CN107177656A - 一种泥鳅鱼蛋白多肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种泥鳅鱼蛋白多肽及其应用，泥鳅鱼蛋白多肽为分子量介于1000‑1300Da的泥鳅鱼降压肽，该泥鳅鱼降压肽釆用微波辅助酶解技术制备而得，该制备方法包括如下步骤：前处理的步骤、蛋白质改性的步骤、一次酶解的步骤、二次酶解的步骤、灭酶的步骤、分离纯化的步骤、高压蒸汽灭菌的步骤、浓缩干燥的步骤。通过改进泥鳅鱼蛋白多肽的酶解工艺与技术，采用超波辅助酶解技术，制备具有降压活性的多肽，本发明制备的泥鳅鱼降压肽的肽得率高，纯度高，可以作为添加剂或活性药物添加至到人类食品、医药、保健品等多种行业和领域，无疑对延长泥鳅产业链，全面提高泥鳅产业综合效益，实现农业增效农民增收农村繁荣，对推动一带一路建设有重大意义。

Description

一种泥鳅鱼蛋白多肽及其应用
技术领域
本发明涉及一种生物工程技术，尤其涉及一种泥鳅鱼蛋白多肽及其应用。
背景技术
泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)，又名鳅、鳅鱼，属鲤形目鲤亚目，鳅科类的小型鱼类，在我国各地的淡水中均有分布，自然产量大，分布广，是常见的水产类大众食品。泥鳅肉质细嫩，味道鲜美，营养丰富，并具有重要的药用价值，《本草纲目》和《中药大辞典》等中药医书中均有详细记载，泥鳅全体或皮肤分泌的滑液均可入药，具有补中气、祛湿邪的功效，还能治消渴、水肿黄疸、清热解毒、痔疾、阳痿等，对慢性肝炎患者肝功能的改善也有很明显的作用。因此，泥鳅是药食兼用的滋补胜品，被喻为“水中人参”。
泥鳅中的可食部分占总体的80％左右，高于一般的淡水鱼类，可食部分含水79.18％，脂肪1.50％，灰分1.17％，蛋白质17.88％，其中氨基酸总量(占鲜重)17.26％，8种必须氨基酸的总量为7.61％，呈味氨基酸6.85％，必需氨基酸的含量都非常接近于WHO/FAO模式，氨基酸中的牛磺酸占3.5％以上，故泥鳅为高蛋白低脂肪的营养品，既美味又滋补。泥鳅及其提取物中含丰富的K、Na、Fe、Cu、Ze、Mg、Mn、Se等微量元素，对防治心脑血管疾病和免疫系统调节有重要的意义。泥鳅具有脂肪含量低、胆固醇少的特点，泥鳅各组织中含十多种脂肪酸，不同组织中均含较高的单不饱和脂肪酸及多不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸具有很强的生理活性，有助于降低胆固醇、降血脂、抗动脉硬化等。从泥鳅中可分离出多种活性物质，包括泥鳅多糖、多肽、凝集素、抗菌肽、超氧化物歧化酶和透明质酸等，具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗癌等重要的营养保健作用和临床药用价值。
泥鳅本身药用价值高，高蛋白、低脂肪，是一种潜在的动物蛋白资源，经常食用可防血管硬化，对高血压、贫血等心血管疾病患者都有辅助治疗作用。但是目前对泥鳅的研究主要集中在泥鳅多糖、微量元素等方面，而对泥鳅体内丰富蛋白质资源的研究却报道尚少。因此利用现代食品生物技术对泥鳅蛋白进行深度开发，制备出具有保健作用的功能食品，不仅可提高现有资源的利用率，为泥鳅的深度加工提供一条新的途径，增加渔农的经济效益；而且可增强水产养殖和食品加工企业的科技含量和市场竞争力，对提高我国水产品现代化综合加工技术水平和发展保健食品工业具有重要的社会意义和经济效益。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成己为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种泥鳅鱼蛋白多肽。通过改进泥鳅鱼蛋白多肽的酶解工艺与技术，采用超波辅助酶解技术，制备具有降压活性的多肽，本发明制备的泥鳅鱼降压肽的肽得率高，纯度高。
本发明的目的之二在于一种泥鳅鱼蛋白多肽在复方泥鳅鱼蛋白多肽酒中的应用。本发明的复方泥鳅鱼蛋白多肽酒以泥鳅鱼蛋白多肽为主要添加的降压成分，罗布麻叶为辅助添加的降压成分，两者配合使用，能够起到协同增效的作用。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种泥鳅鱼蛋白多肽，为分子量介于1000-1300Da的泥鳅鱼降压肽，该泥鳅鱼降压肽釆用微波辅助酶解技术制备而得，该制备方法包括如下步骤：
前处理的步骤：
将鲜活泥鳅鱼用清水静养24h，捞取沥干，去掉头和内脏后，用绞肉机绞成肉泥；
蛋白质改性的步骤：
称取泥鳅肉泥，按照固液比1:20加入纯净水，然后用盐酸调pH值至3.0-5.0，在40-50℃下，微波处理20分钟，之后保温30-45min，pH值保持在5.0以下，得到改性泥鳅鱼蛋白溶液；
一次酶解的步骤：
以改性泥鳅鱼蛋白溶液为底物，用盐酸调pH值至3.0-5.0，按照底物质量百分比为2-3％加入复合酶拌匀，然后在40-50℃下，微波处理20分钟，pH值保持在5.0以下；
二次酶解的步骤：
经过第一次酶解处理后，将第一次酶解液降至常温，再次用盐酸调节pH值至3.0-5.0，以改性泥鳅鱼蛋白溶液为底物，按照底物质量百分比为2-3％加入木瓜蛋白酶拌匀，然后在40-50℃下，微波处理20分钟，pH值保持在5.0以下，酶解结束；
灭酶的步骤：
酶解结束后再次启动微波加温至90℃,维持10min，得到灭酶水解液；
分离纯化的步骤：
将灭酶活的水解液降至室温，调pH值至5.0-6.0，采用Sephadex G-25凝胶过滤色谱分离纯化灭酶活的水解液；
高压蒸汽灭菌的步骤：
经分离纯化的水解液在温度为121℃，压力为0.1MPa的条件下高压蒸汽灭菌15min；
浓缩干燥的步骤：
将高压蒸汽灭菌后的水解液调pH值至7.0，进行浓缩低温真空干燥，即得泥鳅鱼降压肽。
进一步地，在蛋白质改性的步骤中，所述用盐酸调pH值至3.5，在45℃下，微波处理。
进一步地，在一次酶解的步骤中，所述复合酶为由胰凝乳蛋白酶、羧肽酶A和胰蛋白酶复合而成的复合酶，所述胰凝乳蛋白酶、羧肽酶A和胰蛋白酶的质量比为1:(2-3):(3-4)。
进一步地，在一次酶解的步骤中，所述用盐酸调pH值至4，在42℃下，微波处理。
进一步地，在二次酶解的步骤中，所述木瓜蛋白酶的活力为6×105U/g。
进一步地，在二次酶解的步骤中，所述用盐酸调pH值至4.5，在48℃下，微波处理。
进一步地，在蛋白质改性的步骤、一次酶解的步骤、二次酶解的步骤中所述微波的频率为2500MHz，功率为15KW。
进一步地，所述分离纯化的步骤具体如下：用pH值为7.0的浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲液平衡凝胶层析柱，柱子尺寸为1.6cm×70cm，填料为葡聚糖凝胶树脂SephadexG-25，流速为1.0mL/min；将灭酶活的水解液溶于所述磷酸盐缓冲液配置成20mg/mL的溶液，上柱，用pH值为7.0浓度为0.02mol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱流速为2mL/min，并用分步收集器收集洗脱液，4mL/管，于256nm下检测吸光值，将属于同一峰的收集液混合，然后进行浓缩。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种复方泥鳅鱼蛋白多肽酒的制备方法，由上述的泥鳅鱼蛋白多肽酿制而成，包括如下步骤：
辅料中药浸提液的步骤：
将罗布麻叶粉碎后，加入4倍量浓度为65％的米酒浸提，在超声波条件下辅助降压功能成分的浸出，浸提液经离心分离制得，罗布麻叶浸提液；
勾兑的步骤：
以浓度为30％米酒为基液，加入25-30％基酒重量的所述泥鳅鱼蛋白多肽以及10-15％基酒重量的罗布麻叶浸提液，搅拌均匀，并密封储存2个月；
双频超波陈化的步骤：
在两种超波频率条件下进行轮流超波陈化处理，第一种超波条件：200W、20kHz的超波20min；第二种超波条件：200W、28kHz的超波20min；共超声2h；
调配检验的步骤：
调整酒精浓度和糖度，储藏，确保酒体清亮透明；然后检验合格后灌装，即得复方泥鳅鱼蛋白多肽酒。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)通过改进泥鳅鱼蛋白多肽的酶解工艺与技术，采用超波辅助酶解技术，制备具有降压活性的多肽，本发明制备的泥鳅鱼降压肽的肽得率高，纯度高，可以作为添加剂或活性药物添加至到人类食品、医药、保健品等多种行业和领域，无疑对延长泥鳅产业链，全面提高泥鳅产业综合效益，实现农业增效农民增收农村繁荣，对推动一带一路建设有重大意义。
(2)本发明整个工艺流程短、时间短，能耗低、污染少、不使用有毒试剂、无污染物排放，达到清洁生产目标。
(3)在控制酶解过程中酶的选择是关键，它不仅影响最后产品的生理功能、原料利用率、反应速度，而且也直接影响产品的风味和物理化学特性。酶的选择、酶解过程的控制是酶解法制备活性肽的关键技术。本发明经过大量试验筛选出复合酶和木瓜蛋白酶来水解泥鳅鱼蛋白，并且筛选出最优的用酶条件，对泥鳅鱼蛋白的酶解效果最好。由于各种酶由于酶作用位点的特异性，对同一底物泥鳅蛋白具有不同的水解能力。胰凝乳蛋白酶、羧肽酶A和胰蛋白酶是一种含内切蛋白酶和外切蛋白酶的复合蛋白酶，它的专一性较弱，能广泛水解多个位点，如Arg-，Lys-，Phe-，Try-。木瓜蛋白酶是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，主要作用位点在Arg-，Lys-，Phe-，X-。因此多位点的切割，使其水解产物的水解度和肽得率都较高。
上述两次酶解产物中富含必需氨基酸色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸、苏氨酸、赖氨酸。值得一提的是，两次酶解产物的必需氨基酸含量均高于FAO/WHO推荐的成人模式，具有较高的营养价值。这是由于不同酶的酶切位点对其酶解产物中氨基酸的组成和数量有重要影响。泥鳅蛋白酶解产物中的必需氨基酸指数均高于原料泥鳅蛋白，即可提高其营养价值。
(4)由本发明Sephadex G-25凝胶层析过滤色谱分离纯化得到的泥鳅鱼蛋白多肽的分子量介于1000-1300Da，该泥鳅鱼蛋白多肽组分降压作用强，研究发现，并非肽分子量越小或越大其降压活性越强，肽的活性也受其氨基酸的组成、排序或肽的空间结构等因素的影响，由本发明纯化得到的分子量介于1000-1300Da泥鳅鱼蛋白多肽其降压活性最强。另外，本发明的分离条件温和、样品回收率高、实验结果重现性高、设备简便经济。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
一种泥鳅鱼蛋白多肽，为分子量介于1000-1300Da的泥鳅鱼降压肽，该泥鳅鱼降压肽釆用微波辅助酶解技术制备而得，该制备方法包括如下步骤：
前处理的步骤：
将鲜活泥鳅鱼用清水静养24h，捞取沥干，去掉头和内脏后，用绞肉机绞成肉泥；
蛋白质改性的步骤：
称取泥鳅肉泥，按照固液比1:20加入纯净水，然后用盐酸调pH值至3.0-5.0，在40-50℃下，微波处理20分钟，微波的频率为2500MHz，功率为15KW；之后保温30-45min，pH值保持在5.0以下，得到改性泥鳅鱼蛋白溶液；优选地，用盐酸调pH值至3.5，在45℃下，微波处理。
一次酶解的步骤：
以改性泥鳅鱼蛋白溶液为底物，用盐酸调pH值至3.0-5.0，按照底物质量百分比为2-3％加入复合酶拌匀，然后在40-50℃下，微波处理20分钟，微波的频率为2500MHz，功率为15KW；pH值保持在5.0以下；复合酶为由胰凝乳蛋白酶、羧肽酶A和胰蛋白酶复合而成的复合酶，胰凝乳蛋白酶、羧肽酶A和胰蛋白酶的质量比为1:(2-3):(3-4)。优选地，用盐酸调pH值至4，在42℃下，微波处理。胰凝乳蛋白酶、羧肽酶A和胰蛋白酶均购自杭州三叶生物化工厂。
二次酶解的步骤：
经过第一次酶解处理后，将第一次酶解液降至常温，再次用盐酸调节pH值至3.0-5.0，以改性泥鳅鱼蛋白溶液为底物，按照底物质量百分比为2-3％加入木瓜蛋白酶拌匀，然后在40-50℃下，微波处理20分钟，微波的频率为2500MHz，功率为15KW；pH值保持在5.0以下，酶解结束；优选地，木瓜蛋白酶的活力为6×105U/g。用盐酸调pH值至4.5，在48℃下，微波处理。木瓜蛋白酶购于江门拜奥生物科技有限公司。
在控制酶解过程中酶的选择是关键，它不仅影响最后产品的生理功能、原料利用率、反应速度，而且也直接影响产品的风味和物理化学特性。酶的选择、酶解过程的控制是酶解法制备活性肽的关键技术。本发明经过大量试验筛选出复合酶和木瓜蛋白酶来水解泥鳅蛋白，并且筛选出最优的用酶条件，对泥鳅鱼蛋白的酶解效果最好。由于各种酶由于酶作用位点的特异性，对同一底物泥鳅蛋白具有不同的水解能力。胰凝乳蛋白酶、羧肽酶A和胰蛋白酶是一种含内切蛋白酶和外切蛋白酶的复合蛋白酶，它的专一性较弱，能广泛水解多个位点，如Arg-，Lys-，Phe-，Try-。木瓜蛋白酶是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，主要作用位点在Arg-，Lys-，Phe-，X-。因此多位点的切割，使其水解产物的水解度和肽得率都较高。
上述两次酶解产物中富含必需氨基酸色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸、苏氨酸、赖氨酸。值得一提的是，两次酶解产物的必需氨基酸含量均高于FAO/WHO推荐的成人模式，具有较高的营养价值。这是由于不同酶的酶切位点对其酶解产物中氨基酸的组成和数量有重要影响。泥鳅蛋白酶解产物中的必需氨基酸指数均高于原料泥鳅蛋白，即可提高其营养价值。
灭酶的步骤：
酶解结束后再次启动微波加温至90℃,维持10min，得到灭酶水解液；
分离纯化的步骤：
将灭酶活的水解液降至室温，调pH值至5.0-6.0，采用Sephadex G-25凝胶过滤色谱分离纯化灭酶活的水解液；分离纯化的步骤具体如下：用pH值为7.0的浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲液平衡凝胶层析柱，柱子尺寸为1.6cm×70cm，填料为葡聚糖凝胶树脂Sephadex G-25，流速为1.0mL/min；将灭酶活的水解液溶于磷酸盐缓冲液配置成20mg/mL的溶液，上柱，用pH值为7.0浓度为0.02mol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱流速为2mL/min，并用分步收集器收集洗脱液，4mL/管，于256nm下检测吸光值，将属于同一峰的收集液混合，然后进行浓缩。
凝胶过滤色谱是利用具网状结构的凝胶的分子筛作用，据被分离物的分子量大小不同来进行分离。当混合肽溶液通过凝胶柱时，由于凝胶含有大量微孔，只允许缓冲液和相对分子质量较小的肽进入其中，而相对分子质量较大的肽却被排阻在凝胶颗粒外部，在填料间隙中流动，比相对分子质量较小的肽更早地被洗脱下来，待分离的肽组分就按不同相对分子质量被筛分开来。
由本发明Sephadex G-25凝胶层析过滤色谱分离纯化得到的泥鳅鱼蛋白多肽的分子量介于1000-1300Da，该泥鳅鱼蛋白多肽组分降压作用强，研究发现，并非肽分子量越小或越大其降压活性越强，肽的活性也受其氨基酸的组成、排序或肽的空间结构等因素的影响，由本发明纯化得到的分子量介于1000-1300Da泥鳅鱼蛋白多肽其降压活性最强。另外，本发明的分离条件温和、样品回收率高、实验结果重现性高、设备简便经济。
高压蒸汽灭菌的步骤：
经分离纯化的水解液在温度为121℃，压力为0.1MPa的条件下高压蒸汽灭菌15min；
杀菌处理是肽类物质在加工过程中的关键环节，恰当的杀菌工艺不仅能杀灭微生物、钝化酶的活性，延长肽类物质的保质时间，另外，还能生成一些特殊的活性物质，对降压作用有一定辅助作用。
浓缩干燥的步骤：
将高压蒸汽灭菌后的水解液调pH值至7.0，进行浓缩低温真空干燥，即得泥鳅鱼降压肽。
一种复方泥鳅鱼蛋白多肽酒的制备方法，由上述的泥鳅鱼蛋白多肽酿制而成，包括如下步骤：
辅料中药浸提液的步骤：
将罗布麻叶粉碎后，加入4倍量浓度为65％的米酒浸提，在超声波条件下辅助降压功能成分的浸出，浸提液经离心分离制得，罗布麻叶浸提液；
勾兑的步骤：
以浓度为30％米酒为基液，加入25-30％基酒重量的泥鳅鱼蛋白多肽以及10-15％基酒重量的罗布麻叶浸提液，搅拌均匀，并密封储存2个月；
双频超波陈化的步骤：
在两种超波频率条件下进行轮流超波陈化处理，第一种超波条件：200W、20kHz的超波20min；第二种超波条件：200W、28kHz的超波20min；共超声2h；
调配检验的步骤：
调整酒精浓度和糖度，储藏，确保酒体清亮透明；然后检验合格后灌装，即得复方泥鳅鱼蛋白多肽酒。
本发明的多肽酒的检测指标包括企标感官与理化指标，如表1-2：
表1 感官要求
表2 检验理化指标
罗布麻叶，学名：A.venetum L.，别称红麻、茶叶花、红柳子等，直立半灌木，高1.5-3米，一般高约2米，最高可达4米，生长于河岸、山沟、山坡的砂质地，在中国淮河、秦岭、昆仑山以北各省(自治区)都有罗布麻分布。其性味甘苦，凉。归肝经。有清火，降压，强心，利尿。用于肝阳眩晕，心悸失眠，浮肿尿少；高血压病等病。泥鳅鱼蛋白多肽与罗布麻叶均有降压的作用，本发明以泥鳅鱼蛋白多肽为主要添加的降压成分，罗布麻叶为辅助添加的降压成分，两者配合使用，能够起到协同增效的作用。
另外，超波陈化采用双频条件下进行陈化，由于双频率的超声波使酒液内部出现两种波的加强点和减弱点，在两种不同波的减弱点处，由于其相对压力较小，因此容易形成不同微小的气泡，而当这些气泡运动到两种不同波的加强点时，由于压力较大，而使这些气泡破裂。在气泡的生成和破裂过程中产生了两种巨大的能量，加速了酒液中各成分分子健的断裂和生成，提高了分子间的有效碰撞率，增强了极性分子间的亲合力，不仅增强了酒精分子与水分子之间的缔合度，而且可能形成更大且牢固的极性分子间的缔合群，从而使酒液中醇类、醛类、酸类以及酯类获得巨大的能量，加速发生聚合、醛化、酸化、酯化以及裂解等一系列复杂反应，令体系中的酯类分子产生，某些酯类及酸类等成分也可能奉与这种缔合群，加速酒液的熟化，使酒在香气、口感上都能更加上乘。
实施例1
一种泥鳅鱼蛋白多肽，为分子量介于1000-1300Da的泥鳅鱼降压肽，该泥鳅鱼降压肽釆用微波辅助酶解技术制备而得，该制备方法包括如下步骤：
前处理的步骤：
将鲜活泥鳅鱼用清水静养24h，捞取沥干，去掉头和内脏后，用绞肉机绞成肉泥；
蛋白质改性的步骤：
称取泥鳅肉泥，按照固液比1:20加入纯净水，然后用盐酸调pH值至3.5，在45℃下，微波处理20分钟，微波的频率为2500MHz，功率为15KW；之后保温40min，pH值保持在5.0以下，得到改性泥鳅鱼蛋白溶液；
一次酶解的步骤：
以改性泥鳅鱼蛋白溶液为底物，用盐酸调pH值至4.0，按照底物质量百分比为2-3％加入复合酶拌匀，然后在42℃下，微波处理20分钟，微波的频率为2500MHz，功率为15KW；pH值保持在5.0以下；复合酶为由胰凝乳蛋白酶、羧肽酶A和胰蛋白酶复合而成的复合酶，胰凝乳蛋白酶、羧肽酶A和胰蛋白酶的质量比为1:3:3。
二次酶解的步骤：
经过第一次酶解处理后，将第一次酶解液降至常温，再次用盐酸调节pH值至4.5，以改性泥鳅鱼蛋白溶液为底物，按照底物质量百分比为2.5％加入木瓜蛋白酶拌匀，然后在48℃下，微波处理20分钟，微波的频率为2500MHz，功率为15KW；pH值保持在5.0以下，酶解结束；
灭酶的步骤：
酶解结束后再次启动微波加温至90℃,维持10min，得到灭酶水解液；
分离纯化的步骤：
将灭酶活的水解液降至室温，用pH值为7.0的浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲液平衡凝胶层析柱，柱子尺寸为1.6cm×70cm，填料为葡聚糖凝胶树脂Sephadex G-25，流速为1.0mL/min；将灭酶活的水解液溶于磷酸盐缓冲液配置成20mg/mL的溶液，上柱，用pH值为7.0浓度为0.02mol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱流速为2mL/min，并用分步收集器收集洗脱液，4mL/管，于256nm下检测吸光值，将属于同一峰的收集液混合，然后进行浓缩。
高压蒸汽灭菌的步骤：
经分离纯化的水解液在温度为121℃，压力为0.1MPa的条件下高压蒸汽灭菌15min；
浓缩干燥的步骤：
将高压蒸汽灭菌后的水解液调pH值至7.0，进行浓缩低温真空干燥，即得泥鳅鱼降压肽。
实施例2
一种泥鳅鱼蛋白多肽，为分子量介于1000-1300Da的泥鳅鱼降压肽，该泥鳅鱼降压肽釆用微波辅助酶解技术制备而得，该制备方法包括如下步骤：
前处理的步骤：
将鲜活泥鳅鱼用清水静养24h，捞取沥干，去掉头和内脏后，用绞肉机绞成肉泥；
蛋白质改性的步骤：
称取泥鳅肉泥，按照固液比1:20加入纯净水，然后用盐酸调pH值至3.0，在40℃下，微波处理20分钟，之后保温30min，pH值保持在5.0以下，得到改性泥鳅鱼蛋白溶液；
一次酶解的步骤：
以改性泥鳅鱼蛋白溶液为底物，用盐酸调pH值至3.0，按照底物质量百分比为2％加入复合酶拌匀，然后在40℃下，微波处理20分钟，pH值保持在5.0以下；
二次酶解的步骤：
经过第一次酶解处理后，将第一次酶解液降至常温，再次用盐酸调节pH值至3.0，以改性泥鳅鱼蛋白溶液为底物，按照底物质量百分比为2％加入木瓜蛋白酶拌匀，然后在40℃下，微波处理20分钟，pH值保持在5.0以下，酶解结束；
灭酶的步骤：
酶解结束后再次启动微波加温至90℃,维持10min，得到灭酶水解液；
分离纯化的步骤：
将灭酶活的水解液降至室温，调pH值至5.0，采用Sephadex G-25凝胶过滤色谱分离纯化灭酶活的水解液；
高压蒸汽灭菌的步骤：
经分离纯化的水解液在温度为121℃，压力为0.1MPa的条件下高压蒸汽灭菌15min；
浓缩干燥的步骤：
将高压蒸汽灭菌后的水解液调pH值至7.0，进行浓缩低温真空干燥，即得泥鳅鱼降压肽。
实施例3
一种泥鳅鱼蛋白多肽，为分子量介于1000-1300Da的泥鳅鱼降压肽，该泥鳅鱼降压肽釆用微波辅助酶解技术制备而得，该制备方法包括如下步骤：
前处理的步骤：
将鲜活泥鳅鱼用清水静养24h，捞取沥干，去掉头和内脏后，用绞肉机绞成肉泥；
蛋白质改性的步骤：
称取泥鳅肉泥，按照固液比1:20加入纯净水，然后用盐酸调pH值至5.0，在50℃下，微波处理20分钟，之后保温45min，pH值保持在5.0以下，得到改性泥鳅鱼蛋白溶液；
一次酶解的步骤：
以改性泥鳅鱼蛋白溶液为底物，用盐酸调pH值至5.0，按照底物质量百分比为3％加入复合酶拌匀，然后在50℃下，微波处理20分钟，pH值保持在5.0以下；
二次酶解的步骤：
经过第一次酶解处理后，将第一次酶解液降至常温，再次用盐酸调节pH值至5.0，以改性泥鳅鱼蛋白溶液为底物，按照底物质量百分比为3％加入木瓜蛋白酶拌匀，然后在50℃下，微波处理20分钟，pH值保持在5.0以下，酶解结束；
灭酶的步骤：
酶解结束后再次启动微波加温至90℃,维持10min，得到灭酶水解液；
分离纯化的步骤：
将灭酶活的水解液降至室温，调pH值至6.0，采用Sephadex G-25凝胶过滤色谱分离纯化灭酶活的水解液；
高压蒸汽灭菌的步骤：
经分离纯化的水解液在温度为121℃，压力为0.1MPa的条件下高压蒸汽灭菌15min；
浓缩干燥的步骤：
将高压蒸汽灭菌后的水解液调pH值至7.0，进行浓缩低温真空干燥，即得泥鳅鱼降压肽。
对比例1
与实施例1的区别在于在一次酶解中，复合酶中胰凝乳蛋白酶、羧肽酶A和胰蛋白酶的质量比不在本发明限定的范围内，即为胰凝乳蛋白酶、羧肽酶A和胰蛋白酶的质量比1:1:1。
对比例2
与实施例1的区别在于去除分离纯化的步骤，其余步骤与参数相同。
实施例4
一种复方泥鳅鱼蛋白多肽酒，由如下步骤制成：
辅料中药浸提液的步骤：
将罗布麻叶粉碎后，加入4倍量浓度为65％的米酒浸提，在超声波条件下辅助降压功能成分的浸出，浸提液经离心分离制得，罗布麻叶浸提液；
勾兑的步骤：
以浓度为30％米酒为基液，加入25-30％基酒重量的泥鳅鱼蛋白多肽以及10-15％基酒重量的罗布麻叶浸提液，搅拌均匀，并密封储存2个月；
双频超波陈化的步骤：
在两种超波频率条件下进行轮流超波陈化处理，第一种超波条件：200W、20kHz的超波20min；第二种超波条件：200W、28kHz的超波20min；共超声2h；
调配检验的步骤：
调整酒精浓度和糖度，储藏，确保酒体清亮透明；然后检验合格后灌装，即得复方泥鳅鱼蛋白多肽酒。
对比例3
与实施例4的区别在于去除辅料中药浸提液的步骤，不添加罗布麻叶浸提液，其余步骤与参数相同。
对比例4
与实施例4的区别在于去除双频超波陈化的步骤，其余步骤与参数相同。
下面，对本发明制备的泥鳅鱼降压肽的肽得率、纯度以及降压作用进行测定与验证。
1、肽得率的测定
采用三氯乙酸(TCA)沉淀法与甲醛滴定法相结合进行测定。取10mL酶解液加10mL20％(g/g)TCA，搅匀静置半小时后在4800r/min下离心10min，所得的上清液记作上清液TCA，分别用凯氏定氮法和甲醛滴定法测定上清液中的总氮含量和氨态氮含量，则肽氮量和肽得率按下式进行计算，结果如表3：
上清液总肽氮量＝上清液TCA总氮量－上清液TCA总氨态氮量，
肽得率＝上清液总肽氮含量/原料总蛋白氮含量×100％。
2、纯度的测定
以牛血清白蛋白(BSA)为标准品，制成不同浓度的BSA溶液。向7支试管中分别加入5mL考马斯亮蓝染色溶液染色5min。以第1支试管中的溶液为空白对照，测定其余6支试管中溶液在595nm处的吸光度。以蛋白质质量浓度(g·L-1)为横坐标，吸光度为纵坐标，进行线性回归分析。得到的线性回归方程为Y＝6.6154X+0.01(r＝0.999)，线性范围为0-100μg。结果表明，线性关系良好，可以用来进行蛋白质含量的测定。分别吸取实施例1-3所得的泥鳅鱼蛋白多肽作为供试品，在595nm处测定吸光度，并根据标准曲线计算蛋白质含量，计算蛋白质质量分数/％，结果如表3。
3、降压作用的验证
降血压肽通过抑制血管紧张素转化酶(ACE)的活性而起到降压作用，以ACE抑制率为指标，观察本发明降血压肽对ACE抑制率的影响，结果如表3。
使用N-(3-(2-呋喃)丙烯醇酰)-2-苯丙氨酰甘氨酸(FAPGG)作为底物，将10μL的ACE溶液(0.25U/mL)和10μL蛋白水解液加入微孔板的微孔中但不混合，然后加入150μL经过预热的底物(用含0.3mol/L NaCl的50mmol/L Tris-HCl，pH7.5配制FAPGG，使其终浓度为1.0mmol/L)使其开始反应。迅速将微孔板放入酶标仪中并加热到37℃，每1min记录1次在340nm波长处的吸光度，共记录20min。空白对照使用10μL的缓冲液(50mmol/L的Tris-HCl，pH7.5，包含0.3mol/L NaCl)代替蛋白水解液。以吸光度(ΔA340nm)对时间做出曲线，计算出斜率，通常取10～20min的斜率来计算。IC50为抑制50％ACE活性时所需酶解样品的质量浓度。
ACE抑制率/％＝(1-ΔA抑制剂/ΔA空白)×100％
表3 泥鳅鱼降压肽的肽得率、纯度以及降压效果
肽得率(％) 纯度(％) ACE抑制率(％)
实施例1 76.89 73.8 78.63
实施例2 75.41 72.1 75.25
实施例3 74.32 70.6 76.85
对比例1 51.12 23.6 57.31
对比例2 35.62 21.8 55.66
实施例4 - - 83.29
对比例3 - - 65.17
对比例4 - - 59.36
本发明实施例1-3制备的泥鳅鱼降压肽的肽得率高，纯度高，可以作为添加剂或活性药物添加至到人类食品、医药、保健品等多种行业和领域，无疑对延长泥鳅产业链，全面提高泥鳅产业综合效益，实现农业增效农民增收农村繁荣，对推动一带一路建设有重大意义。而对比例1-2制备的泥鳅鱼降压肽的肽得率与本发明相比具有较大差异，说明本发明的复合酶中胰凝乳蛋白酶、羧肽酶A和胰蛋白酶的质量比及分离纯化的步骤对整个肽得率高，纯度高影响较大。
实施例4与5的数据说明，本发明泥鳅鱼蛋白多肽与罗布麻叶两者配合使用，能够起到协同增效的作用。不添加罗布麻叶，其ACE抑制率会下降将近20％，也就是说其降压效果也会下降；另外，实施例4与6的数据说明，本泥鳅鱼蛋白多肽与罗布麻叶两者的协同增效作用跟双频超波陈化的步骤有关，去除双频超波陈化的步骤，其降压效果也会下降。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种泥鳅鱼蛋白多肽，其特征在于，为分子量介于1000-1300Da的泥鳅鱼降压肽，该泥鳅鱼降压肽釆用微波辅助酶解技术制备而得，该制备方法包括如下步骤：
前处理的步骤：
将鲜活泥鳅鱼用清水静养24h，捞取沥干，去掉头和内脏后，用绞肉机绞成肉泥；
蛋白质改性的步骤：
称取泥鳅肉泥，按照固液比1:20加入纯净水，然后用盐酸调pH值至3.0-5.0，在40-50℃下，微波处理20分钟，之后保温30-45min，pH值保持在5.0以下，得到改性泥鳅鱼蛋白溶液；
一次酶解的步骤：
以改性泥鳅鱼蛋白溶液为底物，用盐酸调pH值至3.0-5.0，按照底物质量百分比为2-3％加入复合酶拌匀，然后在40-50℃下，微波处理20分钟，pH值保持在5.0以下；
二次酶解的步骤：
经过第一次酶解处理后，将第一次酶解液降至常温，再次用盐酸调节pH值至3.0-5.0，以改性泥鳅鱼蛋白溶液为底物，按照底物质量百分比为2-3％加入木瓜蛋白酶拌匀，然后在40-50℃下，微波处理20分钟，pH值保持在5.0以下，酶解结束；
灭酶的步骤：
酶解结束后再次启动微波加温至90℃,维持10min，得到灭酶水解液；
分离纯化的步骤：
将灭酶活的水解液降至室温，调pH值至5.0-6.0，采用Sephadex G-25凝胶过滤色谱分离纯化灭酶活的水解液；
高压蒸汽灭菌的步骤：
经分离纯化的水解液在温度为121℃，压力为0.1MPa的条件下高压蒸汽灭菌15min；
浓缩干燥的步骤：
将高压蒸汽灭菌后的水解液调pH值至7.0，进行浓缩低温真空干燥，即得泥鳅鱼降压肽。
2.如权利要求1所述的泥鳅鱼蛋白多肽，其特征在于，在蛋白质改性的步骤中，所述用盐酸调pH值至3.5，在45℃下，微波处理。
3.如权利要求1所述的泥鳅鱼蛋白多肽，其特征在于，在一次酶解的步骤中，所述复合酶为由胰凝乳蛋白酶、羧肽酶A和胰蛋白酶复合而成的复合酶，所述胰凝乳蛋白酶、羧肽酶A和胰蛋白酶的质量比为1:(2-3):(3-4)。
4.如权利要求1所述的泥鳅鱼蛋白多肽，其特征在于，在一次酶解的步骤中，所述用盐酸调pH值至4，在42℃下，微波处理。
5.如权利要求1所述的泥鳅鱼蛋白多肽，其特征在于，在二次酶解的步骤中，所述木瓜蛋白酶的活力为6×105U/g。
6.如权利要求1所述的泥鳅鱼蛋白多肽，其特征在于，在二次酶解的步骤中，所述用盐酸调pH值至4.5，在48℃下，微波处理。
7.如权利要求1所述的泥鳅鱼蛋白多肽，其特征在于，在蛋白质改性的步骤、一次酶解的步骤、二次酶解的步骤中所述微波的频率为2500MHz，功率为15KW。
8.如权利要求1所述的泥鳅鱼蛋白多肽，其特征在于，所述分离纯化的步骤具体如下：用pH值为7.0的浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲液平衡凝胶层析柱，柱子尺寸为1.6cm×70cm，填料为葡聚糖凝胶树脂Sephadex G-25，流速为1.0mL/min；将灭酶活的水解液溶于所述磷酸盐缓冲液配置成20mg/m L的溶液，上柱，用pH值为7.0浓度为0.02mol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱流速为2mL/min，并用分步收集器收集洗脱液，4mL/管，于256nm下检测吸光值，将属于同一峰的收集液混合，然后进行浓缩。
9.一种复方泥鳅鱼蛋白多肽酒，其特征在于，由如权利要求1-8任一项所述的泥鳅鱼蛋白多肽酿制而成。
10.如权利要求9所述的复方泥鳅鱼蛋白多肽酒，其特征在于，由如下步骤制备而成：
辅料中药浸提液的步骤：
将罗布麻叶粉碎后，加入4倍量浓度为65％的米酒浸提，在超声波条件下辅助降压功能成分的浸出，浸提液经离心分离制得，罗布麻叶浸提液；
勾兑的步骤：
以浓度为30％米酒为基液，加入25-30％基酒重量的所述泥鳅鱼蛋白多肽以及10-15％基酒重量的罗布麻叶浸提液，搅拌均匀，并密封储存2个月；
双频超波陈化的步骤：
在两种超波频率条件下进行轮流超波陈化处理，第一种超波条件：200W、20kHz的超波20min；第二种超波条件：200W、28kHz的超波20min；共超声2h；
调配检验的步骤：
调整酒精浓度和糖度，储藏，确保酒体清亮透明；然后检验合格后灌装，即得复方泥鳅鱼蛋白多肽酒。
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