.23**0.37±0.30**0.40±0.25 | 4.43±0.293.99±0.51*3.52±0.34**3.35±0.26**3.63±0.33 | 2.04±0.161.84±0.201.66±0.181.54±0.19*1.51±0.27 |
艾迪注射液组 | 16.67ml/kg | **0.38±0.41** | *3.50±0.42** | 1.63±0.33 |
注:与生理盐水组比较,*P<0.05,**P<0.01
表2 本专利组合物一对FC肿瘤细胞的影响
组别 | 剂量 | OD值 | 抑瘤率(%) |
RPMI1640本专利组合物一本专利组合物一本专利组合物一本专利组合物一本专利组合物一艾迪注射液 | -8.3mg/L16.7mg/L25mg/L50mg/L100mg/L16.67ml/L | 1.624±0.1340.779±0.108*0.656±0.090**0.518±0.074**0.439±0.100**0.412±0.113**0.661±0.124** | -52.0359.6068.1072.9774.6359.30 |
注:与生理盐水组比较,*P<0.05,**P<0.01
表3 本专利组合物一对荷小鼠前胃癌FC小鼠体重的影响
组别 | 药前体重 | 药后体重 | 差值 |
空白对照组组合物一低剂量组组合物一中剂量组组合物一高剂量组环磷酰胺组艾迪注射液组 | 20.07±1.2519.89±1.3020.14±1.2620.04±1.1919.76±1.0619.94±1.29 | 23.55±1.6224.10±1.7223.20±1.3523.84±1.2821.51±1.3422.47±1.52 | 3.48±0.984.21±1.333.06±0.843.80±1.011.75±0.92**2.53±1.05* |
注:与生理盐水组比较,*P<0.05,**P<0.01
表4 本专利对荷小鼠前胃癌FC小鼠外周血白细胞的影响
组别 | 药前白细胞 | 药后白细胞 | 差值 |
空白对照组组合物一低剂量组组合物一中剂量组组合物一高剂量组 | 13.04±1.9512.97±2.0512.85±1.8613.11±1.99 | 13.00±2.0413.01±1.8312.90±1.5413.12±2.06 | -0.04±0.070.04±0.080.05±0.100.01±0.13 |
环磷胺酰组艾迪注射液组 | 12.95±1.3813.04±1.27 | 11.47±1.6312.73±1.54 | -0.48±0.11**-0.31±0.13* |
具体实施例
以下为结合具体实施方式对本发明所作的进一步的详细描述,并不对本发明作任何限制:
实施例1:胶囊处方及工艺
处方 (按1000粒计)
人参 80g
灵芝 12g
斑蝥 5g
干蟾皮 3g
微粉硅胶 5g
制成 1000粒
制法:取处方量的人参、灵芝、斑蝥、干蟾皮制成提取物。
人参提取物的制备:取人参粗粉500g,加5000ml 70%乙醇回流提取三次(第一次浸泡过夜),每次1小时,合并三次提取液,滤过,滤液回收乙醇,并浓缩至稠膏每1ml相当于原生药2g的溶液,用10%氢氧化钠溶液调节pH值至9.5,加乙醇溶液使含醇量达90%,取上清液,减压回收乙醇,浓缩至相当于生药材1∶1,加水稀释至1000ml,用10%盐酸溶液调pH值7左右,冷藏12小时,滤过,滤液上已处理好的D101大孔吸附树脂柱(树脂用量与药材比为1∶5),依次用4000ml水和25%乙醇4000ml洗脱,弃去洗脱液,再用70%乙醇溶液4000ml洗脱,收集洗脱液,滤过,回收乙醇,浓缩至每1ml相当于原生药5g的稠膏,于100℃减压干燥,即得人参提取物,备用。
灵芝提取物的制备:取灵芝5kg,超微粉碎,用水50L50℃超声提取2次,每次20分钟,合并提取液,过滤,滤液减压干燥,即得灵芝提取物,备用。
斑蝥提取物的制备:称取斑蝥2kg,加入20L倍量125mmol/L氢氧化钠溶液,超声波发生器中,功率600kHz超声提取2次(25,15min)。提取液滤过,合并滤液,以3000r/min离心10min,上清液水浴浓缩至20L,减压干燥即得。
干蟾皮提取物的制备:采用溶媒提取法,将蟾酥1kg粉碎成细粉,用90%乙醇渗漉至无色,残渣继续用80%醇渗漉至无色,合并渗漉液。减压浓缩至浸膏状。10L水溶解,静置48小时。取上清液,干燥即得。
取上述提取物加微粉硅胶混均,装胶囊,即得。
实施例2:粉针处方及工艺
处方 (按1000瓶计)
人参 140g
灵芝 50g
斑蝥 6g
干蟾皮 4g
甘露醇 150g
制成 1000瓶
制法:提取方法同实施例1,但最后的干燥过程应在洁净的环境中进行。成型工艺为:取处方量提取物、甘露醇、60%处方量注射用水溶解;静置过夜,取上清液。初滤后再用0.2um微孔滤膜精滤;补足注射用水至全量;分装;冻干;包装。
实施例3:注射液处方及工艺
处方 (按1000瓶计)
人参 150g
灵芝 40g
斑蝥 2g
干蟾皮 0.4g
甘露醇 150g
制成 1000瓶
制法:提取方法同实施例1,但最后的干燥过程应在洁净的环境中进行。成型工艺为:取处方量提取物、甘露醇、60%处方量注射用水溶解;静置过夜,取上清液。初滤后再用0.2um微孔滤膜精滤;补足注射用水至全量;分装;灭菌;包装。
实施例4:片剂处方及工艺
处方 (按1000片计)
人参 80g
灵芝 12g
斑蝥 5g
干蟾皮 3g
淀粉 50g
羟丙基纤维素 7g
羟甲基淀粉钠 7g
微粉硅胶 10g
制成 1000片
制法:提取方法同实例1。成型工艺为:取处方量提取物、淀粉,羧甲基淀粉钠,用5%羟丙基纤维素作黏合剂,制软材,20目筛制粒,60℃干燥,加入微粉硅胶整粒,压片。
实例5:滴丸处方及工艺
处方 (按1000粒计)
人参 20g
灵芝 3g
斑蝥 1g
干蟾皮 0.6g
聚乙二醇6000 50g
制成 1000粒
制法:提取方法同实例1。成型工艺为:取聚乙二醇6000于油浴上加热至90-100℃,待全部溶解后,加入提取物、搅拌至溶解,转移至贮液瓶中,密闭并保温再80-90℃,调节滴液定量阀门,滴入10-15℃的液体石蜡中,将形成的滴丸沥干并擦除液体石蜡,干燥。
Claims (12)
1、一种治疗肿瘤的药物组合物,其特征在于该药物组合物的配方为:人参1-98.6%、灵芝1-98.6%、斑蝥0.2-98.6%、干蟾皮0.2-98.6%。
2、根据权利要求1所述的治疗肿瘤的药物组合物,其特征在于该药物组合物的配方为:人参1-96%、灵芝1-96%、斑蝥1-96%、干蟾皮1-96%。
3、根据权利要求1所述的治疗肿瘤的药物组合物,其特征在于该药物组合物的配方为:人参35-92%、灵芝5-30%、斑蝥2-20%、干蟾皮1-15%。
4、根据权利要求1所述的治疗肿瘤的药物组合物,其特征在于该药物组合物的配方为:人参55-87%、灵芝10-30%、斑蝥2-10%、干蟾皮1-5%。
5、根据权利要求1所述的治疗肿瘤的药物组合物,其特征在于该药物组合物的配方为:人参70%、灵芝25%、斑蝥3%和干蟾皮2%。
6、根据权利要求1所述的治疗肿瘤的药物组合物,其特征在于该药物组合物的配方为:人参77.5%、灵芝20%、斑蝥1%和干蟾皮1.5%。
7、一种治疗肿瘤的药物组合物的制备方法,处方组成为人参1-98.6%、灵芝1-98.6%、斑蝥0.2-98.6%、干蟾皮0.2-98.6%。其特征在于各组份使用各组份的提取物。
人参提取物的制备:取人参粗粉,加乙醇回流提取,滤过,滤液回收乙醇,并浓缩至稠膏,用氢氧化钠溶液调节pH值至碱性,加乙醇溶液,取上清液,减压回收乙醇,浓缩,加水稀释,用盐酸溶液调pH值至中性,冷藏,滤过,滤液上大孔吸附树脂柱,用乙醇溶液1洗脱,收集洗脱液,滤过,回收乙醇,浓缩至稠膏,减压干燥,即得人参提取物,备用。
灵芝提取物的制备:取灵芝,超微粉碎,用水超声提取,提取液过滤,滤液减压干燥,即得灵芝提取物,备用。
斑蝥提取物的制备:称取斑蝥,加入氢氧化钠溶液,超声提取。提取液滤过,合并滤液,离心,上清液水浴浓缩,减压干燥即得。
干蟾皮提取物的制备:采用溶媒提取法,将干蟾皮粉碎成细粉,用乙醇渗漉至无色,渗漉液.减压浓缩至浸膏状。水溶解,静置。取上清液,干燥即得。
8、按照权利要求7所述的治疗肿瘤药物组合物的制备方法,其特征在于:所制备的各组份的提取物含有:人参多糖,人参皂甙,灵芝多糖,斑蝥素。
9、按照权利要求7所述的治疗肿瘤药物组合物的制备方法,其特征在于:所制备的各组份的提取物含有:人参多糖,人参皂甙二醇组,灵芝多糖,斑蝥素、华蟾毒精。
10、按照权利要求7所述的治疗肿瘤药物组合物的制备方法,其特征在于:所制备的各组份的提取物含有:人参多糖,人参皂甙Rg3,灵芝多糖,斑蝥素衍生物、华蟾毒精。
11、按照权利要求7所述的治疗肿瘤药物组合物的制备方法,其特征在于:所制备的各组份的提取物含有:人参多糖,人参皂甙Rg3,灵芝多糖,灵芝孢子油,斑蝥素衍生物、华蟾毒精。
12、按照权利要求7所述的治疗肿瘤药物组合物(制剂)的制备方法,其特征在于:它的剂型是适合临床应用的注射液(包括输液、冻干粉针)、乳剂、丸剂、滴丸、片剂(包括分散片、口崩片等)、缓释片、胶囊、软胶囊、颗粒剂、散剂、锭剂、栓剂、煎膏剂、口服液(合剂)、糖浆剂、软膏剂、搽剂、涂膜剂等药剂学上可以接受的剂型中的任何一种药物剂型。
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- 2005-08-02 CN CNA2005100887872A patent/CN1907308A/zh active Pending
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