CN101260421A - 一种利用复合蛋白酶水解制备乳清蛋白肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备乳清蛋白肽的方法，包括以下步骤：(1)向乳清蛋白溶液中加入复合蛋白酶进行酶解；(2)灭活复合蛋白酶；(3)将酶解液进行沉淀，取上清液进行离心；(4)取离心后所得到的上清液进行脱色处理后再接着进行脱盐处理；(5)将脱盐处理后的酶解液进行纳滤；(6)浓缩；(7)浓缩后的产物包埋于壁材中；(8)喷雾干燥，即得。本发明应用复合蛋白酶酶解乳清蛋白，有效提高了酶水解度，显著提高了乳清蛋白的利用率，产品收率高，乳清蛋白肽分子量分布范围优，肽含量高，产品质量好。经检测，本发明方法所制备的乳清蛋白肽含量(以干基计)高达75.15％，小于2257道尔顿的肽分子量分布范围可达到98.83％。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物活性短肽的制备方法，尤其涉及一种通过将乳清蛋白进行复合酶解以制备乳清蛋白肽的方法，属于生物化学领域。
背景技术
乳中含有大量不同活性的生物活性肽，这些肽或自然存在于乳中或源于乳蛋白水解后的产物。由于其分子量较小，在小肠内以完整肽段的形式被人体吸收，不会引起人体的免疫排斥反应，且具有多种特殊的生理活性功能。
乳清蛋白经蛋白酶酶解得到小分子乳清蛋白肽，乳清蛋白肽主要是由2～7个氨基酸组成的多肽混合物，是一种多功能营养因子，具有免疫调节、抗血栓、抗高血压、降胆固醇、抗菌等多种生理活性功能，可广泛应用于食品和医药等行业，可制成天然降血压药、患者营养补剂、婴幼儿食品、老年食品、运动食品和各种功能健康食品等。功能性食品是二十一世纪食品工业发展的重点，开发具有多种生理活性功能的乳清蛋白肽具有深远的意义和重要的应用价值。
乳源生物活性肽的研究始于1979年，德国的Brantl等人通过酶解牛乳酪蛋白得到了一些多肽产物，并证明它们具有类吗啡活性，从此人们展开了生物活性肽方面的研究。国外经过近20年的探索，到目前为止，已经发现了多种乳源生物活性肽。国外对乳蛋白来源的ACE抑制肽研究有一定的报道，尤其是日本对来源于乳清蛋白、酪蛋白和酸奶中的ACE抑制肽进行了较多的研究，取得了较大的进展。
国内目前对此方面的研究刚刚起步。国内数所高校进行了乳源生物活性肽的研究，在蛋白酶的选择、酶解工艺等方面取得一定的进展。目前，采用酶解法提取的乳源生物活性肽，应用的蛋白水解酶较为单一，主要有胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等。对于大多数乳蛋白来源的生物活性肽来说，其工业化生产还有一定的难度，主要是因为这些生物活性肽在乳蛋白酶解液中的含量低，分离和提纯难度大，检测手段和技术不够成熟。
目前国内关于复合蛋白酶水解乳清蛋白制取乳清蛋白肽的研究尚未见报道。
发明内容
本发明目的是提供一种新的乳清蛋白肽的制备方法，该方法能够充分的将乳清蛋白水解，乳清蛋白的利用率高，所制得的乳清蛋白肽分子量分布范围优、肽含量高，肽产品质量好，该方法可以进行规模化生产。
本发明目的是通过以下技术方案来实现的：
一种制备乳清蛋白肽的方法，包括以下步骤：(1)向乳清蛋白溶液中加入复合蛋白酶进行酶解；(2)酶解完成后，灭活复合蛋白酶；(3)将酶解液进行沉淀，取上清液进行离心；(4)取离心后的上清液进行脱色处理后再接着进行脱盐处理；(5)将脱盐处理后的酶解液进行纳滤；(6)浓缩；(7)浓缩后的产物包埋于壁材中；(8)喷雾干燥，即得。
为了达到更好的技术效果，步骤(1)中所述乳清蛋白溶液的浓度优选是2.0-8.0wt％，更优选为6.0wt％；另外，将所配制的乳清蛋白溶液进行酶解之前，先按照以下步骤进行预处理：将浓度是2.0-8.0wt％的乳清蛋白溶液在70-100℃温度条件下加热10-20min，然后冷却至30-60℃，调节pH值至5.0-9.0。
优选的，步骤(1)中所述的复合蛋白酶由木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、动物蛋白水解酶、酸性蛋白酶和胃蛋白酶中的任意两种或两种以上所组成；更优选的，由胰蛋白酶与木瓜蛋白酶组成；特别优选的，由胰蛋白酶与木瓜蛋白酶按照1-3∶1的重量比例组成；最优选的，所述的复合蛋白酶由胰蛋白酶与木瓜蛋白酶按照2∶1的重量比例组成。
优选的，步骤(1)中所述的酶解按照以下条件进行：复合蛋白酶的用量为乳清蛋白重量的2.0-8.0wt％，酶解温度30-60℃，酶解时间6-10h，酶解反应体系的pH值控制在5.0-9.0；更优选的，复合蛋白酶的用量为乳清蛋白重量的4.0wt％，酶解温度45℃，酶解时间为7h，酶解反应体系的pH值控制为7.5。
步骤(1)中酶解时间可视具体情况而定，反应时间稍长或稍短对于本发明的实施或效果不构成实质性的影响，本领域技术人员可根据实际情况很容易确定，作为参考，酶解时间最好为3-5h以上，优选为6-10h。
优选的，步骤(2)中所述的灭活复合蛋白酶的方法如下：将乳清蛋白酶解反应体系迅速升温至70℃-100℃并保持10-20min。
步骤(3)中将酶解液优选按照以下方法沉淀未完全酶解的乳清蛋白质大分子：在酶水解液中添加HCl溶液，调整pH至4.3-4.7，加热15-20min。
步骤(3)中将上清液按照以下条件进行离心分离未完全酶解的乳清蛋白沉淀物，得到澄清透明的酶解液：离心转速为4000-5000r/min，离心分离时间为15-20min。
步骤(4)中所述的脱色处理优选按照以下条件进行：采用氢氧化钠溶液将离心后所取上清液的pH调整至6.0-8.0，加入为上清液重量0.5-3.0％的粉末活性炭，在30-50℃条件下进行脱色处理，1.0-3.0h后过滤分离；
步骤(4)中所述的脱盐处理优选按照以下条件进行：经脱色处理的乳清蛋白酶解液，采用浸泡法或过柱法，先经24g/100mL的强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，处理乳清蛋白肽30min，后经24g/100mL的强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂处理乳清蛋白肽30min；
步骤(5)中所述的纳滤优选按照以下条件进行：采用NF-1即截留分子量为2000的纳滤膜，在操作压力0.3-1.0Mpa的条件，截留分离分子量范围小于2000的乳清蛋白肽；
步骤(6)中所述的浓缩优选按照以下条件进行：控制真空度为600-750mmHg，在蒸发温度60-70℃条件下，将乳清蛋白肽溶液浓缩至固形物含量为10-30％；通过真空蒸发浓缩，得到高含量的乳清蛋白肽溶液；
步骤(7)中所述的壁材由多孔淀粉与β-环糊精复合而成。
本发明中所用到的各种原料都可通过商业途径购买得到，例如所用到的胃蛋白酶、胰蛋白酶，动物蛋白水解酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等都可从生物公司购买得到，如Novozymes公司、上海宝丰生化有限公司、南宁庞博生物工程有限公司等。
本发明利用单因素试验和正交试验对复合蛋白酶的水解条件进行优化，建立了pH、酶解温度、酶解时间、酶与底物的比例、底物浓度与酶水解度的关系，得到复合蛋白酶的最佳水解条件为：胰蛋白酶和木瓜蛋白酶比例1-3∶1，复合蛋白酶的用量为乳清蛋白质量的2.0-8.0wt％，底物浓度2.0-8.0wt％，pH 5.0-9.0，在30-60℃条件下酶解6-10h，其最高水解度可以达到46.5％。
在此基础上，本发明又系统优化和筛选了脱色、脱盐、纳滤、真空浓缩、复合微胶囊包埋、喷雾干燥等工艺条件，与前面的复合蛋白酶的水解条件相配套，建立了一套完整的复合蛋白酶提取乳清蛋白肽的方法。
本发明应用二种或二种以上的复合蛋白酶酶解乳清蛋白，制备乳清蛋白肽，有效的提高了酶水解度，显著提高了乳清蛋白的利用率，所制备得到的乳清蛋白肽分子量分布范围优、肽含量高，产品质量好；经检测，本发明方法所制备的乳清蛋白肽含量(以干基计)达75.15％；肽分子量分布范围为：小于2257道尔顿的占98.83％。
本发明方法安全性高，无副作用，所制备得到的乳清蛋白肽主要是由2～7个氨基酸组成的多肽混合物，是一种多功能营养型因子，具有免疫调节、抗血栓、抗高血压、降胆固醇、抗菌等多种生理活性功能，可广泛应用于食品和医药等行业，可制成天然降血压药、患者营养补剂、婴幼儿食品、老年食品、运动食品和各种功能健康食品等。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
一、试验材料
乳清蛋白WPI9000(广州利澳贸易有限公司)；胃蛋白酶120万u/g、胰蛋白酶250万u/g(国药集团化学试剂有限公司)；菠萝蛋白酶85万u/g、动物蛋白水解酶10万u/g(广西南宁庞博生物科技有限公司)，中性蛋白酶200万u/g、木瓜蛋白酶7万u/g(上海宝丰生化有限公司)；酸性蛋白酶5万u/g(无锡市酶制剂厂)。
二、肽分子量分布测定方法
A.1方法提要
采用高效凝胶过滤色谱法测定。即以多孔性填料为固定相，依据样品组分分子体积大小的差别进行分离，在肽键的紫外吸收波长220纳米条件下检测，使用凝胶色谱测定分布的专用数据处理软件(即GPC软件)，对色谱图及其数据进行处理，计算得到多肽的相对分子量大小及分布范围。
A.2仪器
(1)高效液相色谱仪，配有紫外检测器和含有GPC数据处理软件的色谱工作站或积分仪；
(2)流动相真空抽滤脱气装置；
(3)超声波震荡器；
(4)分析天平，感量0.0001g。
A.3试剂
(1)乙晴，色谱纯；
(2)三氟醋酸，分析纯；
(3)水，超纯级或二次蒸馏水；
(4)分子量校正曲线所用标准品：
(a)细胞色素C(cyyochrome，MW 12500)
(b)抑肽酶(aprotinin，MW 6500)
(c)杆菌酶(bacitracin，MW 1450)
(d)乙氨酸-乙氨酸-清氨酸-精氨酸(MW 451)
(e)乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW 189)
A.4色谱条件与系统适应性实验
色谱柱：TSKgel G2000 SWXL 300mm×7.8mm，或性能与此相近的同类型其它适用于测定蛋白质和肽的凝胶柱。
流动相：乙晴∶水∶三氟乙酸，10∶90∶0.1(体积比)
检测波长：UV220nm
流速：0.5ml/min
柱温：30℃
进样体积：10μL
为使色谱系统符合检测要求，规定在上述色谱条件下，凝胶色谱柱的柱效即理论塔板数(N)按三肽标准品(乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸)峰计算不低于10000，肽的分配系数(Kd)应在0～1之间。
A.5分子量校正曲线制作
分别用流动相配制成质量分数为0.1％的上述不同分子量肽标准品溶液，用孔径0.2-0.5μm聚四氟乙烯或尼龙过滤膜过滤后分别进样，得到系列标准品的色谱图。以分子量的对数(lgMV)对保留时间作图或作线性回归，得到分子量校正曲线及其方程。
A.6样品制备
称取样品约20.0mg于10ml容量瓶中，用流动相定容至刻度，超声震荡10min，使样品充分溶解混匀，用孔径为0.2μm——0.5μm聚四氟乙烯或尼龙过滤膜过滤后，上机进样。
A.7分子量分布的计算
将A.5制备的样品溶液在上述色谱条件下分析。然后用GPC数据处理软件，将样品的色谱数据代入校正曲线方程中进行计算，即可得到样品的肽分子量及其分布范围。用峰面积归一法可计得不同分子量范围肽的相对百分比。
表1乳清蛋白肽分子量分布
三、乳清蛋白水解度测定方法
1溶液中可溶性氮的测定方法(微量扩散法)
取乳清蛋白酶解澄清液5ml，加入1g消化催化剂和10ml浓硫酸，在高温下消化至黄绿色后，取出冷却至室温，加水定容。然后取5ml加入到扩散皿的外室，并在扩散皿的内室加入2ml的硼酸溶液，向外室中加入4ml浓NaOH溶液，并迅速盖上盖片。在自然条件放置24h左右后，用标准的盐酸溶液滴定硼酸溶液至紫罗兰色即可。
含氮量N(％)＝(V2-V1)×NH×0.014×稀释倍数/样品重量×100％
注：V1：空白所需盐溶液体积(ml)
V2：滴定待测液耗用标准酸体积(ml)
NH：标准酸当量浓度
0.014 1ml当量氮的克数
2水解度的测定方法——TCA法
取10ml酶解物中加入10mlTCA，在水浴中加热20min，然后在4000r/min转速下离心15min。取上清液，蛋白质总氮和上清液可溶性氮由3.1中方法测得。
注：N1空白试样的含氮量
N2乳清蛋白未经酶解的含氮量
N3乳清蛋白经酶解后的含氮量。
实施例1
称取定量乳清蛋白，水化，配制成6.0wt％乳清蛋白溶液，85℃加热15min，冷却至45℃，调节pH值至7.5；加入复合蛋白酶(该复合蛋白酶由胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按照2∶1的重量比例所组成)，复合蛋白酶用量为乳清蛋白质量的4.0％，45℃恒温条件下，在恒温酶解罐(酶反应装置)中水解；水解过程中不断加入pH调节剂，将pH值恒定在7.5；酶水解7h后，经检测，乳清蛋白的水解度为46.5％；将反应体系乳清蛋白酶水解液迅速升温至90℃并保持20min，使酶失活，控制水解度；在酶水解液中添加HCl溶液，调整pH至4.3-4.7，加热15-20min，沉淀未完全酶解的乳清蛋白质大分子；取酶解上清液，4000-5000r/min，离心分离15-20min，得到澄清透明的上清液；将该上清液pH调整至6.0-8.0，加入为离心上清液重量的0.5-3.0％的粉末活性炭，于30-50℃条件下脱色处理，1.0-3.0h后过滤分离；经脱色处理的乳清蛋白酶解液采用过柱法或浸泡法，先经24g/100mL的强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，处理30min，后经24g/100mL的强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂处理30min，进行脱盐处理；采用NF-1即截留分子量为2000的纳滤膜，操作压力0.3-1.0Mpa，截留分离分子量范围小于2000的乳清蛋白肽；控制真空度为600-750mmHg，温度60-70℃，将乳清蛋白肽溶液浓缩至固形物含量为10-30％；采用多孔淀粉与β-环糊精复合壁材，与乳清蛋白肽均匀混合，30MPa高压均质，将乳清蛋白肽均匀分散于壁材中，进行复合微胶囊包埋稳定化；喷雾干燥，控制进风温度190℃、出风温度95℃、进料流量40ml/min，将均质后的乳化液，经喷雾干燥，得到粉末状乳清蛋白肽。
经检测，本实施例所制备的乳清蛋白肽含量(以干基计)达75.15％；肽分子量分布范围为：小于2257道尔顿的占98.83％。
实施例2
称取定量乳清蛋白，水化，配制成4.0wt％乳清蛋白溶液，85℃加热15min，冷却至56℃，调节pH值至6.0；加入复合蛋白酶(该复合蛋白酶由胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按照3∶1的重量比例所组成)，复合蛋白酶用量为乳清蛋白重量的8.0％，在35℃恒温条件下，在恒温酶解罐(酶反应装置)中水解；水解过程中不断加入pH调节剂，将pH值恒定在6.0；酶水解10h后，经检测，乳清蛋白的水解度为42.5％；将反应体系乳清蛋白酶水解液迅速升温至85℃并保持20min，使酶失活，控制水解度；在酶水解液中添加HCl溶液，调整pH至4.3-4.7，加热15-20min，沉淀未完全酶解的乳清蛋白质大分子；取酶解上清液，4000-5000r/min，离心15-20min，得到澄清透明的上清液；将该上清液pH调整至6.0-7.0，加入上清液重量的0.5-3.0％％的粉末活性炭，于30-50℃条件下进行脱色处理，1.0-3.0h后过滤分离；经脱色处理的乳清蛋白酶解液，采用过柱法或浸泡法，先经24g/100mL的强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，处理30min，后经24g/100mL的强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂处理30min，进行脱盐处理；采用NF-1即截留分子量为2000的纳滤膜，压力0.3-1.0Mpa，截留分离分子量范围小于2000的乳清蛋白肽；控制真空度为600-750mmHg，温度60-70℃，将乳清蛋白肽溶液浓缩至固形物含量为10-30％；采用多孔淀粉与β-环糊精复合壁材，与乳清蛋白肽均匀混合，30MPa压力高压均质，将乳清蛋白肽均匀分散于壁材中，进行复合微胶囊包埋稳定化；喷雾干燥，控制进风温度190℃、出风温度95℃、进料流量40ml/min，将均质后的乳化液，经喷雾干燥，得到粉末状乳清蛋白肽产品。
经检测，本实施例所制备的乳清蛋白肽含量(以干基计)达72.34％；肽分子量分布范围为：小于2257道尔顿的占96.73％。
实施例3
称取定量乳清蛋白，水化，配制成2.0％乳清蛋白溶液，100℃加热10min，冷却至30℃，调节pH值至5.0；加入复合蛋白酶(该复合蛋白酶由胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按照1∶1的重量比例所组成)，复合蛋白酶的加入量为乳清蛋白质量的2.0％，60℃恒温条件下，在恒温酶解罐(酶反应装置)中水解；水解过程中不断加入pH调节剂，将pH值恒定在5.0；酶水解10h后，经检测，乳清蛋白的水解度为41.2％；将反应体系乳清蛋白酶水解液迅速升温至88℃并保持20min，使酶失活，控制水解度；在酶水解液中添加HCl溶液，调整pH至4.3-4.7，加热15-20min，沉淀未完全酶解的乳清蛋白质大分子；取酶解上清液，4000-5000r/min，离心分离15-20min，得到澄清透明的上清液；将该上清液pH调整至6.0-7.0，加入上清液重量0.5-3.0％的粉末活性炭，于30-50℃条件下进行脱色处理，1.0-3.0h后过滤分离；经脱色处理的乳清蛋白酶解液采用过柱法或浸泡法，先经24g/100mL的强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，处理30min，后经24g/100mL的强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂处理30min，进行脱盐处理；采用NF-1即截留分子量为2000的纳滤膜，0.3-1.0Mpa，截留分离分子量范围小于2000的乳清蛋白肽。在真空度600-750mmHg，温度60-70℃条件下，将乳清蛋白肽溶液浓缩至固形物含量为10-30％；采用多孔淀粉与β-环糊精复合壁材，与乳清蛋白肽均匀混合，30MPa压力高压均质，将乳清蛋白肽均匀地分散于壁材中，进行复合微胶囊包埋稳定化；喷雾干燥，控制进风温度190℃、出风温度95℃、进料流量40ml/min，将均质后的乳化液，经喷雾干燥，得到粉末状乳清蛋白肽产品。
经检测，本实施例所制备的乳清蛋白肽含量(以干基计)达73.42％；肽分子量分布范围为：小于2257道尔顿的占95.76％。
实施例4
称取定量乳清蛋白，水化，配制成8.0％乳清蛋白溶液，70℃加热20min，冷却至60℃，调节pH值至9.0；加入复合蛋白酶(该复合蛋白酶由木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶按照1∶1的重量比例所组成)，复合蛋白酶用量为乳清蛋白质量的4.0％，37℃恒温条件下，在恒温酶解罐(酶反应装置)中水解；水解过程中不断加入pH调节剂，将pH值恒定在9.0；酶水解6h后，经检测，乳清蛋白的水解度为34.5％；将反应体系乳清蛋白酶水解液迅速升温至90℃并保持20min，使酶失活，控制水解度；在酶水解液中添加HCl溶液，调整pH至4.3-4.7，加热15-20min，沉淀未完全酶解的乳清蛋白质大分子；取酶解上清液，4000-5000r/min，离心分离15-20min，得到澄清透明的上清液；将该上清液pH调整至6.0-7.0，加入上清液重量0.5-3.0％的粉末活性炭，于30-50℃条件下进行脱色处理，1.0-3.0h后过滤分离；经脱色处理的乳清蛋白酶解液采用过柱法或浸泡法，先经24g/100mL的强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，处理30min，后经24g/100mL的强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂处理30min，进行脱盐处理；采用NF-1即截留分子量为2000的纳滤膜，压力0.3-1.0Mpa，截留分离分子量范围小于2000的乳清蛋白肽。在真空度600-750mmHg，温度60-70℃条件下，将乳清蛋白肽溶液浓缩至固形物含量为10-30％。采用多孔淀粉与β-环糊精复合壁材，与乳清蛋白肽均匀混合，30MPa高压均质，将乳清蛋白肽均匀地分散于壁材中，进行复合微胶囊包埋稳定化。喷雾干燥，控制进风温度190℃、出风温度95℃、进料流量40ml/min，将均质后的乳化液，经喷雾干燥，得到粉末状乳清蛋白肽产品。
经检测，本实施例所制备的乳清蛋白肽含量(以干基计)达66.25％；肽分子量分布范围为：小于2257道尔顿的占90.83％。
实施例5
称取定量乳清蛋白，水化，配制成5.0％乳清蛋白溶液，85℃加热15min，冷却至56℃，调节pH值至7.5；加入复合蛋白酶(该复合蛋白酶由胃蛋白酶和动物蛋白水解酶按照2∶1的重量比例所组成)，复合蛋白酶用量为乳清蛋白质量的4.0％，在45℃恒温条件下，在恒温酶解罐(酶反应装置)中水解；水解过程中不断加入pH调节剂，将pH值恒定在6.0；酶水解10h后，经检测，乳清蛋白的水解度为29.8％；将反应体系乳清蛋白酶水解液迅速升温至85℃并保持20min，使酶失活，控制水解度；在酶水解解液中添加HCl溶液，调整pH至4.3-4.7，加热15-20min，沉淀未完全酶解的乳清蛋白质大分子；取酶解上清液，4000-5000r/min，离心分离15-20min，分离得到澄清透明的上清液；将该上清液pH调整至6.0-7.0，加入上清液重量0.5-3.0％的粉末活性炭，于30-50℃条件下脱色处理，1.0-3.0h后过滤分离；经脱色处理的乳清蛋白酶解液采用过柱法或浸泡法脱盐，先经24g/100mL的强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，处理30min，后经24g/100mL的强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂处理30min；采用NF-1即截留分子量为2000的纳滤膜，压力0.3-1.0Mpa，截留分离分子量范围小于2000的乳清蛋白肽。在真空度600-750mmHg，温度60-70℃条件下，将乳清蛋白肽溶液浓缩至固形物含量为10-30％；采用多孔淀粉与β-环糊精复合壁材，与乳清蛋白肽均匀混合，搅拌后，30MPa压力高压均质，将乳清蛋白肽均匀地分散于壁材中，进行复合微胶囊包埋稳定化；喷雾干燥，控制进风温度190℃、出风温度95℃、进料流量40ml/min，将均质后的乳化液，经喷雾干燥，得到粉末状乳清蛋白肽产品。
经检测，本实施例所制备的乳清蛋白肽含量(以干基计)达62.85％；肽分子量分布范围为：小于2257道尔顿的占84.82％。
实施例6
称取定量乳清蛋白，水化，配制成6.0％乳清蛋白溶液，85℃加热15min，冷却至50℃，调节pH值至7.5；加入复合蛋白酶(该复合蛋白酶由胰蛋白酶和菠萝蛋白酶按照2∶1的重量比例所组成)，复合蛋白酶用量为乳清蛋白质量的6.0％，在37℃恒温条件下，在恒温酶解罐(酶反应装置)中水解；水解过程中不断加入pH调节剂，将pH值恒定在7.5；酶水解7h后，经检测，乳清蛋白的水解度为31.8％；将反应体系乳清蛋白酶水解液迅速升温至90℃并保持20min，使酶失活，控制水解度；在酶水解解液中添加HCl溶液，调整pH至4.3-4.7，加热15-20min，沉淀未完全酶解的乳清蛋白质大分子；取酶解上清液，4000-5000r/min，离心分离15-20min，分离得到澄清透明的上清液；将该上清液pH调整至6.0-7.0，加入上清液重量0.5-3.0％的粉末活性炭，于30-50℃条件下进行脱色处理，1.0-3.0h后过滤分离；经脱色处理的乳清蛋白酶解液采用过柱法或浸泡法脱盐，先经24g/100mL的强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，处理30min，后经24g/100mL的强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂处理30min；采用NF-1即截留分子量为2000的纳滤膜，压力0.3-1.0Mpa，截留分离分子量范围小于2000的乳清蛋白肽。在真空度600-750mmHg，温度60-70℃条件下，将乳清蛋白肽溶液浓缩至固形物含量为10-30％；采用多孔淀粉与β-环糊精复合壁材，与乳清蛋白肽均匀混合，30MPa压力高压均质，将乳清蛋白肽均匀地分散于壁材中，进行复合微胶囊包埋稳定化；喷雾干燥，控制进风温度190℃、出风温度95℃、进料流量40ml/min，将均质后的乳化液，经喷雾干燥，得到粉末状乳清蛋白肽产品。
经检测，本实施例所制备的乳清蛋白肽含量(以干基计)达66.24％；肽分子量分布范围为：小于2257道尔顿的占86.91％。
试验例1蛋白酶的筛选试验
试验选用木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、菠萝蛋白酶、动物蛋白水解酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶等七种蛋白酶。在各种酶的适宜条件下进行酶解，比较分析各种蛋白酶对乳清蛋白的水解度(DH)，结果见表2。
表2不同蛋白酶的水解度
由表2可见，采用胰蛋白酶或木瓜蛋白酶的水解度明显大于其它5种蛋白酶，且两者的水解度相近；现有文献表明，两种或两种以上蛋白酶同时作用底物时，往往具有协同增效作用。所以，本试验采用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶复合酶解乳清蛋白制取乳清蛋白肽。
试验例2胰蛋白酶和木瓜蛋白酶复合酶对乳清蛋白水解的正交试验
单因素试验结果分析：酶解温度和酶解时间对乳清蛋白水解度的影响明显小于其它四个因素(蛋白酶比例，底物浓度，酶比底物值，pH)，所以，酶解温度和酶解时间不作为正交试验因素；根据单因素试验结果确定，酶解温度选择45℃、酶解时间选择7h。
试验以胰蛋白酶与木瓜为试验因素，采用L9(34)正交试验表，对胰蛋白酶与木瓜蛋白酶复合酶酶解乳清蛋白的工艺进行优化研究，其优化工艺结果见表3。
表3正交试验因素设计与结果
通过表2的极差分析可见，各因素对水解度的影响主次顺序为：酶比底物值＞底物浓度＞胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的比例＞pH；胰蛋白酶和木瓜蛋白酶复合酶解乳清蛋白最佳工艺条件是：C1B2A3D3，即酶比底物值4.0％，底物浓度6.0％，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶比例为2∶1，pH为7.5。采用最佳工艺条件(C1B2A3D3)对乳清蛋白进行酶解，其水解度大于正交表中任何一种组合，且水解度为46.5％。
Claims (10)
1、一种利用复合蛋白酶水解制备乳清蛋白肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)向乳清蛋白溶液中加入复合蛋白酶进行酶解；(2)酶解完成后，灭活复合蛋白酶；(3)将酶解液进行沉淀，取上清液进行离心；(4)取离心后所得到的上清液进行脱色处理后再接着进行脱盐处理；(5)将脱盐处理后的酶解液进行纳滤；(6)浓缩；(7)浓缩后的产物包埋于壁材中；(8)喷雾干燥，即得。
2、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(1)将乳清蛋白溶液进行酶解之前，先按照以下步骤进行预处理：将乳清蛋白配成浓度为2.0-8.0wt％的水溶液，在70-100℃温度条件下加热10-20min，然后冷却至30-60℃，调节pH值至5.0-9.0。
3、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的复合蛋白酶由木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、动物蛋白水解酶、酸性蛋白酶和胃蛋白酶中的任意两种或两种以上所组成；优选的，由胰蛋白酶与木瓜蛋白酶组成；优选的，由胰蛋白酶与木瓜蛋白酶按照1-3∶1的重量比例组成；更优选的，所述的复合蛋白酶由胰蛋白酶与木瓜蛋白酶按照2∶1的重量比例组成。
4、按照权利要求1的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的酶解按照以下条件进行：复合蛋白酶的用量为乳清蛋白重量的2.0-10.0wt％，酶解温度30-60℃，酶解时间6-10h，酶解反应体系的pH值控制在5.0-9.0。
5、按照权利要求4的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的酶解按照以下条件进行：复合蛋白酶的用量为乳清蛋白重量的4.0wt％；酶解温度45℃，酶解时间为7h，酶解反应体系的pH值控制为7.5。
6、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(2)中按照以下方法将所述的复合蛋白酶灭活：将乳清蛋白酶解反应体系迅速升温至70℃-100℃并保持10-20min。
7、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(3)中将酶解液按照以下方法沉淀未完全酶解的乳清蛋白质大分子：在酶水解液中添加盐酸溶液，调整pH至4.3-4.7，加热15-20分钟。
8、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的脱色处理按照以下条件进行：采用氢氧化钠溶液将离心后所取上清液的pH调整至6.0-8.0，加入为上清液重量0.5-3.0％的粉末活性炭，在30-50℃条件下进行脱色处理，1.0-3.0小时后过滤分离。
9、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的脱盐处理按照以下条件进行：经脱色处理的乳清蛋白酶解液采用过柱法或浸泡法，先经24g/100mL的强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂处理乳清蛋白肽30分钟后，后经24g/100mL的强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂处理乳清蛋白肽30分钟。
10、按照权利要求1的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的纳滤按照以下条件进行：采用NF-1即截留分子量为2000的纳滤膜，在操作压力0.3-1.0Mpa的条件，截留分离分子量范围小于2000的乳清蛋白肽；步骤(6)中所述的浓缩按照以下条件进行：控制真空度为600-750mmHg，在蒸发温度60-70℃条件下，将乳清蛋白肽溶液浓缩至固形物含量为10-30％；步骤(7)中所述的壁材由多孔淀粉与β-环糊精复合而成。
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