CN106418550B - 一种大豆肽螯合钙的制备方法 - Google Patents
一种大豆肽螯合钙的制备方法 Download PDFInfo
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Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
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Abstract
本发明公开了一种大豆肽螯合钙的制备方法，以大豆分离蛋白为原料，在碱性蛋白酶和中性蛋白酶酶解的过程中利用氢氧化钙溶液调节反应的pH，使酶解过程在规定的pH下反应。酶解后的蛋白溶液经灭酶处理后，通过离心机分离沉淀，将上清液通过0.22μm的微滤膜过滤，滤液用无水乙醇沉淀，离心分离，弃掉上清液，将沉淀物经过冷冻干燥即得到大豆肽‑钙螯合物产品，将大豆肽的制备和钙的螯合由原来的必须首先制备出肽，再加入钙离子进行肽‑钙螯合的两步反应合并为一步完成，且在制备过程中没有钠离子和氯离子的引入，该制备方法简单，易操作，成本低。
Description
技术领域
本发明属于保健食品或食品添加剂制备技术领域，具体涉及一种大豆肽螯合钙的制备方法。
背景技术
钙在人体内具有许多重要生理功能，在人体健康方面发挥重要作用。钙不仅是骨头和牙齿的重要成分，还是细胞分裂和凋亡的信号物质，有助于维持毛细血管和细胞膜中的渗透压，参与肌肉收缩等各种各样的生理活动。钙的缺乏会导致人体发生一系列不利变化，如骨质疏松、营养不良、发育迟缓、免疫能力下降等。
补钙剂发展到今天经历了四个阶段。
第一代补钙产品主要有氧化钙、氯化钙、磷酸钙、碳酸钙等无机盐组成的补钙制剂，必须由胃酸中和并解离成Ca2+才被吸收，强烈刺激胃。并且还需要相关酶类及维生素D才能被消化吸收，吸收利用率低，未消化的钙易停留在肾脏，以难溶盐的形式被排泄，易引起肾结石，有毒副作用。
第二代补钙产品主要有葡萄糖酸钙、乳酸钙、柠檬酸钙等传统的有机酸钙，这类制剂溶解性较好，吸收率优于无机钙，胃肠刺激小含钙量较低，有一定副作用，且Ca2+在胃内易与食物中草酸、植酸等结合，形成草酸钙、植酸钙等沉淀阻碍钙的吸收；例如:醋酸钙急性毒性较大，易导致肾结石、心脏痉挛、血管钙化和软组织钙化症。且第二代补钙产品的吸收利用也依赖体内维生素D，因此，会对钙的吸收产生影响。
第三代补钙产品是以氨基酸螯合钙为代表的新型有机酸钙，由于它是将钙元素嵌合在氨基酸中间，溶解性好，不受食物中植物酸、草酸和胃酸、碱性的影响，直接通过肠道粘膜吸收，有效的提高了钙的吸收利用率。常见的包括氨基酸螯合钙，复合氨基酸螯合钙等。这类补钙制剂的吸收是主动吸收，且属于不饱和吸附状态。氨基酸螯合钙能以螯合物的形式持续解离钙离子供机体利用，实现钙与氨基酸同时补充的目的，但是该补钙制剂与短肽螯合钙相比在吸收与转运机制方面存在缺陷，因为人体吸收蛋白质主要是以短肽的形式吸收的，而不是氨基酸。短肽螯合钙是一种新型的钙螯合物，相比之下，具有比氨基酸螯合钙更易吸收、生物利用度更高的优点。和前两种补钙制剂相比，氨基酸螯合钙虽然有着优良的性能，但它也可能使人体吸收氨基酸比例不协调，给人体带来负氮平衡。
第四代补钙产品为肽-钙螯合物，正受到越来越多的关注 。现有研究报道显示，大豆蛋白，小麦蛋白和牛血清蛋白水解物可以作为钙吸收的促进剂，且这种作用受到肽中氨基酸种类和序列的影响。第四代补钙产品可以使人体同时补充钙与蛋白肽，吸收效果优于第一代、第二代及第三代补钙产品。但其生产工艺还存在诸多问题需要研究解决，例如需要先对蛋白质进行水解得到肽的粗产品，然后对粗肽半成品进行脱盐纯化得到肽产品，再进行肽和钙的螯合反应。
目前肽-钙螯合物的制备方法主要是首先利用蛋白质原料水解制备肽，然后使肽和无机钙发生螯合制备出肽-钙螯合物。CN 101161114B公开了大豆肽-钙复合物的制备方法，该发明以低温脱脂豆粕或大豆分离蛋白为原料，经蛋白酶水解得到大豆肽后再与钙螯合，制备得到大豆肽-钙复合物（螯合物）。CN 103040000 B公开了大豆胜肽-钙螯合物的制备方法，该发明将大豆蛋白经米曲霉、酱油曲霉发酵后得到大豆蛋白水解液，澄清化处理后，加入钙离子，制备得到大豆胜肽-钙螯合物。肖珊等发表了“乳清多肽螯合钙的制备与结构表征”的论文（食品工业科技，2013，34（24）：253-257），是以乳清蛋白为原料，用酶法水解制得乳清多肽，加入钙盐，制备得到乳清多肽螯合钙。敖冉等发表了“胶原多肽螯合钙螯合工艺研究”的论文（食品工业，2016，37（ 3）：27-30），是利用猪皮酶解原液，添加外源钙制剂进行螯合后制得胶原多肽。这些方法操作步骤繁琐，并且在制备肽的过程往往有钠离子和氯离子等盐分引入，增加了产品中灰分的含量，影响了产品的质量和口感。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种大豆肽-钙螯合物制备的新方法，将大豆肽的制备和钙的螯合由原来的必须首先制备出肽，再加入钙离子进行肽-钙螯合的两步反应合并为一步完成，且在制备过程中没有钠离子和氯离子的引入。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种大豆肽螯合钙的制备方法，该制备方法将大豆蛋白的酶水解过程和钙的螯合反应同步进行，具体步骤如下：
（1）原料预处理：将大豆分离蛋白配制成大豆分离蛋白溶液，水浴加热至95℃维持8~10min，使大豆分离蛋白变性，以利于蛋白酶的水解，将变性大豆分离蛋白溶液冷却到35℃~65℃；
（2）酶解：在冷却后的变性大豆分离蛋白溶液中加入氢氧化钙悬浊液，维持体系pH为8~10，加入碱性蛋白酶酶解10～30min，然后，加入氢氧化钙悬浊液控制反应液pH为6~8，加入中性蛋白酶，在35℃~65℃下继续反应10～30min；
（3）灭酶：酶解反应后的溶液水浴加热到95℃灭酶10min，快速冷却到室温，得到大豆蛋白水解液；
（4）离心沉淀：将大豆蛋白水解液离心，得到上清液和沉淀物，其中沉淀物为未反应的大豆蛋白，弃去沉淀物，上清液通过微滤膜，得到滤液；
（5）乙醇沉淀：向滤液中加入无水乙醇使滤液产生沉淀，进行离心分离后初步脱去大豆肽-钙螯合物的水分，收集沉淀物；
（6）干燥：将沉淀物进行真空冷冻干燥，得到干燥的大豆肽螯合钙产品。
所述步骤（1）中大豆分离蛋白溶液的质量分数为10%。
所述步骤（2）中氢氧化钙悬浊液的质量分数为10%。
所述步骤（2）中以底物干基的质量计，碱性蛋白酶的加入量为1~2%，中性蛋白酶的加入量为2~4%。
所述步骤（2）中碱性蛋白酶的酶活力为20万u/g，中性蛋白酶的酶活力为10万u/g。
所述步骤（4）中的微滤膜的孔径为0.22μm。
所述步骤（5）中滤液和无水乙醇的体积比为1:9。
所述步骤（4）和步骤（5）中的离心均是在转速为5000r/min的条件下离心10min。
所述步骤（6）中的真空冷冻干燥条件为冷冻温度-35℃、真空度 30Pa、解吸温度50℃、冷冻时间24h。
本发明的有益效果：本发明提供了一种大豆肽-钙螯合物制备的新方法，将大豆蛋白的酶水解过程和钙的螯合反应同步进行，即将大豆肽的制备和钙的螯合由原来的必须首先制备出肽，再加入钙离子进行肽-钙螯合的两步反应合并为一步完成，且在制备过程中没有钠离子和氯离子的引入，避免了两步法反应中采用氢氧化钠调节大豆蛋白酶解过程中的pH，避免了两步法所制备的大豆肽中含有较高的盐分从而需要对大豆肽产物脱盐的负担以及盐分残留高不易彻底脱除的弊端。另一方面，本专利申请采用一步法利用氢氧化钙中和大豆蛋白水解产生的酸性基团，保持反应溶液处于pH8~10的范围，以适和碱性蛋白酶保持活性的pH条件；同时，加入的钙离子可直接和大豆蛋白水解产生的酸性基团发生螯合，和两步法相比，一步法具有明显的节能降耗效果。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
图2为大豆肽螯合钙的光电子能谱全扫描图。
图3为大豆肽螯合钙中钙离子的光电子能谱图。
图4为柠檬酸脱钙处理制备的大豆肽的高效液相色谱图。
图5为柠檬酸的高效液相色谱图。
图6为大豆肽和大豆肽螯合钙的傅里叶红外光谱图。
图7为大豆肽的核磁共振谱图。
图8为大豆肽螯合钙的核磁共振谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
一种大豆肽螯合钙的制备方法，该制备方法将大豆蛋白的酶水解过程和钙的螯合反应同步进行，本发明的工艺流程如图1所示，具体步骤如下：
（1）原料预处理：称取10.00g 大豆分离蛋白，加去离子水至100.00g，将配置的溶液搅拌均匀，在95℃浴中处理10min使大豆蛋白变性，然后冷却至45℃；
（2）酶解：在冷却后的变性大豆分离蛋白溶液中加入10%（w/w）的氢氧化钙悬浊液，维持体系pH＝8，加入1.5%（以底物干基计）的碱性蛋白酶（酶活力，20万u/g），酶解 20min，然后加入10%（w/w）的氢氧化钙悬浊液控制反应液pH＝6，加入3%（以底物干基计）的中性蛋白酶（酶活力，10万u/g），在45℃下继续反应 20min；
（3）灭酶：酶解反应后的溶液水浴加热到95℃灭酶10min，快速冷却到室温，得到大豆蛋白水解液；
（4）分离：酶解后的反应液5000r/min下离心10min，收集上清液，过0.22μm 微滤膜；
（5）沉淀：收集滤液，加入9倍滤液体积的无水乙醇，沉淀1h，然后5000r /min 下离心10min，弃去上清液，收集沉淀物；
（6）干燥：将沉淀物冷冻干燥24h得到大豆肽螯合钙产品。
实施例2
一种大豆肽螯合钙的制备方法，该制备方法将大豆蛋白的酶水解过程和钙的螯合反应同步进行，具体步骤如下：
（1）原料预处理：称取10.00g 大豆分离蛋白，加去离子水至100.00g，将配置的溶液搅拌均匀，在95℃浴中处理8min使大豆蛋白变性，然后冷却至50℃；
（2）酶解：在冷却后的变性大豆分离蛋白溶液中加入10%（w/w）的氢氧化钙悬浊液，维持体系pH＝9，加入2%（以底物干基计）的碱性蛋白酶（酶活力，20万u/g），酶解 20min，然后加入10%（w/w）的氢氧化钙悬浊液控制反应液pH＝7，加入4%（以底物干基计）的中性蛋白酶（酶活力，10万u/g），在50℃下继续反应 20min；
（3）灭酶：酶解反应后的溶液水浴加热到95℃灭酶10min，快速冷却到室温，得到大豆蛋白水解液；
（4）分离：将大豆蛋白水解液在5000r/min的条件下离心10min，得到上清液和沉淀物，其中沉淀物为未反应的大豆蛋白，弃去沉淀物，上清液通过0.22μm的微滤膜，得到滤液；
（5）沉淀：收集滤液，加入9倍滤液体积的无水乙醇，沉淀1h，然后在5000r /min的条件下离心10min，弃去上清液，收集沉淀物。
（6）干燥：将沉淀物冷冻干燥24h得到大豆肽螯合钙产品。
实施例3
一种大豆肽螯合钙的制备方法，该制备方法将大豆蛋白的酶水解过程和钙的螯合反应同步进行，具体步骤如下：
（1）原料预处理：称取10.00g大豆分离蛋白，加去离子水至100.00g，将配置的溶液搅拌均匀，在95℃浴中处理10min使大豆蛋白变性，然后冷却至60℃；
（2）酶解：在冷却后的变性大豆分离蛋白溶液中加入10%（w/w）的氢氧化钙悬浊液，维持体系pH＝10，加入2%（以底物干基计）的碱性蛋白酶（酶活力，20万u/g），酶解20min，然后，加入10%（w/w）的氢氧化钙悬浊液控制反应液pH＝8，加入4%（以底物干基计）的中性蛋白酶（酶活力，10万u/g），在60℃下继续反应20min；
（3）灭酶：酶解反应后的溶液水浴加热到95℃灭酶10min，快速冷却到室温，得到大豆蛋白水解液；
（4）分离：（4）分离：将大豆蛋白水解液在5000r/min的条件下离心10min，得到上清液和沉淀物，其中沉淀物为未反应的大豆蛋白，弃去沉淀物，上清液通过0.22μm的微滤膜，得到滤液；
（5）沉淀：收集滤液，加入9倍滤液体积的无水乙醇，沉淀1h，然后在5000r /min的条件下离心10min，弃去上清液，收集沉淀物。
（6）干燥：将沉淀物冷冻干燥24h得到大豆肽螯合钙产品。
实施例4
一种大豆肽螯合钙的制备方法，该制备方法将大豆蛋白的酶水解过程和钙的螯合反应同步进行，具体步骤如下：
（1）原料预处理：称取10.00g大豆分离蛋白，加去离子水至100.00g，将配置的溶液搅拌均匀，在95℃浴中处理8min使大豆蛋白变性，然后冷却至35℃；
（2）酶解：在冷却后的变性大豆分离蛋白溶液中加入10%（w/w）的氢氧化钙悬浊液，维持体系pH＝8，加入1%（以底物干基计）的碱性蛋白酶（酶活力，20万u/g），酶解30min，然后，加入1%（w/w）的氢氧化钙悬浊液控制反应液pH＝6，加入2%（以底物干基计）的中性蛋白酶（酶活力，10万u/g），在35℃下继续反应30min；
（3）灭酶：酶解反应后的溶液水浴加热到95℃灭酶10min，快速冷却到室温，得到大豆蛋白水解液；
（4）分离：将大豆蛋白水解液在5000r/min的条件下离心10min，得到上清液和沉淀物，其中沉淀物为未反应的大豆蛋白，弃去沉淀物，上清液通过0.22μm的微滤膜，得到滤液；
（5）沉淀：收集滤液，加入9倍滤液体积的无水乙醇，沉淀1h，然后在5000r /min的条件下离心10min，弃去上清液，收集沉淀物。
（6）干燥：将沉淀物冷冻干燥24h得到大豆肽螯合钙产品。
实施例5
一种大豆肽螯合钙的制备方法，该制备方法将大豆蛋白的酶水解过程和钙的螯合反应同步进行，具体步骤如下：
（1）原料预处理：称取10.00g大豆分离蛋白，加去离子水至100.00g，将配置的溶液搅拌均匀，在95℃浴中处理9min使大豆蛋白变性，然后冷却至65℃；
（2）酶解：在冷却后的变性大豆分离蛋白溶液中加入10%（w/w）的氢氧化钙悬浊液，维持体系pH＝9，加入2%（以底物干基计）的碱性蛋白酶（酶活力，20万u/g），酶解10min，然后，加入10%（w/w）的氢氧化钙悬浊液控制反应液pH＝7，加入4%（以底物干基计）的中性蛋白酶（酶活力，10万u/g），在65℃下继续反应10min；
（3）灭酶：酶解反应后的溶液水浴加热到95℃灭酶10min，快速冷却到室温，得到大豆蛋白水解液；
（4）分离：将大豆蛋白水解液在5000r/min的条件下离心10min，得到上清液和沉淀物，其中沉淀物为未反应的大豆蛋白，弃去沉淀物，上清液通过0.22μm的微滤膜，得到滤液；
（5）沉淀：收集滤液，加入9倍滤液体积的无水乙醇，沉淀1h，然后在5000r /min的条件下离心10min，弃去上清液，收集沉淀物。
（6）干燥：将沉淀物冷冻干燥24h得到大豆肽螯合钙产品。
实施例6
一种大豆肽螯合钙的制备方法，该制备方法将大豆蛋白的酶水解过程和钙的螯合反应同步进行，具体步骤如下：
（1）原料预处理：称取10.00g 大豆分离蛋白，加去离子水至100.00g，将配置的溶液搅拌均匀，在95℃浴中处理10min使大豆蛋白变性，然后冷却至50℃；
（2）酶解：在冷却后的变性大豆分离蛋白溶液中加入10%（w/w）的氢氧化钙悬浊液，维持体系pH＝10，加入1.5%（以底物干基计）的碱性蛋白酶（酶活力，20万u/g），酶解15min，然后，加入10%（w/w）的氢氧化钙悬浊液控制反应液pH＝8，加入3%（以底物干基计）的中性蛋白酶（酶活力，10万u/g），在50℃下继续反应25min；
（3）灭酶：酶解反应后的溶液水浴加热到95℃灭酶10min，快速冷却到室温，得到大豆蛋白水解液；
（4）分离：将大豆蛋白水解液在5000r/min的条件下离心10min，得到上清液和沉淀物，其中沉淀物为未反应的大豆蛋白，弃去沉淀物，上清液通过0.22μm的微滤膜，得到滤液；
（5）沉淀：收集滤液，加入9倍滤液体积的无水乙醇，沉淀1h，然后在5000r /min的条件下离心10min，弃去上清液，收集沉淀物。
（6）干燥：将沉淀物冷冻干燥24h得到大豆肽螯合钙产品。
（一）大豆肽螯合钙中肽含量标准曲线的绘制
用凯氏定氮法测定按照基本条件（大豆分离蛋白浓度10.00%，混合液总重100.00g，加酶量（碱性蛋白酶：中性蛋白酶为1:2）为5%（以底物干基计），反应过程中料液pH8.00，反应过程中料液温度45℃，反应时间30min。）所制备产品的蛋白质含量，将该产品分别配置成蛋白浓度为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8和3.2g/L的溶液。用双缩脲法测定其吸光度，作出标准曲线。
（二）大豆肽螯合钙中钙含量的测定方法
称取一定量的大豆肽螯合钙产品，将其溶解在去离子水中，取1mL溶液用双缩脲法测定其中肽含量。另取1mL溶液，用原子吸收法测定沉淀物中钙含量。
本发明制备的大豆肽螯合钙产品的X射线光电子能谱全扫描如图2所示，结果显示其中含有一定量的钙。对大豆肽钙螯合物中钙的电子能进行分峰软件的处理结果如图3所示。其结果显示，大豆肽螯合钙中的Ca P3/2电子结合能分别为346.70 v、347.17 ev和347.70ev。根据国家标准与技术研究所（NIST）的数据和学者研究可知，Ca P3/2电子结合能在346.7 eV 和347.0 eV之间时，钙可能以Ca-O形式结合。Ca P3/2电子结合能为347.4ev时，钙可能以Ca-OOCH形式结合。Ca P3/2电子结合能为347.7ev时，钙可能以Ca=O形式结合。由此推测，本发明制备的大豆肽螯合钙产品中的钙分别以Ca-O、Ca-OOCH、Ca=O三种结合形式存在。
为了对本发明大豆肽螯合钙产品和未结合钙的大豆肽进行傅里叶红外光谱特征吸收峰及核磁共振氢谱的对比分析，我们对制备的肽-钙螯合物产品进行柠檬酸脱钙处理，得到脱除钙离子的大豆肽样品。对经柠檬酸处理后得到的大豆肽，通过加入无水乙醇除去残留柠檬酸，利用高效液相色谱法检测其中是否残留有柠檬酸，具体步骤如下。
取5g大豆肽螯合钙产品，加入245g去离子水调配成2%（w/w）的溶液，加入11mL左右的 1mol/L柠檬酸。此时加入的柠檬酸为过量，可以将肽-钙螯合物中的钙全部形成柠檬酸钙沉淀析出。溶液在65℃下真空浓缩到30ml左右，提高浓度有利于螯合形式的钙全部形成柠檬酸钙沉淀析出，微滤膜（0.22μm）过滤，除去柠檬酸钙沉淀。
取滤液10mL，加入9倍于滤液体积的无水乙醇，5000r/min离心10min，样品分为固液两相，沉淀物为脱除钙离子后的大豆肽，液体部分为乙醇溶液。残留的柠檬酸存在于乙醇溶液中，无水乙醇洗涤沉淀物3次，去除上清液，即可除去柠檬酸。将该沉淀物冷冻干燥后可以得到脱除钙离子的大豆肽样品。该大豆肽样品的高效液相色谱如图4所示，而柠檬酸的高效液相色谱如图5所示。结果显示，该大豆肽样品中未检出柠檬酸的残留。火焰原子吸收检测大豆肽样品中的钙含量≤0.5%。凯氏定氮检测该大豆肽样品中肽含量 ≥ 90%。
采用傅里叶红外光谱对脱除钙离子后的大豆肽样品及制备的大豆肽螯合钙产品进行分析，如图6所示。结果显示，在特征区内，大豆肽样品的-NH2吸收峰为3302cm-1，而大豆肽螯合钙的-NH2吸收峰红移到3323cm-1。在指纹区内，大豆肽样品的C=O吸收峰为1624cm-1，而大豆肽螯合钙的C=O吸收峰红移到1643cm-1；大豆肽样品的-COOH吸收峰为1385cm-1，大豆肽螯合钙的-COOH吸收峰红移到1414cm-1。这说明制备的大豆肽螯合钙产品和脱除钙后的大豆肽样品为两种物质。大豆肽螯合钙产品中，钙和肽分子内的-COOH、-NH2 发生了某种结合。
采用核磁共振对脱除钙离子后的大豆肽样品及制备的大豆肽螯合钙产品进行分析，如图7和图8所示。结果显示，大豆肽样品活泼氢的积分面积比值为7.76，大豆肽螯合钙活泼氢积分面积比值为0.64。表明在大豆肽螯合钙产品中，由于活泼氢基团和钙的结合导致了活泼氢个数显著下降。而大豆肽分子中的-COOH和-NH2基团中含有活泼氢。可以推测，钙和大豆肽的螯合反应可能发生在-COOH 和-NH2等活泼氢基团的位置上。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (7)
1.一种大豆肽螯合钙的制备方法，其特征在于：该制备方法将大豆蛋白的酶水解过程和钙的螯合反应同步进行，具体步骤如下：
（1）原料预处理：将大豆分离蛋白配制成大豆分离蛋白溶液，水浴加热至95℃维持8~10min，使大豆分离蛋白变性，以利于蛋白酶的水解，将变性大豆分离蛋白溶液冷却到35℃~65℃；
（2）酶解：在冷却后的变性大豆分离蛋白溶液中加入氢氧化钙悬浊液，维持体系pH为8~10，加入碱性蛋白酶酶解10～30min，然后，加入氢氧化钙悬浊液控制反应液pH为6~8，加入中性蛋白酶，在35℃~65℃下继续反应10～30min；
（3）灭酶：酶解反应后的溶液水浴加热到95℃灭酶10min，快速冷却到室温，得到大豆蛋白水解液；
（4）离心沉淀：将大豆蛋白水解液离心，得到上清液和沉淀物，其中沉淀物为未反应的大豆蛋白，弃去沉淀物，上清液通过微滤膜，得到滤液；
（5）乙醇沉淀：向滤液中加入无水乙醇使滤液产生沉淀，进行离心分离后初步脱去大豆肽-钙螯合物的水分，收集沉淀物；
（6）干燥：将沉淀物进行真空冷冻干燥，得到干燥的大豆肽螯合钙产品;
所述步骤（2）中以底物干基的质量计，碱性蛋白酶的加入量为1~2%，中性蛋白酶的加入量为2~4%；
所述步骤（2）中碱性蛋白酶的酶活力为20万u/g，中性蛋白酶的酶活力为10万u/g。
2.根据权利要求1所述的大豆肽螯合钙的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中大豆分离蛋白溶液的质量分数为10%。
3.根据权利要求1所述的大豆肽螯合钙的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中氢氧化钙悬浊液的质量分数为10%。
4.根据权利要求1所述的大豆肽螯合钙的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中的微滤膜的孔径为0.22μm。
5.根据权利要求1所述的大豆肽螯合钙的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）中滤液和无水乙醇的体积比为1:9。
6.根据权利要求1所述的大豆肽螯合钙的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）和步骤（5）中的离心均是在转速为5000r/min的条件下离心10min。
7.根据权利要求1所述的大豆肽螯合钙的制备方法，其特征在于：所述步骤（6）中的真空冷冻干燥条件为冷冻温度-35℃、真空度 30Pa、解吸温度50℃、冷冻时间24h。
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