CN111560412A - 一种从燕窝中同时提取燕窝多肽和燕窝多糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从燕窝中同时提取燕窝多肽和燕窝多糖的方法，其包括：燕窝粉末加水浸泡，恒温水浴处理4h，以便得到燕窝匀浆；向燕窝匀浆中加入蛋白酶酶解处理4h，沸水浴灭酶，以便得到燕窝酶解液；向燕窝酶解液加入硫酸铵沉淀，冷冻离心，以便得到上清液和沉淀；将沉淀加水复溶，进行反渗透脱盐处理后，进行二次酶解和酸解处理，膜过滤，收集滤液，以便得到燕窝多肽；将上清液浓缩后，过DEAE‑52纤维素柱子，采用梯度洗脱，分别收集洗脱峰和透过峰，再经SephadexG‑100收集燕窝多糖的组分，以便得到燕窝多糖。利用本发明的方法能够同时分离纯化出燕窝多肽和燕窝多糖，实现燕窝高附加值的综合利用。

Description

一种从燕窝中同时提取燕窝多肽和燕窝多糖的方法
技术领域
本发明涉及食品领域，具体涉及一种从燕窝中同时提取燕窝多肽和燕窝多糖的方法。
背景技术
燕窝又称燕菜、燕根、燕蔬菜，是指雨燕科的部分雨燕和金丝燕属的几种金丝燕分泌出来的唾液，再混合其他物质所筑成的巢穴。燕窝是中国自明代以来开始被食用的传统名贵食品之一。随着人民生活水平的提高，越来越多的消费者选择燕窝作为高级滋补品，用于滋阴润肺、护肤养颜、提高免疫力等保健调养。
目前燕窝的加工方式主要是以蒸煮的粗加工方式，这种方式得到的燕窝产品中基本保持原有大分子蛋白质结构，由于蛋白质分子量太大，无法被人体完全吸收，使得燕窝的吸收效率较低，因此一些研究者进一步探究了燕窝深加工的方式，通过提取出燕窝中的营养成分，用以制备天然产物，或是以此为基础开发饮料。
相关技术中通常采用水提法或者酶解法来制备燕窝多肽，但所制得的燕窝多肽产率低，纯度低，含有较多的杂质，并且在制备的过程中，不能有效的同时分离和和纯化出高纯度的低分子量的燕窝多肽和燕窝多糖，未能实现燕窝高附加值的综合利用。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种从燕窝中同时提取燕窝多肽和燕窝多糖的方法，该方法能从燕窝中同时分离纯化出燕窝多肽和燕窝多糖，实现燕窝高附加值的综合利用。
具体而言，本发明提供了如下技术方案：
在本发明的第一方面，本发明的实施例提供了一种从燕窝中同时提取燕窝多肽和燕窝多糖的方法，其包括以下步骤：
(1)燕窝粉末按照1:30的料液比加水浸泡，恒温水浴处理4h，以便得到燕窝匀浆；
(2)向所述燕窝匀浆中加入1％的所述燕窝粉末的蛋白酶酶解处理4h，沸水浴灭酶，以便得到燕窝酶解液；
(3)向所述燕窝酶解液加入硫酸铵沉淀，冷冻离心，以便得到上清液和沉淀；
(4)将所述沉淀加水复溶，进行反渗透脱盐处理后，进行二次酶解和酸解处理，调节溶液的pH至中性，冷冻离心，膜过滤，收集滤液，冷冻干燥，以便得到燕窝多肽；
(5)将所述上清液浓缩后，复溶，过DEAE-52纤维素柱子，采用梯度洗脱，分别收集洗脱峰和透过峰，再经SephadexG-100进行脱盐和定向收集燕窝多糖的组分，旋蒸浓缩后进行醇沉，冷冻干燥后，以便得到燕窝多糖。
本发明实施例提供的一种从燕窝中同时提取燕窝多肽和燕窝多糖的方法，该方法采用酶解工艺，盐析联合柱层析技术，将燕窝粉末水浴处理，使得燕窝中的糖苷键断裂，让燕窝原料充分分解，有利于内容物的释放，利用酶解技术，盐析技术联合酸解技术的方法，进一步将燕窝沉淀物中的蛋白质转化成小分子多肽，提高燕窝酶解液中的低聚肽的含量。另外将进行盐析之后的上清液，旋蒸浓缩之后，利用醇沉技术和柱层析技术相结合的方法，起到了脱盐和定向收集燕窝多糖的效果，提高了燕窝多糖的纯度，同时避免了无机盐对产品风味的影响。从而充分利用了燕窝原料，节约了成本，实现了燕窝低聚肽和燕窝多糖的同时制备，在保证纯度的同时，提高了提取率，实现了燕窝高附加值的综合利用。
另外，根据本发明上述实施例提出的一种从燕窝中同时提取燕窝多肽和燕窝多糖的方法，还可以具有如下附加的技术特征：
可选地，步骤(1)中，恒温水浴的温度为40～90℃。
可选地，步骤(2)中，蛋白酶为木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶，中性蛋白酶，碱性蛋白酶、风味蛋白酶中的一种或几种。
可选地，步骤(3)中，硫酸铵沉淀的饱和度为60～100％。
可选地，步骤(4)中，酸解处理为：采用柠檬酸调节溶液的pH至1～3。
可选地，步骤(4)中，膜过滤的膜通量为1kD。
可选地，步骤(5)中，采用0～1M NaCl进行梯度洗脱。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例的工艺流程图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
各成分的检测方法如下：
燕窝多肽的提取率：采用甲醛滴定法测定酶解液中的水解度，水解度越高说明多肽含量的提取率越高。
甲醛滴定法：
在小烧杯中量取蛋白酶解液5.0mL并加入60mL蒸馏水混合均匀，采用0.2mol/L标准NaOH溶液调节酶解稀释液至pH 8.2，再加入pH 8.2的甲醛溶液20mL，最后用0.1mol/L标准NaOH溶液滴定，记录pH滴至9.2时所消耗的标准NaOH溶液的体积。
计算公式：
Figure BDA0002494474010000031
Figure BDA0002494474010000032
Figure BDA0002494474010000033
式中：
ΔV：滴定样品与滴定蛋白原液所消耗的标准NaOH溶液体积之差；
C：NaOH标准溶液浓度(mol/L)；
W：原料克数(g)；
Vtot：酶解液的总体积(mL)；
V：滴定取用的酶解液体积(mL)；
no：水解前每克蛋白游离的氨基毫摩尔数(mmol/g)；
n：水解后每克蛋白游离的氨基毫摩尔数(mmol/g)；
htot：原料蛋白质中所含肽键总数(mmol/g)；
Pro％：样品的蛋白质含量；
110：氨基酸平均分子量。
燕窝多糖含量的测定：苯酚-硫酸法。
苯酚-硫酸法测定多糖含量的原理：在浓硫酸的作用下，多糖水解为单糖并脱水生成糠醛衍生物，后者能与苯酚生成橙黄色化合物，通过比色法可以测出糖浓度，此法简单、快速、灵敏、重复性好。
葡糖糖标准曲线制作：准确称取20mg干燥至恒重的葡萄糖置于100ml容量瓶中，定容后充分混勾，为葡萄糖标准液(0.2mg/ml)；分别吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml葡萄糖标准液至干燥试管中，分别加去离子水将总体积补至0.5ml，在分别加入6％的苯酚溶液1ml，浓硫酸4ml，充分摇匀后37℃水浴15min，室温放置30min冷却后于490nm处测光密度值。
样品中多糖含量的测定：吸取0.5mL适当浓度样品液于具塞试管，加入1mL 6％苯酚和4mL浓硫酸，充分摇匀后置于37℃水浴15min，室温放置30min冷却后于490nm处测光密度值：通过标准曲线方程计算多糖含量。
燕窝多肽分子量含量的测定：凝胶过滤色谱法(HPSEC)
分子量范围测定：色谱柱：TSKgel G4000 PWXL 7.8*300nm 10μm，流动相：乙腈：水：三氟乙酸＝45:55：:01(体积比)，流速：0.5mL/min，检测波长：220nm，进样量：20μL，参照国家标准中的方法。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1
在该实施例中，按照下列方法提取燕窝多肽和燕窝多糖：
预处理：
称取1kg燕窝在50℃下烘2h，得干燕窝，干燕窝放入高速粉碎机中粉碎成燕窝粉末，然后按照料液比1:30将燕窝粉末加入水中浸泡，待燕窝充分溶胀之后，进行70℃水浴处理4h，以便得到燕窝匀浆。
一次酶解：
称取64g的燕窝匀浆，加入20mg胰蛋白酶，混合均匀，用1mol/L和0.1mol/L的碳酸钠溶液调节燕窝匀浆的pH至8.5，在50℃下酶解4h，得到酶解液；接着，将酶解液置于沸水浴中灭活10min。
硫酸铵沉淀：
向酶解液中加入饱和度为100％的硫酸铵，搅拌均匀后静置2h，在4℃下进行10000r/min高速离心15min后，以便得到上清液和沉淀。
酸解处理：
将所述沉淀加水复溶，进行反渗透脱盐处理，进行二次酶解(常温酶解3h)后，进行酸解处理，将二次酶解的酶解液的pH调整为2.0，在80-110℃下，保温3-10小时，冷冻离心，于膜通量为1kD的膜过滤设备中进行过滤，过滤后得到微黄色液体，进行冷冻干燥，即为燕窝多肽粉。
将上清液过DEAE-52纤维素柱，采用梯度洗脱(0-1M NaCl)，上样量为主体积的1/3，恒定洗脱流速1mL/min，分别收集洗脱峰和穿透峰，每管收集6mL，分别过SephadexG-100进行脱盐和定向收集燕窝多糖的组分，之后进行旋蒸浓缩后，进行醇沉，乙醇的浓度为80％，4℃静止过夜，冷冻离心，冷冻干燥，即为燕窝多糖。
结果如下：
燕窝多肽粉分子量：
分子量范围 含量
＞10K 11.36％
10K-5K 25.12％
＜5K 63.52％
提取率：
名称
燕窝多肽提取率 92％
燕窝多糖提取率 83％
燕窝多糖纯度 82％
由此，可同时从燕窝中分离纯化出燕窝多肽和燕窝多糖，在保证纯度的同时，提高了提取率，实现了燕窝高附加值的综合利用。
实施例2
在该实施例中，按照下列方法提取燕窝多肽和燕窝多糖：
预处理：
称取1kg燕窝在50℃下烘2h，得干燕窝，干燕窝放入高速粉碎机中粉碎成燕窝粉末，然后按照料液比1:30将燕窝粉末加入水中浸泡，待燕窝充分溶胀之后，进行50℃水浴处理4h，以便得到燕窝匀浆。
一次酶解：
称取64g的燕窝匀浆，加入20mg胰蛋白酶，混合均匀，用1mol/L和0.1mol/L的碳酸钠溶液调节燕窝匀浆的pH至8.5，在50℃下酶解4h，得到酶解液；接着，将酶解液置于沸水浴中灭活10min。
硫酸铵沉淀：
向酶解液中加入饱和度为50％的硫酸铵，搅拌均匀后静置2h，在4℃下进行10000r/min高速离心15min后，以便得到上清液和沉淀。
酸解处理：
将所述沉淀加水复溶，进行反渗透脱盐处理，进行二次酶解后，进行酸解处理，将二次酶解的酶解液的pH调整为2.0，在80-110℃下，保温3-10小时，冷冻离心，于膜通量为1kD的膜过滤设备中进行过滤，过滤后得到微黄色液体，进行冷冻干燥，即为燕窝多肽粉。
将上清液过DEAE-52纤维素柱，采用梯度洗脱(0-1M NaCl)，上样量为主体积的1/3，恒定洗脱流速1mL/min，分别收集洗脱峰和穿透峰，每管收集6mL，分别过SephadexG-100进行脱盐和定向收集燕窝多糖的组分，之后进行旋蒸浓缩后，进行醇沉，乙醇的浓度为80％，4℃静止过夜，冷冻离心，冷冻干燥，即为燕窝多糖。
结果如下：
燕窝多肽粉分子量：
分子量范围 含量
＞10K 31.42％
10K-5K 35.67％
＜5K 33.12％
提取率：
名称
燕窝多肽提取率 72％
燕窝多糖提取率 56％
燕窝多糖纯度 80％
由此，可同时从燕窝中分离纯化出燕窝多肽和燕窝多糖，但硫酸铵的饱和度较低时会影响燕窝多肽和燕窝多糖的提取率。
实施例3
在该实施例中，按照下列方法提取燕窝多肽和燕窝多糖：
预处理：
称取1kg燕窝在50℃下烘2h，得干燕窝，干燕窝放入高速粉碎机中粉碎成燕窝粉末，然后按照料液比1:30将燕窝粉末加入水中浸泡，待燕窝充分溶胀之后，进行70℃水浴处理4h，以便得到燕窝匀浆。
一次酶解：
称取64g的燕窝匀浆，加入20mg胰蛋白酶，混合均匀，用1mol/L和0.1mol/L的碳酸钠溶液调节燕窝匀浆的pH至8.5，在50℃下酶解4h，得到酶解液；接着，将酶解液置于沸水浴中灭活10min。
硫酸铵沉淀：
向酶解液中加入饱和度为80％的硫酸铵，搅拌均匀后静置2h，在4℃下进行10000r/min高速离心15min后，以便得到上清液和沉淀。
酸解处理：
将所述沉淀加水复溶，进行反渗透脱盐处理，进行二次酶解后，进行酸解处理，将二次酶解的酶解液的pH调整为2.0，在80-110℃下，保温3-10小时，冷冻离心，于膜通量为1kD的膜过滤设备中进行过滤，过滤后得到微黄色液体，进行冷冻干燥，即为燕窝多肽粉。
将上清液过DEAE-52纤维素柱，采用梯度洗脱(0-1M NaCl)，上样量为主体积的1/3，恒定洗脱流速1mL/min，分别收集洗脱峰和穿透峰，每管收集6mL，分别过SephadexG-100进行脱盐和定向收集燕窝多糖的组分，之后进行旋蒸浓缩后，进行醇沉，乙醇的浓度为50％，4℃静止过夜，冷冻离心，冷冻干燥，即为燕窝多糖。
结果如下：
燕窝多肽粉分子量：
分子量范围 含量
＞10K 12.21％
10K-5K 25.94％
＜5K 62.37％
提取率：
名称
燕窝多肽提取率 90％
燕窝多糖提取率 43％
燕窝多糖纯度 46％
由此，可同时从燕窝中分离纯化出燕窝多肽和燕窝多糖，但醇沉时乙醇的浓度较低的饱和度较低时会影响燕窝多糖的提取率。
综上，本发明实施例提供的一种从燕窝中同时提取燕窝多肽和燕窝多糖的方法，该方法采用酶解工艺，盐析联合柱层析技术，将燕窝粉末水浴处理，使得燕窝中的糖苷键断裂，让燕窝原料充分分解，有利于内容物的释放，利用酶解技术，盐析技术联合酸解技术的方法，进一步将燕窝沉淀物中的蛋白质转化成小分子多肽，提高燕窝酶解液中的低聚肽的含量。另外将进行盐析之后的上清液，旋蒸浓缩之后，利用醇沉技术和柱层析技术相结合的方法，起到了脱盐和定向收集燕窝多糖的效果，提高了燕窝多糖的纯度，同时避免了无机盐对产品风味的影响。从而充分利用了燕窝原料，节约了成本，实现了燕窝低聚肽和燕窝多糖的同时制备，在保证纯度的同时，提高了提取率，实现了燕窝高附加值的综合利用。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (7)

1.一种从燕窝中同时提取燕窝多肽和燕窝多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)燕窝粉末按照1:30的料液比加水浸泡，恒温水浴处理4h，以便得到燕窝匀浆；
(2)向所述燕窝匀浆中加入1％的所述燕窝粉末的蛋白酶酶解处理4h，沸水浴灭酶，以便得到燕窝酶解液；
(3)向所述燕窝酶解液加入硫酸铵沉淀，冷冻离心，以便得到上清液和沉淀；
(4)将所述沉淀加水复溶，进行反渗透脱盐处理后，进行二次酶解和酸解处理，调节溶液的pH至中性，冷冻离心，膜过滤，收集滤液，冷冻干燥，以便得到燕窝多肽；
(5)将所述上清液浓缩后，复溶，过DEAE-52纤维素柱子，采用梯度洗脱，分别收集洗脱峰和透过峰，再经SephadexG-100进行脱盐和定向收集燕窝多糖的组分，旋蒸浓缩后进行醇沉，冷冻干燥后，以便得到燕窝多糖。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，恒温水浴的温度为40～90℃。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，蛋白酶为木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶，中性蛋白酶，碱性蛋白酶、风味蛋白酶中的一种或几种。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，硫酸铵沉淀的饱和度为60～100％。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，酸解处理为：采用柠檬酸调节溶液的pH至1～3。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，膜过滤的膜通量为1kD。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，采用0～1M NaCl进行梯度洗脱。
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