CN1739548A - 治疗肝癌的虎眼万年青多糖药物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从虎眼万年青中提取的治疗肝癌的虎眼万年青多糖药物，其含有阿拉伯糖(arabinose)和半乳糖(galactose)成分，其主要组分是阿拉伯半乳糖蛋白。所述的虎眼万年青多糖提取物是通过如下的方法提取的：以虎眼万年青为原料，采用水提醇沉方法使虎眼万年青多糖含量以葡萄糖计达50％～60％(W/W)；以虎眼万年青多糖为活性成分，不加任何辅料可以制成治疗肝癌药物，疗效确切。吉林省长白山区野生和人工种植虎眼万年青资源十分丰富。本发明的虎眼万年青多糖，有丰富的原料来源。由于虎眼万年青多糖所具有的明显的抗辐射、提高机体免疫力和抗肿瘤的功效，可以用于制备有效治疗肝癌的药物，具有广阔的应用前景。

Description

治疗肝癌的虎眼万年青多糖药物

技术领域：

本发明涉及从虎眼万年青中提取的虎眼万年青多糖提取物为单一组分，以虎眼万年青多糖为有效活性成分治疗肝癌的虎眼万年青多糖药物

背景技术：

虎眼万年青(Ornithogalum caudatum Ait.)是长白山地区特有的民间药材，虽然未见历代本草收载，但民间多用其全草或球茎入药，外用其鲜汁液涂抹于患处以治疗疔疮、消炎；内服可治疗无名肿毒、肝炎、腮腺炎、肝硬化、肝癌等，而且疗效确切，毒副作用小。

近几年来，国内外对其基础研究的报道较多，1992年，国外科学家从同属植物虎眼万年青(Ornithogalum Saundersiae)中分离出具有强抗癌作用的酰化二糖皂苷类化合物OSW-1。生理活性筛选实验表明，其体外对肺癌、乳房癌有明显抗癌活性，对P388小鼠白血病细胞有细胞毒作用，对P388细胞蛋白合成前体的结合及核酸的合成有抑制作用，比常见抗癌药喜树碱、阿霉素、紫杉醇的抗癌活性高10倍以上，而且对正常细胞没有毒性作用。

目前，科学家正在对虎眼万年青皂苷的分子结构进行改造，以期进一步提高其活性，使其更有可能成为抗癌药物，而美国同行则正在利用我国科学家提供的样品进行抗癌机理的研究。

发明内容：

本发明的目的在于：提供一种用新的方法从虎眼万年青提取的虎眼万年青多糖提取物，以虎眼万年青多糖提取物为单一组分，将虎眼万年青多糖作为活性成分用于制备治疗肝癌的药物。

本发明提供的从虎眼万年青提取的虎眼万年青多糖提取物，它是通过如下的方法提取的：以虎眼万年青为原料，粉碎成粗颗粒，分别按13mL/g生药、10mL/g生药及10mL/g生药加水，加热至沸腾，提取三次，每次2小时，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度1.03～1.05(80℃)，放冷，加乙醇至含醇量为20％，静置24小时，抽滤，弃去沉淀物，滤液再加乙醇至含醇量为70％，静置24小时，抽滤，收取沉淀，沉淀以无水乙醇适量洗涤，干燥(50℃)，粉碎成80目细粉，得虎眼万年青多糖干粉提取物，其中虎眼万年青多糖含量以葡萄糖计达50％～60％(W/W)。

本发明所述的虎眼万年青多糖含有阿拉伯糖(arabinose)和半乳糖(galactose)成分，其主要组分是阿拉伯半乳糖蛋白。

发明人发现本发明提供的从虎眼万年青提取的虎眼万年青多糖对于肝癌有良好的治疗作用。本发明提供的虎眼万年青多糖即使大剂量使用时，实验动物的行为也无任何显著变化。对动物神经系统、心血管系统、呼吸系统无明显影响。大鼠长期毒性试验结果表明：给药组及对照组大鼠在给药期间及恢复期内均活动正常，毛发光泽，未见尿、粪便异常，无一死亡；动物体重增长给药组与对照组比较无显著性差异；动物血液血象和血液生化学检查总体未见异常，病理组织学检查未见异常，其它送检的脏器均未见有规律的形态学改变，在大鼠长期毒性恢复期后也未见有各脏器有规律的形态学改变。故可认为虎眼万年青多糖对大鼠长期毒性极低。

虎眼万年青多糖鉴定：

将本发明提供的从虎眼万年青提取的虎眼万年青多糖提取物粗品溶解配成20％水溶液，经唾液淀粉酶37℃酶解除淀粉，Sevage法除蛋白，蒸馏水透析48h除盐浓缩后的样品在热水(60℃)中溶解，然后加入不同体积的乙醇使含醇量分别达到40％、60％进行分级沉淀。这样多糖被分成3个部分：40％乙醇沉淀(OC-1)、60％乙醇沉淀(OC-2)和60％乙醇溶解部分(即60％乙醇沉淀的上清液)(OC-3)。

将60％乙醇沉淀部分(OC-2)溶于热水(60℃)后与Sephadex DEAE树脂在一个烧杯中混合。平衡后，将树脂置于漏斗中并用0.5M NH₄HCO₃溶液洗涤，由此分成2个组分：0.5M NH₄HCO₃洗脱液(OC-2-1)和结合在树脂上的残余组分(OC-2-2)。0.5M NH₄HCO₃洗脱液蒸干后溶解在水中装在DEAE柱上，将此多糖用0.2M NH₄HCO₃溶液等度洗脱，测定各洗脱液的215nm和280nm的吸收值(OD值)，用收集管数对OD值绘制洗脱曲线。将同一洗脱峰的组分合并，产生4个主要组分：OC-2-1-a(未结合部分)，OC-2-1-b，OC-2-1-c，OC-2-1-d，OC-2-1-e。用旋转蒸发仪在60℃以下将各组分蒸干，然后用PD 10柱除去盐和小分子。

我们采用改良硫酸-咔唑法，首先对其中OC-2-1-b，OC-2-1-c，OC-2-1-d，OC-2-1-e四个组分糖醛酸含量法进行了测定，结果表明，OC-2-1-b，OC-2-1-c，OC-2-1-d，OC-2-1-e各组分含有较高的糖醛酸含量，其含量分别为22％，25％，52％，53％。

其次，OC-2-1-b，OC-2-1-c，OC-2-1-d，OC-2-1-e四个组分在SDS凝胶(SDS PAGE 4-15％)电泳后用考马斯亮蓝(Coomasssie Blue)试剂和β-葡萄糖基-Yariv(1，3，5-三-(4-β-D-葡萄吡喃糖基-氧化苯基-偶氮基)-2，4，6-三羟基苯)试剂分别染色，所用Marker是Benchmarker预先染色的蛋白梯度(分子量从6.0到181.8kDa)OC-2-1-b，OC-2-1-c，OC-2-1-d，OC-2-1-e四个组分用考马斯亮蓝试剂染色后未发现明显的蛋白质点；用β-葡萄糖基-Yariv试剂染色后现出4个明显的红色条带。由于β-葡萄糖基-Yariv试剂是阿拉伯半乳糖蛋白(arabino-galactan proteins，AGPs)的特异性染色剂，因此可以初步说明OC-2-1-b，OC-2-1-c，OC-2-1-d，OC-2-1-e四个组分是阿拉伯半乳糖蛋白。

将糖醛酸还原，然后甲基化，用气相色谱法进行连接和组成分析，结果表明，OC-2-1-b，OC-2-1-c，OC-2-1-d，OC-2-1-e四个组分含有较高的阿拉伯糖(arabinose)和半乳糖(galactose)成分，这进一步说明四个组分主要是阿拉伯半乳糖蛋白。

实验结果表明：本发明的虎眼万年青多糖对昆明小鼠肝癌H₂₂的平均抑瘤率分别为16.72％、23.86％、40.75；对小鼠肉瘤S₁₈₀的平均抑瘤率分别为27.49％、33.53％、49.61％；对腹腔接种肝癌腹水(HepA)小鼠的平均生命延长率分别为35.4％、51.4％、49.2％。提示虎眼万年青多糖200mg/kg剂量组对小鼠肝癌H₂₂及肉瘤S₁₈₀生长有明显的抑制作用，可使腹腔接种肝癌腹水(HepA)小鼠的生命延长率明显延长。

吉林省长白山区野生和人工种植虎眼万年青资源十分丰富。本发明提供的从虎眼万年青提取的虎眼万年青多糖，有丰富的原料来源。本发明对其有效成分和药理活性作了进一步的研究，由于虎眼万年青多糖所具有的明显的抗辐射、提高机体免疫功能和抗肿瘤的功效，其可以用于制备治疗肝癌的药物

本发明的虎眼万年青多糖可以按照医药学领域的常规技术及生产方法，以虎眼万年青多糖提取物为单一组分，以虎眼万年青多糖为有效活性成分制备药物的各种剂型，包括片剂和胶囊剂。本发明的虎眼万年青多糖药物对于人的用量可以是0.9g/次。一日3次服用。

具体实施方式：

下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是限制本发明。

实施例一：虎眼万年青多糖提取物的制备

取虎眼万年青药材6000g，粉碎成粗颗粒，分别加水13mL/g生药、10mL/g生药及10mL/g生药，加热至沸腾，提取三次，每次2小时，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度1.03～1.05(80℃)放冷，加乙醇至含醇量为20％，静置24小时，抽滤，弃去沉淀物，滤液继续加乙醇至含醇量为70％，静置24小时，抽滤，收取沉淀，沉淀以无水乙醇适量洗涤，干燥(50℃)，粉碎成细粉，得虎眼万年青多糖提取物干粉300g，经分光光度法测定虎眼万年青多糖含量以葡萄糖计达50％～60％(W/W)。

实施例二

取虎眼万年青多糖提取物细粉，装入1#胶囊，制成1000粒，每粒0.3g，即得药物成品。

其它项目应符合中华人民共和国药典2005版胶囊项下有关规定。

实施例三

取虎眼万年青多糖提取物细粉，用85％乙醇湿法制粒，整粒，干燥，压片。每片0.3g，即得药物成品。

其它项目应符合中华人民共和国药典2005版片剂项下有关规定。

实施例四

虎眼万年青多糖对肝癌的治疗作用的实验：

实验是用本发明的实施例一所得的虎眼万年青多糖提取物50、100、200mg/kg剂量组对昆明种小鼠进行试验。昆明种小鼠，6～8周龄，体重18～22g，雌雄兼用。每批实验采用同一性别，实验前在实验室常规饲养一周。

将小鼠按体重随机分为5组：

对照组：给予蒸馏水

阳性药对照组：给予环磷酰胺20mg/kg

药物多糖小剂量组：给予虎眼万年青多糖提取物50mg/kg

药物多糖中剂量组：给予虎眼万年青多糖提取物100mg/kg

药物多糖大剂量组：给予虎眼万年青多糖提取物200mg/kg

药物组每日灌胃给药1次，给药容量均为0.2ml/10g，共10～15天。

按抗肿瘤药物实验方法制备体内移植性肿瘤模型，取接种于昆明种小鼠第7天的肝癌H₂₂腹水，在无菌条件下配制成瘤细胞悬液，调整活细胞数为1×107/ml，接种于昆明种小鼠左腹股沟皮下，每只小鼠接种0.2ml，接种次日起分组给药。于停药后24小时颈椎脱臼处死荷瘤小鼠，剥离肿瘤组织，称重。结果以肿瘤生长抑瘤率表示：

抑瘤率＝(1-实验组平均瘤重/对照平均瘤组)×100％

取符合实验标准要求(对照组平均瘤重＞1g，且瘤重＜400mg的动物数不超过总数的20％)的三批试验结果进行统计学分析。

三批试验结果表明，虎眼万年青多糖多糖提取物50、100、200mg/kg剂量组对小鼠肝癌H₂₂的平均抑瘤率分别为16.72％、23.86％、40.75％；虎眼万年青纯化前多糖50、100、200mg/kg剂量组对小鼠肝癌H₂₂的平均抑瘤率分别为15.02％、21.86％、30.06％，表明虎眼万年青多糖大剂量组对小鼠肝癌H₂₂生长有明显抑制作用，虎眼万年青多糖小、中剂量组及虎眼万年青纯化前多糖对小鼠肝癌H₂₂生长有一定的抑制作用，见表1-1、1-2、1-3。

    表1-1虎眼万年青多糖对小鼠肝癌H₂₂的生长抑制作用( x±s)

组别      例数        药前体重     药后体重     瘤重        抑瘤率

          (药前/药后) (g)          (g)          (g)         (％)

对照组

20ml/kg   21/20       21.40±1.96  23.55±3.82  2.44±1.13  -

环磷酰胺

20mg/kg   21/17       20.67±1.35  19.93±1.98  1.09±0.31  55.43^***

虎眼万年青多糖

50mg/kg   12/12       20.11±1.44  22.20±2.90  2.10±0.83  14.00

100mg/kg  12/12       20.58±1.44  21.50±2.81  2.03±0.58  16.88

200mg/kg  12/9        20.11±1.27  23.78±2.44  1.49±0.68  38.93^*

虎眼万年青纯化前多糖

50mg/kg   12/11       21.80±1.40  24.20±2.90  2.06±0.74  15.90

100mg/kg  12/12       22.08±1.56  24.50±2.84  1.96±0.72  19.92

200mg/kg  12/9        20.56±2.01  23.56±4.19  2.00±1.31  18.22

注：与对照组比较^***P＜0.001

       表1-2虎眼万年青多糖对小鼠肝癌H₂₂的生长抑制作用( x±s)

组别      例数        药前体重     药后体重     瘤重        抑瘤率

          (药前/药后) (g)          (g)          (g)         (％)

对照组

20ml/kg   22/16       19.75±1.48  26.56±3.93  2.07±1.06  -

环磷酰胺

20mg/kg   22/14       19.50±1.51  20.71±4.78  0.80±0.71  61.16^**

虎眼万年青多糖

50mg/kg   12/12       20.80±1.40  25.20±2.90  1.77±0.62  14.42

100mg/kg  12/11       20.55±1.21  27.27±4.78  1.71±0.72  17.42

200mg/kg  12/11       20.11±0.78  24.89±3.86  1.23±0.62  40.58^**

虎眼万年青纯化前多糖

50mg/kg   12/11       20.80±1.40  26.20±2.90  1.84±0.46  11.08

100mg/kg  12/12       20.58±1.16  27.00±5.13  1.64±0.96  20.78

200mg/kg  12/12       20.58±1.16  27.08±3.92  1.60±0.86  22.54

注：与对照组比较^**P＜0.01

      表1-3虎眼万年青多糖对小鼠肝癌H₂₂的生长抑制作用( x±s)

组别      例数        药前体重     药后体重     瘤重        抑瘤率

          (药前/药后) (g)          (g)          (g)         (％)

对照组

20ml/kg   18/14       18.12±0.86  26.21±3.04  2.20±1.58  -

环磷酰胺

20mg/kg   18/15       18.13±1.13  22.67±3.64  0.46±0.25  79.12^***

虎眼万年青多糖

50mg/kg   13/11       19.80±1.40  24.20±2.90  1.72±0.46  21.97

100mg/kg  13/11       19.27±0.65  25.27±5.20  1.38±0.84  37.28

200mg/kg  13/13       18.92±0.95  26.85±3.02  1.26±0.77  42.73^*

虎眼万年青纯化前多糖

50mg/kg   13/11       18.80±1.40  26.20±2.90  1.80±0.66  18.09

100mg/kg  13/12       18.53±0.79  26.83±2.66  1.66±0.86  24.88

200mg/kg  13/12       18.58±0.79  26.67±1.92  1.11±0.56  49.42^**

注：与对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001

Claims (4)

1、一种治疗肝癌的虎眼万年青多糖药物，其特征在于：虎眼万年青多糖含有阿拉伯糖(arabinose)和半乳糖(galactose)成分，其主要组分是阿拉伯半乳糖蛋白。

所述的虎眼万年青多糖是用如下的方法提取的：将虎眼万年青药材粉碎成粗颗粒，加水量分别为13mL/g生药、10mL/g生药及10mL/g生药，加热至沸腾，提取三次，每次2小时，滤液浓缩至相对密度1.03～1.05(80℃)，加乙醇至含醇量为20％，静置24小时，抽滤，弃去沉淀，滤液继续加乙醇至含醇量为70％，静置24小时，抽滤，收取沉淀，沉淀以无水乙醇适量洗涤，干燥(50℃)，得虎眼万年青多糖干粉提取物，其中虎眼万年青多糖含量以葡萄糖计达50％～60％(W/W)。

2、根据权利要求1所述的治疗肝癌的虎眼万年青多糖药物，其特征在于，所述的虎眼万年青多糖的提取方法是：在沉淀以无水乙醇适量洗涤，干燥(50℃)后，粉碎成80目细粉，得虎眼万年青多糖干粉提取物，其中虎眼万年青多糖含量以葡萄糖计达50％～60％(W/W)。

3、根据权利要求1所述的治疗肝癌的虎眼万年青多糖药物，其特征在于，以虎眼万年青多糖提取物为单一组分，以虎眼万年青多糖为有效活性成分，可以制成胶囊剂型。

4、根据权利要求1所述的治疗肝癌的虎眼万年青多糖药物，其特征在于，以虎眼万年青多糖提取物为单一组分，以虎眼万年青多糖为有效活性成分，可以制成片剂剂型。