CN113024685A

CN113024685A - 一种低分子量竹荪菌托多糖及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN113024685A
Application number: CN202110433647.3A
Authority: CN
Inventors: 杨玲; 罗丽平; 康超; 郑旋; 王万坤; 曾维军; 李鹏; 向准; 杨彝华
Original assignee: Guizhou Institute of Biology
Current assignee: Guizhou Institute of Biology
Priority date: 2021-04-20
Filing date: 2021-04-20
Publication date: 2021-06-25

Abstract

本发明涉及食用菌加工领域，具体是一种低分子量竹荪菌托多糖及其制备方法与应用。本发明将烘干的竹荪菌托脱脂、烘干、粉碎得菌托干粉；按比例加入纯净水以及纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶，调节pH，酶解；恒温热水浸提；提取液过滤、活性炭脱色、脱蛋白；离心、真空减压浓缩；加入乙醇沉淀、过滤、离心；真空冷冻干燥，得到竹荪菌托粗多糖；用DEAE‑52纤维素离子交换层析柱纯化，再用Sephadex G‑200葡聚糖凝胶色谱柱纯化，洗脱，浓缩，干燥，得到竹荪菌托多糖。本发明利用竹荪栽培的废弃物菌托，采用复合酶法提取低分子量多糖，提取率高，提取的多糖分子量小，对·OH、DPPH·的清除率高，对Fe³⁺的还原能力较强，还可以抑制α‑葡萄糖苷酶和α‑淀粉酶的活性。

Description

一种低分子量竹荪菌托多糖及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及食用菌加工领域，具体是一种低分子量竹荪菌托多糖及其制备方法与应用。

背景技术

竹荪(Dictyophora)，属鬼笔目(Phallales)鬼笔科(Phallaceae)竹荪属(Dictyophora Desv.)，全株由菌托、菌柄、菌盖构成，商品竹荪是菌柄和菌盖，菌托在采收时都是被摘除废弃，而菌托中粗多糖含量为10％以上、氨基酸总量为14％以上、蛋白质含量为23％以上，还含有钙、铁、锌等微量元素，经济价值较高，利用竹荪菌托提取多糖提供了食用菌多糖开发利用的新途径。

竹荪菌托糖主要的生理功能有：(1)调节免疫功能；(2)抑制肿瘤和癌细胞；(3)抗氧化、延缓衰老；(4)降血糖、降血脂等。

竹荪菌托多糖的分子量影响多糖的生物活性，低分子量多糖具有更好的生物活性，分子量越大，不利于多糖在生物体内吸收及发挥活性作用，从而影响多糖的利用。所以，通过降解多糖，把大分子断裂成较小片段，降低多糖分子量是多糖及其产品开发急待解决的问题。目前，降解植物多糖的方法多种多样，如高压均质降解、超声波降解、酸降解、酶降解等。高压均质降解、超声波降解设备投入大，成本高，推广有难度，酸降解等化学方法易产生化学溶剂残留，影响了多糖在食品、护肤品等领域的应用。目前的技术都是多糖提取后再溶解进行分子量降解，操作较复杂，多糖的损失也较大。例如专利申请CN105837701A(一种竹荪多糖的提取工艺)公开了一种竹荪多糖的提取工艺，取竹荪子实体，粉碎成细粉，加至NaOH溶液中浸提，在所得浸提液中加入胰蛋白酶、纤维素酶和柠檬酸，35～45℃酶解，然后将所得酶解液通过大孔吸附树脂进行除杂，最后在所得透过液中加入无水乙醇进行沉淀，上清液经减压浓缩，得到竹荪多糖，其是利用碱进行提取，再进行酶解，既有化学物质残留，多糖损失也较大。又如CN112010989A(一种具有抗氧化活性的竹荪菌托多糖的制备方法)公开了一种具有抗氧化活性的竹荪菌托多糖的制备方法，包括脱脂、粉碎、提取、分离、除蛋白、纯化步骤，其特征在于，所述提取是以pH4.5-5.5的富硒茶汤为溶剂对竹荪菌托进行恒温提取；本发明利用茶叶种植的废弃物老叶和竹荪栽培的废弃物菌托提取具有抗氧化活性的多糖，其并不具备针对低分子量竹荪菌托多糖进行提取的技术效果。

近年来竹荪菌托多糖在食品、护肤品以及保健品等领域的应用也越来越广泛。竹荪菌托多糖作为竹荪的主要功能成分之一，来源广泛，具有较好的市场应用价值。目前对低分子量竹荪菌托多糖提取技术及功效应用的研究还比较少。

因此，寻找一种不需要在提取后将竹荪菌托多糖再溶解进行分子量降解、操作简单、避免竹荪菌托多糖在降解处理过程损失的竹荪菌托多糖制备方法是当务之急。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种低分子量竹荪菌托多糖的制备方法，具体如下：

一种低分子量竹荪菌托多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)竹荪菌托预处理：将竹荪菌托烘干，然后用75％乙醇浸泡脱脂48小时，烘干，粉碎，备用；

(2)复合酶酶解竹荪菌托：分别称取竹荪菌托干粉质量1.5～3.5％的纤维素酶、0.3～0.5％的果胶酶、1～3％的木瓜蛋白酶，分别用纯净水溶解后合并溶液，再向其中加入菌托干粉，按竹荪菌托干粉与纯净水的料液质量比1:20～40进行补加纯净水，搅拌均匀，调节pH值为4.5～5.0之间，于50～60℃恒温酶解反应1～2小时；

(3)竹荪菌托多糖提取：将步骤(2)得到的酶解提取液按其中菌托干粉与纯净水的料液质量比1:20～40进行补加纯净水，然后于75～85℃恒温提取2～4小时；

(4)提取液过滤：将步骤(3)所得提取液依次过60目、100目、150目、200目筛网进行分级过滤，收集滤液；

(5)提取液脱色、脱蛋白：将步骤(4)所得滤液加入体积比1％～3％的颗粒活性炭，升温至50℃，500～1000r/min搅拌，90～120min；

(6)浓缩、醇沉；将步骤(5)中活性炭处理后的滤液用100目筛网过滤，4000～5000r/min离心30～40min，上清液真空减压浓缩至1/3体积，加入浓缩液3倍体积的95％乙醇，沉淀12小时以上，50-70目筛网过滤；

(7)真空冷冻干燥得竹荪菌托粗多糖：将步骤(6)中过滤后的沉淀3000～4000r/min离心10～20min，弃去上清液，将沉淀真空冷冻干燥，得到竹荪菌托粗多糖；

(8)竹荪菌托粗多糖的纯化：将得到的竹荪菌托粗多糖溶于水，用层析柱进行纯化，收集洗脱液，再用色谱柱进行纯化，收集洗脱液，浓缩，干燥，得到竹荪菌托多糖。

进一步的，所述乙醇，是食品级乙醇。

进一步的，所述步骤(1)中的烘干，粉碎，具体是，40-50℃烘干至恒重，粉碎过50-70目筛网。

进一步的，所述步骤(8)，用层析柱进行纯化，具体是用DEAE-52纤维素离子交换层析柱纯化，用蒸馏水、0.1～0.5mol/LNaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液。

进一步的，所述步骤(8)，用色谱柱进行纯化，具体是用Sephadex G-200葡聚糖凝胶色谱柱纯化，以0.1～0.5mol/LNaCl溶液为洗脱剂，收集洗脱液。

进一步的，所述步骤(8)的干燥，具体是真空冷冻干燥。

通过上述方法制备得到的低分子量竹荪菌托多糖，其中竹荪菌托多糖含量为70％～75％，各成分分别为：15％～20％葡萄糖醛酸、15％～20％半乳糖、13％～18％甘露糖、10％～15％葡萄糖、3％～6％的岩藻糖、1～2％的木糖。

进一步的，所得到的竹荪菌托多糖，数均分子量为1.9～2.0×10⁴g/mol，重均分子量为3.3～3.4×10⁴g/mol，78％～80％的分子量小于3.3×10⁴g/mol。

上述低分子量竹荪菌托多糖在制备面霜中的应用以及在制备辅助降血糖的功能性食品中的应用。

与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：

1、本发明的制备方法在竹荪菌托多糖提取前添加几种不同特质的酶对菌托原料进行酶解处理，充分发挥各种生物酶间的协同作用，在比较温和的条件下分解菌托组织，加速多糖的释放及提取，多糖提取率可达13～15％。

2、本发明的制备方法能降低竹荪菌托多糖的分子量，所得多糖的数均分子量为1.9～2.0×10⁴g/mol，重均分子量为3.3～3.4×10⁴g/mol，78％～80％的分子量小于3.3×10⁴g/mol。所得竹荪菌托多糖的分子量小、水溶性好，有利于生物吸收、发挥生物活性。

3、本发明的制备方法同时进行多糖提取以及分子量降解，与之前的多糖降解方法相比，不需要在提取后将多糖再溶解进行分子量降解，本发明操作简单，也避免了多糖在降解处理过程的损失。

4、竹荪菌托色素含量较高，本发明采用食品级颗粒活性炭进行脱色、脱蛋白，并结合DEAE-52纤维素离子交换层析柱、Sephadex G-200葡聚糖凝胶色谱柱进行脱色纯化，两个操作步骤相结合，达到理想的脱色、脱蛋白效果，避免了采用传统Sevage试剂、H₂0₂处理过程多糖损耗高、影响结构、溶剂残留的缺点。本发明得到的竹荪菌托多糖含量为70％～75％，蛋白质含量小于4％。

5、本发明制备的竹荪菌托多糖对·OH、DPPH·的清除率高，对Fe³⁺的还原能力较强，可以作为抗氧化成分添加到护肤品中。还可以抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的活性，可以用于糖尿病辅助治疗的功能性食品或保健品中。

6、本发明的方法制备工艺简单，设备投入小、运行成本低，可规模化生产，产品安全、健康、有效、应用范围广，具有较好的经济、社会、生态效益。

附图说明

图1为竹荪菌托多糖含量测定标准曲线(以葡萄糖为标准)。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

实施例1

一种低分子量竹荪菌托多糖的制备方法，具体步骤如下：

(1)竹荪菌托预处理：将竹荪菌托烘干，然后用75％食品级乙醇浸泡脱脂48小时，45℃烘干至恒重，粉碎过60目筛网，备用；

(2)复合酶酶解竹荪菌托：分别称取竹荪菌托干粉质量2.5％的纤维素酶、0.4％的果胶酶、2％的木瓜蛋白酶，分别用纯净水溶解后合并溶液，再向其中加入菌托干粉，按竹荪菌托干粉与纯净水的料液质量比1:30进行补加纯净水，搅拌均匀，调节pH值为4.6，于55℃恒温酶解反应1.5小时；

(3)竹荪菌托多糖提取：将步骤(2)得到的酶解提取液按其中菌托干粉与纯净水的料液质量比1:30进行补加纯净水，然后于80℃恒温提取3小时；

(5)提取液脱色、脱蛋白：将步骤(4)所得滤液加入体积比2％的颗粒活性炭，升温至50℃，750r/min搅拌105min；

(6)浓缩、醇沉；将步骤(5)中活性炭处理后的滤液用100目筛网过滤，4500r/min离心35min，上清液真空减压浓缩至1/3体积，加入浓缩液3倍体积的95％食品级乙醇，沉淀14小时，60目筛网过滤；

(7)真空冷冻干燥得竹荪菌托粗多糖：将步骤(6)中过滤后的沉淀3500r/min离心15min，弃去上清液，将沉淀真空冷冻干燥，得到竹荪菌托粗多糖；

(8)竹荪菌托粗多糖的纯化：将得到的竹荪菌托粗多糖溶于水，用DEAE-52纤维素离子交换层析柱纯化，用蒸馏水、0.3mol/LNaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用SephadexG-200葡聚糖凝胶色谱柱纯化，以0.3mol/LNaCl溶液为洗脱剂，收集洗脱液，浓缩，真空冷冻干燥，得到竹荪菌托多糖。

实施例2

一种低分子量竹荪菌托多糖的制备方法，具体步骤如下：

(1)竹荪菌托预处理：将竹荪菌托烘干，然后用75％食品级乙醇浸泡脱脂48小时，40℃烘干至恒重，粉碎过70目筛网，备用；

(2)复合酶酶解竹荪菌托：分别称取竹荪菌托干粉质量1.5％的纤维素酶、0.3％的果胶酶、1％的木瓜蛋白酶，分别用纯净水溶解后合并溶液，再向其中加入菌托干粉，按竹荪菌托干粉与纯净水的料液质量比1:20进行补加纯净水，搅拌均匀，调节pH值为4.5，于50℃恒温酶解反应2小时；

(3)竹荪菌托多糖提取：将步骤(2)得到的酶解提取液按其中菌托干粉与纯净水的料液质量比1:20进行补加纯净水，然后于75℃恒温提取4小时；

(5)提取液脱色、脱蛋白：将步骤(4)所得滤液加入体积比1％的颗粒活性炭，升温至50℃，1000r/min搅拌，90min；

(6)浓缩、醇沉；将步骤(5)中活性炭处理后的滤液用100目筛网过滤，4000r/min离心40min，上清液真空减压浓缩至1/3体积，加入浓缩液3倍体积的95％食品级乙醇，沉淀12小时，70目筛网过滤；

(7)真空冷冻干燥得竹荪菌托粗多糖：将步骤(6)中过滤后的沉淀3000r/min离心20min，弃去上清液，将沉淀真空冷冻干燥，得到竹荪菌托粗多糖；

(8)竹荪菌托粗多糖的纯化：将得到的竹荪菌托粗多糖溶于水，用DEAE-52纤维素离子交换层析柱纯化，用蒸馏水、0.1mol/LNaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用SephadexG-200葡聚糖凝胶色谱柱纯化，以0.1mol/LNaCl溶液为洗脱剂，收集洗脱液，浓缩，真空冷冻干燥，得到竹荪菌托多糖。

实施例3

一种低分子量竹荪菌托多糖的制备方法，具体步骤如下：

(1)竹荪菌托预处理：将竹荪菌托烘干，然后用75％食品级乙醇浸泡脱脂48小时，50℃烘干至恒重，粉碎过50目筛网，备用；

(2)复合酶酶解竹荪菌托：分别称取竹荪菌托干粉质量3.5％的纤维素酶、0.5％的果胶酶、3％的木瓜蛋白酶，分别用纯净水溶解后合并溶液，再向其中加入菌托干粉，按竹荪菌托干粉与纯净水的料液质量比1:40进行补加纯净水，搅拌均匀，调节pH值为5.0，于60℃恒温酶解反应1小时；

(3)竹荪菌托多糖提取：将步骤(2)得到的酶解提取液按其中菌托干粉与纯净水的料液质量比1:40进行补加纯净水，然后于85℃恒温提取2小时；

(5)提取液脱色、脱蛋白：将步骤(4)所得滤液加入体积比3％的颗粒活性炭，升温至50℃，500r/min搅拌，120min；

(6)浓缩、醇沉；将步骤(5)中活性炭处理后的滤液用100目筛网过滤，5000r/min离心30min，上清液真空减压浓缩至1/3体积，加入浓缩液3倍体积的95％食品级乙醇，沉淀16小时，50目筛网过滤；

(7)真空冷冻干燥得竹荪菌托粗多糖：将步骤(6)中过滤后的沉淀4000r/min离心10min，弃去上清液，将沉淀真空冷冻干燥，得到竹荪菌托粗多糖；

(8)竹荪菌托粗多糖的纯化：将得到的竹荪菌托粗多糖溶于水，用DEAE-52纤维素离子交换层析柱纯化，用蒸馏水、0.5mol/LNaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用SephadexG-200葡聚糖凝胶色谱柱纯化，以0.5mol/LNaCl溶液为洗脱剂，收集洗脱液，浓缩，真空冷冻干燥，得到竹荪菌托多糖。

实施例4竹荪菌托多糖面霜的制备

A组分：单脂肪酸甘油酯2g、鲸蜡硬脂醇3.6g、十六醇硬脂酸甘油酯5g、氢化聚异丁烯5g、霍霍巴籽油2g。

B组分：去离子水76g、甘油4g、透明质酸0.05g。

C组分：竹荪菌托多糖2g(实施例1所得)。

D组分：防腐剂羟苯丙酯0.20g、香精0.15g。

按照配方准确称量A、B组分，分别加热至75～80℃，保温10min，边搅拌边将A组分加入到B组分中，继续保温并充分搅拌5min，均质2min，不断搅拌，降温至50℃后，加入C组分，降温至40℃时加入D组分，搅拌均匀，包装即得竹荪菌托多糖面霜。

实施例5竹荪菌托多糖口服液的制备

取竹荪菌托多糖(实施例1所得)溶于纯净水中，配制成5mg/mL的多糖溶液，以多糖溶液计，加入木糖醇3.5％，三氯蔗糖1.3％，柠檬酸0.3％，搅拌，过滤，高压均质，真空脱气，高温瞬时灭菌，灌装，即制得竹荪菌托多糖口服液。

对比例1

竹荪菌托预处理后，按菌托干粉与纯净水的料液质量比一次加入全部纯净水后，按照本发明的方法步骤(3)～(8)提取竹荪菌托多糖。

对比例2

按照专利申请CN105837701A的实施例1进行，原料选用竹荪菌托。

对比例3

按照专利申请CN 112010989A的实施例1进行，原料选用竹荪菌托。

将实施例1-3及对比例1-3所得的竹荪菌托多糖进行对比，具体如下：

分别计算各对比例和实施例的多糖提取率，对所提取的竹荪菌托多糖进行含量测定、分子量测定，并测定对比例和实施例样品对·OH清除率、对DPPH·清除率、对Fe³⁺总还原力，对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用，评价对比例和实施例多糖的抗氧化、辅助降血糖功效。结果见表1～表8。

1、多糖提取率

多糖提取率(％)＝冻干样品质量(g)/菌托干粉质量(g)×100式(1)

表1对比例和实验例多糖提取率比较

2、竹荪菌托多糖含量测定：硫酸-苯酚法。

2.1葡萄糖标准曲线的制作

配制0.1mg/mL的葡萄糖母液，分别稀释浓度为0.005mg/mL，0.015mg/mL，0.025mg/mL，0.035mg/mL，0.045mg/mL，取1.0mL样品加入6％苯酚1.0mL，再缓慢加入5.0mL浓硫酸，充分摇匀，放置冷却至室温。同时取1.0mL蒸馏水于试管中，同法加入苯酚和浓硫酸，作为空白对照溶液。在波长490nm处测定各溶液的吸光度值，以葡萄糖质量浓度(mg/mL)为横坐标，吸光值A为纵坐标，绘制标准曲线，见附图1。标准曲线回归方程为y＝11.37x-0.012，相关系数R²＝0.998，线性关系良好。

2.2多糖含量的测定及计算

取粗多糖0.05g完全溶解于10mL容量瓶中，加蒸馏水定容至10mL，取溶液20μL至试管中，再加入1mL蒸馏水、1mL6％苯酚、5mL浓硫酸，同时作一个平行组。另取20μL蒸馏水于试管中，同法加入苯酚和浓硫酸，作为空白对照溶液。振荡试管使其反应完全，放置冷却至室温，于490nm处测定吸光度值，一组测两次。由回归方程计算粗多糖中的多糖含量。

表2对比例和实验例多糖含量比较

3、分子量测定：采用HP-GPC进行检测，采用美国安捷伦公司的凝胶渗透色谱仪，色谱柱为TSK-G5000PWXL和TSK-G3000PWXL串联柱，流动相为0.02mol/L磷酸盐缓冲溶液；流速为0.6mol/L；柱温为45℃，检测器为2414型示差折光检测器。

表3对比例和实验例多糖分子量比较

4、对·OH清除率

采用水杨酸显色法进行测定。反应体系为1mL、8mmol/LFeSO₄，1mL、8mmol/L H₂O₂，1mL、8mmol/L水杨酸，1mL蒸馏水，1mL相应浓度的被试样品溶液。反应体系体积共计5mL，将混合体系摇匀后置于37℃恒温水浴锅中加热反应30min，后于510nm处测定混合体系的吸光值(A1)，用1mL的蒸馏水代替反应体系中的水杨酸测得样品本底吸光值(A2)，用1mL的蒸馏水代替反应体系中的样品测得空白吸光值(A0)。每组实验做三个平行，最终值取三次的平均值，清除率计算公式见式(2)。

清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]×100 式(2)

表4对比例和实验例对·OH清除率比较

5、对DPPH·清除率

反应体系由1mL不同浓度的被试样溶液，1mL、0.2mmol/LDPPH·溶液和2mL蒸馏水组成。将反应组合摇匀后置于25℃恒温水浴锅中避光加热反应15min，后于517nm处测定混合反应体系的吸光值(A1)。用1mL的蒸馏水代替1mL的DPPH·溶液，其余成分相同，测得样品的本底吸光值(A2)，用1mL的蒸馏水代替1mL的样品溶液，其余成分相同，测得空白吸光值(A0)。每组实验做三个平行，最终值取三次值的平均值，清除率计算公式见(3)式。

清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]×100 式(3)

表5对比例和实验例对DPPH·清除率比较

6、对Fe³⁺总还原力

采用铁氰化钾显色法测定。取各不同浓度被试样品1mL，加入pH6.8的PBS缓冲液1mL及1％的铁氰化钾溶液1mL，摇匀后置于50℃恒温水浴锅中加热反应30min。加热反应结束后取出并急速冷却后，加入已配置好的10％的三氯乙酸溶液1mL，充分混匀后4000r/min离心10min，取上清液1mL并加入0.1％的三氯化铁溶液1mL，随后加入3mL的蒸馏水，混匀后于700nm处测定此反应体系的吸光值(A1)，以1mL的蒸馏水代替不同浓度的试样品，其他操作相同，在700nm处测得空白吸光值(A0)。以(A1-A0)的值来衡量样品还原能力的强弱，还原力的强弱与吸光值的大小成正相关。每组实验做三个平行，最终值取三次的平均值。IC₅₀值越小说明还原能力越强。

表6对比例和实验例对Fe³⁺总还原力IC₅₀值比较

样品	对比例1	对比例2	对比例3	实施例1	实施例2	实施例3
							IC<sub>50</sub>/(mg/mL)	5.30	5.47	4.38	4.25	4.24	4.29

7、对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用

采用4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)比色法测定被试样品对α-葡萄糖苷酶活性的影响。以向4mL磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中加入1mL 0.1mmol/L PNPG和1mL 0.1mol/LNa₂CO₃溶液作为空白调零组。以向3mL缓冲液1mL 20mg/mLα-葡萄糖苷酶加入1mL PNPG和1mLNa₂CO₃溶液为对照组在400nm处测得A。取被试样品溶液，加入缓冲液定容至3mL，后加入1mLα-葡萄糖苷酶溶液，摇匀后置于37℃水浴锅中加热反应10min后加入1mL PNPG继续37℃水浴反应10min，取出并加入1mLNa₂CO₃溶液，摇匀于400nm测得吸光值A1。另取被试样品溶液加入缓冲液至4mL，摇匀后于37℃水浴锅中加热10min，随后加入1mLPNPG，继续在37℃水浴中加热10min后取出加入1mLNa₂CO₃溶液，于400nm下测得A0。每组实验做三个平行，最终值取三次的平均值，抑制率计算公式见式(4)。

抑制率(％)＝[1-(A1-A0)/A]×100 式(4)

表7对比例和实验例对α-葡萄糖苷酶活性抑制率比较

样品	对比例1	对比例2	对比例3	实施例1	实施例2	实施例3
							抑制率(％)	20.30	15.26	22.54	27.02	26.64	26.12

8、对α-淀粉酶活性抑制作用

采用二硝基水杨酸(DNS)法来测定被试样对α-淀粉酶活性的影响。向2mL磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中加入0.5mL 0.5％可溶性淀粉溶液和4mL DNS作为空白调零，以1mL缓冲液1mL 1％α-淀粉酶溶液、0.5mL 0.5％的淀粉和4mL DNS作为对照组测得A。取1mL的被试样品溶液，再加入PBS定容至2mL，再加入1mLα-淀粉酶溶液，摇匀。放入37℃水浴预热10min后，加入0.5mL 0.5％的淀粉溶液，在37℃恒温水浴锅中反应10min取出并加入4mL DNS溶液，后置于沸水浴中5min，待冷却后于540nm下测得值A1。另取一组适量浓度的被试样品溶液作为本底组，加入缓冲液定容至3mL，置于37℃水浴预热10min后，加入0.5mLPBS，37℃水浴10min，加入4mL PBS溶液，置于沸水中水浴5min，待冷却后于540nm下测得吸光值A0。每组实验做三个平行，最终值取三次的平均值，抑制率计算公式见式(5)。

抑制率(％)＝[1-(A1-A0)/A]×100 式(5)

表8对比例和实验例对α-淀粉酶活性抑制率比较

样品	对比例1	对比例2	对比例3	实施例1	实施例2	实施例3
							抑制率(％)	24.30	20.37	27.59	32.52	32.64	32.48

最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种低分子量竹荪菌托多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的低分子量竹荪菌托多糖的制备方法，其特征在于，所述乙醇，是食品级乙醇。

3.根据权利要求1所述的低分子量竹荪菌托多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的烘干，粉碎，具体是，40-50℃烘干至恒重，粉碎过50-70目筛网。

4.根据权利要求1所述的低分子量竹荪菌托多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(8)，用层析柱进行纯化，具体是用DEAE-52纤维素离子交换层析柱纯化，用蒸馏水、0.1～0.5mol/LNaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液。

5.根据权利要求1所述的低分子量竹荪菌托多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(8)，用色谱柱进行纯化，具体是用Sephadex G-200葡聚糖凝胶色谱柱纯化，以0.1～0.5mol/LNaCl溶液为洗脱剂，收集洗脱液。

6.根据权利要求1所述的低分子量竹荪菌托多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(8)的干燥，具体是真空冷冻干燥。

7.通过权利要求1-6中任一项的方法制备得到的低分子量竹荪菌托多糖，其特征在于，竹荪菌托多糖含量为70％～75％，其中各成分为：15％～20％葡萄糖醛酸、15％～20％半乳糖、13％～18％甘露糖、10％～15％葡萄糖、3％～6％的岩藻糖、1～2％的木糖。

8.根据权利要求7所述的低分子量竹荪菌托多糖，其特征在于，数均分子量为1.9～2.0×10⁴g/mol，重均分子量为3.3～3.4×10⁴g/mol，78％～80％的分子量小于3.3×10⁴g/mol。

9.权利要求7所述的低分子量竹荪菌托多糖在制备面霜中的应用。

10.权利要求7所述的低分子量竹荪菌托多糖在制备辅助降血糖的功能性食品中的应用。