CN108265092A - 一种具有优良抗氧化活性的香菇寡糖及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有优良抗氧化活性的香菇寡糖及制备方法，方法步骤为：(1)将香菇多糖与蒸馏水混合，加入β‑甘露聚糖酶，调节pH＝5‑7，在40‑60℃下恒温水浴，搅拌反应煮沸13‑17min以停止反应，过滤，滤液浓缩，浓缩液透析，除去未降解的大分子香菇多糖，透析液浓缩、冻干，得到香菇寡糖粗品；(2)按比例，取香菇寡糖粗品溶于蒸馏水中，加入乙醇水溶液，醇沉，离心，上清浓缩冻干；(3)将冻干产物通过Sephadex G‑15柱分离纯化。本发明采用酶解法降解香菇多糖，降解条件温和。制备过程简单，产量高。所制备的寡糖具有优良的抗氧化活性，可用于保健品，食品药品及其抗氧化添加剂。
Description
技术领域
本发明属于功能性食品或保健品技术领域，具体涉及一种具有优良抗氧化活性的香菇寡糖及制备方法。
背景技术
香菇，是世界上第二大食用菌，味道鲜美，营养丰富，是一种药食同源的食物，具有很高的营养、药用和保健价值。香菇多糖是香菇中含有的一种具有多种生物活性的有效成分，自Chihara等首先利用热水提从香菇子实体中浸提出6种多糖之后，香菇多糖受到了广泛的关注与研究。研究报道香菇多糖具有抗肿瘤、免疫调节、抗病毒、抗感染、抗炎症、抗氧化、降血糖以及降血脂等生物活性。
尽管糖苷键类型和单糖连接方式对多糖的活性很重要，但是通常提取的多糖分子量大，结构不均一，从而导致多糖不但含有活性成分和惰性成分，甚至还含有一些会导致副作用的成分。而宁君等认为，香菇多糖中起着关键活性作用的是其中含有的寡糖重复单元的存在，而不是其三维的宏观结构(宁君,杨广斌,张文辉等.葡萄寡糖的结构及其抗肿瘤及免疫性能[J].环境化学与生态毒理学国家重点实验室,2002.)，并通过合成香菇多糖中的寡糖重复片段，证实了该寡糖片段确实比香菇多糖具有更优的性能。
寡糖又称为低聚糖，是指由2-10个单糖通过糖苷键连接而成的一类糖。研究发现寡糖除具有活性多糖的大多数功能外，还具有独特的低甜度、抗龋齿等功能。此外，寡糖还在促进肠道有益菌生长，抑制有害菌增殖，调节胃肠道功能，刺激免疫应答以及抗衰老方面起着重要作用。目前，寡糖已在食品、药品以及保健品等领域有着越来越广泛的应用。
寡糖的降解制备主要有酶解法和酸解法两种方法。但是，酸解法的反应进程不易控制，且产物不适宜直接应用在食品领域；而酶解法反应条件温和，且可控性强。目前，许多食品中的寡糖都是通过酶解多糖得到。但是由于不同的多糖其单糖组成以及糖单元之间的糖苷键各不相同，因此选用的酶也各不相同。本专利依据所述方法提取得到的香菇多糖的单糖组成，特异性地选择了β-甘露聚糖酶进行酶解，从而可以确保尽可能多的得到结构完整的葡聚寡糖片段。此外，目前关于香菇的研究多集中于香菇多糖，对于香菇寡糖的制备研究主要是通过化学合成法，但由于单糖基分子的复杂性，合成过程中涉及到多步的保护与脱保护操作、糖苷键的形成存在一定的区域和立体选择性等问题，因此，化学合成法仅适于实验室小量g级产品，难以大量制备。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种具有优良抗氧化活性的香菇寡糖。
本发明的目的是克服现有的化学合成法的不足，提供一种制备路线简单，提高了制备产量的具有优良抗氧化活性的香菇寡糖的制备方法。
本发明的第三个目的是提供具有优良抗氧化活性的香菇寡糖在制备优良抗氧化食品或保健品的应用。
本发明的技术方案概述如下：
一种具有优良抗氧化活性的香菇寡糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)按质量比为1：50-100的比例将香菇多糖与蒸馏水混合，加入β-甘露聚糖酶，使β-甘露聚糖酶的终浓度为30-150U/ml，调节pH＝5-7，在40-60℃下恒温水浴，搅拌反应48-96h，煮沸13-17min以停止反应，过滤，滤液浓缩至滤液体积的10％-20％，浓缩液经截留分子量为3.5-8KDa的透析袋透析，以除去未降解的大分子香菇多糖，透析液浓缩、冻干，得到香菇寡糖粗品；
(2)按比例，取5g香菇寡糖粗品溶于50-100mL蒸馏水中，加入体积浓度为95％的乙醇水溶液使混合液中乙醇的体积浓度为70％-80％，在4℃条件下，醇沉10-16h，离心15-20min，收集上清液，浓缩、冻干；
(3)将步骤(2)得到的冻干产物通过Sephadex G-15柱分离纯化，制备得到具有优良抗氧化活性的香菇寡糖。
优选地，步骤(1)为：按质量比为1：80的比例将香菇多糖与蒸馏水混合，加入β-甘露聚糖酶，使β-甘露聚糖酶的终浓度为75U/ml，调节pH＝6，在50℃下恒温水浴，搅拌反应72h，煮沸15min以停止反应，过滤，滤液浓缩至滤液体积的15％，浓缩液经截留分子量为6KDa的透析袋透析，以除去未降解的大分子香菇多糖，透析液浓缩、冻干，得到香菇寡糖粗品。
步骤(2)为：按比例，取5g香菇寡糖粗品溶于80mL蒸馏水中，加入体积浓度为95％的乙醇水溶液使混合液中乙醇的体积浓度为80％，在4℃条件下，醇沉13h，离心18min，收集上清液，浓缩、冻干。
步骤(3)为将步骤(2)得到的冻干产物用蒸馏水溶解，按冻干产物克数与SephadexG-15柱体积的毫升数为1：10-15的比例将冻干产物水溶液上样于Sephadex G-15柱，蒸馏水洗脱，洗脱速率为0.5-1.0mL/min，在线监测洗脱液中的总糖含量，收集洗脱峰处溶液，浓缩、冻干，制备得到具有优良抗氧化活性的香菇寡糖。
上述方法制备具有优良抗氧化活性的香菇寡糖。
上述具有优良抗氧化活性的香菇寡糖在制备优良抗氧化食品或保健品的应用。
本发明的优点：
本发明采用酶解法降解香菇多糖，降解条件温和。同时相对于化学合成法，制备过程简单，产量高。所制备的寡糖具有优良的抗氧化活性，可用于保健品，食品药品及其抗氧化添加剂，适合推广应用。
附图说明
图1是香菇寡糖的红外色谱图。
图2是香菇寡糖气相(GC)色谱图。A：七种标准单糖的气相色谱；B：香菇寡糖的气相色谱图。
图3为本发明香菇寡糖与香菇多糖抗氧化性性能测试结果。
具体实施方式
本发明是以香菇多糖为原料。香菇多糖可购买，也可以自己制备。
实施例1
香菇多糖的制备：
(1)取香菇干燥粉碎，过60目筛；
(2)按质量比1：30的比例，将步骤(1)所得的香菇粉末与蒸馏水混合，在100℃下煮沸提取30min，过滤，滤渣重复提取1次，滤液浓缩至蒸馏水体积的20％得浓缩液；按比例，向500mL浓缩液中加入酶活为2800U/g的木瓜蛋白酶0.9g，酶解糖蛋白，得木瓜蛋白酶酶解液；按sevag试剂与木瓜蛋白酶酶解液体积比为1：5的比例向木瓜蛋白酶酶解液中加入sevag试剂，于分液漏斗中充分混合，静置分层，放出下层含蛋白沉淀的有机层，留下上层溶液重复sevag法1次，得除蛋白液；浓缩，至除蛋白液体积的20％，向除蛋白浓缩液中加入其体积3倍的体积浓度为95％的乙醇水溶液，4℃静置10h，离心收集沉淀，冷冻干燥后得香菇多糖。
实施例2
一种具有优良抗氧化活性的香菇寡糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)按质量比为1：80的比例将实施例1制备的香菇多糖与蒸馏水混合，加入β-甘露聚糖酶，使β-甘露聚糖酶的终浓度为75U/ml，调节pH＝6.0，在50℃下恒温水浴，搅拌反应72h，煮沸15min以停止反应，过滤，滤液浓缩至滤液体积的15％，浓缩液经截留分子量为6KDa的透析袋透析，以除去未降解的大分子香菇多糖，透析液浓缩、冻干，得到香菇寡糖粗品；
(2)按比例，取5g香菇寡糖粗品溶于80mL蒸馏水中，加入体积浓度为95％的乙醇水溶液使混合液中乙醇的体积浓度为80％，在4℃条件下，醇沉13h，离心18min，收集上清液，浓缩、冻干；
(3)将步骤(2)得到的冻干产物用蒸馏水溶解，按冻干产物克数与Sephadex G-15柱体积的毫升数为1：10的比例将冻干产物水溶液上样于Sephadex G-15柱，蒸馏水洗脱，洗脱速率为0.5mL/min，在线监测洗脱液中的总糖含量，收集洗脱峰处溶液，浓缩、冻干，制备得到具有优良抗氧化活性的香菇寡糖，收率18.04％。见图1和图2。
实施例3
一种具有优良抗氧化活性的香菇寡糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)按质量比为1：50的比例将实施例1制备的香菇多糖与蒸馏水混合，加入β-甘露聚糖酶，使β-甘露聚糖酶的终浓度为30U/ml，调节pH＝5，在40℃下恒温水浴，搅拌反应96h，煮沸13min以停止反应，过滤，滤液浓缩至滤液体积的10％，浓缩液经截留分子量为8KDa的透析袋透析，以除去未降解的大分子香菇多糖，透析液浓缩、冻干，得到香菇寡糖粗品；
(2)按比例，取5g香菇寡糖粗品溶于50mL蒸馏水中，加入体积浓度为95％的乙醇水溶液使混合液中乙醇的体积浓度为70％，在4℃条件下，醇沉16h，离心15min，收集上清液，浓缩、冻干；
(3)将步骤(2)得到的冻干产物用蒸馏水溶解，按冻干产物克数与Sephadex G-15柱体积的毫升数为1：10的比例将冻干产物水溶液上样于Sephadex G-15柱，蒸馏水洗脱，洗脱速率为1.0mL/min，在线监测洗脱液中的总糖含量，收集洗脱峰处溶液，浓缩、冻干，制备得到具有优良抗氧化活性的香菇寡糖，收率15.21％。
实施例4
一种具有优良抗氧化活性的香菇寡糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)按质量比为1：100的比例将实施例1制备的香菇多糖与蒸馏水混合，加入β-甘露聚糖酶，使β-甘露聚糖酶的终浓度为150U/ml，调节pH＝7，在60℃下恒温水浴，搅拌反应48h，煮沸17min以停止反应，过滤，滤液浓缩至滤液体积的20％，浓缩液经截留分子量为3.5KDa的透析袋透析，以除去未降解的大分子香菇多糖，透析液浓缩、冻干，得到香菇寡糖粗品；
(2)按比例，取5g香菇寡糖粗品溶于100mL蒸馏水中，加入体积浓度为95％的乙醇水溶液使混合液中乙醇的体积浓度为80％，在4℃条件下，醇沉10h，离心20min，收集上清液，浓缩、冻干；
(3)将步骤(2)得到的冻干产物用蒸馏水溶解，按冻干产物克数与Sephadex G-15柱体积的毫升数为1：15的比例将冻干产物水溶液上样于Sephadex G-15柱，蒸馏水洗脱，洗脱速率为0.5mL/min，在线监测洗脱液中的总糖含量，收集洗脱峰处溶液，浓缩、冻干，制备得到具有优良抗氧化活性的香菇寡糖，收率14.69％。
实施例5具有优良抗氧化活性的香菇寡糖(简称香菇寡糖)抗氧化性性能测试实验
检测实施例2制备得到的香菇寡糖的抗氧化活性，包括DPPH自由基清除能力、ABTS总抗氧化性以及还原能力。分别取0，0.25，0.5，0.75，1，2，3，4，5mg/mL不同浓度梯度的寡糖样品(溶剂为水)，用于检测不同浓度下，样品的抗氧化活性。取香菇多糖样品以相同方法重复抗氧化性实验，并将其结果与香菇寡糖进行比较。
图3为本发明香菇寡糖与香菇多糖抗氧化性性能测试结果。
本发明香菇寡糖(实施例2制备)的抗氧化性结果如图3所示。香菇寡糖的抗氧化活性是浓度依赖型，在一定浓度范围内抗氧化性随着浓度的增大而增强。对于DPPH自由基清除能力和ABTS总抗氧化性来说，当浓度超过某一范围时，香菇寡糖的自由基清除力达到100％，并趋于稳定。不同浓度下，本发明的香菇寡糖抗氧化活性皆明显优于香菇多糖。实验证明，
实施例3、4制备的香菇寡糖的抗氧化活性与实施例2制备的香菇寡糖相似。
以上结果说明本发明的香菇寡糖具有优良的抗氧化活性。可以用于保健品，食品药品及其抗氧化添加剂的制备。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (5)
1.一种具有优良抗氧化活性的香菇寡糖的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)按质量比为1：50-100的比例将香菇多糖与蒸馏水混合，加入β-甘露聚糖酶，使β-甘露聚糖酶的终浓度为30-150U/ml，调节pH＝5-7，在40-60℃下恒温水浴，搅拌反应48-96h，煮沸13-17min以停止反应，过滤，滤液浓缩至滤液体积的10％-20％，浓缩液经截留分子量为3.5-8KDa的透析袋透析，以除去未降解的大分子香菇多糖，透析液浓缩、冻干，得到香菇寡糖粗品；
(2)按比例，取5g香菇寡糖粗品溶于50-100mL蒸馏水中，加入体积浓度为95％的乙醇水溶液使混合液中乙醇的体积浓度为70％-80％，在4℃条件下，醇沉10-16h，离心15-20min，收集上清液，浓缩、冻干；
(3)将步骤(2)得到的冻干产物通过Sephadex G-15柱分离纯化，制备得到具有优良抗氧化活性的香菇寡糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(1)为：按质量比为1：80的比例将香菇多糖与蒸馏水混合，加入β-甘露聚糖酶，使β-甘露聚糖酶的终浓度为75U/ml，调节pH＝6，在50℃下恒温水浴，搅拌反应72h，煮沸15min以停止反应，过滤，滤液浓缩至滤液体积的15％，浓缩液经截留分子量为6KDa的透析袋透析，以除去未降解的大分子香菇多糖，透析液浓缩、冻干，得到香菇寡糖粗品。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)为：按比例，取5g香菇寡糖粗品溶于80mL蒸馏水中，加入体积浓度为95％的乙醇水溶液使混合液中乙醇的体积浓度为80％，在4℃条件下，醇沉13h，离心18min，收集上清液，浓缩、冻干。
4.权利要求1-3之一的方法制备的具有优良抗氧化活性的香菇寡糖。
5.权利要求4的具有优良抗氧化活性的香菇寡糖在制备优良抗氧化食品或保健品的应用。
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