CN101856364B - R′-β-D-吡喃果糖苷(R′-β-D-fructopyranoside)在制备防治癌细胞扩散转移药物的用途及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了“R′-β-D-吡喃果糖苷(R′-β-D-fructopyranoside)”在制备防治癌细胞扩散转移药物的用途及应用。首次利用R′-β-D-吡喃果糖苷对癌细胞扩散转移的阻抑作用，制备防治癌细胞扩散转移的药物，并临床应用于胃癌、肝癌、肠癌等消化系统的癌症扩散转移的防治；配合放化疗防治胃癌细胞扩散转移时，病人血常规正常保持率为70％，血T淋巴细胞亚群正常保持率为70％，肝肾功能正常保持率为80％以上的显著高效低毒效果，解决了至今没有低毒高效的胃癌扩散转移防治药物的难题。

Description

R′-β-D-吡喃果糖苷(R′-β-D-fructopyranoside)在制备防治癌细胞扩散转移药物的用途及应用

技术领域

本发明属癌症扩散转移防治药物制备领域，具体地说是涉及一种用“R′-β-D-吡喃果糖苷(R′-β-D-fructopyranoside)”制备防治胃癌扩散转移的药物用途及应用。

背景技术

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，危害极大，男性胃癌死亡率高达40.8/10万，女性高达18.6/10万，分别是欧美发达国家的4.2-7.9倍和3.8-8.0倍，发病率和死亡率居各类肿瘤的首位。

胃癌的治疗主要有手术，放射治疗、化疗。早期胃癌多无症状或仅有轻微症状，当临床症状明显时，病变已属晚期，手术的可能性不大，即便能够手术也仅为姑息性的局部切除，临床上扩散转移率高，至今没有低毒高效防治胃癌扩散转移的药物。

目前公知的糖类和中药藤梨根(猕猴桃根)在防治癌细胞扩散转移中的应用技术：

一、糖类的抗肿瘤作用研究

1、稀有糖类抑制癌细胞增殖研究

2007年，日本香川大学的德田雅明教授发现一种在自然界中仅微量存在的稀有糖类“D-阿洛糖”，结构与葡萄糖相似，是葡萄糖的C-3差向异构体

具有阻碍癌细胞的葡萄糖代谢、抑制细胞分裂，抑制癌细胞增殖功能。如：能使肝癌细胞增殖速度放缓，1万个细胞经过3天增殖到约1.7万个，与不加任何物质的肝癌细胞相比，增殖速度要低50％。实验还证明，“D-阿洛糖”对卵巢癌细胞具有同样的抑制效果，对白血病细胞作用更大，能减少白血病细胞，没有副作用。利用这种稀有糖类制成口服液与抗癌剂并用，用于控制癌细胞的扩散，可减少副作用很强的抗癌剂的使用量。

2、壳寡糖的抗癌作用研究

寡糖是由少数(2-6个)单糖分子结合而成的糖。已有资料报道，壳寡糖对癌细胞具有三抑的功能：一是抑制癌细胞转移，壳寡糖对接着分子具有强烈的吸附作用，使癌细胞不能与接着分子结合，从而失去载体，不能转移，而被消灭；二是抑杀癌细胞，壳寡糖能激活淋巴细胞，使免疫功能强化。T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、LAK细胞联合作战直接杀死癌细胞，与抗癌药并用，提高疗效，减少化疗副作用；三是抑制癌毒素，癌细胞增殖时会释放毒素，此毒素能破坏血清中的铁质，造成贫血；并且分解脂肪，兴奋满腹中枢，使人失去食欲，身体消瘦，壳寡糖体内分解之后，能够控制“癌毒素”的作用。

壳寡糖对癌细胞DNA合成的抑制率最高达98.5％；壳寡糖对肝癌细胞有明显抗癌、抑制癌细胞转移效果。

3、多糖的抗癌作用研究

①、香菇多糖能增强癌症患者NK细胞、细胞毒T细胞(CTL)、淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)及单核巨噬细胞的活性，并可诱导INF、白细胞介素(IL)等细胞因子的产生，能抑制小鼠S-180实体癌的生长和干扰体外培养的人肝癌SMMC-7721细胞的增殖，具有较好的抗癌活性。

②、芦荟多糖是以甘露聚糖为主(乙酰甘露聚糖、阿拉伯糖和鼠李糖)，一般认为它的免疫调节活性与巨噬细胞的活化有关，活化的巨噬细胞具有细胞毒性，通过非特异性途径而抑制癌细胞的增殖或杀死癌细胞；同时它能刺激巨噬细胞分泌、释放细胞因子IL-6和INF一，与干扰素IFN-7一起作用可促使NO释放，对癌细胞有杀伤作用，特别是巨噬细胞产生的NO能参与多种类型癌细胞的杀灭活动。

③、绞股兰多糖PGP能显著增强肝癌Heps小鼠NK细胞活性，且剂量依赖性增强。

④、银杏多糖(GBLP)银杏叶多糖显著增加荷瘤小鼠脾指数和胸腺指数，降低s180腹水癌细胞的分裂指数，延长荷癌小鼠的存活期。

⑤、地黄多糖(LRPS)可使小鼠Lewis肺癌细胞内抗癌细胞p53基因表达明显增强，从而引发Lewis肺癌细胞的程序性死亡，这可能是多糖抗癌作用的又一新途径。

⑥、除上述几种多糖外，在米糠中得到新右旋糖酐型葡聚糖-RON，从东当归Angel&a acutiloba的根中得到的果腔多糖以及山药多糖、枸杞多糖(LBP-X)和红毛五加多糖均对癌细胞具有抑制作用并促使癌细胞凋亡的作用。

4、杂合糖分子(多聚糖)抑制癌细胞增殖研究

2009年07月《美国国家科学院院刊》报道，美国伯纳姆医学研究所的福田实教授发现，特殊的杂合糖分子(多聚糖)可对乳腺癌和前列腺癌起到抑制作用。杂合糖分子(多聚糖)能够与层粘连蛋白结合，并依附于α-DG细胞表面蛋白。这种结合有助于增强上皮细胞及基底膜细胞的附着力，防止细胞转移。一种名为β-3GnT1的酶与LARGE/LARGE2基因一起控制着绑定层粘连蛋白的多聚糖合成。β-3GnT1的下调会减少多聚糖数量，从而导致扩散性乳腺癌细胞活动能力增强。而当研究人员迫使侵略性癌细胞表达β-3GnT1时，绑定层粘连蛋白的多聚糖则会恢复，癌的形成速度也会随之下降。

5、稀有糖被认为在人们健康中具有重要的功能，是未来人们研究的热点，已经有三种稀有糖具有产业化生产的可能性，分别是D-塔格糖、D-阿洛酮糖、D-阿洛糖。但绝大多数稀有糖的生物转化生产距离产业化还很遥远，这不仅需要高活性优质酶的开发，要借助于酶固定化方法的创新及酶反应器生产的优化。

6、天然糖苷的作用研究

天然糖苷中的糖苷基有醇类、醛类、酚类、固醇和嘌呤等。它大多极毒，但微量糖苷可作药物。重要糖苷有：能引起溶血的皂角苷，有强心剂作用的毛地黄苷，以及能引起葡萄糖随尿排出的根皮苷。苦杏仁苷也是一种毒性物质。配糖体一般对植物有毒，形成糖苷后则无毒。这是植物的解毒方法，也可保护植物不受外来伤害。

7、果糖苷的生物特性研究

在自然界很少见到果糖形成的糖苷。低聚果糖预防各种慢性病、癌症的作用明显，在人体内双歧杆菌吸收低聚果糖后，迅速增殖，抑制大肠杆菌、沙门氏菌和梭状芽胞杆菌等腐败菌发生作用，减少毒性代谢物(如吲哚、亚硝基氨)的生成，同时迅速将毒性代谢物排出体外，减轻肝脏负担，起到保护肝脏的作用，预防各种慢性病、癌症等作用明显，低聚果糖极少会被消化道中的胃酸和酶分解，极难被人体吸收。

二、藤梨根(猕猴桃)有效部位抗癌作用研究

猕猴桃根中主要含三萜类、黄酮类(蒽醌类、酚类)和糖类等化合物。近年来的研究发现中华猕猴桃根及其制剂均具有较好的抗癌作用，尤其对消化系统的癌症治疗效果更为显著。

1、有研究发现中越猕猴桃根有多种活性成分，其中的三萜类化学成分丰富。三萜类化合物陈希慧等人从中华猕猴桃根中分离得到5种三萜化合物，分别是熊果酸，3β，23-二羟基-12-烯-28-乌苏酸，3α，24-二羟基-12-烯-28-乌苏酸，2α，3β，24-三羟基-12-烯-28-乌酸，2α，3α，23，24-四羟基-12-烯-28-乌苏酸。崔莹等对中华猕猴桃根乙酸乙酯萃取部分的化学成分进行了研究，从中分离得到9种三萜类化合物，经鉴定分别为2α-羟基齐墩果酸(2α-hydroxyoleanolic acid)，jacoumaric acid，2α-羟基乌苏酸(2α-hydroxyursolic acid)，蔷薇酸(euscaphic acid)，23-羟基乌苏酸(23-hydroxyursolic acid)，3β-()-乙酰乌苏果酸(3β-()-acetylursolicacid)，2α，24-二羟基乌苏酸(2α，24-dihydroxyursolicacid)，2，3α，23-三羟基-12-烯-28-乌苏酸(2α，3α，23-trihydroxyurs-12-en-28-oieacid)，2α，3α，23-三羟基-12，20(30)-二烯-28-乌苏酸(2α，3α，23-trmydroxyurs-12，20(30)-dien-28-oic acid)。周雪峰等人对中华猕猴桃根中三萜类化学成分进行研究，又鉴定出两种新化合物，分别为2α，38-dihydroxyurs-12-en-28，30-olide和2，38，24-trihydroxyurs-12-en-28，30-olide。

萜类化合物主要作用于细胞有丝分裂过程中形成纺锤体的微管蛋白，促进微管聚合并抑制其解溶，具有广谱抗癌活性，尤其是对子宫癌、卵巢癌、乳腺癌具有特殊疗效。

2、猕猴桃根中丰富的蒽醌类化合物：姬政等由硬毛中华猕猴桃中分得了6个蒽醌类成分：大黄素甲醚、大黄素、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、Questin、m-羟基大黄素和大黄酸。

邹益友用MTT法研究猕猴桃根中提取的蒽醌类化合物的抑癌作用。结果显示，其对白血病细胞的抑制率为54.24％，对结肠低分化腺癌细胞的抑制率为60.1％，提示猕猴桃根中提取的复合液对癌细胞的DNA合成和诱导T4淋巴细胞产生IL-2，促进天然杀伤细胞对YAC-1淋巴细胞的毒作用，从而杀伤癌细胞，猕猴桃根提取物蒽醌类化合物对癌细胞有明显的杀伤作用。

3、甾体类化合物崔莹等人对中华猕猴桃根乙酸乙酯萃取部分的化学成分进行了研究，从中分离得到3个甾体类化合物，经鉴定是(22E，24R)-麦角甾-4，6，8(14)，22-四烯-3-酮[(22E，24R)-ergosta-4，6，8，(14)，22-tetraen-3-one]，β-谷甾醇(17-steriol)，317，6n-二羟基豆甾烷(stigmastane-317，6d-diol)。

4、中华猕猴桃的叶与根中均含有果糖(fructose)、葡萄糖(glucose)、蔗糖(sucrose)、肌醇(inositol)fin]。

根部多糖(AcluddiaChiaesis Planch Polysaccharide，ACPS)复合物ACPS-R是一种新的免疫调节剂，有很强的抗细菌感染的作用。还能增强NK细胞的溶瘤活性和促进巨噬细胞吞噬的功能。(ACPS-R)80mg/kg与5-Fu 250mg/kg合用时，对HepS的抑癌率明显高于单用5-Fu、ACPS-R剂量为80～100mg/kg及125mg/kg时，对EAC的疗效，大体分别与15mg/kg和22.5mg/kg的环磷酰胺(cy)相当。〔林佩芳，等。中华肿瘤杂志，1988，10(6)：440]。

5、卫培峰等认为藤梨根(猕猴桃的根茎)提取物确有抑制实验性大鼠胃癌生长和转移的作用，胃癌生长的抑制率为69％，胃周淋巴结、肝脏转移率分别减少了33.3％、25.0％。

三、藤梨根(猕猴桃根)原药治疗胃癌的研究

藤梨根糖浆，每100ml内的含药量相当于藤梨根生药200g。另有复方糖浆，由藤梨根与虎杖等中草药经提取制成。口服，每次10～20ml，每日3次。主治胃癌、肠癌、食道癌。对肺癌、肝癌、乳腺癌亦有一定效果。

《抗癌良方》介绍了杭州市肿瘤医院拟的“两根汤”：藤梨根、半支莲各60克，野葡萄根90克，紫草、丹参、白花蛇舌草各30克，干蟾皮、急性子各12克，姜半夏、天龙、甘草各6克，马钱子3克。水煎服，日一剂。对胃癌的防治具有显著的效果。

《全国中草药汇编》介绍了：藤梨根常与野葡萄藤、半枝莲、半边莲、白茅根等配伍，使用于各种癌症，尤其对于肠胃道方面的癌症应用更多。可配合寻骨风、络石藤、防已等用于风湿骨痛；配蒲公英、田基黄等治黄疸。

《中国民间疗法》杂志1999年第7期43页的《壁虎藤梨根治疗胃癌临床及实验研究》介绍了朱秀山等根据民间经验，于1992～1997年用藤梨根、壁虎等组成昭黄散治疗晚期胃癌72例，疗效与化疗组相近，而在防止肿瘤进展、提高生存质量、延长生存期方面明显优于化疗组，且毒副作用较化疗组轻。

江西《中草药学》介绍了藤梨根治食道癌：猕猴梨根配水杨梅根二两，野葡萄根一两，半枝莲五钱，半边莲五钱，凤尾草五钱，白茅根五钱。水煎服。对胃癌的防治具有显著的效果。

《河北中医》2004年第26卷第04期《藤梨根对胃癌细胞抑制作用的实验研究》，结果藤梨根原液(药物浓度5.2mg/ml)经稀释4倍(1.3mg/ml)后，抑瘤率最强(88.19％)，对胃癌细胞有明显杀伤作用。

此外，民间亦有单用藤梨根治疗癌症的报道，即用生药2～5两，加水用文火煎3小时以上，两次分服，15～20天为一疗程，一般服四个疗程，疗程间休息数天。韩国《妙药奇方》也有使用藤梨根治疗癌症的记载。

公开的中药藤梨根(猕猴桃根)及其提取物在胃癌防治中的专利技术

涉及藤梨根的专利30多项。

上海市普陀区赵正福的《一种具有抗肿瘤作用的“猕猴桃素”及其制备方法和应用》，申请号为200610027326.9的专利，涉及一种“猕猴桃素”---猕猴桃根提取的含复合蒽醌类的总有效部位的制备方法和抗肿瘤方面的应用。

中国科学院化学研究所发明的《一种藤梨根提取物及其抗癌用途》，申请号为200510126430.9的专利，涉及一种藤梨根提取物的制备方法：乙醇，回流提取→干燥→二氯甲烷、甲醇和乙酸的混合物洗脱→分别收集黄色和浅黄色两个色带的洗脱物→除去溶剂，真空干燥→得到本发明的藤梨根提取物。用于制备治疗抗癌药物。

中国中医科学院中药研究所发明的《一种中药藤梨根抗肿瘤活性部位的提取工艺》，申请号为200910147760.4的专利，涉及一种中药藤梨根总黄酮的提取分离方法。

中国科学院化学研究所发明的《藤梨根的酶解提取方法》，申请号为200510123230.8的专利，涉及一种藤梨根的酶解提取方法。

中国科学院化学研究所发明的《一种用于治疗肝癌的壁虎藤梨根水提取物》，申请号为200610066993.8的专利，涉及一种用于治疗肝癌的壁虎藤梨根的水提取物。

浙江大学发明的《具有抗肿瘤和免疫佐剂作用的多糖及其制备方法和用途》，申请号为200910097497.2的专利，涉及一种从中草药白藤梨根中提取分离的白藤梨多糖A、白藤梨多糖B、白藤梨多糖C、白藤梨多糖D和包含有这4种多糖的混合物——白藤梨总多糖，具有显著抗肿瘤和免疫佐剂作用。

华南理工大学发明的《藤梨根抗肿瘤提取物及其制备方法和用途》，申请号为200510032668.5的专利，涉及藤梨根抗肿瘤提取物可通过水或有机溶剂在70～100℃温度下浸提、然后减压浓缩、调酸、萃取、聚酰胺层析、溶剂洗脱，浓缩干燥制得。用于治疗各种肿瘤的口服或注射单方以及复方制剂。

其它则为含藤梨根的治疗胃癌的中药复方制剂专利。

综上所述，国内外对植物多糖(葡聚糖)、动物壳聚糖的研究很多，现代药理表明多糖和藤梨根有显著的抗突变、抗畸变和抗癌活性，但对稀有糖的研究很少，对稀有糖的衍生物--R′-β-D-吡喃果糖苷(R′-β-D-fructopyranoside)的抗病毒、抗癌活性研究未见报道。

对猕猴桃根的研究很多，有的资料报道“藤梨根中含有的总黄酮具有显著的抗癌活性”、有的报道“藤梨根中含有的多糖具有显著的抗癌活性”、有的报道“藤梨根中含有的三萜皂苷具有显著的抗癌活性”、有的报道“藤梨根中含有的蒽醌苷类具有显著的抗癌活性”，但还没有“藤梨根中含有稀有糖的衍生物--正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷(n-butyl-O-β-D-fructopyranoside)具有显著的抗癌活性及在制备防治胃癌扩散转移药物的用途和应用”的文献报道。

现有防治胃癌扩散转移药物存在的问题：

防治胃癌扩散转移药物存在高毒低效的问题，至今没有低毒高效的胃癌扩散转移防治药物。

胃癌的治疗有手术，放射治疗、化疗三类。早期胃癌多无症状或仅有轻微症状，当临床症状明显时，病变已属晚期，手术的可能性不大，即便能够手术也仅为姑息性的局部切除，临床上扩散转移率高；放射治疗对人体危害极大，化疗的化学药物都存在高毒、产生耐药等低效问题。

多糖、壳寡糖对癌细胞DNA合成有抑制作用，对肝癌细胞癌细胞转移有一定的效果，但达不到高效的理想状态。

中药三萜类皂苷开发防治癌症扩散转移药物存在的问题：皂苷水溶液能与红细胞壁上的胆甾醇结合，生成不溶于水的分子复合物，破坏了红细胞的正常渗透，使细胞内渗透压增加而发生崩解，从而导致溶血现象，因此，三萜类皂苷开发防治癌症扩散转移药物存在溶血问题，特别不能用于静脉注射。

发明内容

发明目的

开发“R′-β-D-吡喃果糖苷(R′-β-D-fructopyranoside)”的抗癌新用途，制备一种低毒高效的防治癌症扩散转移药物，用于防治癌症的扩散和转移。

本发明的技术特征

1、“R′-β-D-吡喃果糖苷”的结构特征为：

R′＝正丁基(n-butyl-)或正丁氧基(n-butyl-O-)或大黄素配体或三萜皂苷配体

2、“R′-β-D-吡喃果糖苷”的功能特征为：

“R′-β-D-吡喃果糖苷”具有特殊功能，在人体中起着“通讯”、“识别”和“调控”生物过程，调节基因表达，控制机能平衡等生理作用。进入人体后能迅速有效地闭合病变细胞带负电的糖链，阻断病变细胞的信息传递路径，使病变细胞失去活性而凋亡，或被体内的免疫细胞吞噬，保证人体的健康。

3、“R′-β-D-吡喃果糖苷”阻抑癌细胞增值特征为：

癌细胞的生长需要提高糖酵解为其提供能量，而“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”具有功能糖特征，与能量糖不同，难糖酵解为癌细胞提供能量和增殖的物质基础，也就阻抑了癌细胞的能量来源和增殖的中间物，使癌细胞变性坏死，非毒性阻抑癌细胞增殖。

4、“R′-β-D-吡喃果糖苷”抑制癌细胞转移特征为：

癌细胞的转移，通常须经过血管，在血管内皮细胞表面有一种所谓的“接着分子”，癌细胞只有首先被“接着分子”附着、结合，才能顺利进入血管。“R′-β-D-吡喃果糖苷”具有和血管内皮细胞表面“接着分子”结合的特性，使癌细胞无法和血管内皮细胞的“接着分子”结合，也就无法进入血管，起到了抑制癌细胞转移的作用。而且，即使有些癌细胞侥幸侵入血管，进入血液循环，但由于体内有了“R′-β-D-吡喃果糖苷”，可以封锁癌细胞，使其不与身体其它部位的“接着分子”结合，同时激活和增强的NK细胞、LAK细胞杀死癌细胞，巨噬细胞吞噬分解癌细胞，从而达到抑制癌细胞转移的功效。

5、其中“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”的结构特征为：

6、其中“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”的分子特征为：

白色粉末，mp 149～150℃。H-NMR(500MHz，CDCl3)δ：3.56(2H，t，J＝7.0Hz，1-H)，1.57(2H，m，2-H)，1.39(2H，m，3-H)，0.94(3H，t，J＝7.0Hz，4-H)，3.84(1H，d，J＝12.0Hz，1’-Ha)，3.75(1H，d，J＝11.5Hz，1’-Hb)，3.77～4.01(糖上其他氢)。13C-NMR(125MHz，CD3OD)δ：61.7(C-1)，33.3(C-2)，20.5(C-3)，14.3(C-4)，63.6(C-1’)，101.6(C-2’)，70.8(C-3‘)，71.6(C-4’)，71.1(C-5’)，65.2(C-6’)。

7、其中“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”的构效特征为：

“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”为烷基化果糖苷，其糖苷结构部分与癌细胞的囊膜糖蛋白有高度亲和性，其烷基部分与癌细胞囊膜脂双层作用，高效破坏其囊膜，使癌细胞凋亡。未烷基化的“-β-D-吡喃果糖苷”活性低，烷基化后活性显著提高，脱去烷基后活性又明显降低。

本发明的技术路线

本发明根据癌细胞对糖具有特殊的嗜好和以糖酵解生存和增殖的特性，选取糖苷作靶向功能基团，利用“正丁基配体(烷基部分)”能阻缓糖酵解、促进天然杀伤细胞杀死癌细胞和诱导癌细胞凋亡的特性，制备高效防治癌症扩散转移药物，用于临床防治胃癌的扩散转移，对正常细胞无毒副作用。

癌细胞有嗜糖性，血液流过癌体，约有57％的血糖被癌细胞消耗掉(如果正常细胞从1000毫升的血液里吸取2-7克葡萄糖，而癌细胞则吸取70克)。

癌细胞以糖酵解为生存和增殖的物质基础。癌细胞呼吸作用很弱，以糖酵解作用为主，即使在氧供应充分的条件下也主要是以无氧糖酵解获取能量。其酵解能力约为正常细胞的70-80倍，糖酵解的许多中间产物被癌细胞利用合成蛋白质、核酸及脂类，从而为癌细胞本身的生长和增生提供了必需的物质基础，所以癌细胞是依靠非常强盛的糖酵解能力而生存和增殖的。

本发明在上述药理指导下，通过对藤梨根或土茯苓或菝葜或鬼针草或怀牛膝或水红花子的化学成分研究，确立从藤梨根或土茯苓或菝葜或鬼针草或怀牛膝或水红花子中提取分离果糖苷等抗癌的有效成分和活性部位的技术路线，确立“R′-β-D-吡喃果糖苷”为藤梨根或土茯苓或菝葜或鬼针草或怀牛膝或水红花子抗癌的特征性成分或指标性成分，建立藤梨根或土茯苓或菝葜或鬼针草或怀牛膝或水红花子的“R′-β-D-吡喃果糖苷”质量标准，制备临床应用的低毒高效防治癌症扩散转移新药，为进一步开发藤梨根或土茯苓或菝葜或鬼针草或怀牛膝或水红花子等药用植物资源提供了依据。

本发明的技术方案：

1、提取含“R′-β-D-吡喃果糖苷”的总糖

①原料物的选择：从天然植物藤梨根或土茯苓或菝葜或鬼针草或怀牛膝或水红花子中选择至少一种或多种作为提取原料物。

②除杂：对提取原料物选去泥沙、杂草。

③粉碎：将原料粉碎成20目左右。

④生物预处理：纤维素酶+盐酸+水(PH2-5)，酶解3-9小时；

⑤微波、超声波提取：提取温度为30-75℃、时间为30-360分钟；

⑥固--液分离；

⑦液相过滤、浓缩，得含“R′-β-D-吡喃果糖苷”的总糖苷浓浸膏；

⑧浓浸膏经80％的乙醇醇沉，过滤；

⑨固相干燥，即得含“R′-β-D-吡喃果糖苷”的总糖；

⑩滤液加热回收乙醇。

2、提取藤梨根中的三萜类、蒽醌类等其他抗癌成份

①原料物的选择：将本发明的“技术方案1：提取含“R′-β-D-吡喃果糖苷”总糖的第⑥步“固--液分离”后的藤梨根或土茯苓或菝葜或鬼针草或怀牛膝或水红花子粉作为提取原料物。

②微波、超声波提取：加70％-76％的乙醇，提取温度为60-75℃、时间为30-360分钟；

③固--液分离；

④液相过滤、浓缩、回收乙醇，得藤梨根浓浸膏；

⑤分离三萜类、蒽醌类抗癌成份；

⑥回收溶剂；

⑦浓缩、干燥，即得三萜类、蒽醌类其他抗癌成份。

3、制备防治胃癌扩散转移的“R′-β-D-吡喃果糖苷”输液

①原料物的选择：将本发明的“技术方案1”得到的含“R′-β-D-吡喃果糖苷”的总糖作原料物。

②加蒸溜水至含“R′-β-D-吡喃果糖苷”的总糖完全溶解。

③过滤

④加入95％的乙醇到过滤液中，调整乙醇至80％止。

⑤沉淀，过滤；回收溶剂；

⑥干燥，即得含“R′-β-D-吡喃果糖苷”的总糖纯品；

⑦将含“R′-β-D-吡喃果糖苷”的总糖纯品加蒸溜水或医学上接受的载体，充分溶解，配制成50％的输液；

⑧沉淀，过滤；按500ml/瓶(袋)或250ml/瓶(袋)包装。

4、制备防治胃癌扩散转移的复合“R′-β-D-吡喃果糖苷(R′-β-D-fructopyranoside)”颗粒

①原料物的选择：将本发明“技术方案1”得到的含“R′-β-D-吡喃果糖苷”的总糖和本发明的“技术方案2”得到的“三萜类、蒽醌类其他抗癌成份”作原料物。

②按重量取含“R′-β-D-吡喃果糖苷”的总糖∶“三萜类、蒽醌类其他抗癌成份”＝2∶1，混合均匀；

③按10g/袋或5g/袋包装。

5、制备防治胃癌扩散转移的复合“R′-β-D-吡喃果糖苷(R′-β-D-fructopyranoside)”口服液

①原料物的选择：将本发明“技术方案1”得到的含“R′-β-D-吡喃果糖苷”的总糖和本发明的“技术方案2”得到的“三萜类、蒽醌类其他抗癌成份”作原料物。

②按重量取含“R′-β-D-吡喃果糖苷”的总糖∶“三萜类、蒽醌类其他抗癌成份”∶蒸溜水或医学上接受的载体＝2∶1∶3，充分溶解，混合均匀；

③按20ml/瓶或10ml/瓶包装。

6、“R′-β-D-吡喃果糖苷”防治胃癌扩散转移的应用

本发明的技术效果

实验证明，在放化疗的同时配合服用“R′-β-D-吡喃果糖苷”，病人血常规正常保持率为85％，血T淋巴细胞亚群正常保持率为80％，肝肾功能正常保持率为95％。说明“R′-β-D-吡喃果糖苷”能明显减轻放化疗的副作用。“R′-β-D-吡喃果糖苷”与抗肿瘤药物5-氟脲嘧啶、顺铂、盐酸阿霉素等配伍使用，抑癌的协同效果非常明显。

具体实施方式

实施例1：提取含“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷(n-butyl-O-β-D-fructopyranoside)”的总糖：

①称取100公斤的水，倒入1000立升的容器中，加入16公斤的盐酸，搅拌均匀(PH4)。再加入0·3公斤的纤维素酶，搅拌均匀。

②称取100公斤的天然植物藤梨根，选去泥沙、杂草；粉碎成20目左右，倒入上述容器的酶解液中，搅拌酶解6小时；

③将以上酶解处理过的藤梨根倒入1000立升的微波、超声波提取釜中，在温度为60-70℃、提取80分钟；

④用“固-液”分离装置将藤梨根粉末和提取液分开。

④将提取液过滤、浓缩，得含“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”的总糖苷

浓浸膏；

⑤将含“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”的总糖苷浓浸膏加入蒸溜水至完全溶解后，再加入适量的95％的乙醇至整体溶液的乙醇浓度为80％。

⑥将以上溶液沉淀24小时，过滤；液相加热回收乙醇。

⑦固相干燥，即得含“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”的总糖5-11公斤。

实施例2：提取藤梨根中的三萜类、蒽醌类等其他抗癌成份

①称取“实施例1”中第“④”步分离出的藤梨根粉100公斤(含水30％)，加入适量的80-95％的乙醇至整体溶液的乙醇浓度为75％。

②微波、超声波提取，提取温度为60-75℃、时间为30-360分钟；

③固--液分离；

④液相过滤、浓缩、回收乙醇，得5-10公斤浓浸膏；

⑤除去蛋白质等杂质；

⑥回收溶剂；

⑦浓缩、干燥，即得3-7公斤三萜类、蒽醌类其他抗癌成份。

实施例3：制备防治胃癌扩散转移的“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”静脉输液

①称取“实施例1”中提取的含“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷(n-butyl-O-β-D-fructopyranoside)”的总糖苷5·5公斤；

②加蒸溜水至含“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷(n-butyl-O-β-D-fructopyranoside)”的总糖苷完全溶解。

③过滤

④加入95％的乙醇到过滤液中，调整乙醇浓度至80％止。

⑤沉淀，过滤；回收乙醇；

⑥干燥，即得纯含“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷(n-butyl-O-β-D-fructopyranoside)”的高纯总糖苷；

⑦将纯含“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷(n-butyl-O-β-D-fructopyranoside)”的高纯总糖苷加蒸溜水或医学上接受的载体5公斤，充分溶解，配制成50％的输液；

⑧沉淀，过滤；按500ml/瓶(袋)或250ml/瓶(袋)包装，即制得500ml/瓶防治胃癌扩散转移的“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”静脉输液20瓶(袋)或250ml/瓶(袋)防治胃癌扩散转移的“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”静脉输液40瓶(袋)。

实施例4：制备防治胃癌扩散转移的复合“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”颗粒

①取“实施例1”提取的含“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷(n-butyl-O-β-D-fructopyranoside)”的总糖苷2公斤，“实施例2”提取的含“三萜类、蒽醌类其他抗癌成份”1公斤；

②混合均匀；

③按10g/袋或5g/袋称重包装，制得10g/袋的复合“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”颗粒300袋或5g/袋的复合“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”颗粒600袋。

实施例5：制备防治胃癌扩散转移的复合“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”口服液

①分别取“实施例1”提取的含“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷(n-butyl-O-β-D-fructopyranos ide)”的总糖苷2公斤，“实施例2”提取的含“三萜类、蒽醌类其他抗癌成份”1公斤；

②加入蒸溜水或医学上接受的载体3公斤；

③充分溶解，混合均匀；

④按20ml/瓶或10ml/瓶称重包装，制得20ml/瓶的复合“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”口服液300瓶或10ml/瓶的复合“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”颗粒600瓶。

实施例6：复合“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”颗粒防治胃癌扩散转移的应用

复合“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”颗粒，具有清热解毒，软坚散结、滋阴益气之功，用于肺癌、胃癌扩散转移的辅助治疗和治疗。本组观察肿瘤患者156例，其中治疗组102例，对照组54例。其中肺癌、胃癌的总有效率分别为86.2％、96.5％，均优于对照组。在服药过程中未发现明显不良反应，对心、肝、肾及血象基本无改变。

一般资料：本组观察病例均为住院患者，症状明确，带瘤生存，年龄在18-65周岁者，观察对象随机分组，单盲法进行观察。

1、性别分布：女性患者103，男性患者53人；

2、年龄分布：40岁以下9人：41-50岁42人；51-60岁49人，61-65岁56人。

治疗方法：

治疗组，均服用复合“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”颗粒，每次1包(20g)，一日3次开水冲服，连服三个月。

对照组，均服用贞芪扶正颗粒，每次1包(20g)，一日3次开水冲服，连服三个月。

治疗效果：

一般疗效：1、根据《中国常见恶性肿瘤诊治规范》指定肺癌、胃癌疗效标准，治疗组与对照组有效率分别为86.2％、96.5％和74.04％、77.78％。

部分缓解(PR)：病灶缩小＞50％；稳定(NR)：病灶缩小不到50％或扩大不足25％；进展(PD)：病灶较治疗前扩大25％以上。

2、健康状况变化karnafsky氏评分法，对患者治疗前后，健康状况进行评估，治疗后上升10分以上为上升，下降10分以上者为下降，活动在10分之间为稳定。

3、临床症状疗效评定：对肿瘤的常见症状如咳嗽、痰血、胸痛等，按症状的轻(+)、中(++)、重(+++)、严重(++++)4级记分。根据治疗前后症状量评分的改变，进行疗效评定，显效：主要症状和体征大部分消失，治疗前后积分减少60％以上；有效；主要症状和体征部分减轻或消失，积分减少在15-59％；无效：主要症状和体征无明显变化。

复合“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”颗粒临床观察病例症状疗效评定结果

临床观察表明复合“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”颗粒作为癌症患者辅助治疗的药物具有抑制肿瘤生长、缓解临床症状，改善健康状况、提高肿瘤患者生存质量等作用。而且该药安全性好、适宜临床推广应用。

实施例7：“含正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷的总糖”抑癌的实验

根据“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”具有抑癌的生理功能，进行了抑癌活性筛选、体外及体内抑癌作用实验，结果如下：

1材料与方法：

1.1材料：

1.1.1甘露寡糖(由中科院微生物所提供)

1.1.2含“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”的总糖(自制)

1.1.3壳寡糖(由中科院微生物所提供)

1.1.4昆明种1月龄雌性二级小鼠，体重18-22g(湖农大实验动物中心提供)

1.1.5S-180癌细胞(由华南医科大学病理室提供)

1.2方法：

1.2.1含“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”的总糖：按“实施例1”制备；

1.2.2同位素掺入实验方法

由已接种7-8天患S-180腹水癌昆明小鼠5只，无菌制成混合腹水，染色，镜检，癌细胞≥95％，用Eagle，s液稀释成3.5×106/ml。实验分成对照和实验二组，每个样设三个平行管。各管按上述顺序加完后，混匀，37℃保温4小时后，细胞收集器收集癌细胞于玻璃纤维膜、用冷生理盐水洗涤2次每次5秒钟，间隔空抽2秒。最后用10％TCA洗涤并固定细胞，干燥，置于闪烁杯中，消化，冷却，各管加7ml闪烁液。LKB-1209全自动液闪仪进行测量(cpm)。按公式：抑制率＝[对照管(cpm)-实验管(cpm)]/对照管(cpm)×100％计算样品对癌细胞DNA合成的抑制率。

1.2.3“含正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”总糖的抑癌剂量的筛选

小鼠的等效剂量相当于人体推荐剂量的10倍。分别以人体推荐剂量的5倍、10倍和20倍(2·5mg/ml，5mg/ml，10mg/ml)剂量进行动物试验；

1.2.4移植性癌细胞试验(腹水癌)的方法：

收集腹腔癌细胞悬液：S-180癌细胞复苏后接种于小鼠腹腔内，传代一次后7～10天的动物，颈椎脱臼处死。固定于蜡版上，腹部皮肤消毒后，剪开并剥去腹部皮肤。用消毒空针穿过腹部肌肉，抽取腹水，放入无菌试管内，试管周围置冰块保存。若用多只动物供瘤时，应将腹水混合，癌细胞计数结果。接种：

用Hanks工作液稀释癌细胞悬液至活细胞数为2×106个/mL。在给予受试物15天后将癌细胞接种于空白对照组、环磷酰胺对照组和低、中、高剂量组小鼠的腹腔内，每只小鼠0.2mL。继续给予受试物15天。同时环磷酰胺对照组腹腔注射环磷酰胺；

1.2.5抑制癌细胞生长的检测方法采MTT(四唑蓝)法：

实验重复两次，每组实验设平行孔，“含正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”总糖给药组剂量分别为2·5mg/ml，5mg/ml，10mg/ml，贴壁细胞于实验前一天铺板，悬浮细胞于实验当天处理。每孔细胞数为1×105，终体积为1ml。阳性对照药物顺铂浓度为10μg/ml。加药后培养72小时，加MTT及溶解液，于595nm比色测定，并根据吸光度计算抑制率。

排染法检测“含正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”的总糖对S-180的抑制率。

分别在第8、16、24小时取各孔的细胞悬液50微升于载玻片上，再加台酚蓝染液50微升，混匀后在显微镜下观察。核蓝染的为死细胞。

抑制率＝死细胞数/细胞总数×100％

结果：

①不同剂量“含正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”总糖对S-180癌细胞的抑制作用：用“含正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”总糖剂量分别为2·5mg/ml，5mg/ml，25mg/ml进行抑癌试验，筛选合适的抑癌剂量，结果表明：“含正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”总糖的抑癌率远高于甘露寡糖和壳寡糖，三个不同剂量“含正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”总糖处理组中，抑癌率均达到90％以上，表明较低的浓度就能达到较高的抑癌率(见表1)。

表1.“含正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”总糖及不同寡聚糖对S-180的抑癌率

样品	用量(mg/mL)	抑癌率(％)
			壳寡糖	10	80.5
	7	90.5
				4	95.5
甘露寡糖	5	59.5
				2.5	60.5
	1.5	12.9
			“含正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”总糖	10	98.5
	5	98.0
				2.5	97.5

②“含正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”总糖对腹水癌小鼠生存时间的作用：

由表2可见，小鼠接种癌细胞后，与对照组比较，环磷酰胺阳性对照组生存时间延长40％；低、中、高剂量组生存时间分别延长40％，51％，52％。

表2口服“含正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”总糖30天对S-180腹水瘤小鼠生存时间的影响

组别	剂量	动物数	生存时间
					(mL/)	(只)	(天)
空白对照组	0	12	11.9±2.2
				低剂量组	2.5mg/mL	12	16.8±2.0***
中剂量组	5mg/mL	12	18.5±3.6***
				高剂量组	10mg/mL	12	18.6±1.5***
阳性对照组	顺铂10μg/ml	12	16.8±2.6***

*：差异显著性  **：差异非常显著性  ***：差异极显著性

③“含正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”总糖对实体瘤小鼠瘤重的影响

表3口服口服“含正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”总糖30天对实体瘤小鼠瘤重的影响

组别	剂量	动物数	实体瘤重
					(mL/)	(只)
空白对照组	0	16	1
				低剂量组	2.5mg/mL	16	1-86％**
中剂量组	5mg/mL	16	1-90％±***
				高剂量组	10mg/mL	16	1-92％±***
阳性对照组	顺铂10μg/ml	16	1-23％*

*：差异显著性  **：差异非常显著性  ***：差异极显著性

表3可见，小鼠接种肿瘤20天后，与对照组比较，环磷酰胺阳性对照组实体瘤重降低23％，低、中、高剂量组实体瘤重分别降低86％，90％，92％。

综合表2和表3的结果可以看出“含正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”总糖对荷实体瘤小鼠肿瘤具有明显抑制作用。

④“含正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”总糖对小鼠NK细胞活性的影响

表4“含正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷”总糖对小鼠NK细胞活性的影响

组别	剂量	动物数	NK活性(1∶50)
					(mL/)	(只)	(％)
空白对照组	0	12	26.5±10.0
				低剂量组	2.5mg/mL	12	83.6±10.0
中剂量组	5mg/mL	12	86.0±12.0
				高剂量组	10mg/mL	12	84.6±10.0

表4可见，经口给予小鼠不同剂量的受试物30天后，与对照组比较，各剂量组的NK细胞活性有显著差异，表明对小鼠免疫系统有显著的提高作用。

实施例8：“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷输液”对实验性大鼠胃癌抑制作用的实验

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物BALB/Cnu/nu裸鼠，由华南医学院动物实验中心提供，雄性，6周龄，体重18～20g，在SPF(specificpathogenfreec nditi n)级条件下分笼饲养

1.1.2实验瘤株为SGC-7901胃癌细胞株、瘤块。采用华南医学院生物研究中心提供的人胃腺癌SGC-7901细胞株，于裸鼠皮下注射成瘤后，反复传代形成实体瘤。

1.1.3实验药物：“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷输液”按“实施例3”制备；

1.2实验方法

1.2.1造模实验造模方法参考文献，从荷瘤动物皮下取出符合本实验要求的实体肿瘤，去除坏死组织.剪成1mm直径的碎块。再将实验动物腹腔麻醉，选择左侧正中旁切口，打开腹腔，暴露胃壁，在胃大弯近胃窦处植入1块瘤组织，在瘤块表面滴上少许OB生物胶(由广州自云医用胶公司提供)，使其覆盖瘤组织表面，约40秒凝固后，缝合腹膜及皮肤，再关腹，即完成造模工作。

1，2.2实验分组及给药瘤体种植后1周，将存活的裸鼠随机分为：

“阴性对照组”：12只，腹腔注射生理盐水0.2mL/只·d，每天注射1次，连续注射3周。

“5-FU组”：12只，注射5-FU，60mg/kg，每周注射1次，连续注射3周。；

“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷输液”实验组：12只，5ml/kg·d，“-吡喃果糖苷输液”，每天注射1次，连续注射3周。

1.2.3肿瘤生长和转移的测定

测定方法：(1)瘤重、肿瘤体积及抑瘤率；种植后第12周待荷瘤鼠频临衰竭时，拉颈处死，剥离原位肿瘤，称取瘤重w，并计算抑瘤率：

抑瘤率(％)＝{(w对照组-w实验组)/w对照组}×100％

再分别放入盛有适量(肿瘤组织能完全浸入)双蒸水的量筒中，记下高度B(单位厘米)，测定置入后的高度A，按公式V：(A-B)JIRgcn3，计算肿瘤体积。(2)观察“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷输液”物对胃癌舌勺转移抑制情况：取下各脏器及淋巴结，用10％甲醛固定石蜡包埋、切片，HE染色，作组织病理学检查。收取腹水，观察腹水出现情况。

1.3统计学处理各组之间的比较采用方差分析，各脏器转移及腹水出现情况用x²检验。

2结果

2.1“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷输液”对裸鼠人胃癌原位种植肿瘤体积、瘤重、抑瘤率的影响，对照组荷瘤鼠胃壁均有肿瘤生长，多呈圆形，实质性，表面有结节状隆起，呈淡红色鱼肉状，中心有坏死。经方差分析，“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷输液”实验组与对照组相比，瘤体积、瘤重、抑瘤率，其差异0均有高度统计学意义(P＜0.01)，经两两分析，与5-FU组相比，“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷输液”实验组的瘤体积、瘤重之差异亦有统计学意义(P＜0.05)；表明“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷输液”对胃癌生长有明显抑制作用(见表1)

表1“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷输液”对胃癌生长的抑制作用(x±s)

组别	N(只)	瘤体积(cm3)	瘤重w(g)	抑瘤率(％)
					对照组	12	1.58±0.77	2.32±0.81	0
5-FU组	12	0.96±0.45	1.12±0.89	49.3
					正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷输液组	12	0.65±0.55	0.71±0.54	70.0

与对照组相比，①P＜0.01，②P＜0.05；与5-FU组相比，③P＜0.05

2.2对胃癌转移抑制情况：“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷输液”对肿瘤胃周淋巴结、肝脏转移率及癌性腹水形成有一定抑制作用，与对照组相比较，其差异有统计学意义(P＜0.01)。虽然从实验结果看，“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷输液”与5～FU组在抑制转移上其差异无统计学意义，但胃周淋巴结、肝脏转移率分别减少了33.3％、25.0％，抑制转移作用较5-FU组仍强，见表2。

表2“正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷输液”对胃癌转移的抑制作用(x±s)

组别	胃周淋巴结转移率	肝脏转移率	腹水形成率
				对照组	100％(12/12)	75.0％(9/12)	66.7％(8/12)
5-FU组	75.0％(9/12)	50.0％(6/12)	50.0％(6/12)
				正丁基-O-β-D-吡喃果糖苷输液组	50.0％(6/12)	33.3％(4/12)	25.0％(3/12)

与5-FU组相比，P＜0.01

Claims (1)

1.一种R′-β-D-吡喃果糖苷(R′-β-D-fructopyranoside)用于制备防治胃癌细胞、肠癌细胞、食道癌细胞以及肝癌细胞扩散转移药物中的应用，其特征在于：

①所述的R′-β-D-吡喃果糖苷的分子结构为：

②所述的R′-β-D-吡喃果糖苷的R′为：

R′＝正丁基氧(n-butyl-O-) 。