CN108530551B - 贝母多糖的制备及在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

贝母多糖的制备及在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

贝母多糖的制备及在制备抗肿瘤药物中的应用，属于植物活性成分的药物医疗和保健应用领域。依次采用水提取、醇沉、Sevag法脱蛋白、透析分离纯化，然后浓缩冷冻干燥。该贝母多糖中不含有蛋白质；肿瘤包括Hela(人宫颈癌细胞)，SH‑SY5Y(人神经母细胞瘤细胞)，MCF‑7(人乳腺癌细胞)，U266(人骨髓瘤细胞)、RAW264.7(小鼠腹腔巨噬细胞细胞)等。本发明将贝母多糖用于抗癌药物的制备，以供癌症的治疗使用。

Description

贝母多糖的制备及在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种贝母多糖的抗肿瘤作用，属于植物活性成分的药物医疗和保健应用领域。
背景技术
癌症一直是影响人类健康主要疾病之一。2014年世界卫生组织(WHO)发布的《全球癌症报告》数据显示，我国的新增癌症病例高居第一位。在肝、食道、胃和肺等4种恶性肿瘤中，中国新增病例和死亡人数均居世界首位。
多糖(Polysaccharides)是一类具有广泛生物学功能的化合物，它不仅是生命体的物质基础，同时参与到细胞间的识别、机体免疫功能的调节、细胞的转化、肿瘤细胞的凋亡等生物学过程。目前对于多糖抗肿瘤、免疫调节的研究受到广泛关注。
贝母属于百合科多年生草本植物，在2015年版《中国药典》一部中收载川贝母Fritillaria cirrhosa D.Don、暗紫贝母Fritillaria unibracteata Hsiao etK.C.Hsia、甘肃贝Fritillaria przewalskii Maxim.的干燥鳞茎。贝母属药食同源植物，主要药用或食用部位是贝母鳞茎，其性苦、甘、微寒，归肺、心经，具有镇咳、祛痰、平喘、镇静、镇痛、心血管、抗溃疡、抗血小板聚集、抗肿瘤等功效。
发明内容
本发明的目的是提供一种贝母多糖的制备，及在制备抗肿瘤药物方面的新用途。
本发明的技术方案为：一种贝母多糖的制备，对贝母进行多糖提取分离、纯化后，再将多糖作用于Hela(人宫颈癌细胞)，SH-SY5Y(人神经母细胞瘤细胞)，MCF-7(人乳腺癌细胞)，U266(人骨髓瘤细胞)、RAW264.7(小鼠腹腔巨噬细胞细胞)等肿瘤细胞。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种贝母多糖的制备、表征及在抗肿瘤中的应用。
本发明所提供的贝母多糖，经测试具有一定的抗肿瘤活性，在体外给药0.043-1.4mg/mL范围内可抑制多种肿瘤细胞的生长，且呈现明显的量效关系。
本发明一种贝母多糖的制备，包括以下步骤：
1)预处理：
将贝母粉碎，如采用XDW-6J超微粉碎机粉碎，备用，优选粉碎成超微粉；
2)贝母粗多糖分离：
称取步骤1)贝母粉加入纯水，于60-80℃水浴提取0.5-2h，离心分离出上清液，将分离出固体按上述操作重复3次，将3次上清液合并；合并的上清液进行浓缩，加入无水乙醇，4℃下进行醇沉24h，离心，并用乙醇洗涤沉淀多次并边洗涤边搅拌，-60℃下真空冷冻干燥，得到灰色粗多糖；
优选每10g加入纯水50-200mL，合并的上清液浓缩至10-15mL，加入3-4倍体积的无水乙醇进行醇沉。
3)Sevag法脱蛋白：
将步骤2)所得的粗多糖用蒸馏水溶解后，加入与蒸馏水等体积的Sevage试剂震荡30min，之后离心，取上清；重复多次，上清液备用；其中Sevage试剂为氯仿:正丁醇体积比＝4:1；
4)贝母多糖透析分离纯化：
取步骤3)中上清液，放入透析袋中，在蒸馏水中透析72h，中间不断换水；所用透析袋截留分子量为3500以上；析袋中所得液体于-60℃下冷冻真空干燥，得贝母多糖。
贝母多糖含量测定
利用高效凝胶渗透色谱法对所得昆布多糖进行分析检测，结果表明贝母多糖纯度为80％以上；同时，用考马斯亮蓝G-250法测蛋白质为阴性，表明实验用贝母多糖中不含有蛋白质。
贝母多糖的红外光谱
取适量待测样品，用溴化钾(KBr)压片后置于IR检测台上，在4000～800cm-1进行扫描，观察谱峰情况。
贝母多糖的IR光谱中出现3407cm-1、2928cm-1、1655cm-1、1369cm-1、1023cm-1等典型的多糖特征吸收峰；861cm-1附近有α-糖苷键的特征吸收峰；762cm-1附近的吸收峰说明其含有吡喃环；IR光谱中出现了1655、1369和1153cm-1吸收峰，推测为C＝O伸缩振动和O-H变角振动、-CO的C＝O非对称伸缩振动和C＝O对称伸缩振动特征吸收峰，说明多糖组分中含有糖醛酸。
贝母多糖的抗氧化活性
①DPPH自由基清除能力的测定
将0.2mL DPPH乙醇溶液(0.1mmol/mL)、0.2mL贝母多糖溶液(浓度分别为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.20、0.50、0.80、1.0mg/mL)放入96孔板中，搅拌均匀后，避光室温反应30min后于517nm波长处测定混合物的吸光度。
清除率SD(％)＝[1-(Ai-Aj)/Ac]×100
其中：Ac：2mLDPPH加2mL无水乙醇
Aj：2mL无水乙醇加2mL待测液
Ai：2mLDPPH加2mL待测液
②·OH自由基活性
将0.1mL 10mmol/L Fe3O4、0.1mL 10mmol/L水杨酸的乙醇溶液、以及0.1mL贝母多糖溶液(浓度分别为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.20、0.50、0.80、1.0mg/mL)放入96孔板中。最后加0.1mL8.8mmol/L H2O2，于37℃反应0.5h，以蒸馏水作参比，在510nm下测定各浓度的吸光度。以蒸馏水作为空白。
清除率计算公式：清除率(％)＝[A0-(A1-A2)]/A0×100
其中：A0为参比溶液的吸光度
A1为加入贝母多糖溶液后的吸光度
A2为不加显色剂H2O2的吸光度
贝母多糖的抗肿瘤活性检测
根据样品溶解情况，用无菌生理盐水溶解样品并0.22μm滤膜过滤除菌，贝母多糖样品为10mg/ml。
将所选肿瘤细胞于37℃、5％CO2及饱和湿度环境下培养于含10％胎牛血清的完全培养基，细胞呈对数增长时铺板，调整细胞悬浮浓度为3000个/ml，接种于96孔培养板，其中每孔180μl。待细胞贴壁生长12h后，加入检测样品(43.75、87.5、175、350、700、1400μl/ml)及阳性对照药各20μl，空白组同时加入等体积生理盐水，细胞共同孵育72h后，弃细胞上清，加入终浓度为0.5mg/ml CCK-8溶液，继续培养4h。吸弃上清，每孔加入150μl DMSO，置摇床上振荡10min，使结晶物充分溶解，于酶标仪450nm处测量吸光值。独立重复三次实验。
肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(OD对照-OD实验)/(OD对照-OD空白)×100。
MTT实验中，抑制率越高，说明受试物的作用活性越强。
本发明所提供的贝母多糖，主要用于癌症的治疗与辅助治疗，如：Hela(人宫颈癌细胞)，SH-SY5Y(人神经母细胞瘤细胞)，MCF-7(人乳腺癌细胞)，U266(人骨髓瘤细胞)、RAW264.7(小鼠腹腔巨噬细胞细胞)等，尤其对SH-SY5Y、MCF-7和U266细胞株有一定的杀伤作用，可用于制备抗肿瘤或治疗肿瘤的药物。
本发明所述的抗肿瘤药物包括贝母多糖和药学上可接受的载体或者常规食用辅料，如：淀粉、蔗糖、乳糖、糖粉、葡萄糖、甘露醇等。
本发明所述的抗肿瘤药物的剂型为药学上可接受的任意一种剂型。
本发明中采用的贝母多糖试样的制备方法与现有同类技术相比，具有如下优点：
1)本工艺对提高贝母多糖的纯度具有较好的借鉴；
2)贝母为常见中药材，从贝母中提取多糖成分，有利于实现了贝母原材料的高值化利用；
3)本发明的贝母多糖具有较好的抑制肿瘤生长的作用；
4)贝母性寒、味苦，具有较强的抗炎、抗病毒及抗肿瘤的作用，常与其他清热解毒药物配伍使用，治疗乳腺疾患、结核、皮肤肿烂等疾病。
附图说明
图1贝母多糖的红外谱图
图2贝母多糖的DPPH自由基清除率
图3贝母多糖的羟自由基清除率
图4制备的贝母多糖，在作用72h后，对Hela(人宫颈癌细胞)，SH-SY5Y(人神经母细胞瘤细胞)，MCF-7(人乳腺癌细胞)，U266(人骨髓瘤细胞)、RAW264.7(小鼠腹腔巨噬细胞细胞)的细胞生长抑制率的对比。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1：贝母多糖的制备方法
1)预处理：
取贝母药材，经超微粉碎后，备用。
2)水提：
称取步骤1)贝母细粉5g的，放入纯水100mL中搅拌均匀，用柠檬酸调节溶液pH在4.5，于65℃，200W超声辅助提取45min，过滤，滤液减压浓缩至10～20mL。向所得滤液中加4倍无水乙醇，4℃下冷藏过夜，经高速离心分离得清液。将分离的清液减压浓缩，得浓缩液；在浓缩液中加入质量浓度95％乙醇，4℃下冷藏过夜，过滤得到沉淀，用乙醇洗涤沉淀多次并边洗涤边搅拌，然后用乙醇洗涤多次并边洗涤边搅拌，干燥，得到灰色粗多糖。
3)Sevag法脱蛋白：
将步骤2)所得的粗多糖用蒸馏水溶解后，加入与蒸馏水等体积的正丁醇：氯仿(1：4)混合溶液混合后，离心，取上清液；重复多次；上清液备用。
4)透析分离纯化：
取步骤3)中上清液，放入透析袋中，在蒸馏水中透析72h，中间不断换水；所用透析袋截留分子量为3500以上；
5)将步骤4)透析袋中所得的浓缩液进行减压浓缩直至固形物含量≥30％，再冷冻干燥，得贝母多糖。
实施例2：贝母多糖抗肿瘤活性检测
1)细胞株：Hela(人宫颈癌细胞)，SH-SY5Y(人神经母细胞瘤细胞)，MCF-7(人乳腺癌细胞)，U266(人骨髓瘤细胞)、RAW264.7(小鼠腹腔巨噬细胞细胞)。
2)待测样品：提取的贝母多糖，完全培养基配制，终浓度为10mg/mL。
3)CCK-8法
肿瘤细胞于37℃、5％CO2及饱和湿度环境下培养于含10％胎牛血清的完全培养基,细胞呈对数增长时铺板，调整细胞浓度至3000个/孔接种180μl完全于96孔培养板。待细胞贴壁生长12h后，加入检测样品及阳性对照药20μl，终浓度均为10μg/ml，空白组同时加入等体积生理盐水，细胞共同孵育72h后，弃细胞上清，加入终浓度为0.5mg/ml CCK-8溶液，继续培养4h。吸弃上清，每孔加入150μl DMSO，置摇床上振荡10min，使结晶物充分溶解，于酶标仪450nm处测量吸光值。独立重复三次实验。
肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(OD对照-OD实验)/(OD对照-OD空白)×100。
CCK-8法实验中，抑制率越高，说明受试物的作用活性越强。
经CCK-8检测贝母多糖的肿瘤活性，在多糖能显著的抑制Hela(人宫颈癌细胞)，SH-SY5Y(人神经母细胞瘤细胞)，MCF-7(人乳腺癌细胞)，U266(人骨髓瘤细胞)、RAW264.7(小鼠腹腔巨噬细胞细胞)的生长，见图4。进一步对贝母多糖的抗肿瘤活性进行复筛，结果发现该化合物随着浓度增大对各肿瘤细胞的增殖抑制率呈明显的正相关，对SH-SY5Y细胞的IC50为0.65mg/mL，表明贝母多糖对SH-SY5Y细胞具有一定的抑制细胞增殖活性；而对MCF-7和U266的IC50均大于1.4mg/mL，说明对这两种肿瘤细胞的增殖抑制相对较弱。
实施例3：贝母多糖样品制剂
贝母多糖胶囊的制备方法：取实施例1中贝母多糖粉末，加入1％～15％淀粉或其它药学上可接受的载体或者常规食用辅料(如蔗糖、糖粉、木糖醇、聚乙二醇、吐温-80、甘油、纤维素钠、糊精、硫代硫酸钠和明胶等常规辅料，制剂的后期制备工艺及设备均属制药领域的常规技术，本发明对此不作限定，故在此不予详述)，用90％乙醇为润湿剂，制备软材，过20目筛制粒，60℃下干燥，20目筛整理，即得合格颗粒，装胶囊，得0.050g贝母多糖/粒。

Claims (3)

1.一种贝母多糖的应用，其特征在于，所述的贝母多糖用于制备治疗肿瘤SH-SY5Y（人神经母细胞瘤细胞）的药物；
所述贝母多糖制备方法，包括以下步骤：
1) 预处理：
将贝母粉碎，备用；
2) 贝母粗多糖分离：
称取步骤1）贝母粉加入纯水，用柠檬酸调节溶液pH在4.5，于60-80 ℃水浴提取0.5-2h，离心分离出上清液，将分离出固体按上述操作重复3次，将3次上清液合并；合并的上清液进行浓缩，加入无水乙醇，4 ℃下进行醇沉24 h，离心，并用乙醇洗涤沉淀多次并边洗涤边搅拌，-60℃下真空冷冻干燥，得到灰色粗多糖；
3) Sevag法脱蛋白：
将步骤2)所得的粗多糖用蒸馏水溶解后，加入与蒸馏水等体积的Sevage试剂震荡30min，之后离心，取上清；重复多次，上清液备用；其中Sevage试剂为氯仿:正丁醇体积比=4:1；
4) 贝母多糖透析分离纯化：
取步骤3)中上清液，放入透析袋中，在蒸馏水中透析72h，中间不断换水；所用透析袋截留分子量为3500以上；析袋中所得液体于-60℃下冷冻真空干燥，得贝母多糖。
2.按照权利要求1所述的一种贝母多糖的应用，其特征在于，步骤1）粉碎成超微粉。
3.按照权利要求1所述的贝母多糖的应用，其特征在于，步骤2）每10 g贝母粉加入纯水50-200 mL，合并的上清液浓缩至10-15 mL，加入3-4倍体积的无水乙醇进行醇沉。
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