CN111040040B - 一种平贝母多糖锌配合物的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种平贝母多糖锌配合物的制备方法及应用，属于生物医药技术领域。具体包括以下步骤：采用纤维素酶‑超声波辅助法提取平贝母多糖，Sevag法脱蛋白后，以脱蛋白后的平贝母多糖为原料，制备平贝母多糖锌配合物。本发明取得的有益效果是：(1)可同时作为锌补充剂和抗氧化剂，协同增效；(2)生物利用度高，相对生物利用度为62.16％；(3)抗氧化能力强，可有效清除羟基自由基和超氧阴离子自由基。

Description

一种平贝母多糖锌配合物的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体的说是涉及一种平贝母多糖锌配合物的制备方法及应用。
背景技术
人体在生命代谢过程中会自发地产生大量的氧自由基，自由基可以直接诱导某些疾病的形成，自由基对人体的损伤主要有三个方面：破坏细胞膜；血清抗蛋白酶失活；受损基因导致细胞突变率增加。羟基自由基开始攻击于人体的细胞膜，细胞膜极具弹性和柔韧性，因此，细胞膜极易受到自由基的攻击。一旦电子被自由基带走，细胞膜就失去弹性，失去所有功能，从而导致心血管疾病。更严重的是，当羟基自由基攻击基因时，会破坏基因的分子结构并导致基因突变，从而导致终生的系统性失调。超氧阴离子在生物体内普遍存在，具有很强的氧化性和细胞毒性。随着年龄的增长，人体清除超氧阴离子的能力逐渐下降，进而导致人体衰老。因此，清除自由基尤为重要。
人体是由60多种元素所组成。根据元素在人体内的含量不同，可分为宏量元素和微量元素两大类。如铁、锌、铜、锰、铬、硒、钼、钴、氟等，称为微量元素。锌是人体第二大金属微量元素，仅次于铁元素。它在维持蛋白质和DNA的合成、调节细胞生长、增殖和代谢等生理过程中发挥重要作用，也是生物物质的重要组成部分。因此，锌是人体必需的元素，越来越受到人们的重视。人体缺少锌元素会增加各种疾病的风险，如低进化、骨骼变异、厌食症、心脑血管疾病，特别是癌症。值得注意的是，锌不能在体内合成，只能通过膳食补充剂摄取。锌补充剂主要分为两类：一类是富含锌的膳食补充剂，另一类是单体锌补充剂。但现有的补锌方法存在生物利用度低、锌吸收不良、毒副作用等限制。
多糖是一类生物大分子，广泛分布于植物、动物、微生物等自然资源中。它是生物膜和DNA的重要组成部分或细胞内的一种代谢物。近年来，各种药用植物多糖的抗氧化活性越来越受到人们的关注。多糖具有重要的保健功能，包括氧化还原平衡的维护、与重金属螯合、免疫调节系统的调节、抑制基因毒性等，都依赖于多糖的结构特征。一般来说，带负电荷的多糖由于具有较强的氢原子或电子的给电子能力，具有较好的生物活性作用，这也进一步说明多糖具有与某些阳离子结合的潜力。因此，初步认定多糖与锌离子的结合不仅可以补充机体所需的锌元素，而且可以提高机体对各种疾病的防御功能。然而，多糖与锌离子的结合过程中，易出现结合不完全及引入杂离子等情况，导致活性低、生物利用度低及毒副作用大等问题，需严格控制反应条件。
因此，提供一种活性高、生物利用度高、毒副作用低的锌补充剂和天然抗氧化剂是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种平贝母多糖锌配合物的制备方法及应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种平贝母多糖锌配合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)平贝母进行预处理，得到脱脂平贝母粉；
(2)脱脂平贝母粉经酶-超声提取、醇沉、干燥，得到平贝母粗多糖；
(3)平贝母粗多糖经过Sevag法脱蛋白，得到平贝母多糖；
(4)配制质量浓度为5-10mg/mL的平贝母多糖溶液，并与2-4mg/mL、pH＝3.0的锌盐溶液混合，平贝母多糖溶液与锌盐溶液的体积比为1:1-1:2，在45-55℃的条件下，磁力搅拌5-10min，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH＝8.0，继续搅拌48-72h至反应结束，得预产物；
(5)将预产物用2mol/L HCl溶液调节pH＝3.0-4.0，并透析48-72h，收集透析液，真空干燥后，即得平贝母多糖锌配合物。
平贝母(Fritillaria ussuriensis Maxim.)又名坪贝、北贝、东北贝母、灯笼花，为百合科平贝母的干燥鳞茎。我国野生平贝母主要分布于东北地区长白山脉和小兴安岭南部山区，海拔1000m以下的湿润山脚坡地阔叶林带及河谷两岸。平贝母中含有多糖类、生物碱类、核苷类、皂苷类等多种有效成分。
平贝母多糖与锌离子的鳌合作用在碱性条件下发生，故需特定调节pH值，而采用特定的0.5mol/LNaOH溶液调节pH值，是为更好的控制pH值调节，而又不引入其他影响反应的杂离子。
在反应完成后，用2mol/L HCl调节pH，是为更好的控制pH值调节，使产物达到稳定状态，此时溶液明显由乳白色浊液转变为澄清的黄色。
优选的，步骤(1)所述平贝母预处理具体包括：
(11)取平贝母药材，粉碎后过60-80目筛，得平贝母粗粉；
(12)平贝母粗粉用石油醚回流脱脂4-6h，在20-30℃条件下经抽滤、挥干，得到脱脂平贝母粉。
优选的，所述步骤(2)的具体操作为：
(21)向脱脂平贝母粉中加入质量浓度为5％的纤维素酶溶液，质量体积比为1:20-1:30，在超声功率500W，超声温度50℃的条件下提取50min，得到平贝母多糖粗提液；
(22)将平贝母多糖粗提液在90-100℃条件下加热10-15min灭酶；
(23)将灭酶后的平贝母多糖粗提液在25℃、3000-4000r/min条件下离心15-20min，收集上清液并进行减压浓缩，得平贝母多糖浓缩液；
(24)向平贝母多糖浓缩液中加入无水乙醇，使乙醇体积浓度达到80-85％，静置48-72h后离心收集沉淀，经真空干燥后即得平贝母粗多糖。
优选的，所述步骤(3)的具体操作为：配制质量浓度10-20％的平贝母粗多糖溶液，加入其1/4体积的Sevag试剂充分震荡20-30min，在25℃、4000r/min条件下离心15min，保留上清液，透析48-72h，重复上述操作4-5次，得平贝母多糖。
优选的，所述Sevag试剂为三氯甲烷和正丁醇的混合液，三氯甲烷与正丁醇的体积比为4:1或5:1。
平贝母多糖锌配合物作为锌补充剂和抗氧化剂的应用
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果是：(1)可同时作为锌补充剂和抗氧化剂，协同增效；(2)生物利用度高，相对生物利用度为62.16％；(3)抗氧化能力强，可有效清除羟基自由基和超氧阴离子自由基。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为实验2中紫外-可见光谱分析图；
图2附图为实验3中红外光谱图；
图3附图为实验4中X-射线粉末衍射图；
图4附图为实验5中扫描电镜图；
图5附图为实验6中平贝母多糖的能谱图；
图6附图为实验6中平贝母多糖锌配合物的能谱图；
图7附图为实验7中热重-差热图；
图8附图为实验8中血药浓度-时间曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)取平贝母药材，经机械粉碎后过80目筛，得平贝母粗粉，将平贝母粗粉经石油醚回流脱脂4-6h后在20-30℃下抽滤并挥干溶剂，得到脱脂平贝母粉；
(2)称取脱脂平贝母粉50g，加入1000mL质量浓度为5％纤维素酶溶液，在超声功率500W，超声温度50℃条件下提取50min，得到平贝母多糖粗提液；
(3)将平贝母多糖粗提液放入95℃水浴锅中加热10min灭酶；
(4)将灭酶后的平贝母多糖粗提液在25℃、4000r/min条件下离心15min，收集上清液并减压浓缩，得到平贝母多糖浓缩液；
(5)向平贝母多糖浓缩液中加入5倍体积的无水乙醇，使乙醇体积浓度达到80％，静置48h，离心，真空干燥，即得平贝母粗多糖；
(6)配制质量浓度为10％的平贝母粗多糖水溶液，之后加入其1/4体积的Sevag试剂(三氯甲烷：正丁醇＝4:1)充分震荡30min，在25℃、4000r/min条件下离心15min，保留上清液，透析48h，重复上述操作4-5次，得平贝母多糖；
(7)称取50mg平贝母多糖，溶于10mL双蒸水中，与3mg/mL ZnCl2(pH值为3.0)溶液混合，体积比为1:1，50℃条件下，磁力搅拌5min，然后缓慢滴入0.5mol/LNaOH溶液直至pH值达到8.0，继续搅拌48h，反应结束后，用2mol/L的HCl溶液将反应溶液调至pH值为3.0，透析48h，收集透析液，真空干燥后，即得平贝母多糖锌配合物。
测定产品得率为73.46％。
实施例2
步骤(7)中ZnCl2溶液的质量浓度为2mg/mL，其余操作同实施例1。
实施例3
步骤(7)中ZnCl2溶液的质量浓度为2.5mg/mL，其余操作同实施例1。
实施例4
步骤(7)中ZnCl2溶液的质量浓度为4mg/mL，其余操作同实施例1。
实施例5
步骤(7)中的平贝母多糖称取100mg，溶于10mL双蒸水中，其余操作同实施例1。
实施例6
步骤(7)中的平贝母多糖溶液与3mg/mL ZnCl2溶液的体积比为1:2，其余操作同实施例1。
实施例7
步骤(2)中加入1500mL质量浓度为5％纤维素酶溶液，其余操作同实施例1。
实施例8
步骤(1)中平贝母药材经机械粉碎后过60目筛，其余操作同实施例1。
对比例1
步骤(7)中ZnCl2溶液的质量浓度为1mg/mL，其余操作同实施例1。
对比例2
步骤(7)中，反应结束后，用2mol/L HCl将反应溶液调至pH＝7.0，其余操作同实施例1。
对比例3
将步骤(7)中的ZnCl2溶液替换成质量浓度为3mg/mL的ZnSO4溶液，其余操作同实施例1。
实验1理化指标测定
(1)测定样品：实施例1-8及对比例1-3制备的平贝母多糖锌配合物；
(2)测定指标：pH值、比表面积、孔体积、孔径及Zn元素含量；
(3)测定方法：
pH检测方法：将样品配制成1.5mg/mL的溶液，利用PHS-3C型pH计在室温下测定pH值。
比表面积、孔体积、孔径检测方法：比表面积、孔体积和孔径在贝士德3H-2000PS2型比表面及孔径分析仪上通过N2吸附脱附技术测得(77K)。
Zn元素含量在Phenom ProX能谱仪上测得，加速电压为5kV。
(4)测定结果见表1。
表1平贝母多糖锌配合物对理化指标和抗氧化活性检测结果
Figure BDA0002268363770000061
由实施例1-4及对比例1的结果来看，实施例1中Zn元素含量最高，这说明平贝母多糖鳌合锌离子的程度与ZnCl2溶液的质量浓度有关，从而影响其物理指标(如表面积、孔隙体积和孔径等)。ZnCl2质量浓度越大，锌元素含量越高。但超过浓度限定后，锌元素含量减小，这可能与多糖分子结构的空间位阻有关，从而影响与锌离子的鳌和程度。
由实施例1-4及对比例1-2的结果可知，pH是影响平贝母多糖与金属鳌合的重要因素，当用2mol/L HCl将反应溶液调节为7.0时(即对比例2)，此时反应溶液呈乳白色浊液，这是由于反应中生成Zn(OH)2所致，平贝母多糖与OH-争夺Zn2+，进而导致平贝母多糖中锌元素含量降低。当用2mol/L HCl将反应溶液调节为3.0时(即实施例1-4)，溶液由乳白色浊液变成黄色溶液，这是由于中和反应生成的Zn(OH)2，生成稳定的氯化盐，这说明反应溶液在酸性条件下促进金属离子与平贝母多糖的鳌合程度，溶液的稳定性增强。由对比例3可以发现，反应溶液中加入ZnSO4溶液时，由于SO4 2-相比于Cl-更难去除，且溶液稳定性较差，因此锌元素含量较低。
由实施例6-8可知，平贝母多糖的制备条件同时可以影响与锌离子的鳌和程度，但影响结果相对来说较小。
实验2紫外-可见光谱分析
(1)检测样品：实施例1中步骤(6)制备的平贝母多糖FUP及实施例1中步骤(7)制备的平贝母多糖锌配合物FUP-Zn；
(2)检测方法：将样品配制成0.375mg/mL的溶液，在200-800nm下扫描；
(3)检测结果见图1。
由图1结果可知，平贝母多糖FUP和平贝母多糖锌配合物FUP-Zn在260-280nm处出没有明显的吸收峰，说明平贝母多糖及其多糖锌配合物中不含有核酸、蛋白质等物质，Sevag法将此类物质基本除净。
实验3红外光谱分析
(1)检测样品：实施例1中步骤(6)制备的平贝母多糖FUP及实施例1中步骤(7)制备的平贝母多糖锌配合物FUP-Zn；
(2)检测方法：利用Alpha CentaurtFT/IR红外光谱仪进行测定，测定范围400-4000cm-1(KBr压片)；
(3)检测结果见图2。
从图2可以看出，FUP在3428cm-1处出现的宽峰是-OH伸缩振动的特征吸收峰。由于多糖分子具有许多羟基，分子内和分子间氢键的形成使其峰值特别宽。在FUP-Zn中向低波数移至3416cm-1。2938cm-1为FUP的C-H伸缩振动吸收峰；1636cm-1、1424cm-1分别为FUP的C＝O伸缩振动吸收峰和-OH弯曲振动吸收峰；而平贝母多糖结构修饰后吸收峰为分别向高波数移至1645cm-1、1429cm-1，这说明平贝母多糖结构中-OH和C＝O参与络合反应。FUP在1154cm-1、1091cm-1、1021cm-1的吸收峰归属于吡喃环的振动吸收峰，与Zn形成配合物FUP-Zn后，此处吸收峰显著增强。红外光谱的不同，进一步说明平贝母多糖与锌离子鳌合成功。
实验4X-射线粉末衍射分析
(1)检测样品：实施例1中步骤(6)制备的平贝母多糖FUP及实施例1中步骤(7)制备的平贝母多糖锌配合物FUP-Zn；
(2)检测方法：采用X-射线单晶衍射在0～80°对样品的非晶态特性进行分析；
(3)检测结果如图3所示。
由图3结果可知，在图谱中显示了平贝母多糖经与锌离子形成配合物前后的特征衍射曲线，当2θ接近23°时，曲线上出现了一个圆形的鼓包，并没有出现明显的峰值，说明平贝母多糖FUP及平贝母多糖锌配合物FUP-Zn不具有呈晶型结构，平贝母多糖经与金属锌离子鳌合后，结晶性能不受影响。平贝母多糖的非晶态可能是由于多糖是由单糖单元组成并通过糖苷键连接在一起的多相碳水化合物，其多糖的分子量大，结构复杂，呈晶型结构相对困难。事实上，物质的结晶性或非结晶性对其溶解度、溶胀性、粘度、水解等理化性质有重要影响。
实验5扫描电镜分析
(1)检测样品：实施例1中步骤(6)制备的平贝母多糖FUP及实施例1中步骤(7)制备的平贝母多糖锌配合物FUP-Zn；
(2)检测方法：将样品均匀地分散在粘有双面导电胶的样品台上，置于PhenomProX扫描电镜中进行分析，加速电压为15kV。
(3)检测结果见图4。
从表面形貌来看，FUP表面粗糙，裂纹明显，颗粒排列松散，有很多细小空隙，与锌离子配位后，FUP-Zn呈蜂窝状，表面粗糙，颗粒排列紧密，空隙较少，说明FUP与Zn2+形成了配合物。从均匀程度来看，FUP颗粒大小不均，与Zn2+络合后，FUP-Zn颗粒大小比较均一。
实验6能谱分析
(1)检测样品：实施例1中步骤(6)制备的平贝母多糖FUP及实施例1中步骤(7)制备的平贝母多糖锌配合物FUP-Zn；
(2)检测方法：对样品中的C、O、Zn的元素分析采用Perkin-Elmer 2400分析仪进行测定；
(3)FUP的检测结果如图5所示，FUP-Zn的检测结果如图6所示。
由图5、图6的结果可知，元素分析结果(％)如下：
FUP：C52.86％、O 47.14％；FUP-Zn：C 48.66％、O44.15％、Zn7.19％。
实验7热重-差热分析
(1)检测样品：实施例1中步骤(6)制备的平贝母多糖FUP及实施例1中步骤(7)制备的平贝母多糖锌配合物FUP-Zn；
(2)检测方法：将样品置于TG/DSC1/1100SF热重-差热同步分析仪中进行检测，由室温升至700℃，升温速率为10℃/min，载气为N2。
(3)检测结果如图7所示。
由图7结果可知：
①平贝母多糖热分解的第一阶段为30.0～262.9℃(质量损失5.486％)，此阶段损失的主要是自由水，热分解的第二阶段为262.9～700.0℃(质量损失34.22％)，在262.9～500.0℃质量损失速度增快，说明此时平贝母多糖的化学键被破坏，平贝母多糖已被分解。
②平贝母多糖锌配合物热分解的第一阶段为30.0～228.7℃(质量损失4.469％)，此阶段损失的主要是自由水，热分解的第二阶段为228.7～700℃(质量损失36.14％)，在228.7～500℃质量损失速度增快，说明此时多糖锌的化学键被破坏，主要结构已被分解。
③平贝母多糖、平贝母多糖锌配合物温度趋于平稳时，分别为500.0℃、507.8℃，说明稳定性顺序为：平贝母多糖锌配合物>平贝母多糖。
④由平贝母多糖和平贝母多糖锌配合物的差热扫描(DTA)曲线可知，在200～600℃之间，属于两种多糖分子结构中的分解反应，消除多糖中的羟基分子降解。平贝母多糖经393.6℃，441.8℃两个吸热反应，336.1℃一个放热反应而分解；平贝母多糖锌配合物经442.1℃，493.5℃，556.9℃三个吸热反应，398.1℃一个放热反应而分解；这说明平贝母多糖及平贝母多糖锌配合物结构存在差异。
实验8生物利用度实验
(1)检测样品：实施例1中步骤(7)制备的平贝母多糖锌配合物FUP-Zn。
(2)检测方法：
①试剂配制：
标准溶液配制：精密称取氯化锌适量，加水稀释成0.6、1.0、1.4、2.0、2.4、3.0μg/mL标准锌溶液；
配制10-3mol/L四苯基卟啉溶液(简称TPP)，加二甲基甲酰胺(DMF)溶解配成。
②血样检测方法：由大鼠眼静脉丛采血约1mL，待血液自然凝固后，离心(4℃，10000r/min，5min)，精密吸取0.2mL血清，加入2.5mL 15％的三氯乙酸，涡旋混匀，离心(4℃，4000r/min，5min)，取上清液旋蒸至近干，依次加入5mL DMF，10-3mol/LTPP溶液2mL，一粒NaOH，混匀溶解后，置水浴加热25min，放冷至室温，加苯2.5mL，转移入分液漏斗中，用少量DMF清洗烧杯，洗液并入分液漏斗中，加水60mL，充分振摇，弃去水相，再用50mL水，混匀后分层，保留有机相层，用微量进样器进样5μL于色谱柱，以丙酮-乙腈(40:60)为流动相进行分离检测，检测波长421nm。
③大鼠锌浓度测定：
选用体重200～235g SD大鼠12只，按体重随机分成2组，每组6只，雌雄各半。禁食约12h后，给药组分别一次口服灌胃平贝母多糖锌配合物和葡萄糖酸锌片15mgZn/kg体重剂量。各组药前采血，于药后0、1、2、3、4、5、6、8、12、24h眼静脉丛采血约1mL，置于离心管中，处理血样并检测分离。
④计算方法：
Figure BDA0002268363770000101
式中，AUC代表血药浓度-时间曲线下面积，T和R分别代表试验试剂和参比试剂，D代表给药剂量。
(3)检测结果：平贝母多糖锌配合物的平均血药浓度-时间曲线如图8所示。
由图8结果可知，大鼠体内口服葡萄糖酸锌和FUP-Zn后，吸收迅速，消除缓慢，血药浓度-时间曲线呈现单峰现象，显示平贝母多糖锌配合物入血后可被吸收，且生物利用度明显高于葡萄糖酸锌组。AUC0-t平均值计算口服方式的平贝母多糖锌配合物相对生物利用度为62.16％。
实验9羟基自由基清除能力检测
(1)检测样品：VC、实施例1中步骤(6)制备的平贝母多糖、实施例1-8和对比例1-3制备的平贝母多糖锌配合物。
(2)检测方法：
取2mmol/L水杨酸钠-乙醇溶液0.5mL，加入0.5mL 9mmol/L硫酸亚铁溶液，分别加入1.5mL不同浓度(0.1875、0.375、0.75、1.5、3、4.5mg/mL)的样品溶液，最后加入0.5mL6mmol/L双氧水。37℃反应1h，在510nm下测定吸光度(Ax)。同时测定用蒸馏水代替硫酸亚铁溶液的吸光度(Ay)，蒸馏水代替样品溶液作为空白对照的吸光度(A0)。用下列公式计算清除率(E％)。
清除率＝[1-(Ax-Ay)/A0]×100％，式中：
Ax：加入硫酸亚铁后样品的吸光度；
Ay：不加硫酸亚铁后样品的吸光度；
A0：空白对照溶液的吸光度。
(3)检测结果见表2。
表2羟基自由基清除能力检测结果(％)
Figure BDA0002268363770000111
Figure BDA0002268363770000121
由表2结果表明，不同浓度的平贝母多糖和平贝母多糖锌配合物对羟基自由基具有的清除作用。总的来说，随着浓度的增加，羟基自由基的清除率随之增加，有明显的上升趋势，这可能是由于金属离子的正电荷与多糖的负电荷之间的静电吸引所致，从而影响了多糖的电子云密度，导致其抗氧化活性差异明显。从对羟基自由基清除率可以看出，pH、反应溶液均影响抗氧化能力(即对比例2和对比例3)。此外，平贝母多糖锌配合物清除羟基自由基的能力远远强于平贝母多糖，实施例1中FUP-Zn羟基自由基清除率可高达68.17％。
实验10超氧阴离子自由基清除能力检测
(1)检测样品：VC、实施例1中步骤(6)制备的平贝母多糖、实施例1-8和对比例1-3制备的平贝母多糖锌配合物。
(2)检测方法：
在试管中依次加入0.5mL不同浓度(0.1875、0.375、0.75、1.5、3、4.5mg/mL)的样品溶液，5mL 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液，在25℃放置10min后加入0.2mL 6mmol/L邻苯三酚，迅速摇匀，反应5min后立即在315nm处测定吸光度，用下列公式计算清除率(E％)。
清除率＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％，式中：
Ai：加入多糖溶液或VC时的吸光度；
Aj：只加样品时的背景吸光度；
A0：蒸馏水代替样品溶液时的吸光度。
(3)检测结果见表3。
表3超氧阴离子清除能力检测结果(％)
Figure BDA0002268363770000122
Figure BDA0002268363770000131
由表3可知，质量浓度在1～5mg/mL范围内，VC对超氧阴离子的清除效果仍然是最佳，平贝母多糖的清除效果最差。质量浓度范围在0～5mg/mL平贝母多糖和平贝母多糖锌配合物(实施例1)的清除率随着质量浓度的增加而增强，质量浓度为4.5mg/mL时，达到最大清除率分别为48.67％和74.97％。这表明，Zn2+的引入对超氧阴离子有显著的清除作用。与实施例1相比，当ZnCl2浓度达到4mg/mL时，对超氧阴离子自由基清除活性减弱，这可能与多糖与锌离子的鳌和饱和程度有关。
综上所述，本发明通过FUP与Zn2+的结合，成功制备FUP-Zn，并通过各种表征手段测定了其理化特性。结果表明，FUP-Zn比FUP更稳定。体外抗氧化活性研究表明，FUP-Zn对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除活性较FUP显著增强，可能与FUP-Zn具有协同作用、较大孔径有关，有利于样品与自由基的结合，从而增强抗氧化能力。本发明为多糖锌配合物的抗氧化剂和锌补充剂的评估提供了重要的理论基础，同时可以作为一种新型的天然抗氧化剂和补锌剂。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种平贝母多糖锌配合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)平贝母进行预处理，得到脱脂平贝母粉；
(2)脱脂平贝母粉经酶-超声提取、醇沉、干燥，得到平贝母粗多糖；
(3)平贝母粗多糖经过Sevag法脱蛋白，得到平贝母多糖；
(4)配制质量浓度为5-10mg/mL的平贝母多糖溶液，并与2-4mg/mL、pH＝3.0的ZnCl2溶液混合，平贝母多糖溶液与ZnCl2溶液的体积比为1:1-1:2，在45-55℃的条件下，磁力搅拌5-10min，用0.5mol/L的NaOH溶液调节pH＝8.0，继续搅拌48-72h至反应结束，得预产物；
(5)将预产物用2mol/LHCl溶液调节pH＝3.0-4.0，并透析48-72h，收集透析液，真空干燥后，即得平贝母多糖锌配合物。
2.如权利要求1所述的一种平贝母多糖锌配合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述平贝母预处理具体包括：
(11)取平贝母药材，粉碎后过60-80目筛，得平贝母粗粉；
(12)平贝母粗粉用石油醚回流脱脂4-6h，在20-30℃条件下经抽滤、挥干，得到脱脂平贝母粉。
3.如权利要求2所述的一种平贝母多糖锌配合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体操作为：
(21)向脱脂平贝母粉中加入质量浓度为5％的纤维素酶溶液，质量体积比为1:20-1:30，在超声功率500W，超声温度50℃的条件下提取50min，得到平贝母多糖粗提液；
(22)将平贝母多糖粗提液在90-100℃条件下加热10-15min灭酶；
(23)将灭酶后的平贝母多糖粗提液在25℃、3000-4000r/min条件下离心15-20min，收集上清液并进行减压浓缩，得平贝母多糖浓缩液；
(24)向平贝母多糖浓缩液中加入无水乙醇，使乙醇体积浓度达到80-85％，静置48-72h后离心收集沉淀，经真空干燥后即得平贝母粗多糖。
4.如权利要求3所述的一种平贝母多糖锌配合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的具体操作为：配制质量浓度10-20％的平贝母粗多糖溶液，加入其1/4体积的Sevag试剂充分震荡20-30min，在25℃、4000r/min条件下离心15min，保留上清液，透析48-72h，重复上述操作4-5次，得平贝母多糖。
5.如权利要求4所述的一种平贝母多糖锌配合物的制备方法，其特征在于，所述Sevag试剂为三氯甲烷和正丁醇的混合液，三氯甲烷与正丁醇的体积比为4:1或5:1。
6.如权利要求1-5任一所述的制备方法制成的平贝母多糖锌配合物。
7.如权利要求6所述的平贝母多糖锌配合物作为锌补充剂和抗氧化剂的应用。
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