CN102614238A - 灵芝人参药性菌质在制备治疗肺癌的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种灵芝人参药性菌质在制备治疗肺癌的药物中的应用，所述灵芝人参药性菌质为以人参为基质、以灵芝为菌种，经过双向固体发酵后得到，其中含有人参皂苷Rg1、Rb1、Re、Rg3、Rh1等多种人参皂苷，还含有人参多糖、灵芝多糖等成分，可用于制备治疗肺癌的药物。本发明以所述灵芝人参药性菌质作为体内治疗药物对小鼠Lewis肺癌进行研究，分别以0.5g/kg、1.0g/kg、2.0g/kg的剂量对小鼠进行灌胃，同时以空白组、模型组、顺铂组、参一胶囊组、人参组、灵芝组和人参加灵芝组作为对照，结果表明，所述灵芝人参药性菌质对于肺癌的治疗效果与顺铂、参一胶囊等药物相当，优于灵芝、人参和人参加灵芝。

Description

灵芝人参药性菌质在制备治疗肺癌的药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种灵芝人参药性菌质在制备治疗肺癌的药物中的应用。
背景技术
肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，绝大多数肺癌起源于支气管粘膜上皮，故亦称支气管肺癌。近50多年来，世界各国特别是工业发发达国家，肺癌的发病率和病死率均迅速上升，死于癌症的男性病人中肺癌已居首位。因此，对肺癌进行有效治疗是目前的研究热点之一。
目前，现有技术公开了多种用于治疗肺癌的药物，如B.Rosenborg等发现的顺铂，顺铂是癌症治疗的常用化学药物，对肺癌、鼻咽癌、卵巢癌、前列腺癌等多种实体肿瘤均能显示疗效，对肺癌具有较高的疗效。但是，顺铂是中心以二价铂通两个氯原子和两个氨分子结合的重金属络合物，使用时会出现骨髓抑制、胃肠道反应、肾脏毒性、神经毒性、过敏反应、电解质紊乱等不良反应，其用法及用量都存在诸多限制。
与顺铂等化学合成类药物相比，中药具有毒性小、安全性高等优点而广泛用于癌症的治疗中，如黄芪、白花蛇舌草、茯苓、白术、川芎、甘草、红参、女贞子、三七、当归、大黄、桃仁等均可用于治疗癌症。其中，参一胶囊是采用生物酶提取转化技术提取红参中的人参皂苷Rg3制备的胶囊剂，其具有培元固本、补益气血的功效，可配合化疗用药，提高基体免疫能力，改善肿瘤患者的气虚症状，有助于提高原发性肺癌、肝癌的功效。虽然参一胶囊的毒副作用较小，但是其需要采用化学水解、酶水解、微生物发酵等方法制备，工艺过程较为繁琐，对反应条件及产物结构不易控制，且对环境污染较大。
申请号为201010176053.0的中国专利公开了一种以人参作为基质，以灵芝作为菌种经过较为简单的双向固体发酵得到的灵芝人参药性菌质，该灵芝人参药性菌质不仅含有传统人参的有效成分，而且含有灵芝的有效成分，不仅毒性极低，而且有助于改善睡眠、促进生长发育。但是，目前并没有任何文献公开灵芝人参药性菌质在治疗肿瘤方面的应用，尤其是在治疗肺癌方面的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种灵芝人参药性菌质在制备治疗肺癌的药物中的应用，其疗效较高且毒副作用较小。
本发明提供了一种灵芝人参药性菌质在制备治疗肺癌的药物中的应用，所述灵芝人参药性菌质为以人参为基质、以灵芝为菌种，经过双向固体发酵后得到，具体过程如下：
将人参粉碎后加水润湿，灭菌后得到发酵基质，加水的重量为人参干重的100％～150％，所述润湿的时间为6h～12h；
将灵芝菌种活化后进行扩大培养，得到发酵菌种；
将所述发酵菌种接种于发酵基质中，在24℃～28℃、避光的条件下进行双向固体发酵10天～20天。
采用上述方法制备得到的灵芝人参药性菌质中含有人参皂苷Rg1、Rb1、Re、Rg3、Rh1等多种人参皂苷，还含有人参多糖、灵芝多糖等成分，现有技术公开其无毒性，有助于改善睡眠。发明人研究发现，所述灵芝人参药性菌质还可以用于制备治疗肺癌的药物，效果与顺铂、参一胶囊等药物相当，优于灵芝、人参和人参加灵芝。灵芝人参药性菌质及其制备方法在申请号为201010176053.0的中国专利文献中有详细阐述，本发明不再赘述。
为了提高灵芝人参药性菌质对肺癌的治疗效果，本发明优选对所述灵芝人参药性菌质按照以下方法进行预处理：
向灵芝人参药性菌质加入水或乙醇提取，回收水或乙醇后进行浓缩、干燥、粉碎，得到灵芝人参药性菌质粉。
本发明优选以水或乙醇为溶剂提取灵芝人参药性菌质的有效成分，本发明对所述提取过程没有特殊限制，本领域技术人员熟知的提取方法即可。在进行提取时，所述水的重量优选为所述灵芝人参药性菌质重量的6～8倍，更优选为6.5～7.5倍；所述乙醇的重量优选为所述灵芝人参药性菌质重量的10％～90％，更优选为20％～80％。本发明优选对所述灵芝人参药性菌质进行多次提取，更优选进行3次以上的提取，提取完毕后将过滤得到的滤液合并，按照本领域技术人员熟知的方法回收溶剂、浓缩、干燥、粉碎，得到灵芝人参药性菌质粉。
得到灵芝人参药性菌质粉后，以其作为体内治疗药物对小鼠Lewis肺癌进行研究，分别以0.5g/kg、1.0g/kg、2.0g/kg的剂量对小鼠进行灌胃，同时以空白组、模型组、顺铂组、参一胶囊组、人参组、灵芝组和人参加灵芝组作为对照，结果表明，所述灵芝人参药性菌质对于肺癌的治疗效果与顺铂和参一胶囊等药物相当，优于灵芝、人参和人参加灵芝。
具体实施方式
实施例1
将长春中医药大学药用真菌研究所保存的灵芝菌株接种在PDA斜面培养基上、27℃±1℃时进行培养，培养7天得到菌丝体备用；
制作含2wt％葡萄糖、0.5wt％蛋白胨、0.1wt％酵母粉、0.15wt％KH2PO4、和0.1wt％MgSO4的菌种培养液。取100mL菌种培养液装入250mL三角瓶中，0.1MPa、121℃灭菌30min。在无菌室内切取4块0.5cm×0.5cm的菌丝体接入三角瓶的菌种培养液中，28℃、150r/min的条件下振荡培养5天后，得到含有菌丝球的种子液；
取50g无虫蛀、无霉变的生晒人参粉碎过60目筛，加50g水润湿12h后，将得到的人参装入500mL三角瓶中，0.1MPa灭菌60min后，接入50mL种子液，28℃时黑暗培养10天，得到灵芝人参药性菌质；
向所述灵芝人参药性菌质中加入8倍重量的水提取3次，合并滤液，回收水，浓缩、干燥、粉碎后得到灵芝人参药性菌质粉。
实施例2
灵芝人参药性菌质体内对小鼠Lewis肺癌的抑制作用
2.1实验材料
2.1.1实验动物及分组
雌性C57BL/6小鼠，购于中国科学院上海分院史莱克动物中心，按体重随机分为7组：
A为空白组、B为模型组、C为阳性药顺铂组、D为参一胶囊组、E为灵芝人参药性菌质低剂量组(0.5g/kg)、F为灵芝人参药性菌质中剂量组(1g/kg)、G为灵芝人参药性菌质高剂量组(2g/kg)，H为人参组(2g/kg)，I为灵芝组(2g/kg)，J为人参加灵芝组(2g/kg)；
每组12只，每组分为2笼，每笼6只。
2.1.2实验试剂
2.1.2.1参一胶囊
吉林亚泰制药股份有限公司，国药准字Z20030044。每粒含人参皂苷Rg310mg，按体表面积折算为小鼠剂量为8mg/kg，以蒸馏水配为0.4mg/mL，给药体积20mL/kg。小鼠灌胃400μL/20g体重，每日一次。
2.1.2.2顺铂：
按体表面积一次20mg/m2，每只鼠0.2mg/20g体重，腹腔注射，连续14天。
取顺铂16mg/mL，以无菌水稀释到1mg/mL，腹腔注射0.2mlL即为0.2mg/20g体重。
2.1.2.3灵芝人参药性菌质低剂量组
取5g实施例1制备的灵芝人参药性菌质粉溶于100mL无菌水，倍比稀释到0.025g/mL，小鼠灌胃400μL/20g体重，即为0.5g/kg；
2.1.2.4灵芝人参药性菌质中剂量组
取5g实施例1制备的灵芝人参药性菌质粉溶于100mL无菌水，即为0.05g/mL，小鼠灌胃400μL/20g体重，即为1.0g/kg；
2.1.2.5灵芝人参药性菌质高剂量组
取5g实施例1制备的灵芝人参药性菌质粉溶于100mL无菌水，即为0.05g/mL，小鼠灌胃400μL/20g体重，上下午各灌胃一次即为2g/kg；
2.1.2.6人参组
取5g人参细粉溶于100mL无菌水，即为0.05g/mL，小鼠灌胃400μL/20g体重，上下午各灌胃一次即为2g/kg；
2.1.2.7灵芝组
取5g灵芝细粉溶于100mL无菌水，即为0.05g/mL，小鼠灌胃400μL/20g体重，上下午各灌胃一次即为2g/kg；
2.1.2.8人参加灵芝组
取2.5g灵芝细粉和2.5g人参细粉混合后溶于100mL无菌水，即为0.05g/mL，小鼠灌胃400μL/20g体重，上下午各灌胃一次即为2g/kg。
2.1.3实验设备及材料
电子天平：德国赛昂纳斯；
灌胃管：厦门大学实验动物中心提供；
无菌一次性注射器：购自厦门大学医学院仓库；
普通饲料：由厦门大学医学院动物中心提供；
无菌手术刀：厦门大学医学院实验动物中心提供；
流式细胞仪：分选型流式细胞仪，厦门大学医学院中心实验室提供；
Elispot试剂盒：深圳达科为公司预包被板；
CD4抗体：购自eBiolegend公司，FITC标记；
CD8抗体：购自eBioscience公司，PE标记。
2.2实验方案
2.2.1荷瘤动物模型的建立
取传代后14天的Lewis肺癌瘤源小鼠，脱颈处死，固定于鼠板上，常规消毒，于超净工作台中，从腋部皮下剥取肿瘤组织，剔除纤维包膜和坏死组织，在无菌平皿中剪碎，置组织研磨器中加4℃生理盐水轻轻研磨，过滤，制成瘤细胞悬液，调整细胞浓度为1×107/mL。
将上述动物分组并给予相应药物5天后，除A组外，其他各组小鼠均于右腋部皮下注射上述瘤细胞悬液0.2mL以建立荷Lewis肺癌动物模型。接种瘤细胞次日开始继续灌胃给予相应药物，C组腹腔注射给药，每天一次，连续14天，每天观察小鼠饮食及肿瘤生长情况。末次灌胃给药后24h，小鼠称重，处死，评价各组药物的抗肿瘤活性。
2.2.2观察指标
观察肿瘤重量变化，评价灵芝人参药性菌质体内对肿瘤生长的影响，确定其体内的抗肿瘤活性，同时通过观察动物一般表现、体重变化及用药后动物的胸腺和脾脏、肝脏重量的改变，初步评价药物的潜在的一般毒性及其对动物免疫功能的影响，肿瘤生长抑制率和脏器指数分别按照以下公式计算：
Figure BDA0000154706170000051
Figure BDA0000154706170000061
检测脾脏的CD4、CD8细胞的比值，以初步判断对免疫细胞的影响；
检测脾脏CTL(杀伤性T细胞的数量)的产生情况。
2.2.3实验步骤：
第1天至第5天：A组与B组灌胃蒸馏水400μL/20g；D组灌胃0.4mg/mL、400μL/20g；G组灌胃0.05g/mL，上下午各400μL/20g；F组灌胃0.05g/mL、400μL/20g；E组灌胃0.025g/mL、400μL/20g，H组、I组、J组灌胃0.05g/mL，上下午各400μL/20g。
第6天：给除A组以外的小鼠接种肿瘤。
第7天至第25天：A组与B组继续灌以蒸馏水400μL/20g，C组腹腔注射0.1mg/mL，200μL/20g；D组灌胃0.4mg/mL，400μL/20g；G组灌胃0.05g/mL，上下午各400μL/20g；F组灌胃0.05g/mL、400μL/20g；E组灌胃0.025g/mL、400μL/20g；H组、I组、J组灌胃0.05g/mL、上下午各400μL/20g。
第26天：处死小鼠，取肿瘤、胸腺、脾脏、肝脏，并分别称重，检测脾脏CD4、CD8细胞的比值，检测脾脏CTL的产生情况。
2.3实验结果
2.3.1肿瘤抑制生长率结果
末次灌胃给药后24h，小鼠称重，处死，取各组小鼠的肿瘤、肝脏、脾脏、胸腺并分别称重，并按照上文所述的公式计算各组小鼠的肿瘤抑制生长率和脏器指数，结果参见表1，表1为小鼠脏器指数及肿瘤抑制生长率结果。
表1小鼠脏器指数及肿瘤抑制生长率结果
Figure BDA0000154706170000071
表1中，*表示与空白组比较P＜0.05，△表示与模型组比较P＜0.05。
由表1可知，给药各组的肿瘤重量明显低于模型组，其中灵芝人参药性菌质高剂量组的肿瘤最小；灵芝人参药性菌质高剂量组的小鼠肿瘤抑制率最高，灵芝人参药性菌质低剂量组的肿瘤抑制率较参一胶囊组、人参组、灵芝组及人参加灵芝组高；各组小鼠的肝脏指数、胸腺指数、脾脏指数无明显差异，模型组的脾脏指数比其余各组略高。
2.3.2脾脏CD4、CD8细胞数量及比值结果
用流式细胞术检测脾脏的CD4、CD8细胞数量及比值，结果参见表2，表2为脾脏CD4、CD8细胞数量及比值结果。
表2脾脏CD4、CD8细胞数量及比值结果
Figure BDA0000154706170000081
表2中，*表示与空白组比较P＜0.05，△表示与模型组比较P＜0.05。
由表2可知，给药各组小鼠脾脏的CD4和CD8阳性细胞数比模型组明显增多，灵芝人参药性菌质高剂量组增加量最多，灵芝人参药性菌质低剂量组与参一胶囊组、人参组、灵芝组及人参加灵芝组增加量相当。
2.3.3脾脏CTL结果
用ELISPOT检测脾脏CTL，即杀伤性T细胞的产生情况，结果参见表2，表3为脾脏CTL检测结果。
表3脾脏CTL检测结果
Figure BDA0000154706170000091
表3中，*表示与空白组比较P＜0.05，△表示与模型组比较P＜0.05。
由表3可知，给药各组小鼠脾脏的CTL细胞产生增多，其中灵芝人参药性菌质高剂量组CTL细胞产生增量与顺铂组相当，高于其他组；灵芝人参药性菌质低剂量组与参一胶囊组、人参组、灵芝组及人参加灵芝组增加量相当。
由上述实施例可知，灵芝人参药性菌质在体内有抗小鼠成瘤的作用，可调节CD4、CD8、CTL细胞产生，且不会产生肝脏、胸腺、脾脏毒性，其效果与顺铂、参一胶囊等药物效果相当，优于灵芝、人参和人参加灵芝。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (4)

1.灵芝人参药性菌质在制备治疗肺癌的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述灵芝人参药性菌质按照以下方法进行预处理：
向灵芝人参药性菌质加入水或乙醇提取，回收水或乙醇后进行浓缩、干燥、粉碎，得到灵芝人参药性菌质粉。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述水的重量为所述灵芝人参药性菌质重量的6～8倍。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述乙醇的重量为所述灵芝人参药性菌质重量的10％～90％。
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