CN109810202B - 白花虎眼万年青多糖的制备方法、在制备治疗抗肠道肿瘤药物或促进益生菌生长的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种白花虎眼万年青多糖的制备方法。并公开了其在制备治疗抗肠道肿瘤药物中的应用，以及在促进益生菌生长方面的应用。本发明采用索氏提取法提取养殖三年的白花虎眼万年青球茎中的多糖，并采用两步冻干法获得干粉。预冻可以保证提取液中的多糖结构固定，防止加热烘干的方式导致多糖改性。本发明发现白花虎眼万年青多糖可有效抑制人结、直肠癌细胞，同时可促进肠道益生菌生长，提示白花虎眼万年青多糖作为抗肠道肿瘤药物时，白花虎眼万年青多糖不仅可抑制癌细胞，同时还可促进益生菌生长，两者协同作用，可以对肠道肿瘤的治疗起到更好的效果。
Description
技术领域
本发明涉及白花虎眼万年青多糖的制备方法及其在制备治疗抗 肠道肿瘤药物或者促进益生菌生长的应用。
背景技术
虎眼万年青(Ornithogalum thyrsoide)，又名珍珠草、海葱、鸟乳花、 葫芦兰等，属百合科虎眼万年青属，为常绿多年生草本植物。该药微 寒，味甘，归肝、脾二经。民间多用其全草或球茎入药。茎、叶部分 捣烂外敷于无名肿痛或疔、疮、痈、疖等患处，可起到清热消炎、消 肿止痛的效果；水煎内服可清热解毒、软坚化瘀，多用于治疗肝炎、 胆囊炎、肝硬化等疾病。
据文献报道，虎眼万年青球茎中含有皂苷类、黄酮类、生物碱类、 单萜内酯类、多糖类、微量元素等多种具有生物活性的物质。其中虎 眼万年青皂苷对肿瘤细胞有一定的抑制和杀伤作用；其中的多糖组分 能增强人体体液免疫和细胞免疫功能，与人参皂苷Rg1相近。地方 民间中医有将白花虎眼万年青用于胃病和胃癌的治疗，并有一定的疗 效。2011年，国内学者陈瑞战等在已知虎眼万年青粗多糖能提高小 鼠免疫功能的基础上，对虎眼万年青粗多糖分离纯化后发现一种 OCAP-2-2对小鼠S180肉瘤有显著的抑制活性。
目前，有关虎眼万年青多糖的抗肿瘤作用研究较少，尤其在抗肠 道肿瘤方面。本发明对白花虎眼万年青多糖进行提取制备，并研究其 在抗肠道肿瘤中的应用。
发明内容
1、发明目的。
本发明提出了一种白花虎眼万年青多糖的制备方法及其在制备 治疗抗肠道肿瘤药物或者促进益生菌生长的应用。
2、本发明所采用的技术方案。
一种白花虎眼万年青多糖的制备方法，其步骤包括：
(1)将养殖三年的白花虎眼万年青球茎切块干燥、粉碎；
(2)将步骤(1)得到的干粉以蒸馏水作为溶剂，90℃～95℃索氏 抽提3～5h，得到提取液；
(3)将步骤(2)得到的提取液旋转蒸发浓缩，浓缩至液体体积 为原体积1/4-1/6时回收溶液；
(4)将步骤(3)中得到的浓缩提取液-15--25℃预冻凝固后继以 -70--80℃冷冻干燥，制成干粉；
(5)将步骤(4)得到的干粉用蒸馏水溶解，溶解液上葡聚糖凝 胶G-50层析柱；
(6)用双蒸水洗脱步骤(5)的葡聚糖凝胶G-50，将多糖区段的 层析液旋转蒸发，冷冻干燥，制成多糖干粉。
优选的，步骤(3)中旋转蒸发的条件控制为70℃±5℃，80～100rpm， 0.09～0.10MPa。
本发明还公开了白花虎眼万年青多糖在制备治疗抗肠道肿瘤药物 中的应用。
具体的，所述肠道肿瘤为直肠癌和结肠癌。
本发明还公开了白花虎眼万年青多糖在促进肠道益生菌生长方面 的应用。
具体的，所述益生菌为双歧杆菌。
3、本发明所产生的技术效果。
(1)本发明采用索氏提取法提取白花虎眼万年青球茎中的多糖， 并采用-15--25℃预冻凝固后继以-70--80℃冷冻干燥的方式获得干 粉。预冻可以保证提取液中的多糖结构固定，防止加热烘干的方式导 致多糖改性。
(2)本发明发现培植三年及以上的白花虎眼万年青多糖可有效抑 制人直肠癌细胞和结肠癌细胞，给制备治疗抗肠道肿瘤药物提供了新 的思路。培植一年的白花虎眼万年青球茎中提取的多糖对人直肠癌细 胞和结肠癌细胞的抑制效果较弱。
(3)本发明发现白花虎眼万年青多糖可促进益生菌生长，提示白 花虎眼万年青多糖作为抗肠道肿瘤药物时，不仅白花虎眼万年青多糖 自身可抑制癌细胞，同时还可促进肠道益生菌生长，两者协同作用， 可以对肠道肿瘤的治疗起到更好的效果。
具体实施方式
实施例1
白花虎眼万年青多糖的制备方法，其步骤包括：
(1)将培植三年的白花虎眼万年青球茎切块干燥、粉碎；
(2)将步骤(1)得到的干粉以蒸馏水作为溶剂，90℃～95℃索氏 抽提3～5h，得到提取液；
(3)将步骤(2)得到的提取液旋转蒸发浓缩，旋转蒸发的条件 控制为70℃±5℃，80～100rpm，0.09～0.10MPa；浓缩至液体体积为原 体积1/4-1/6时回收溶液；
(4)将步骤(3)中得到的浓缩提取液-15--25℃预冻凝固后继以 -70--80℃冷冻干燥，制成干粉；
(5)将步骤(4)得到的干粉用蒸馏水溶解，溶解液上葡聚糖凝 胶G-50层析柱；
(6)用双蒸水洗脱步骤(5)的葡聚糖凝胶G-50，将多糖区段的 层析液旋转蒸发，冷冻干燥，制成多糖干粉。
制得的白花虎眼万年青多糖成分包括阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、 半乳糖，其比例为1.55：1：5.76：3.65。
实施例2
白花虎眼万年青多糖对人直肠癌细胞HR-8348的抑制作用
取处于指数生长期、状态良好的人直肠癌细胞HR-8348一瓶，制 成悬液；细胞计数，调整细胞悬液中细胞数为1×105/mL；接种于96 孔板上，100μL/孔，培养12小时；弃培养液，加入白花虎眼万年青 多糖，多糖终浓度分别为1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.1μg/ml、 0.05μg/ml、0.025μg/ml、0μg/ml，培养48小时；弃培养液，加入CCK-8 试剂，10μL/孔，培养4小时，测定A450nm，并计算细胞抑制率。
细胞抑制率(％)＝[1-(A实验组-A生长对照组)/(A生长对照 组-A空白)]×100％
实验结果：0.025～1.00μg·mL-1白花虎眼万年青多糖对人直肠癌细 胞HR-8348有抑制作用。结果见表2。
表2白花虎眼万年青多糖对人直肠癌细胞HR-8348的抑制率
| 浓度(μg/ml) | 抑制率(％) |
| 1 | 97.36 |
| 0.5 | 94.24 |
| 0.25 | 89.26 |
| 0.1 | 86.55 |
| 0.05 | 76.91 |
| 0.025 | 66.42 |
实施例3
白花虎眼万年青多糖对人结肠癌细胞SW-480的抑制作用
取处于指数生长期状态良好的人结肠癌细胞SW-480一瓶，制成 悬液；细胞计数，调整细胞悬液中细胞数为1×105/mL；接种于96孔 板上，100μL/孔，培养12小时；弃培养液，加入白花虎眼万年青多 糖，多糖终浓度分别为1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml、0.025μg/ml、0μg/ml，培养48小时；弃培养液，加入CCK-8 试剂，10μL/孔，培养4小时，测定A450nm，并计算细胞抑制率。
细胞抑制率(％)＝[1-(A实验组-A生长对照组)/(A生长对照 组-A空白)]×100％
实验结果：0.025～1.00μg·mL-1白花虎眼万年青多糖对人结肠癌细 胞SW-480有抑制作用。结果见表3。
表3白花虎眼万年青多糖对人结肠癌细胞SW-480的抑制率
| 浓度(μg/ml) | 抑制率(％) |
| 1 | 94.52 |
| 0.5 | 93.88 |
| 0.25 | 96.16 |
| 0.1 | 71.30 |
| 0.05 | 67.34 |
| 0.025 | 70.42 |
实施例4
白花虎眼万年青多糖对双歧杆菌的促生长作用
在96孔板中加入100μL1.0×105CFU·mL-1双歧杆菌菌液和100μL 白花虎眼万年青多糖溶液，多糖终浓度分别为10mg·mL-1、8mg·mL-1、 6mg·mL-1、4mg·mL-1、2mg·mL-1、0mg·mL-1，厌氧培养16h，测定 A600nm，并计算促进率。
促进率(％)＝(A实验组-A空白)/A空白×100。
实验结果：1～5mg·mL-1虎眼万年青多糖对双歧杆菌生长均有促进 作用，5mg·mL-1的促进率最高。结果见表4。
表4白花虎眼万年青多糖对双歧杆菌生长的促进率
对比例1
采用实施例1相同的方法来提取一年生的白花虎眼万年青多糖。
采用实施2和3的方法检测一年生白花虎眼万年青多糖对人直肠癌 细胞和结肠癌细胞的抑制作用，结果如表5和表6所示。
结论：培植一年的白花虎眼万年青多糖对人直肠癌细胞和结肠癌细 胞的抑制作用不明显。
表5一年生白花虎眼万年青多糖对HR-8348人直肠癌细株吸光度 测定及抑制率
| 浓度(μg/ml) | 抑制率(％) |
| 1 | 41.16 |
| 0.5 | 38.42 |
| 0.25 | 28.57 |
| 0.1 | 22.36 |
| 0.05 | 17.49 |
| 0.025 | 12.77 |
表6一年生白花虎眼万年青多糖对SW-480人结肠癌细的抑制率
| 浓度(μg/ml) | 抑制率(％) |
| 1 | 43.04 |
| 0.5 | 39.56 |
| 0.25 | 32.21 |
| 0.1 | 21.89 |
| 0.05 | 18.43 |
| 0.025 | 11.31 |
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不 受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下 所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都 包含在本发明的保护范围之内。
在本发明的描述中，需要理解的是，指示方位或位置关系的术 语，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指 的设备或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因 此不能理解为对本发明的限制。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、 “连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可 以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可 以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部 的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而 言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、 “下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外” 等指示的方位或位置关系是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示 所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作， 因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二” 、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要 性。
此外，术语“水平”、“竖直”、“悬垂”等术语并不表示要求部件 绝对水平或悬垂，而是可以稍微倾斜。如“水平”仅仅是指其方向相 对“竖直”而言更加水平，并不是表示该结构一定要完全水平，而是 可以稍微倾斜。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征 之上或之下可以包括第一和第二特征直接接触，也可以包括第一和第 二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外的特征接触。而且，第 一特征在第二特征之上、上方和上面包括第一特征在第二特征正上方 和斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在 第二特征之下、下方和下面包括第一特征在第二特征正下方和斜下 方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
Claims (4)
1.一种白花虎眼万年青多糖的制备方法，其步骤包括：
(1)将养殖三年的白花虎眼万年青球茎切块干燥、粉碎；
(2)将步骤(1)得到的干粉以蒸馏水作为溶剂，90℃～95℃索氏抽提3～5h，得到提取液；
(3)将步骤(2)得到的提取液旋转蒸发浓缩，浓缩至液体体积为原体积1/4-1/6时回收溶液；
(4)将步骤(3)中得到的浓缩提取液在-15--25℃预冻凝固后继以-70--80℃冷冻干燥，制成干粉；
(5)将步骤(4)得到的干粉用蒸馏水溶解，溶解液上葡聚糖凝胶G-50层析柱；
(6)用双蒸水洗脱步骤(5)的葡聚糖凝胶G-50，将多糖区段的层析液旋转蒸发，冷冻干燥，制成多糖干粉。
2.根据权利要求1所述的白花虎眼万年青多糖的制备方法，其特征在于：步骤(3)中旋转蒸发的条件控制为70℃±5℃，80～100rpm，0.09～0.10MPa。
3.白花虎眼万年青多糖在制备治疗抗肠道肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述白花虎眼万年青多糖采用权利要求1或2的方法制成，所述肠道肿瘤为直肠癌和结肠癌。
4.白花虎眼万年青多糖在促进双歧杆菌生长方面的应用，其特征在于：所述白花虎眼万年青多糖采用权利要求1或2的方法制成。
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