CN108503720B - 一种美拉德改性龙眼果肉多糖及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于功能食品加工技术领域,具体涉及一种美拉德改性龙眼果肉多糖及其制备方法和应用。该方法包括步骤:1)龙眼果肉多糖与氨基酸在热水中反应,得到龙眼果肉多糖与氨基酸的共价反应产物的水溶液;2)采用纳滤膜对步骤1)得到的龙眼果肉多糖与氨基酸的共价反应产物的水溶液进行浓缩,再对浓缩液进行冷冻干燥,得到美拉德改性龙眼果肉多糖。本发明基于美拉德反应对龙眼果肉多糖进行改性,同时实现多糖一级结构和高级结构的改变,该技术能有效提高龙眼果肉多糖的抗氧化和免疫调节活性,且制备工艺绿色安全。
Description
技术领域
本发明属于功能食品加工技术领域,具体涉及一种美拉德改性龙眼果肉多糖及其制备方法和应用。
背景技术
龙眼(Dimocarpus longan Lour.)是无患子科经济作物,在我国主要分布于广东、广西、福建和海南等省。龙眼果肉是药典收录的药食兼用水果,具有治疗/改善气血不足、心悸怔忡、失眠健忘、贫血、脾虚泄泻等功效。多糖是龙眼果肉的重要功能大分子,具有体内外的免疫调节和抗氧化活性。为了更好地推进龙眼果肉多糖在功能食品和生物医药领域的开发利用,有学者通过结构修饰增强其生物活性。王警等对龙眼果肉多糖进行乙酰化修饰,提高其抗氧化活性(响应面试验优化龙眼肉多糖乙酰化工艺及其抗氧化活性[J].食品科学,2016,37:63-68.);韦毅铭等采用羧甲基化改性,提高龙眼果肉多糖的抗氧化活性和免疫调节活性(羧甲基化龙眼肉多糖制备工艺优化及其抗氧化、免疫活性[J].食品科学,2017,38:275-283.);李雪华等通过硫酸酯化修饰龙眼果肉多糖,可以提高其免疫调节和抗肿瘤活性(龙眼肉多糖硫酸酯化修饰及修饰前后体外抗肿瘤活性初步研究[D].广西医科大学,2011;Sulfated modification of longan polysaccharide and its immunomodulatory andantitumor activity in vitro.[J].International Journal of BiologicalMacromolecules,2014,67:323-329.)。然而,上述传统的改性技术虽然能在一定程度上提高龙眼果肉多糖的生物活性,但因采用强酸和有毒害有机试剂(如浓硫酸、一氯乙酸、乙酸酐、正丁醇等)的制备体系,存在试剂残留安全隐患和环境污染问题。
多糖的生物活性不仅与其活性基团/位点有关,还与分子量/尺寸有密切联系。龙眼果肉多糖不同组分中,高分子量组分具有相对较强的生物活性(Structural featuresand immunomodulatory activities of polysaccharides of longan pulp[J].Carbohydrate Polymers,2012,87:636-643;龙眼多糖的结构表征及其免疫调节活性研究[D].海南大学,2016.)。而传统的化学改性只修饰基团,无法改变分子量/尺寸,存在一定的局限性。
发明内容
为解决现有技术的不足,本发明提供了一种基于美拉德反应改性的龙眼果肉多糖改性及其制备方法和应用。本发明提供了一种同时实现基团修饰和分子链扩增的龙眼果肉多糖的美拉德改性技术,该技术能有效提高龙眼果肉多糖的抗氧化和免疫调节活性,不受改性对象分子量大小的限制,且制备工艺绿色安全。
本发明所提供的技术方案如下:
一种美拉德改性龙眼果肉多糖的制备方法,包括以下步骤:
1)龙眼果肉多糖与氨基酸在热水中反应,得到龙眼果肉多糖与氨基酸的共价反应产物的水溶液,该反应产物的一级结构和高级结构相较龙眼果肉多糖发生显著变化。
2)采用纳滤膜对步骤1)得到的龙眼果肉多糖与氨基酸的共价反应产物的水溶液进行浓缩,再对浓缩液进行冷冻干燥,得到美拉德改性龙眼果肉多糖。
本发明提供了一种同时实现基团修饰和分子链扩增的龙眼果肉多糖的美拉德改性技术,该技术能有效提高龙眼果肉多糖的抗氧化和免疫调节活性,不受改性对象分子量大小的限制,且制备工艺绿色安全。
具体的,步骤1)包括以下步骤:
1a)以龙眼果肉加4~6被重量水制备龙眼果肉均质匀浆,再加10~15倍水浸提后离心分离上清液,得到龙眼果肉多糖粗提液;
1b)采用等电点沉淀法从步骤1)得到的龙眼果肉多糖粗提液中脱除蛋白质,得到龙眼果肉多糖溶液;
1c)采用醇沉法从步骤1b)得到的龙眼果肉多糖溶液中沉淀并过滤出龙眼果肉多糖沉淀,将龙眼果肉多糖沉淀复溶于水后,经冷冻干燥,得到龙眼果肉多糖原料;
1d)将步骤1c)得到的龙眼果肉多糖原料与氨基酸溶于热水中进行反应,得到龙眼果肉多糖与氨基酸的共价反应产物的水溶液,热水的温度为90~100℃。
龙眼果肉多糖在碱性条件下提取,同时溶出的蛋白质相对较难去除,传统的方式是采用有机试剂或酶法脱除,前者需要消耗大量的有机试剂,而后者操作复杂。本发明采用等电点沉淀法脱除蛋白质,相比传统方法的优势在于无有机试剂消耗且操作方法简便。
具体的,步骤1a)中,龙眼果肉均质匀浆中龙眼果肉的重量百分含量为14~20%,加水浸提的提取时间为4~6h,提取液pH为8.5~9.5。
具体的,步骤1b)包括以下步骤:在pH为4.5~5.5的条件下进行等电点沉淀。
具体的,步骤1c)中,在中性条件下进行醇沉法从步骤1b)得到的龙眼果肉多糖溶液中沉淀出龙眼果肉多糖,经离心和过滤分离得到龙眼果肉多糖沉淀,再以乙醇溶液洗涤龙眼果肉多糖沉淀,再经离心和过滤分离得到残留有乙醇的龙眼果肉多糖沉淀,待乙醇挥发后加水复溶龙眼果肉多糖沉淀,再经冷冻干燥,冷冻干燥的温度为-60~-40℃,得到龙眼果肉多糖原料。
具体的,步骤1d)中的反应条件为:龙眼果肉多糖原料在热水中的起始浓度为2~4mg/mL;氨基酸在热水中的起始浓度为2~4mg/mL;龙眼果肉多糖原料与氨基酸的用量比为0.9~1.1:1.1~0.9;pH为8.5~9.5;反应温度为90~100℃;反应时间为4~6h;反应时间到达后冷却终止反应。
具体的,步骤2)中:纳滤膜的截留分子量为500~1000D;冷冻干燥的温度为-50~-30℃。
优选的,氨基酸为赖氨酸。
相比其他氨基酸(如甘氨酸和脯氨酸等),赖氨酸的ε-氨基极易与多糖羰基末端还原基团结合,反应活性更高,改性效果更好。
本发明还提供了一种根据上述美拉德改性龙眼果肉多糖的制备方法制备得到的美拉德改性龙眼果肉多糖。
本发明还提供了美拉德改性龙眼果肉多糖的应用,作为抗氧化剂,或者,用于制备调节免疫活性的制剂。
本发明的有益效果
总体上,相比较现有的化学改性方法(乙酰化、羧甲基化、硫酸酯化等),基于美拉德反应对龙眼果肉多糖改性,不受改性对象分子量大小的限制,制备工艺不消耗有机试剂和强酸,且改性后多糖的抗氧化活性和免疫调节活性显著增强。与发明人前期提供的龙眼果肉多糖与龙眼果肉蛋白质的美拉德反应改性技术相比,改性产物的溶解度(25℃水溶)由2.1mg/mL增加到8.8mg/mL。
附图说明
图1是龙眼果肉多糖改性前后的紫外光谱图。
图2是龙眼果肉多糖改性前后的红外光谱图。
图3是龙眼果肉多糖改性前的分子量分布图。
图4是龙眼果肉多糖改性后的分子量分布图。
图5是龙眼果肉多糖改性前后的DPPH自由基清除活性数据图。
图6是龙眼果肉多糖改性前后的羟自由基清除活性数据图。
图7是龙眼果肉多糖改性前后的刺激巨噬细胞NO生成活性数据图。
图8是龙眼果肉多糖改性前后的刺激巨噬细胞TNF-α分泌活性数据图。
图9是龙眼果肉多糖甘氨酸美拉德反应不同时间的产物分子量分布变化图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述,所举实施例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
实施例1
美拉德改性龙眼果肉多糖的制备,包括以下步骤:
步骤一、取龙眼鲜果肉,加3倍质量的蒸馏水,在10000r/min下间歇高速均质3次,每次3min;均质匀浆补加6倍质量的蒸馏水,调节匀浆pH值为9,常温搅拌浸提4h;浸提结束后,采用4500r/min离心10min,过滤分离上清液,调节其pH值为5,静置4h后离心(4500r/min,10min)分离上清液;上清液调节至pH为中性,经真空浓缩至1/3体积后加入乙醇至体积浓度为75%,并置于4℃下静置12h沉淀多糖;采用4500r/min离心10min分离沉淀,以体积浓度75%的乙醇溶液洗涤沉淀,待乙醇挥发后加水复溶,冷冻干燥,得到龙眼果肉多糖;称取步骤一中的龙眼果肉多糖,与赖氨酸以质量比1:1溶于蒸馏水,两者的浓度均为3mg/mL,调节pH至9.0,在90~100℃下加热反应5h,冷却终止反应;
步骤二、取步骤一中的冷却反应液,采用截留分子量500-1000Da的纳滤膜进行浓缩并脱除游离赖氨酸和其他小分子杂质,截留的浓缩液经冷冻干燥得到美拉德改性的龙眼果肉多糖1。
实施例2
美拉德改性龙眼果肉多糖的制备,包括以下步骤:
步骤一、取龙眼鲜果肉,加3倍质量的蒸馏水,在10000r/min下间歇高速均质3次,每次3min;均质匀浆补加5倍质量的蒸馏水,调节匀浆pH值为9,常温搅拌浸提4h;浸提结束后,采用4500r/min离心10min,过滤分离上清液,调节其pH值为5,静置4h后离心(4500r/min,10min)分离上清液;上清液调节至pH为中性,经真空浓缩至1/3体积后加入乙醇至体积浓度为75%,并置于4℃下静置12h沉淀多糖;采用4500r/min离心10min分离沉淀,以体积浓度75%的乙醇溶液洗涤沉淀,待乙醇挥发后加水复溶,冷冻干燥,得到龙眼果肉多糖;称取步骤一中的龙眼果肉多糖,与赖氨酸以质量比1:1溶于蒸馏水,两者的浓度均为4mg/mL,调节pH至8.5,在100℃下加热反应4h,冷却终止反应;
步骤二、取步骤一中的冷却反应液,采用截留分子量500-1000Da的纳滤膜进行浓缩并脱除游离赖氨酸和其他小分子杂质,截留的浓缩液经冷冻干燥得到美拉德改性的龙眼果肉多糖2。
实施例3
美拉德改性龙眼果肉多糖的制备,包括以下步骤:
步骤一、取龙眼鲜果肉,加3倍质量的蒸馏水,在10000r/min下间歇高速均质3次,每次3min;均质匀浆补加7倍质量的蒸馏水,调节匀浆pH值为9,常温搅拌浸提4h;浸提结束后,采用4500r/min离心10min,过滤分离上清液,调节其pH值为5,静置4h后离心(4500r/min,10min)分离上清液;上清液调节至pH为中性,经真空浓缩至1/3体积后加入乙醇至体积浓度为75%,并置于4℃下静置12h沉淀多糖;采用4500r/min离心10min分离沉淀,以体积浓度75%的乙醇溶液洗涤沉淀,待乙醇挥发后加水复溶,冷冻干燥,得到龙眼果肉多糖;称取步骤一中的龙眼果肉多糖,与赖氨酸以质量比1:1溶于蒸馏水,两者的浓度均为2mg/mL,调节pH至9.5,在90℃下加热反应6h,冷却终止反应;
步骤二、取步骤一中的冷却反应液,采用截留分子量500-1000Da的纳滤膜进行浓缩并脱除游离赖氨酸和其他小分子杂质,截留的浓缩液经冷冻干燥得到美拉德改性的龙眼果肉多糖3。
实施例4
美拉德改性龙眼果肉多糖的制备,包括以下步骤:
步骤一、取龙眼鲜果肉,加3倍质量的蒸馏水,在10000r/min下间歇高速均质3次,每次3min;均质匀浆补加6倍质量的蒸馏水,调节匀浆pH值为9,常温搅拌浸提4h;浸提结束后,采用4500r/min离心10min,过滤分离上清液,调节其pH值为5,静置4h后离心(4500r/min,10min)分离上清液;上清液调节至pH为中性,经真空浓缩至1/3体积后加入乙醇至体积浓度为75%,并置于4℃下静置12h沉淀多糖;采用4500r/min离心10min分离沉淀,以体积浓度75%的乙醇溶液洗涤沉淀,待乙醇挥发后加水复溶,冷冻干燥,得到龙眼果肉多糖;称取步骤一中的龙眼果肉多糖,与甘氨酸以质量比1:1溶于蒸馏水,两者的浓度均为3mg/mL,调节pH至9.0,在90~100℃下加热反应5h,冷却终止反应;
步骤二、取步骤一中的冷却反应液,采用截留分子量500-1000Da的纳滤膜进行浓缩并脱除游离甘氨酸和其他小分子杂质,截留的浓缩液经冷冻干燥得到产物4。
效果例
如图1所示,为龙眼果肉多糖改性前后的紫外光谱图。从图中可以看出龙眼果肉多糖改性后,260nm波长附近吸收明显增强,说明氨基酸含量增加。
如图2所示,为龙眼果肉多糖改性前后的红外光谱图,从图中可以看出龙眼果肉多糖改性后,在1544.36cm-1和1235.03cm-1产生2个新的吸收峰,而869.02cm-1的吸收峰消失,指纹区和酰胺特征吸收增强,说明官能团发生显著变化。
如图3所示,为龙眼果肉多糖改性前的分子量分布图,4.374×105Da、7.869×103Da和2.014×103Da的级分分别占7.5%、29.5%和63.0%;如图4所示,为龙眼果肉多糖改性后的分子量分布图,1.430×106Da、9.539×105Da、7.226×105Da和8.564×104Da的级分分别占37.4%、38.8%、3.1%和20.7%。对比图3和图4可以看出,龙眼果肉多糖改性后的分子量显著增加。
一、龙眼果肉多糖改性前后的DPPH自由基清除活性实验
实验方案如下:
取不同浓度梯度的样品溶液50μL,向其中加入0.7mL的100μmol/L DPPH溶液中,混合均匀后于室温下避光反应30min。在517min处测定反应液吸光度,以甲醇为空白对照,不同样品浓度及测定均做三组平行。DPPH自由基清除能力按以下公式计算。
式中:A0为50μL甲醇与0.7mL100μmol/L DPPH溶液混合液在517nm处的吸光值;Ai为50μL样品溶液与0.7mL100μmol/L DPPH溶液混合液在517nm处的吸光值;Aj为50μL样品溶液与0.7mL甲醇在517nm处的吸光值。
如图5所示,为龙眼果肉多糖改性前后的DPPH自由基清除活性数据图,从图中可以看出,相同浓度下改性多糖的DPPH自由基清除率较未改性多糖高20%~40%。
二、龙眼果肉多糖改性前后的羟自由基清除活性实验
实验方案如下:
分别向样品试管中加入1mL FeSO4(1.5mmol/L)和0.4mL水杨酸(2mmol/L)、1mLH2O2(6mmol/L)、0.6mL不同浓度的多糖溶液。空白组不加多糖溶液,以蒸馏水代替,对照组不加水杨酸以蒸馏水代替。试管置于37℃恒温水浴反应1h,冷却后于510nm处测定吸光值。用蒸馏水调零,不同样品浓度及测定均平行重复3次。羟基自由基(·OH)清除能力按以下公式计算。
如图6所示,为龙眼果肉多糖改性前后的羟自由基清除活性数据图,从图中可以看出,相同浓度下改性多糖的羟自由基清除率较未改性多糖高10%~70%。
三、龙眼果肉多糖改性前后的刺激巨噬细胞NO生成活性实验
实验方案如下:
RAW264.7细胞经DMEM培养基(含10%体积分数的胎牛血清)调整浓度为5×105cells/mL,以400μL/孔加入24孔培养板中,于37℃、5%CO2的培养箱中贴壁培养3h后,吸除培养液。每孔加入由培养基溶解配制的多糖溶液400μL,龙眼多糖终质量浓度为100、200或400μg/mL,LPS终质量浓度为5μg/mL。每个浓度设4个复孔。另设4个孔各加入400μL培养基作为空白对照。培养板于培养箱中孵育48h后,吸取细胞上清液于1.5mL离心管中,加入300g/L的ZnSO4溶液沉淀蛋白,经12 000r/min离心4min后,取100μL上清液于96孔培养板中,并加入100μL的格里斯氏试剂,室温下轻轻摇振10min后在酶标仪上在492nm波长处测定光密度,每个实验孔重复测定3次。以NaNO2建立标准曲线计算巨噬细胞NO生成量。
如图7所示,为龙眼果肉多糖改性前后的刺激巨噬细胞NO生成活性数据图,从图中可以看出,在25~400μg/mL剂量范围内,改性龙眼果肉多糖的巨噬细胞NO生成刺激活性显著强于未改性多糖。
四、龙眼果肉多糖改性前后的刺激巨噬细胞TNF-α分泌活性实验
实验方案如下:
RAW264.7细胞经DMEM培养基(含10%体积分数的胎牛血清)调整浓度为5×105cells/mL,以400μL/孔加入24孔培养板中,于37℃、5%CO2的培养箱中贴壁培养3h后,吸除培养液。每孔加入由培养基溶解配制的多糖溶液400μL,龙眼多糖终质量浓度为100、200或400μg/mL,LPS终质量浓度为5μg/mL。每个浓度设4个复孔。另设4个孔各加入400μL培养基作为空白对照。培养板于培养箱中孵育48h后,取上清液于12 000r/min离心4min后,采用试剂盒测定TNF-α表达水平,每孔重复测定3次。
如图8所示,为龙眼果肉多糖改性前后的刺激巨噬细胞TNF-α分泌活性数据图,从图中可以看出,在200~400μg/mL剂量范围内,改性龙眼果肉多糖的巨噬细胞TNF-α分泌刺激活性显著强于未改性多糖。
五、龙眼果肉多糖-甘氨酸美拉德反应产物的分子量分布测定实验
实验方案如下:
采用高效分子排阻色谱检测多糖的相对分子质量分布。色谱分析条件为:PDA检测器(280nm)和RI检测器串联使用;色谱柱Ultrahydrogel 250(7.8mm×300mm),柱温45℃;流动相0.1mol/L硝酸钠;洗脱流速0.5mL/min;进样体积15μL。采用0.1mol/L硝酸钠配制2.5mg/mL的多糖样液,经0.45μm滤膜过滤后进样分析。如图9所示,为龙眼果肉多糖-甘氨酸美拉德反应不同时间(0~6h)的产物分子量分布变化图,从图中可以看出,龙眼果肉多糖与甘氨酸之间未发生美拉德共价结合。
以实施例1和实施例4中龙眼果肉多糖与氨基酸在热水体系中的美拉德反应动力学特征进行对比,在反应速率和反应产物生成量方面,实施例1明显高于实施例4;实施例4中,龙眼果肉多糖-甘氨酸美拉德反应1~6h的产物分子量分布无变化。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种美拉德改性龙眼果肉多糖的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)龙眼果肉多糖与氨基酸在热水中反应,得到龙眼果肉多糖与氨基酸的共价反应产物的水溶液;
2)采用纳滤膜对步骤1)得到的龙眼果肉多糖与氨基酸的共价反应产物的水溶液进行浓缩,再对浓缩液进行冷冻干燥,得到美拉德改性龙眼果肉多糖;
所述的氨基酸为赖氨酸。
2.根据权利要求1所述的美拉德改性龙眼果肉多糖的制备方法,其特征在于,步骤1)包括以下步骤:
1a)以龙眼果肉制备龙眼果肉均质匀浆,加水浸提后,离心,分离上清液,得到龙眼果肉多糖粗提液;
1b)采用等电点沉淀法从步骤1)得到的龙眼果肉多糖粗提液中脱除蛋白质,得到龙眼果肉多糖溶液;
1c)采用醇沉法从步骤1b)得到的龙眼果肉多糖溶液中沉淀并过滤出龙眼果肉多糖沉淀,将龙眼果肉多糖沉淀复溶于水后,经冷冻干燥,得到龙眼果肉多糖原料;
1d)将步骤1c)得到的龙眼果肉多糖原料与氨基酸溶于热水中进行反应,得到龙眼果肉多糖与氨基酸的共价反应产物的水溶液,热水的温度为90~100℃。
3.根据权利要求2所述的美拉德改性龙眼果肉多糖的制备方法,其特征在于:步骤1a)中,龙眼果肉均质匀浆中龙眼果肉的重量百分含量为14~20%,加水浸提的提取时间为4~6h,提取液pH为8.5~9.5。
4.根据权利要求2所述的美拉德改性龙眼果肉多糖的制备方法,其特征在于,步骤1b)包括以下步骤:在pH为4.5~5.5的条件下进行等电点沉淀。
5.根据权利要求2所述的美拉德改性龙眼果肉多糖的制备方法,其特征在于,步骤1c)中,在中性条件下进行醇沉法从步骤1b)得到的龙眼果肉多糖溶液中沉淀出龙眼果肉多糖,经离心和过滤分离得到龙眼果肉多糖沉淀,再以乙醇溶液洗涤龙眼果肉多糖沉淀,再经离心和过滤分离得到残留有乙醇的龙眼果肉多糖沉淀,待乙醇挥发后加水复溶龙眼果肉多糖沉淀,再经冷冻干燥,得到龙眼果肉多糖原料。
6.根据权利要求2所述的美拉德改性龙眼果肉多糖的制备方法,其特征在于,步骤1d)中的反应条件为:龙眼果肉多糖原料在热水中的起始浓度为2~4 mg/mL;氨基酸在热水中的起始浓度为2~4 mg/mL;龙眼果肉多糖原料与氨基酸的用量比为0.9~1.1:1.1~0.9;反应液的pH为8.5~9.5;反应温度为90~100℃;反应时间为4~6 h;反应时间到达后冷却,终止反应。
7.根据权利要求1所述的美拉德改性龙眼果肉多糖的制备方法,其特征在于,步骤2)中:纳滤膜的截留分子量为500~1000D;冷冻干燥的温度为-50~-30℃。
8.一种根据权利要求1至7任一所述的美拉德改性龙眼果肉多糖的制备方法制备得到的美拉德改性龙眼果肉多糖。
9.一种根据权利要求8所述的美拉德改性龙眼果肉多糖的应用,其特征在于:
用于制备抗氧化剂;
或者,用于制备调节免疫活性的制剂。
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