CN111670997B

CN111670997B - 增强免疫复合蛋白肽酶解液的制备方法、增强免疫复合蛋白肽饮品及其制备方法

Info

Publication number: CN111670997B
Application number: CN202010593247.4A
Authority: CN
Inventors: 许团辉; 陈璇; 李媛媛; 郑晓辉; 吴奕武; 陈蝶玲
Original assignee: Runke Bioengineering Fujian Co ltd
Current assignee: Runke Bioengineering Fujian Co ltd
Priority date: 2020-06-26
Filing date: 2020-06-26
Publication date: 2023-11-07
Anticipated expiration: 2040-06-26
Also published as: CN111670997A

Abstract

一种增强免疫复合蛋白肽酶解液的制备方法，包括下述步骤：（1）配备原料；（2）植物蛋白酶解液的制备，其中酶解用碱性蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶分两步进行；（3）动物蛋白酶解液的制备，其中酶解用碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶分两步进行；（4）离心；（5）脱色和过滤，得到增强免疫复合蛋白肽酶解液。本发明还提供含有增强免疫复合蛋白肽酶解液的增强免疫复合蛋白肽饮品，以及这种增强免疫复合蛋白肽饮品的一种制备方法。本发明能够使每种蛋白都能够充分得到酶解，并保留活性肽，使所得的复合蛋白肽容易被快速吸收，且具有快速补充营养、提高免疫力的作用；增强免疫复合蛋白肽饮品具有显著的增强免疫效果，且较为可口。

Description

增强免疫复合蛋白肽酶解液的制备方法、增强免疫复合蛋白肽饮品及其制备方法

技术领域

本发明涉及蛋白肽及蛋白肽饮品技术领域，具体涉及一种增强免疫复合蛋白肽酶解液的制备方法，以及含有这种增强免疫复合蛋白肽酶解液的增强免疫复合蛋白肽饮品，及该增强免疫复合蛋白肽饮品的制备方法。

背景技术

免疫活性肽主要是指对人体免疫系统具有调节作用的肽段。免疫活性肽一定程度上可以增强机体的免疫能力，增强巨噬细胞的吞噬能力及淋巴细胞的增殖等多种生理功能，大多数的免疫活性肽具有稳定性强、分子量小、生物活性高和免疫原性弱等优点，可以将其制成各种免疫制剂及增强免疫保健营养品，因而具有广阔的应用前景。来源于植物或动物的食源性蛋白质分子中隐藏的具有生物学活性的氨基酸序列，经适宜的蛋白酶酶解后可被释放出来，从而具有一定的免疫功能，能够表现出增强机体防御、预防疾病、促进健康以及能够调节生理节律等作用。目前已经获得免疫蛋白肽的动植物源蛋白主要有螺旋藻蛋白、小球藻蛋白、鱼皮蛋白、小麦蛋白、香菇蛋白、海参蛋白、绿豆蛋白、大豆蛋白、乳清蛋白等。

螺旋藻(Spirulina) 属于蓝藻门，颤藻科，是一类由单细胞或多细胞组成的螺旋形原核藻类，其蛋白质含量高达60-70%，同时还含有丰富的VA、VB以及矿物质。大量的研究表明，螺旋藻具有补充优质蛋白、维生素和矿物质，缓解疲劳，促进造血母细胞的分化和增殖，促进蛋白合成的作用；具有清除自由基、抗氧化、抗炎症、增强免疫力、促进机体免疫系统功能的作用；具有保护神经组织和DNA免受损伤的作用；具有抗肿瘤作用，抑制肿瘤细胞的生长，并诱导肿瘤细胞凋亡的作用；可提高机体的抗辐射能力。以上各方面的功效已经得到普遍的认可，被广泛用于保健食品和医药开发。目前市场上主要以螺旋藻粉、片剂和胶囊为主，由于螺旋藻溶解性差、腥味浓重，蛋白质稳定性较差，易发生沉淀和变性，进而导致生物活性的丧失，同时蛋白分子量较大，不易于人体的消化吸收等原因，使螺旋藻在保健食品和医药领域的进一步发展受到限制。

胶原蛋白肽是一种透明的浅黄色的胶原蛋白提取物，由二至二十个的氨基酸组成，肽的分子量、氨基酸排列顺序不同所表现的功能会各不相同。胶原蛋白是人体的重要组成部分，是修复受损组织的重要原料物质。胶原蛋白肽具有高含量羟脯氨酸、羟赖氨酸及脯氨酸，易于吸收，能够为皮肤、软骨、韧带及骨骼等机体组织提供营养，维持健康，是很好的营养保健品。补充胶原蛋白的观念深入国人心中几千年，人们通常通过猪蹄、鱼胶、阿胶等来补充胶原蛋白，但由于胶原蛋白结构紧密，消化吸收利用率低，效果较差。胶原蛋白肽不仅具有良好的溶解性、水溶性、增稠性、高生物组织安全性，且热稳定性好，适于在各种液体果汁类、乳类饮料或速溶粉剂中添加生产，同时以其良好的生物活性、优越的组织相容性、低免疫原性、生物可降解性及高物理机械性能等优势，在生物医学、材料工程等方面得到广泛应用。目前研究报道的主要表现为：蛋白质营养效果；提高机体免疫力；抑制血小板凝集作用；保护胃粘膜，防治溃疡作用；缓解关节、筋骨等病痛；抗氧化清除自由基作用；降血压作用；抗肿瘤；促进皮肤胶原新生及代谢作用，延缓肌肤衰老；活化细胞机能；促进矿物质吸收；控制体重等多种生理功能。

牦牛骨中有丰富的胶原蛋白、多糖类物质、酶类物质、骨基质及硫酸软骨素等有机物和钙、磷、钠、镁、铁等矿物质，其中 20-30%为胶原蛋白。牦牛骨胶原蛋白肽能促进成骨细胞增殖，对胆汁分泌、蛋白消化吸收、矿物质吸收氨基酸代谢和脂质代谢、细胞免疫、神经系统、碳代谢及内分泌系统等多种代谢通路交互调控作用，可同时干预多个信号通路，多环节、多靶点和多维度对骨质疏松症的预防、改善有作用。由于胶原蛋白中含有大量的羟脯氨酸，羟脯氨酸与维生素 C 作用能维持羟脯氨酸羟化酶和赖氨酰氧化酶的活性，具有清除自由基的能力和抗氧化能力。

大豆肽通常是以大豆蛋白或者豆粕为基本原料，经过化学处理或生物处理或酶解处理得到的混合低聚肽，通常由3-6个氨基酸组成，富含22种氨基酸，其中包含9种人体必需氨基酸，必需氨基酸含量丰富且平衡。大豆肽具有抗疲劳、迅速补充平衡人体营养素、提升免疫力、增强活力、促进脂肪代谢、增强体力等健康功能，被誉为“超级氨基酸”。大豆肽能够快速补充能量，显著延迟运动时肌肉中蛋白质的分解代谢，提高运动能力。大豆肽中含有一种能够促进多核白细胞吞噬细菌的物质，它能够刺激巨噬细胞吞噬作用，从而提高机体的免疫力并且易于吸收，尤其适合蛋白质消化吸收不佳的群众食用。

绿豆属于豆科植物，不但能够食用而且具备一定的药用功效，绿豆中的营养成分包括蛋白质、淀粉、脂肪、碳水化合物及钙、磷、铁等多种矿物质和维生素。绿豆中的蛋白质含量为19.5-33.1%，绿豆已知的一些药理作用包括清热解毒、降血脂、降胆固醇、抗菌、抗过敏、抗氧化、抗肿瘤、利尿消肿、调节免疫等，具备良好的药用和食用价值。绿豆蛋白肽具有提高人体免疫力的活性，研究发现其能够提高脾脏生成抗体细胞数、半数溶血值和小鼠的淋巴细胞增值力，同时能够促进巨噬细胞吞噬能力。近几年研究发现绿豆蛋白肽不仅含有免疫活性肽，还具有抗氧化活性肽，ACE抑制活性肽等活性肽。

小麦蛋白俗称谷肮粉又名活性面筋粉,是从小麦粉中提取出来的天然蛋白质,小麦蛋白的主要成分是麦醇溶蛋白和麦谷蛋白, 都是富有谷氨酸和脯氨酸的蛋白质。小麦蛋白经过酶解获得的小麦多肽具有良好的乳化功能、起泡功能、吸水功能、增稠功能、粘着功能。小麦谷蛋白的胃蛋白酶水解液中具有阿片活性的肽类物质,其活性能够被纳络酮所逆转,被称为外源性阿片活性肽，阿片活性肽除了具有传统意义上的镇痛作用,还发现它们对心血管功能、呼吸功能、消化功能、免疫、垂体激素分泌、睡眠、记忆等的改善有着重要作用。小麦面筋蛋白中含有外源性阿片活性肽，可显著促进免疫脏器的生长、增进腹腔巨噬细胞吞噬能力、提高血液淋巴细胞转化，并促进肠道的分泌，强化粘膜免疫。麦面筋蛋白中富含谷氨酰胺肽，谷氨酰胺肽是保持肌肉新陈代谢与结构的关键,是淋巴细胞嘧啶和嘌呤核苷酸合成的前体物,是合成核酸的不可缺少的氮源,是蛋白质代谢的重要的调节因子。谷氨酰胺肽是肠粘膜细胞及免疫细胞的快速增殖细胞的重要呼吸燃料,能增强机体的免疫应答,维护肠道的屏障功能,对防止细菌和毒素的易位以及促进肠功能恢复具有重要的意义。

乳清蛋白是酪蛋白沉淀分离后保留在上清液中的多种蛋白质组分的统称。乳清蛋白中主要由β-乳球蛋白（55-60%）、α-乳白蛋白（15-20%），牛血清白蛋白（11%），免疫球蛋白（9%），还少量存在一些其他成分，如乳铁蛋白、脂蛋白、生物活性因子和酶类（乳过氧化物酶）等。乳清蛋白肽具有极高的营养价值及生理保健功能，在促进机体的生长、发育和疾病防治等方面都起着重要的作用，可作为功能性食品或食品添加剂乃至药品应用到人们日常生活中。目前在乳清蛋白中发现的活性肽种类主要有阿片肽、抗高血压肽、抗氧化肽、抗菌肽和免疫调节肽四类。外源性的阿片肽可刺激胰岛素和消化道生长抑素的分泌、调节动物行为、促进肠道吸收水分和电解质、调节消化道运动、刺激摄食、抑制呼吸和调整睡眠模式。乳清蛋白降解产生的多肽在机体免疫调节中发挥着重要的作用，能够刺激小鼠脾脏细胞的增殖，并且酶解产物能明显增加γ-干扰素的分泌。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种增强免疫复合蛋白肽酶解液的制备方法，采用这种增强免疫复合蛋白肽酶解液的制备方法能够使每种蛋白都能够充分得到酶解，并保留活性肽，使所得的复合蛋白肽容易被快速吸收，且具有快速补充营养、提高免疫力的作用；在此基础上提供含有这种增强免疫复合蛋白肽酶解液的增强免疫复合蛋白肽饮品及其制备方法，该增强免疫复合蛋白肽饮品具有显著的增强免疫效果，且较为可口。采用的技术方案如下：

一种增强免疫复合蛋白肽酶解液的制备方法，其特征在于包括下述步骤：

（1）按干重计，配备下述原料：螺旋藻5-18%，大豆分离蛋白3-15%，绿豆分离蛋白2-10%，小麦蛋白2-12%，鳕鱼皮18-32%，牦牛骨24-36%，乳清蛋白5-9%；

（2）植物蛋白酶解液的制备

（2-1）螺旋藻预处理

将螺旋藻粉碎，得到螺旋藻粉；然后将螺旋藻粉与纯化水按1：4-1：8的重量比例混合，并搅拌均匀后进行溶胀（优选以30-50转/分钟的速度进行搅拌；在45-65℃溶胀1-2小时）；再将经过溶胀的螺旋藻粉用高压均质机处理（优选高压均质机压力为40-60MPa，处理20-30分钟），得到预处理料液；

（2-2）植物蛋白酶解

将步骤（2-1）得到的预处理料液加入酶反应釜中，并加入大豆分离蛋白、绿豆分离蛋白和小麦蛋白，然后加入纯化水配置成干物质含量8-22%的料液，再将料液的pH值调节至9.2-9.5；

然后用碱性蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶分两步进行酶解，碱性蛋白酶的用量为料液干重的1-3%，风味蛋白酶的用量为料液干重的0.5-2%，木瓜蛋白酶的用量为料液干重的1-3%；

先加入碱性蛋白酶在47-58℃下酶解2-4小时，然后将酶解液升温至80-90℃灭酶20-30分钟；再将酶解液降温到48-64℃，加入风味蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解3-6小时，然后将酶解液升温至80-90℃灭酶20-30分钟，得到植物蛋白酶解液；

（3）动物蛋白酶解液的制备

（3-1）鳕鱼皮预处理

将鳕鱼皮用水清洗干净，再加入水浸泡5-10分钟，加入碳酸氢钠溶液后再浸泡6-9小时；然后用水清洗干净，加入双氧水脱色3-6小时；再用水清洗干净，加入重量为鳕鱼皮干重的3-5倍的纯化水，用搅碎机将鳕鱼皮搅碎，得到鳕鱼皮浆液；

（3-2）牦牛骨预处理

将牦牛骨用重量百分比浓度为0.2-0.5%的NaCl溶液冲洗，再使用流动清水冲洗，直至无血色；然后将牦牛骨吹干，吹干的牦牛骨经粉碎机粉碎成牦牛骨粉（优选粉碎至能过20目筛）；将牦牛骨粉加入到重量百分比浓度为0.5-1%的EDTA 溶液中，浸泡 24-36小时，完成浸泡后滤除EDTA 溶液，并用清水洗1-3遍；

（3-3）蒸煮

将步骤（3-1）得到的鳕鱼皮浆液和步骤（3-2）得到的牦牛骨粉混合，然后加入到高压灭菌锅中，在110-121℃下蒸煮20-40分钟，得到混合料液；

（3-4）动物蛋白酶解

将步骤（3-3）得到的混合料液和乳清蛋白加入到酶反应釜中，然后加入纯化水配置成干物质含量15-24%的料液，再将料液的pH值调节至9.2-9.5；

然后用碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶分两步进行酶解，碱性蛋白酶的用量为料液干重的1-3%，胰蛋白酶的用量为料液干重的0.5-2%，中性蛋白酶的用量为料液干重的1-3%；

先加入碱性蛋白酶在47-58℃下酶解2-4小时，然后将酶解液升温至80-90℃灭酶20-30分钟；再将酶解液降温到42-55℃，加入胰蛋白酶和中性蛋白酶酶解3-6小时，然后将酶解液升温至80-90℃灭酶20-30分钟，得到动物蛋白酶解液；

（4）离心

将植物蛋白酶解液和动物蛋白酶解液混合后用离心机进行离心，获得上清液；

（5）脱色和过滤

将上清液抽入脱色罐中，进行脱色处理；脱色处理后进行过滤，得到增强免疫复合蛋白肽酶解液。

优选步骤（2-1）中，将螺旋藻粉与纯化水共同加入到不锈钢罐中，不锈钢罐带有搅拌系统和循环水系统；搅拌系统用于对不锈钢罐中的物料进行搅拌；循环水系统使不锈钢罐内部温度保持在45-65℃，进行溶胀。

步骤（2-2）中，通常用氢氧化钠调节料液的pH值。

优选步骤（2-2）中，碱性蛋白酶的活力单位为20-50万单位，木瓜蛋白酶的活力单位为50-80万单位，风味蛋白酶的活力单位为5-10万单位。

碱性蛋白酶是一种丝氨酸型的内切蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，在pH值为5-10时较稳定，对底物有高度专一性，只能水解蛋白质肽链，并对切开点羧基侧具有专一性，具有较强的分解蛋白质的能力。风味蛋白酶为外切酶，和内切酶结合能够获得更多的小分子肽，同时植物蛋白在酶解过程中疏水氨基酸被暴露，会产生大量的苦味，风味蛋白酶可以降低苦味，改善口感。木瓜蛋白酶由木瓜乳胶提取粗制，主要含有木瓜蛋白酶，木瓜凝乳蛋白酶以及溶菌酶，同时还含有少量半胱氨酸蛋白酶、纤维素酶、谷氨酞胺等蛋白酶，木瓜蛋白酶属巯基蛋白酶，可水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端，并能优先水解在肽键的N端具有2个羧基的氨基酸或芳香L氨基酸的肽键；具有耐高温、活性强、稳定性好、蛋白质水解能力强等特性，对PH变化和金属离子及去垢剂不敏感；具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的酶解能力，同时还具有合成的能力，可把蛋白质水解物再合成蛋白质类物质，这种能力可用来改善动植物蛋白的营养价值或功能性质。本发明对植物蛋白采用多种酶分步水解，内切酶和外切酶相结合，使蛋白都能够充分得到水解，并保留活性肽。申请人经过多年的实验室研究和生产实践，通过选择合适种类的酶及其比例、添加顺序，以及酶解工艺条件，使每种植物蛋白都能够充分得到水解，并保留活性肽。其中螺旋藻经过生物酶解获得的小分子肽不但大大提高溶解性，改善了口感，更重要的是获得了高活性的免疫调节肽、抗氧化肽、抗肿瘤肽、降压肽、降糖肽等活性肽，小分子活性肽可被直接快速吸收，提高了消化吸收利用率。

通常，步骤（3-1）中所用的碳酸氢钠溶液和双氧水均为食品级。优选步骤（3-1）中，碳酸氢钠溶液的重量百分比浓度为2-5%。优选步骤（3-1）中，双氧水的重量百分比浓度为3-6%。

步骤（3-2）中，利用EDTA溶液浸泡骨粉，对骨粉进行脱钙处理。通常，步骤（3-2）中所用的EDTA（即乙二胺四乙酸）为食品级。优选步骤（3-2）中，粉碎机功率为30-40kW。优选步骤（3-2）中，在浸泡的过程中以100转/分钟的速度进行搅拌。优选步骤（3-2）中，每 12小时更换一次EDTA溶液。

步骤（3-3）中，可采用功率为14-21.5kW的高压灭菌锅进行蒸煮。步骤（3-3）中，蒸煮时高压灭菌锅内的压力通常为0.1-0.15MPa。通常，步骤（3-3）中，鳕鱼皮浆液和牦牛骨粉混合后，需加适量纯化水后再进行蒸煮，纯化水的用量通常为牦牛骨粉干重的3-8倍。

步骤（3-4）中，通常用氢氧化钠调节料液的pH值。

优选步骤（3-4）中，碱性蛋白酶的活力单位为20-50万单位，胰蛋白酶的活力单位为5-20万单位，中性蛋白酶的活力单位为10-30万单位。

碱性蛋白酶是一种丝氨酸型的内切蛋白酶，稳定好，对底物有高度专一性，并对切开点羧基侧具有专一性，对动物蛋白具有较强的分解蛋白质的能力，能够将动物蛋白水解为较小的蛋白质和肽，有利于进一步水解。中性蛋白酶为细菌源蛋白酶，为一种内切蛋白酶，水解能力强、速度快,水解产物产生苦味少等特点，可分解蛋白质肽链中的肽键，中性蛋白酶同时属于金属酶，Ca²⁺是必不可缺的，Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺对其生成量亦有促进作用，本发明选用的动物蛋白含有高含量的钙和多种有益矿物质，中性蛋白酶不受矿物质抑制，并有利于发挥作用。胰蛋白酶是肽链内切酶，丝氨酸蛋白酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断，是特异性最强的蛋白酶。本发明对动物蛋白采用多种酶分步水解，内切酶和外切酶相结合，使蛋白都能够充分得到水解，并保留活性肽。本发明对动物蛋白采用多种酶分步水解，内切酶和外切酶相结合，使蛋白都能够充分得到水解，并保留活性肽。申请人经过多年的实验室研究和生产实践，通过选择合适种类的酶及其比例、添加顺序，以及酶解工艺条件，使每种动物蛋白都能够充分得到水解，并保留活性肽。

优选步骤（4）中，离心机采用碟式离心机，在转速4000-8000转/分钟的条件下进行离心。碟式离心机功率为4-15kW。

优选步骤（5）中，脱色罐中加入有活性炭和硅藻土，活性炭的用量为上清液的1-3%，硅藻土的用量为上清液的1-3%（优选2%）；以30-50转/分钟的转速进行搅拌，在50-60℃下脱色40-60分钟。更优选步骤（5）中使用的活性炭为植物活性炭，其粒径大小为300-800目≥90%。

优选方案中，步骤（5）中过滤包括下述步骤：

（5-1）将脱色液用板框过滤，获得复合蛋白肽溶液；

（5-2）将复合蛋白肽溶液加入不锈钢储罐中，用管式陶瓷微滤设备进行预处理；

（5-3）超滤：用超滤设备对经步骤（5-2）预处理的复合蛋白肽溶液进行超滤，获得小分子复合蛋白肽溶液；

（5-4）纳滤：对步骤（5-3）获得的小分子复合蛋白肽溶液进行纳滤，得到增强免疫复合蛋白肽酶解液。

步骤（5-1）主要过滤去脱色过程中加入的脱色剂，获得的复合蛋白肽溶液通常为浅黄色至橙红色，且透亮。进一步，步骤（5-1）中，板框过滤所用滤布的材质为尼龙材料，滤布的孔径为1-10微米。

步骤（5-2）用管式陶瓷微滤设备进行预处理，目的在于除去复合蛋白肽溶液中的大分子蛋白、色素分子等大分子物质，以及残留的脱色剂，为超滤做准备。进一步，步骤（5-2）中，管式陶瓷微滤设备所用陶瓷膜过滤滤芯的孔径为0.1-0.2微米。

优选步骤（5-3）中，超滤设备所用膜过滤滤芯允许分子量低于5000-10000Da（道尔顿）的物质通过。

优选步骤（5-4）中，纳滤设备所用膜过滤滤芯允许分子量低于150-300Da的物质通过，进行连续三级纳滤，一级纳滤后的截留液为二级纳滤的料液，二级纳滤的截留液为三级的纳滤的料液；一级纳滤压力为0.35MPa，二级纳滤压力为0.4MPa，三级纳滤压力为0.5MPa。通过连续三级纳滤，通过纳滤膜过滤去除钠等一价阳离子，一级纳滤后的截留液为二级纳滤的料液，二级纳滤的截留液为三级的纳滤的料液，三级纳滤的截留液为所需的增强免疫复合蛋白肽酶解液。三级纳滤大大提高了盐离子去除效率和浓缩效率，避免了蛋白肽长期处理引起的活性降低、变性、变质等情况，同时能够高效浓缩，使复合蛋白肽的含量达到25-30%以上，纳滤不仅很好的保护了复合蛋白肽的活性，大大减少了能源的利用，并且成本仅为降膜浓缩成本的十分之一。

本发明将复合蛋白原料通过前处理并选取适宜的酶在合适条件下分两步酶解，通过离心、脱色、板框过滤获得复合蛋白肽粗酶解液，然后通过陶瓷滤芯过滤前处理去除大分子蛋白、活性炭、色素分子等大分子杂质，再通过5000-10000Da的超滤膜过滤去除较大的肽段，使小于3000Da的小分子肽含量大于90%以上，再通过纳滤膜过滤去除矿物质，去除率达到80%以上，从而使所得的复合蛋白肽具有可被直接吸收，吸收快，易溶解，同时保留复合蛋白中的活性多糖、维生素等活性物质。

一种增强免疫复合蛋白肽饮品，其特征在于含有下述重量配比的组分：增强免疫复合蛋白肽酶解液按蛋白肽含量计6-18％，赤藓糖醇2-8%，蜂蜜2-8%，枸杞提取物0.1-5%，维生素C 0.1-2%，酸枣仁提取物0.2-4%，人参提取物0.02-1%，酵母提取物0.01-3%，菠萝果粉0-5%，百香果果粉0-3%，草莓果粉0-2%，黑莓浓缩果汁0-6%，西柚浓缩果汁0-3%，苹果酸0-0.9%，柠檬酸0-1％,果胶0-0.6%，黄原胶0-0.2%，羧甲基纤维素钠0-0.4%，三氯蔗糖0.005-0.025%，余量为纯化水。

上述赤藓糖醇、蜂蜜、维生素C（即VC）、苹果酸、柠檬酸、果胶、黄原胶、羧甲基纤维素钠、三氯蔗糖均为食品级，枸杞提取物为枸杞10-30倍提取物，酸枣仁提取物为酸枣仁10-30倍提取物，人参提取物为人参10-30倍提取物，酵母提取物为酵母破壁提取物，菠萝果粉为菠萝榨汁喷雾干燥粉，百香果果粉为百香果榨汁喷雾干燥粉，草莓为草莓榨汁喷雾干燥粉，黑莓浓缩果汁为黑莓榨汁浓缩液，西柚浓缩果汁为西柚榨汁浓缩液。

本发明还提供上述增强免疫复合蛋白肽饮品的一种制备方法，其特征在于包括下述步骤：

（1’）按重量计，配备下述原料：增强免疫复合蛋白肽酶解液按蛋白肽含量计6-18％，赤藓糖醇2-8%，蜂蜜2-8%，枸杞提取物0.1-5%，维生素C 0.1-2%，酸枣仁提取物0.2-4%，人参提取物0.02-1%，酵母提取物0.01-3%，菠萝果粉0-5%，百香果果粉0-3%，草莓果粉0-2%，黑莓浓缩果汁0-6%，西柚浓缩果汁0-3%，苹果酸0-0.9%，柠檬酸0-1％,果胶0-0.6%，黄原胶0-0.2%，羧甲基纤维素钠0-0.4%，三氯蔗糖0.005-0.025%，余量为纯化水；

（2’）将步骤（1’）配备的各种原料混合，并搅拌均匀，然后用灌装机分装入棕色玻璃瓶中，得到瓶装增强免疫复合蛋白肽饮品；

（3’）将瓶装增强免疫复合蛋白肽饮品在110-121℃下灭菌15-25分钟。

上述步骤（3’）中，可用高温高压灭菌锅对瓶装增强免疫复合蛋白肽饮品进行灭菌，灭菌后得到增强免疫复合蛋白肽饮品的成品。

人参甘温能补，归脾、肺经、心经，大补元气、宁身益智、益气生津、补虚扶正、延年益寿之功效，可补气生血，养血能补益心气，安神益智。现代医学也证明，人参除了能滋补强身外，在增强免疫力、防癌、抗衰老、治疗胃和肝脏疾病、糖尿病等方面均有疗效。人参皂苷和人参多糖是人参调节免疫功能的活性成分，经过动物实验和人体临床实验观察，能显著增强免疫力。

枸杞中含有丰富的枸杞多糖、β-胡萝卜素、维生素E、硒及黄酮类等，这些物质均有较好的抗氧化作用，枸杞还可以对抗自由基过氧化，减轻自由基过氧化损伤，有助于延缓衰老，延年益寿。枸杞有提高机体免疫力的作用，有补气强精、滋补肝肾、抗衰老、止消渴、暖身体、抗肿瘤的功效。另外枸杞有降低血压、血脂以及血糖的作用，可以防止动脉粥样硬化，保护肝脏，抑制脂肪肝，促进肝细胞的再生。

酸枣仁味甘、酸，归心、肝、胆经，具有养心补肝，宁心安神，敛汗，生津的功效，主治虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗，津伤口渴。《神农本草经》载“酸枣安五脏，轻身延年”。医学上常用它来治疗神经衰弱、心烦失眠、多梦、盗汗、易惊等病，是养心安神的食药，安神效果好。

上述增强免疫复合蛋白肽饮品中，增强免疫复合蛋白肽酶解液含有螺旋藻肽、胶原蛋白肽、牦牛骨肽、大豆肽、绿豆肽、小麦肽、乳清蛋白肽的复合蛋白肽，具有容易被快速吸收，且具有快速补充营养、提高免疫力的作用；同时添加枸杞提取物、酸枣仁提取物、人参提取物等草本精华，以及VC等抗氧化成分，具有显著的增强免疫效果；再辅以菠萝果粉、百香果果粉、草莓果粉、黑莓浓缩果汁、西柚浓缩果汁、苹果酸、柠檬酸等，使饮品口感酸甜可口。

本发明具有如下的技术优点和效果：

本发明通过合适的生物酶解工艺获得含有螺旋藻肽、胶原蛋白肽、牦牛骨肽、大豆肽、绿豆肽、小麦肽、乳清蛋白肽的增强免疫复合蛋白肽酶解液，容易被快速吸收，且具有快速补充营养、提高免疫力的作用。目前市面上蛋白肽饮品主要通过直接购买蛋白肽粉原料后复配为蛋白肽饮品，成本高，且各种蛋白肽品质良莠不齐，质量无法保证，本发明开发出增强免疫复合蛋白肽酶解液的制备方法，不但使蛋白肽的品质得到保证，同时所用蛋白肽不经过干燥制粉大大降低了成本，更多的保留了有益成分的活性。

每种蛋白原料各种氨基酸比例有很大的差异，含有不同的活性肽，选用合适的酶并控制酶解条件，在保证酶解效率的同时能够避免活性肽被酶解。申请人经过多年的实验室研究和生产实践，在每种蛋白原料都进行了合适酶的选择、酶的比例、添加顺序及酶解条件的实验的基础上，开发出专门用于酶解动物蛋白和植物蛋白的酶和酶解工艺，对植物复合蛋白和动物复合蛋白分开进行酶解，从而使每种蛋白都能够充分得到水解，并保留活性肽。

每种酶都有专一的酶解位点，多种蛋白混合酶解可以提高蛋白的利用率，获得更多的活性肽。采用多种酶分步进行酶解，具有多个酶切位点，内切酶和外切酶相结合，相互补充，能够更彻底的酶解，同时采用两步酶解使每种酶都能在适宜的酶解条件下发挥作用，减少酶之间的相互抑制作用，提高酶解效率。

本发明的增强免疫复合蛋白肽饮品中，增强免疫复合蛋白肽酶解液含有螺旋藻肽、胶原蛋白肽、牦牛骨肽、大豆肽、绿豆肽、小麦肽、乳清蛋白肽的复合蛋白肽，具有容易被快速吸收，且具有快速补充营养、提高免疫力的作用；同时添加枸杞提取物、酸枣仁提取物、人参提取物等草本精华，以及VC等抗氧化成分，具有显著的增强免疫效果；再辅以菠萝果粉、百香果果粉、草莓果粉、黑莓浓缩果汁、西柚浓缩果汁、苹果酸、柠檬酸等，使饮品口感酸甜可口。

具体实施方式

实施例1

本实施例中，增强免疫复合蛋白肽酶解液的制备方法包括下述步骤：

（1）按干重计，配备下述原料：螺旋藻12%，大豆分离蛋白10%，绿豆分离蛋白6%，小麦蛋白6%，鳕鱼皮30%，牦牛骨30%，乳清蛋白6%；

（2）植物蛋白酶解液的制备

（2-1）螺旋藻预处理

将螺旋藻粉碎，得到螺旋藻粉；然后将螺旋藻粉与纯化水按1：8的重量比例混合，并搅拌均匀后进行溶胀（以50转/分钟的速度进行搅拌；在50℃溶胀2小时）；再将经过溶胀的螺旋藻粉用高压均质机处理（高压均质机压力为40MPa，处理30分钟），得到预处理料液；

本步骤（2-1）中，将螺旋藻粉与纯化水共同加入到不锈钢罐中，不锈钢罐带有搅拌系统和循环水系统；搅拌系统用于对不锈钢罐中的物料进行搅拌；循环水系统使不锈钢罐内部温度保持在50℃，进行溶胀；

（2-2）植物蛋白酶解

将步骤（2-1）得到的预处理料液加入酶反应釜中，并加入大豆分离蛋白、绿豆分离蛋白和小麦蛋白，然后加入纯化水配置成干物质含量10%的料液，再将料液的pH值调节至9.3（用氢氧化钠调节料液的pH值）；

然后用碱性蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶分两步进行酶解，碱性蛋白酶的用量为料液干重的1.5%（碱性蛋白酶的活力单位为50万单位），风味蛋白酶的用量为料液干重的2%（风味蛋白酶的活力单位为10万单位），木瓜蛋白酶的用量为料液干重的1.5%（木瓜蛋白酶的活力单位为60万单位）；

先加入碱性蛋白酶在49℃下酶解2小时，然后将酶解液升温至90℃灭酶20分钟；再将酶解液降温到52℃，加入风味蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解4小时，然后将酶解液升温至90℃灭酶20分钟，得到植物蛋白酶解液；

（3）动物蛋白酶解液的制备

（3-1）鳕鱼皮预处理

将鳕鱼皮用水清洗干净，再加入水浸泡8分钟，加入碳酸氢钠溶液后再浸泡8小时（碳酸氢钠溶液的重量约为鳕鱼皮干重的6倍）；然后用水清洗干净，加入双氧水脱色6小时（双氧水的重量约为鳕鱼皮干重的6倍）；再用水清洗干净，加入重量为鳕鱼皮干重的4倍的纯化水，用搅碎机将鳕鱼皮搅碎，得到鳕鱼皮浆液；

本步骤（3-1）中，碳酸氢钠溶液的重量百分比浓度为4%，双氧水的重量百分比浓度为5%；

（3-2）牦牛骨预处理

将牦牛骨用重量百分比浓度为0.2%的NaCl溶液冲洗，再使用流动清水冲洗，直至无血色；然后将牦牛骨吹干，吹干的牦牛骨经粉碎机粉碎成牦牛骨粉（粉碎至能过20目筛）；将牦牛骨粉加入到重量百分比浓度为1%的EDTA 溶液中，浸泡 24小时，完成浸泡后滤除EDTA 溶液，并用清水洗2遍；

本步骤（3-2）中所用的EDTA（即乙二胺四乙酸）为食品级；粉碎机功率为40kW；在浸泡的过程中以100转/分钟的速度进行搅拌；每 12小时更换一次EDTA溶液；

（3-3）蒸煮

将步骤（3-1）得到的鳕鱼皮浆液和步骤（3-2）得到的牦牛骨粉混合，然后加入到高压灭菌锅中，在115℃下蒸煮40分钟，得到混合料液；

本步骤（3-3）中，采用功率为15kW的高压灭菌锅进行蒸煮；蒸煮时高压灭菌锅内的压力为0.15MPa。在步骤（3-3）中，鳕鱼皮浆液和牦牛骨粉混合后，加纯化水后再进行蒸煮，纯化水的用量为牦牛骨粉干重的5倍；

（3-4）动物蛋白酶解

将步骤（3-3）得到的混合料液和乳清蛋白加入到酶反应釜中，然后加入纯化水配置成干物质含量16%的料液，再将料液的pH值调节至9.3（用氢氧化钠调节料液的pH值）；

然后用碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶分两步进行酶解，碱性蛋白酶的用量为料液干重的2%（碱性蛋白酶的活力单位为50万单位），胰蛋白酶的用量为料液干重的2%（胰蛋白酶的活力单位为10万单位），中性蛋白酶的用量为料液干重的1.2%（中性蛋白酶的活力单位为20万单位）；

先加入碱性蛋白酶在54℃下酶解3小时，然后将酶解液升温至90℃灭酶20分钟；再将酶解液降温到47℃，加入胰蛋白酶和中性蛋白酶酶解4小时，然后将酶解液升温至90℃灭酶20分钟，得到动物蛋白酶解液；

（4）离心

本步骤（4）中，离心机采用碟式离心机（碟式离心机功率为10kW），在转速6000转/分钟的条件下进行离心；

（5）脱色和过滤

上述步骤（5）中，脱色罐中加入有活性炭（活性炭为植物活性炭，其粒径大小为300-800目≥90%）和硅藻土，活性炭的用量为上清液的2%，硅藻土的用量为上清液的2%；以50转/分钟的转速进行搅拌，在50℃下脱色50分钟。

步骤（5）中过滤包括下述步骤：

（5-1）将脱色液用板框过滤，获得复合蛋白肽溶液；

本步骤（5-1）中，板框过滤所用滤布的材质为尼龙材料，滤布的孔径为5微米；

本步骤（5-2）中，管式陶瓷微滤设备所用陶瓷膜过滤滤芯的孔径为0.2微米；

本步骤（5-3）中，超滤设备所用膜过滤滤芯允许分子量低于5000Da（道尔顿）的物质通过；

步骤（5-4）中，纳滤设备所用膜过滤滤芯允许分子量低于300Da的物质通过，进行连续三级纳滤，一级纳滤后的截留液为二级纳滤的料液，二级纳滤的截留液为三级的纳滤的料液；一级纳滤压力为0.35MPa，二级纳滤压力为0.4MPa，三级纳滤压力为0.5MPa。

上述增强免疫复合蛋白肽酶解液粗蛋白中小于3000D的蛋白肽含量为91.06%。粗蛋白中小于3000Da的蛋白肽含量（%）=小于3000Da百分比-游离氨基酸含量/粗蛋白含量。蛋白肽分子量分布测量方法根据GB 31645~2018食品安全国家标准胶原蛋白肽采用高效体积排阻色谱法测定。游离氨基酸含量用氨基酸分析仪检测。

本实施例的蛋白质提取率为60.1%。蛋白肽提取率（%）=（酶解上清液中总蛋白质含量/原料中总蛋白含量）*100。

本实施例的增强免疫复合蛋白肽饮品含有下述重量配比的组分：以上增强免疫复合蛋白肽酶解液的制备方法制得的增强免疫复合蛋白肽酶解液按蛋白肽含量计14.22%，赤藓糖醇6%，蜂蜜8%，枸杞提取物5%，维生素C 0.1%，酸枣仁提取物2%，人参提取物0.05%，酵母提取物0.02%，百香果果粉0.4%，草莓果粉0.2%，黑莓浓缩果汁1%，西柚浓缩果汁0.4%，苹果酸0.06%，柠檬酸0.06％,果胶0.04%，黄原胶0.1%，羧甲基纤维素钠0.2%，三氯蔗糖0.01%，余量为纯化水。

本实施例中，增强免疫复合蛋白肽饮品的制备方法包括下述步骤：

（1’）按重量计，配备下述原料：以上增强免疫复合蛋白肽酶解液的制备方法制得的增强免疫复合蛋白肽酶解液按蛋白肽含量计14.22%，赤藓糖醇6%，蜂蜜8%，枸杞提取物5%，维生素C 0.1%，酸枣仁提取物2%，人参提取物0.05%，酵母提取物0.02%，百香果果粉0.4%，草莓果粉0.2%，黑莓浓缩果汁1%，西柚浓缩果汁0.4%，苹果酸0.06%，柠檬酸0.06％,果胶0.04%，黄原胶0.1%，羧甲基纤维素钠0.2%，三氯蔗糖0.01%，余量为纯化水；

（2’）将步骤（1’）配备的各种原料混合，并搅拌均匀，然后用灌装机分装入棕色玻璃瓶中（每瓶30毫升），得到瓶装增强免疫复合蛋白肽饮品；

（3’）将瓶装增强免疫复合蛋白肽饮品在112℃下灭菌20分钟。

步骤（3’）中，用高温高压灭菌锅对瓶装增强免疫复合蛋白肽饮品进行灭菌，灭菌后得到增强免疫复合蛋白肽饮品的成品。

上述增强免疫复合蛋白肽饮品为均匀的深褐色液体，蛋白肽含量为14.22%，酸甜可口。选12人品尝，有5人可接受，7人喜欢；随机取30瓶放在恒温恒湿箱中52℃下30天，无变质，颜色无明显变，口感无明显变化。

实施例2

（1）按干重计，配备下述原料：螺旋藻18%，大豆分离蛋白5%，绿豆分离蛋白10%，小麦蛋白10%，鳕鱼皮20%，牦牛骨28%，乳清蛋白9%；

（2）植物蛋白酶解液的制备

（2-1）螺旋藻预处理

将螺旋藻粉碎，得到螺旋藻粉；然后将螺旋藻粉与纯化水按1：6的重量比例混合，并搅拌均匀后进行溶胀（以40转/分钟的速度进行搅拌；在65℃溶胀1.5小时）；再将经过溶胀的螺旋藻粉用高压均质机处理（高压均质机压力为50MPa，处理25分钟），得到预处理料液；

本步骤（2-1）中，将螺旋藻粉与纯化水共同加入到不锈钢罐中，不锈钢罐带有搅拌系统和循环水系统；搅拌系统用于对不锈钢罐中的物料进行搅拌；循环水系统使不锈钢罐内部温度保持在65℃，进行溶胀；

（2-2）植物蛋白酶解

将步骤（2-1）得到的预处理料液加入酶反应釜中，并加入大豆分离蛋白、绿豆分离蛋白和小麦蛋白，然后加入纯化水配置成干物质含量20%的料液，再将料液的pH值调节至9.5（用氢氧化钠调节料液的pH值）；

然后用碱性蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶分两步进行酶解，碱性蛋白酶的用量为料液干重的3%（碱性蛋白酶的活力单位为50万单位），风味蛋白酶的用量为料液干重的1%（风味蛋白酶的活力单位为10万单位），木瓜蛋白酶的用量为料液干重的2%（木瓜蛋白酶的活力单位为60万单位）；

先加入碱性蛋白酶在58℃下酶解3小时，然后将酶解液升温至80℃灭酶30分钟；再将酶解液降温到60℃，加入风味蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解5小时，然后将酶解液升温至80℃灭酶30分钟，得到植物蛋白酶解液；

（3）动物蛋白酶解液的制备

（3-1）鳕鱼皮预处理

将鳕鱼皮用水清洗干净，再加入水浸泡6分钟，加入碳酸氢钠溶液后再浸泡7小时（碳酸氢钠溶液的重量约为鳕鱼皮干重的5倍）；然后用水清洗干净，加入双氧水脱色4小时（双氧水的重量约为鳕鱼皮干重的5倍）；再用水清洗干净，加入重量为鳕鱼皮干重的5倍的纯化水，用搅碎机将鳕鱼皮搅碎，得到鳕鱼皮浆液；

本步骤（3-1）中，碳酸氢钠溶液的重量百分比浓度为5%，双氧水的重量百分比浓度为6%；

（3-2）牦牛骨预处理

将牦牛骨用重量百分比浓度为0.5%的NaCl溶液冲洗，再使用流动清水冲洗，直至无血色；然后将牦牛骨吹干，吹干的牦牛骨经粉碎机粉碎成牦牛骨粉（粉碎至能过20目筛）；将牦牛骨粉加入到重量百分比浓度为0.6%的EDTA 溶液中，浸泡36小时，完成浸泡后滤除EDTA 溶液，并用清水洗1遍；

（3-3）蒸煮

将步骤（3-1）得到的鳕鱼皮浆液和步骤（3-2）得到的牦牛骨粉混合，然后加入到高压灭菌锅中，在121℃下蒸煮25分钟，得到混合料液；

本步骤（3-3）中，采用功率为15kW的高压灭菌锅进行蒸煮；蒸煮时高压灭菌锅内的压力为0.15MPa。在步骤（3-3）中，鳕鱼皮浆液和牦牛骨粉混合后，加纯化水后再进行蒸煮，纯化水的用量为牦牛骨粉干重的8倍；

（3-4）动物蛋白酶解

将步骤（3-3）得到的混合料液和乳清蛋白加入到酶反应釜中，然后加入纯化水配置成干物质含量22%的料液，再将料液的pH值调节至9.5（用氢氧化钠调节料液的pH值）；

然后用碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶分两步进行酶解，碱性蛋白酶的用量为料液干重的3%（碱性蛋白酶的活力单位为50万单位），胰蛋白酶的用量为料液干重的1.5%（胰蛋白酶的活力单位为10万单位），中性蛋白酶的用量为料液干重的3%（中性蛋白酶的活力单位为20万单位）；

先加入碱性蛋白酶在58℃下酶解3.5小时，然后将酶解液升温至80℃灭酶30分钟；再将酶解液降温到55℃，加入胰蛋白酶和中性蛋白酶酶解4小时，然后将酶解液升温至85℃灭酶30分钟，得到动物蛋白酶解液；

（4）离心

本步骤（4）中，离心机采用碟式离心机（碟式离心机功率为15kW），在转速8000转/分钟的条件下进行离心；

（5）脱色和过滤

步骤（5）中，脱色罐中加入有活性炭（活性炭为植物活性炭，其粒径大小为300-800目≥90%）和硅藻土，活性炭的用量为上清液的3%，硅藻土的用量为上清液的1.5%；以40转/分钟的转速进行搅拌，在60℃下脱色40分钟。

步骤（5）中过滤包括下述步骤：

（5-1）将脱色液用板框过滤，获得复合蛋白肽溶液；

本步骤（5-1）中，板框过滤所用滤布的材质为尼龙材料，滤布的孔径为2微米；

本步骤（5-2）中，管式陶瓷微滤设备所用陶瓷膜过滤滤芯的孔径为0.1微米；

步骤（5-4）中，纳滤设备所用膜过滤滤芯允许分子量低于200Da的物质通过，进行连续三级纳滤，一级纳滤后的截留液为二级纳滤的料液，二级纳滤的截留液为三级的纳滤的料液；一级纳滤压力为0.35MPa，二级纳滤压力为0.4MPa，三级纳滤压力为0.5MPa。

上述增强免疫复合蛋白肽酶解液粗蛋白中小于3000Da的小分子蛋白肽含量为92.2%。粗蛋白中小于3000Da的蛋白肽含量（%）=小于3000Da百分比-游离氨基酸含量/粗蛋白。蛋白肽分子量分布测量方法根据GB 31645~2018食品安全国家标准胶原蛋白肽采用高效体积排阻色谱法测定。游离氨基酸含量用氨基酸分析仪检测。

本实施例的蛋白质提取率为60.5%。蛋白肽提取率（%）=（酶解上清液中总蛋白质含量/原料中总蛋白含量）*100。

本实施例的增强免疫复合蛋白肽饮品含有下述重量配比的组分：以上增强免疫复合蛋白肽酶解液的制备方法制得的增强免疫复合蛋白肽酶解液按蛋白肽含量计7.9％，赤藓糖醇6%，蜂蜜8%，枸杞提取物5%，维生素C 0.1%，酸枣仁提取物3%，人参提取物0.6%，酵母提取物0.3%，菠萝果粉4%，草莓果粉2%，黑莓浓缩果汁4%，西柚浓缩果汁2%，苹果酸0.6%，柠檬酸0.3％,果胶0.4%，黄原胶0.1%，羧甲基纤维素钠0.2%，三氯蔗糖0.02%，余量为纯化水。

上述增强免疫复合蛋白肽饮品的制备方法包括下述步骤：

（1’）按重量计，配备下述原料：以上增强免疫复合蛋白肽酶解液的制备方法制得的增强免疫复合蛋白肽酶解液按蛋白肽含量计7.9％，赤藓糖醇6%，蜂蜜8%，枸杞提取物5%，维生素C 0.1%，酸枣仁提取物3%，人参提取物0.6%，酵母提取物0.3%，菠萝果粉4%，草莓果粉2%，黑莓浓缩果汁4%，西柚浓缩果汁2%，苹果酸0.6%，柠檬酸0.3％,果胶0.4%，黄原胶0.1%，羧甲基纤维素钠0.2%，三氯蔗糖0.02%，余量为纯化水；

（3’）将瓶装增强免疫复合蛋白肽饮品在110℃下灭菌20分钟。

上述增强免疫复合蛋白肽饮品为均匀的深褐色液体，蛋白含量为7.9％，酸甜可口。选12人品尝，有3人可接受，9人喜欢；随机取30瓶放在恒温恒湿箱中52℃下30天，无变质，颜色无明显变，口感无明显变化。

实施例3 增强免疫复合蛋白肽酶解液增强免疫力功能试验

以实施例1制得的增强免疫复合蛋白肽酶解液为受试物，进行小鼠增强免疫力功能试验，根据国家卫生和计划生育委员会2013年第7号公告，本发明获得的增强免疫复合蛋白肽酶解液按国家公告可作为普通食品，通常推荐人体摄入量为3-5g /d（按蛋白质含量计）（人体重量以 60 kg计，人体推荐增强免疫复合蛋白肽酶解液摄入量为 0.35 ml/kg.bw/d(按蛋白质含5 g/d计）。具体按照以下步骤进行：

一动物：BALB/c小鼠，雄性，体重18-22g；将小鼠分为六批，每批48只；每批按照体重随机分为4组，每组12只；第一批用于脏器/体重实验；第二批进行抗体生成细胞检测、血清半数溶血值HC50测定；第三批用于二硝基氟苯(DNFB)诱导小鼠迟发性变态反应实验；第四批用于小鼠碳廓清实验；第五批用于做小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验；第六批进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验、NK细胞活性测定。实验小鼠均投喂全价颗粒饲料，自由饮水。

二剂量选择：

设计低、中、高剂量，经口给予每日一次，灌胃量分别为1.4 ml /kg.bw/d，2.8 ml/kg.bw /d，5.6ml /kg.bw /d，按人体重60kg计，为人体推荐剂量的4倍，8倍，16倍（按蛋白质含量计），另设溶剂对照组为蒸馏水5.6 ml/kg.bw /d；实验进行30天。

三数据统计方法

以上指标均用SPSS16.0软件进行统计分析：检测数据先经方差齐性检验，再进行方差分析，如组间差异显著，继续进行多个实验组与一个对照组均数的两两比较；对非正态或方差不齐的数据资料进行适当的变量转化，待满足“正态或齐方差”要求后，用转换所得数据进行统计分析，其中，NK细胞活性测定数据需经Sin-1√p转换，并经方差齐性检验再进行方差分析。

四试验方法

1增重和脏器/体重比值测定：各组小鼠连续灌胃30d时，称重，然后静脉注射空气死亡，取脾脏和胸腺，去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表面血迹，称重，计算脾脏/体重比值和胸腺/体重比值，结果见表1、表2。

2 抗体生成细胞检测(Jerne改良载片法)：各组小鼠连续灌胃25d时，将压积绵羊红细胞(SRBC)用生理盐水配成2％（v/v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2ml进行免疫；5d后，将小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有Hanks液的研磨器内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心(1000转/分)10min，用Hanks液洗2遍，最后将细胞悬浮在8ml RPMI 1640培养液中；将表层培养基(1g琼脂糖加双蒸水至100ml)加热溶解后，放45℃水浴保温，与等量pH值7.2-7.4、2倍浓度的Hanks液混合，分装成小试管，每管0.5ml，再向管内加50μl 10％SRBC(v/v，用SA液配制)，20μl脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片；待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中温育1.5小时，然后用SA缓冲液稀释的补体(1:6)加入到玻片架凹槽内，继续温育1.5小时，计数溶血空斑数；结果如表3所示。

3半数溶血值(HC50)的测定：各组小鼠连续灌胃25d时，将压积SRBC用生理盐水配成2％的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2ml进行免疫；5d后，摘眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min 离心 10min，收集血清；血清用SA缓冲液稀释500倍，取稀释后的血清1ml，依次加入10％SRBC 0.5ml，补体1ml(用SA缓冲液按照1:6稀释)，另设不加血清对照管(用SA缓冲液代替)；置37℃恒温水浴25分钟后终止反应；2000转/分下离心10分钟，取上清液1ml，都氏剂3ml于试管内，同时取10％SRBC(v/v)0.5ml，加都氏剂至4ml于另一试管内，充分混匀，放置10分钟后，于540nm处测定各管光密度值；然后按照下面公式计算HC50值：样品HC50=样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值*稀释倍数，结果如表4所示。

4 二硝基氟苯(DNFB)诱导小鼠迟发性变态反应(耳肿胀法 )

称取 DNFB50 mg，置洁净干燥小瓶中，加预先配好的丙酮麻油溶液 (丙酮：麻油 =1：1)5 mL，密塞后胶布封口，混匀，制得SNFB 溶液 (临用前配制，用 250μL注射器通过瓶盖取用 )。各组小鼠连续灌胃25d时，每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约3cm²，5d后用50μLDNFB溶液均匀涂抹于右耳两面进行攻击，攻击后 24 h，颈椎脱臼处死小鼠，每鼠用打孔器取下直径 8 mm的左、右耳片称重，计算右耳片重量减去左片重量的差值，结果如表5所示。

5 小鼠碳廓清试验

将印度墨汁用生理盐水稀释4倍制成注射用墨，称取1.0Na₂CO₃加蒸馏水至1000ml配置成Na₂CO₃溶液。各组小鼠连续灌胃30d时，每鼠尾静脉注入注射用墨汁(0.1mL/10g.bw),注入后立即计时，于注入后2min、10min分别从内眦静脉丛取血20μl，加到2 ml Na₂CO₃溶液中，用分光光度仪计在600nm波长处测光密度值，以Na₂CO₃溶液作为空白对照。颈椎脱臼处死小鼠，取肝脏、脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。结果以吞噬指数计算入表6所示。

K=（lgOD1-lgOD2）/(t2-t1)

吞噬指数=体重*3√k/(肝重+脾重)

6 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验(半体内法 )

取健康公鸡血，经脱纤维生理盐水洗涤后，用生理盐水配成 20 %(v/v)鸡红细胞悬液。各组小鼠连续灌胃至30d时，每鼠腹腔注射20%（v/v）鸡红细胞悬液1mL,30min后，颈椎脱臼处死小鼠，仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板1min,吸出腹腔洗液1ml，分滴于2片载玻片上，放于垫有湿纱布的搪瓷盒内，移至37℃温箱孵育30min，取出，用生理盐水漂洗去除未贴片的细胞，晾干,以 1:1丙酮甲醇液固定 , 4 %(v/v)Giems磷酸缓冲液染色3min, 再用蒸馏水漂洗晾干，用X40显微镜下观察计数巨噬细胞，每张片计数100个，按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。结果如表7所示。

吞噬百分率（%）=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数*100

吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞数/计数的巨噬细胞数

7 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验(MTT法)：RPMI-1640培养液用微孔滤膜过滤除菌,加入10%小牛血清、1%谷氨酰胺(200mmol/l)、青霉素(100U/ml)、链霉素(100g/l)及2-巯基乙醇5μmol/l)，无菌HCl(1mol/l)或无菌NaOH(1 mol/l)调pH值至7.0-7.2，制成完全培养液；用pH值 7.0-7.4的PBS缓冲液作溶剂，现用现配MTT溶液(5mg/ml)；以3.5 %的无菌NaHCO₃将无菌Hanks液调 pH值至7.2 -7.4；用双蒸水配制成100μg/ml的ConA液，过滤除菌后，-20℃保存；在96mL异丙醇中加入 4mL HCl(1mol/l)制成酸性异丙醇溶液。各组小鼠连续灌胃30d时，小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单个细胞悬液，200目过滤，用无菌 Hanks液多次洗涤，离心后悬浮于2ml完全培养液中,用台盼蓝染色记数活细胞，调整细胞浓度为2×10⁶个/ml，分两孔放入培养孔中，每孔1 ml，一孔加 50μlConA 液，另一孔作为对照，置5 %CO2、37℃培养72 h，培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7ml,再加入0.7 ml不含小牛血清的RPMI-1640培养液，同时加入50μl MTT液，继续培养 4h。培养结束，每孔加入1 mL酸性异丙醇溶液，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，移入1mL比色杯中，用分光光度计，570nm处测定光密度。淋巴细胞增殖能力ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞增殖能力。受试样品的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。结果如表8所示。

8 NK细胞活性测定[乳酸脱氢酶（LHD）测定法]：各组小鼠连续灌胃30d时，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的研磨器内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，用无菌Hanks液洗2次，每次离心10分钟(1000转/分)，最后用RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度为2×10⁷个/ml，取靶细胞和效应细胞各100μl(效靶比50:1)，加入U型96孔培养板；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100μl；上述三项均设3个复孔，于37℃、5％CO₂ 培养箱中培养4小时，然后将96孔培养板于1500转/分钟下离心5分钟，每孔吸取上清液100μl置平底96孔培养板，同时加LDH基质液100μl，反应3分钟，每孔加入1mol/l的盐酸30μl，在酶标仪490nm处测定光密度值OD；然后按照以下公式计算NK细胞活性：NK细胞活性%=（反应孔OD-自然释放孔OD）/（最大释放孔OD-自然释放孔OD）*100。结果如表9所示。

五结果

1增重和脏器/体重比值

表1增强免疫复合蛋白肽酶解液对小鼠体重的影响

组别，ml/kg	动物数，只	初始体重（X±SD，g）	结束体重（X±SD，g）	增重（X±SD，g）
					对照组	12	19.8±0.9	42.5±1.7	22.7±1.9
低剂量	12	20.1±0.6	43.2±1.6	23.1±1.7
					中剂量	12	19.7±1.4	44.8±2.1	25.1±2.6
高剂量	12	20.3±1.2	45.3±2.3	25.0.3±2.1

表2增强免疫复合蛋白肽酶解液对小鼠脏体比的影响

组别，ml/kg	动物数，只	脾脏/体重（X±SD，mg/kg）	胸腺/体重（X±SD，mg/kg）
				对照组	12	2.87±0.35	1.48±0.21
低剂量	12	2.71±0.26	1.59±0.23
				中剂量	12	2.77±0.32	1.78±0.26
高剂量	12	2.64±0.35	1.76±0.31

实验前后小鼠增重及实验结束时脾脏/体重比值和胸腺/体重比值如表1和表2 所示：对实验小鼠饲喂增强免疫复合蛋白肽酶解液随着剂量的增加，小鼠的体重增重量和胸腺/体重有增高的趋势，但与对照组无显著性差异(P＜0.05)；脾脏/体重添加组与对照组的实验前后无显著性差异(P＜0.05)。

2 抗体生成细胞检测

表3增强免疫复合蛋白肽酶解液对抗体生成红细胞数的影响

组别，ml/kg	动物数，只	溶血空斑数，个
			对照组	12	132±28^a
低剂量	12	145±23^a
			中剂量	12	195±19^b
高剂量	12	236±32^b

由表3可知，中、高剂量组小鼠的溶血空斑数显著高于溶剂对照组，差异显著(P＜0.05)。由此证明，本发明的增强免疫复合蛋白肽酶解液对小鼠的抗体生成细胞的生成有促进作用,结果为阳性。

3半数溶血值(HC50)

表4增强免疫复合蛋白肽酶解液对小鼠半数溶血值(HC50)的影响

组别，ml/kg	动物数，只	HC50
			对照组	12	237.6±35.3^a
低剂量	12	268.5±36.9^ab
			中剂量	12	289.2±31.1^b
高剂量	12	309.5±47.8^b

由表4可知，中、高剂量组小鼠的半数溶血值显著高于溶剂对照组，差异显著(P＜0.05，P＜0.01)。由此证明，本发明的增强免疫复合蛋白肽酶解液对小鼠半数溶血值有增高作用，结果为阳性。

4 二硝基氟苯(DNFB)诱导小鼠迟发性变态反应

表5增强免疫复合蛋白肽酶解液对DNFB诱导小鼠迟发性变态反应的影响

组别，ml/kg	动物数，只	耳片重量差值（mg）
			对照组	12	28.3±11.2
低剂量	12	30.8±7.8
			中剂量	12	31.33±9.4
高剂量	12	33.25±13.6

表5结果表明添加各组与对照组的二硝基氟苯(DNFB)诱导小鼠迟发性变态反应的耳片重量差值无显著性差异(P＜0.05)，结果表现为阴性。

5 小鼠碳廓清试验

表6增强免疫复合蛋白肽酶解液对小鼠碳廓清吞噬指数结果的影响

组别，ml/kg	动物数，只	吞噬指数（mg）
			对照组	12	28.3±11.2
低剂量	12	30.8±7.8
			中剂量	12	31.33±9.4
高剂量	12	33.25±13.6

表6结果表明添加各组与对照组的小鼠碳廓清试验吞噬指数无显著性差异(P＜0.05)，结果表现为阴性。

6 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验

表7增强免疫复合蛋白肽酶解液对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞结果的影响

组别，ml/kg	动物数，只	吞噬百分率（%）	吞噬指数
				对照组	12	16.7±3.2a	0.211±0.035^a
低剂量	12	20.5±5.6ab	0.273±0.057^ab
				中剂量	12	30.5±6.1b	0.338±0.043^b
高剂量	12	34.7±8.3b	0.379±0.053^b

表7结果表明中剂量和高剂量组的吞噬百分率和吞噬指数均显著高于对照组 (P＜0.05)，结果表现为阳性。

7 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验

表8增强免疫复合蛋白肽酶解液对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验的影响

组别，ml/kg	动物数，只	淋巴细胞的增值能力（OD差值）
			对照组	12	0.012±0.006^a
低剂量	12	0.012±0.007^a
			中剂量	12	0.017±0.011^ab
高剂量	12	0.027±0.010^b

由表8可知，高剂量组ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力显著高于溶剂对照组，差异显著(P＜0.05)。由此证明，本发明的增强免疫复合蛋白肽酶解液对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化有增强作用，结果表现为阳性。

8 NK细胞活性测定

表9增强免疫复合蛋白肽酶解液对小鼠NK细胞活性的影响

组别，ml/kg	动物数，只	NK细胞活性，%
			对照组	12	12.9±4.9^a
低剂量	12	21.6±8.5^ab
			中剂量	12	44.1±12.2^b
高剂量	12	52.35±13.8^c

由表9可知，中、高剂量组小鼠NK细胞活性显著高于溶剂对照组 (P＜0.05)，其中高剂量组小鼠NK细胞活性极显著高于溶剂对照组(P＜0.01)。由此证明，本发明的增强免疫复合蛋白肽酶解液对NK细胞活性有增强作用，结果表现为阳性。

2018年7月4日，卫健委官网宣布《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)失效，新的《保健食品检验与评价技术规范》尚未公布，2003版随不作为保健食品注册的技术审评依据，但其关于保健食品功能学评价程序与检验方法规范仍然具有参考价值。综上，根据卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)中增强免疫力功能评价标准判定，在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力作用。本发明的增强免疫复合蛋白肽酶解液在体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性结果为阳性，因此，本发明的增强免疫复合蛋白肽酶解液对小鼠有增强免疫力作用。

Claims

1.一种增强免疫复合蛋白肽酶解液的制备方法，其特征在于包括下述步骤：

（2）植物蛋白酶解液的制备

（2-1）螺旋藻预处理

将螺旋藻粉碎，得到螺旋藻粉；然后将螺旋藻粉与纯化水按1：4-1：8的重量比例混合，并搅拌均匀后进行溶胀；再将经过溶胀的螺旋藻粉用高压均质机处理，得到预处理料液；

（2-2）植物蛋白酶解

步骤（2-2）中，碱性蛋白酶的活力单位为20-50万单位，木瓜蛋白酶的活力单位为50-80万单位，风味蛋白酶的活力单位为5-10万单位；

（3）动物蛋白酶解液的制备

（3-1）鳕鱼皮预处理

（3-2）牦牛骨预处理

将牦牛骨用重量百分比浓度为0.2-0.5%的NaCl溶液冲洗，再使用流动清水冲洗，直至无血色；然后将牦牛骨吹干，吹干的牦牛骨经粉碎机粉碎成牦牛骨粉；将牦牛骨粉加入到重量百分比浓度为0.5-1%的EDTA 溶液中，浸泡 24-36小时，完成浸泡后滤除EDTA 溶液，并用清水洗1-3遍；

（3-3）蒸煮

（3-4）动物蛋白酶解

步骤（3-4）中，碱性蛋白酶的活力单位为20-50万单位，胰蛋白酶的活力单位为5-20万单位，中性蛋白酶的活力单位为10-30万单位；

（4）离心

（5）脱色和过滤

2.根据权利要求1所述的增强免疫复合蛋白肽酶解液的制备方法，其特征是：步骤（2-1）中，以30-50转/分钟的速度进行搅拌，在45-65℃溶胀1-2小时；高压均质机压力为40-60MPa，处理20-30分钟。

3.根据权利要求1所述的增强免疫复合蛋白肽酶解液的制备方法，其特征是：步骤（3-1）中所用的碳酸氢钠溶液和双氧水均为食品级；碳酸氢钠溶液的重量百分比浓度为2-5%；双氧水的重量百分比浓度为3-6%。

4. 根据权利要求1所述的增强免疫复合蛋白肽酶解液的制备方法，其特征是：步骤（3-2）中所用的EDTA为食品级；粉碎机功率为30-40kW；在浸泡的过程中以100转/分钟的速度进行搅拌；每 12小时更换一次EDTA溶液。

5.根据权利要求1所述的增强免疫复合蛋白肽酶解液的制备方法，其特征是：步骤（3-3）中，采用功率为14-21.5kW的高压灭菌锅进行蒸煮；蒸煮时高压灭菌锅内的压力为0.1-0.15MPa；

步骤（4）中，离心机采用碟式离心机，在转速4000-8000转/分钟的条件下进行离心；

步骤（5）中，脱色罐中加入有活性炭和硅藻土，活性炭的用量为上清液的1-3%，硅藻土的用量为上清液的1-3%；以30-50转/分钟的转速进行搅拌，在50-60℃下脱色40-60分钟。

6.根据权利要求1所述的增强免疫复合蛋白肽酶解液的制备方法，其特征在于步骤（5）中过滤包括下述步骤：

（5-1）将脱色液用板框过滤，获得复合蛋白肽溶液；

7.根据权利要求6所述的增强免疫复合蛋白肽酶解液的制备方法，其特征在于：

步骤（5-1）中，板框过滤所用滤布的材质为尼龙材料，滤布的孔径为1-10微米；

步骤（5-2）中，管式陶瓷微滤设备所用陶瓷膜过滤滤芯的孔径为0.1-0.2微米；

步骤（5-3）中，超滤设备所用膜过滤滤芯允许分子量低于5000Da的物质通过；

8.一种增强免疫复合蛋白肽饮品，其特征在于含有下述重量配比的组分：权利要求1-7任一项所述的方法制得的增强免疫复合蛋白肽酶解液按蛋白肽含量计6-18％，赤藓糖醇2-8%，蜂蜜2-8%，枸杞提取物0.1-5%，维生素C 0.1-2%，酸枣仁提取物0.2-4%，人参提取物0.02-1%，酵母提取物0.01-3%，菠萝果粉0-5%，百香果果粉0-3%，草莓果粉0-2%，黑莓浓缩果汁0-6%，西柚浓缩果汁0-3%，苹果酸0-0.9%，柠檬酸0-1％,果胶0-0.6%，黄原胶0-0.2%，羧甲基纤维素钠0-0.4%，三氯蔗糖0.005-0.025%，余量为纯化水。

9.一种增强免疫复合蛋白肽饮品的制备方法，其特征在于包括下述步骤：

（1’）按重量计，配备下述原料：权利要求1-7任一项所述的方法制得的增强免疫复合蛋白肽酶解液按蛋白肽含量计6-18％，赤藓糖醇2-8%，蜂蜜2-8%，枸杞提取物0.1-5%，维生素C 0.1-2%，酸枣仁提取物0.2-4%，人参提取物0.02-1%，酵母提取物0.01-3%，菠萝果粉0-5%，百香果果粉0-3%，草莓果粉0-2%，黑莓浓缩果汁0-6%，西柚浓缩果汁0-3%，苹果酸0-0.9%，柠檬酸0-1％,果胶0-0.6%，黄原胶0-0.2%，羧甲基纤维素钠0-0.4%，三氯蔗糖0.005-0.025%，余量为纯化水；