CN109504731B - 一种羊胎盘活性肽的制备方法 - Google Patents

一种羊胎盘活性肽的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及多肽技术领域，具体公开一种羊胎盘活性肽的制备方法。所述制备方法，包括如下步骤：选取新鲜羊胎盘，经粉碎处理得到胎盘浆液；加入脂肪酶、无花果蛋白酶及复合风味蛋白酶，酶解得到酶解液；酶解液经过滤、离心脱脂、纳滤、脱盐和浓缩、离子纯化、冷冻干燥，得到羊胎盘活性肽。本发明提供的羊胎盘活性肽的制备方法，提高水解度，使高分子多肽水解为低分子的活性肽，得到高浓度、高活性且分子量均一性好的低分子量的生物活性肽。

Description

一种羊胎盘活性肽的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽技术领域，尤其涉及一种羊胎盘活性肽的制备方法。
背景技术
胎盘是母羊孕育胎儿时候负责母体和胎儿血液和养分交换的组织，能够产生非常多活性物质。而羊胎盘是自然界中最为接近人类胎盘的组织，所以能够很好的被吸收。羊胎盘的主要功效在于：富含孕育生命所必需的所有原始生命物质，其中含有丰富的蛋白质、17种氨基酸、14种微量元素、磷脂、脂多糖、维生素，还有与免疫功能和机体正常运转相关的多种活性多肽，其营养成分天然搭配的比例最接近人体的需求。
目前，国内外对羊胎盘食品的开发，着重于对活性物质的提取、应用，如羊胎盘全粉、活性羊胎素等。羊胎盘除自身具有生物活性外，其蛋白质含量高达80％以上，因此，应该充分利用羊胎盘资源，采用现代生物酶解技术将羊胎盘中的大量蛋白质转变为羊胎盘生物活性肽。生物活性肽具有独特的理化性质与生物活性，分子量相对较低，不会引起像蛋白质或高分子肽对人体造成的过敏反应，更易于被人体消化吸收。
然而，现有技术中，没有对胎盘中的脂肪进行预处理，不利于后续操作；且蛋白酶解效果不理想，使得到的多肽的分子量均一性差，难以得到高浓度、高活性的低分子量的生物活性肽。
发明内容
针对现有制备羊胎盘生物活性肽技术中得到的多肽的分子量均一性差，难以得到高浓度、高活性的低分子量的生物活性肽等问题，本发明提供一种羊胎盘活性肽的制备方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种羊胎盘活性肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)选取新鲜羊胎盘，进行粉碎处理，加入胎盘重量5-6倍纯化水搅拌，得到胎盘浆液；
(2)向所述胎盘浆液中加入脂肪酶，升温至55-65℃，进行酶解处理25-35min，加入无花果蛋白酶和复合风味蛋白酶，保温，酶解处理3.0-4.0h，升温对酶进行灭活处理，得到酶解液；
(3)将所述酶解液进行过滤处理，得到滤液，滤液进行离心脱脂，得到离心液；
(4)所述离心液经纳滤、脱盐和浓缩处理，得到浓缩液；
(5)浓缩液经离子纯化、冷冻干燥，得到羊胎盘活性肽。
进一步地，所述脂肪酶加入量为胎盘重量的0.8％-1.2％，脂肪酶能降解胎盘中的脂肪，使酶解液更容易过滤，且脂肪酶催化水解产生稳定的香味物质，有助于改善活性肽的口感和风味。
进一步地，所述无花果蛋白酶加入量为胎盘重量的1％-1.5％，无花果蛋白酶具有较强的蛋白水解能力，活性强、稳定性高，与复合风味蛋白酶共同作用，使多肽进一步地水解为分子量酶切均匀的低分子的肽。
进一步地，所述复合风味蛋白酶加入量为胎盘重量的0.3％-0.5％，复合风味蛋白酶是利用米曲霉发酵制得，天然安全，含有氨肽酶，羧肽酶，通过末端水解多肽，与无花果蛋白酶配合使用进一步地提高水解度，同时可以去除苦味，改善口感，制取风味良好的活性肽。
进一步地，所述灭活处理温度为100-105℃，时间为10-15min。
进一步地，步骤(3)中，所述酶解液采用卧锣离心机进行过滤处理，所述滤液采用三相离心机进行离心脱脂处理。
进一步地，步骤(4)中，所述离心液采用孔径为0.5nm的纳滤膜进行纳滤处理，透过液采用孔径为0.2nm的纳滤膜进行脱盐和浓缩处理。
进一步地，步骤(5)中，所述冷冻干燥处理方法为：于-45℃预冻1.25-1.35h，在温度为-42℃～-20℃，真空度为0.12mbar-0.15mbar条件下，升华干燥7.8-8.3h，再在温度为-10℃-30℃，真空度为0.15mbar-0.25mbar条件下，解析干燥2.5-3.5h，升华干燥主要针对物料中的自由水，解析干燥主要是去除与固体结合较强的吸附水，提高活性肽产品的品质。
相对于现有技术，本发明提供的羊胎盘活性肽的制备方法，采用脂肪酶、无花果蛋白酶及复合风味蛋白酶多酶水解法制备羊胎盘活性肽，无花果蛋白酶酶解反应温和，不会破坏原料中的活性物质，，与复合风味蛋白酶协同作用，提高水解度，并使蛋白分子量酶切均匀，使高分子多肽水解为低分子的活性肽，同时，可以能充分降解胎盘中的病原体微生物，使产品更安全，而复合风味蛋白酶与脂肪酶配合使用，去除多肽苦味的同时可以产生稳定的香味物质，改善活性肽的口感和风味，此外，脂肪酶降解胎盘中的脂肪，使酶解液更容易过滤，有助于不同分子量活性肽的分离机纯化，得到高浓度、高活性且分子量均一性好的低分子量的生物活性肽。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种羊胎盘活性肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)选取新鲜羊胎盘10kg，采用绞肉机进行粉碎处理，加入50L纯化水搅拌，得到胎盘浆液，内含有蛋白质约8kg；
(2)向所述胎盘浆液中加入80g脂肪酶，升温至55℃，进行酶解处理35min，加入100g无花果蛋白酶和30g复合风味蛋白酶，55℃保温，酶解处理4.0h，升温至100℃对酶进行灭活处理15min，得到酶解液，采用TCA(三氯乙酸)法测得水解度约为89.5％，其中，酶解液中的TCA可溶性多肽约为7.08kg(损失量包括前处理过程中损失的蛋白质及水解得到的游离氨基酸)；
(3)将所述酶解液采用卧锣离心机进行过滤处理，得到滤液，滤液采用三相离心机进行离心脱脂，得到离心液；
(4)所述离心液先采用孔径为0.5nm的纳滤膜进行纳滤处理，透过液采用孔径为0.2nm的纳滤膜进行脱盐和浓缩处理，得到浓缩液；
(5)将步骤(4)中浓缩液用离子过滤器进行离子纯化，用双效浓缩器进一步浓缩后，于-45℃预冻1.25h，在温度为-20℃，真空度为0.12mbar条件下，升华干燥8h，再在温度为-15℃，真空度为0.15mbar条件下，解析干燥3h，得到分子量为180-500Da的羊胎盘活性肽5.81kg，多肽得率(所得活性肽量/蛋白质总量)为72.7％。
实施例2
一种羊胎盘活性肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)选取新鲜羊胎盘10kg，采用绞肉机进行粉碎处理，加入60L纯化水搅拌，得到胎盘浆液，内含有蛋白质约7.6kg；
(2)向所述胎盘浆液中加入120g脂肪酶，升温至65℃，进行酶解处理25min，加入150g无花果蛋白酶和50g复合风味蛋白酶，65℃保温，酶解处理3.0h，升温至105℃对酶进行灭活处理10min，得到酶解液，采用TCA(三氯乙酸)法测得水解度约为90.2％，其中，酶解液中的TCA可溶性多肽约为6.45kg；
(3)将所述酶解液采用卧锣离心机进行过滤处理，得到滤液，滤液采用三相离心机进行离心脱脂，得到离心液；
(4)所述离心液先采用孔径为0.5nm的纳滤膜进行纳滤处理，透过液采用孔径为0.2nm的纳滤膜进行脱盐和浓缩处理，得到浓缩液；
(5)将步骤(4)中浓缩液用离子过滤器进行离子纯化，用双效浓缩器进一步浓缩后，于-45℃预冻1.35h，在温度为-42℃，真空度为0.12mbar条件下，升华干燥7.8h，再在温度为-30℃，真空度为0.15mbar条件下，解析干燥2.5h，得到分子量为180-500Da的羊胎盘活性肽5.22kg，多肽得率为68.7％。
实施例3
一种羊胎盘活性肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)选取新鲜羊胎盘10kg，采用绞肉机进行粉碎处理，加入55L纯化水搅拌，得到胎盘浆液，内含有蛋白质约8.2kg；
(2)向所述胎盘浆液中加入100g脂肪酶，升温至60℃，进行酶解处理30min，加入120g无花果蛋白酶和40g复合风味蛋白酶，60℃保温，酶解处理3.5h，升温至100℃对酶进行灭活处理12min，得到酶解液，采用TCA(三氯乙酸)法测得水解度约为91.3％，其中，酶解液中的TCA可溶性多肽约为7.24kg；
(3)将所述酶解液采用卧锣离心机进行过滤处理，得到滤液，滤液采用三相离心机进行离心脱脂，得到离心液；
(4)所述离心液先采用孔径为0.5nm的纳滤膜进行纳滤处理，透过液采用孔径为0.2nm的纳滤膜进行脱盐和浓缩处理，得到浓缩液；
(5)将步骤(4)中浓缩液用离子过滤器进行离子纯化，用双效浓缩器进一步浓缩后，于-45℃预冻1.3h，在温度为-25℃，真空度为0.15mbar条件下，升华干燥8.3h，再在温度为-10℃，真空度为0.25mbar条件下，解析干燥3.5h，得到分子量为180-500Da的羊胎盘活性肽5.91kg，多肽得率为72.1％。
为了更好的说明本发明的技术方案，下面还通过对比例和本发明的实施例做进一步的对比。
对比例1
将实施例1中的无花果蛋白酶替换为木瓜蛋白酶，其他操作与实施例1相同，得到羊胎盘活性肽，对比例1中酶解液测得水解度为71.4％。
对比例2
将实施例1中的无花果蛋白酶替换为中性蛋白酶，其他操作与实施例1相同，得到羊胎盘活性肽，取对比例1中酶解液测得水解度为69.9％。
为了更好的说明本发明实施例提供的羊胎盘活性肽的制备方法的特性，下面将实施例1-3及对比例1-2制备羊胎盘活性肽过程中得到的离心液进行分子量测定。
分子量的测定
检测方法：通过凝胶层析法测定分子量，选用0.1mol/L的Tris-HCl洗脱液平衡处理SPhedexG-25凝胶柱后，在220nm的波长下，检测浓度为2mg/ml的标准物质：还原性谷胱甘肽(307Da)、氧化性谷胱甘肽(612Da)分子量为、缩宫素(1007Da)和胰高血糖素(3485Da)，根据标准物质分子量对数和洗脱体积，拟合得回归方程：y＝-38.15x+198.6(R2＝0.9932)；其中，y为洗脱体积，x为相应分子量的对数值。
将各实施例和对比例所得离心液进行冷冻干燥，得到冻干粉，将冻干粉分别配置为浓度为5mg/ml，在上述条件下分别进样洗脱，将出峰体积带入回归方程标准曲线，即可得样品分子量及其分布范围，通过峰面积归一法，确定不同分子量蛋白肽的相对百分含量，所得结果如表1所示。
表1
Figure BDA0001915500180000061
Figure BDA0001915500180000071
由以上数据可得，本发明实施例提供的羊胎盘活性肽，采用脂肪酶、无花果蛋白酶及复合风味蛋白酶多酶水解法制备羊胎盘活性肽，提高水解度，并使分子量酶切均匀，将高分子多肽水解为低分子的活性肽，得到高浓度、高活性且分子量均一性好的低分子量的生物活性肽。活性肽分子量主要分布在180-500Da，使人体更容易吸收利用，能广泛的应用于化妆品、食品、保健食品及药品等方面。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种羊胎盘活性肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)选取新鲜羊胎盘，进行粉碎处理，加入胎盘重量5-6倍纯化水搅拌，得到胎盘浆液；
(2)向所述胎盘浆液中加入脂肪酶，升温至55-65℃，进行酶解处理25-35min，加入无花果蛋白酶和复合风味蛋白酶，保温，酶解处理3.0-4.0h，升温对酶进行灭活处理，得到酶解液；所述无花果蛋白酶加入量为胎盘重量的1％-1.5％，所述复合风味蛋白酶加入量为胎盘重量的0.3％-0.5％；所述脂肪酶加入量为胎盘重量的0.8％-1.2％；
(3)将所述酶解液进行过滤处理，得到滤液，滤液进行离心脱脂，得到离心液；
(4)所述离心液经纳滤、脱盐和浓缩处理，得到浓缩液；
(5)浓缩液经离子纯化、冷冻干燥，得到羊胎盘活性肽。
2.如权利要求1所述的羊胎盘活性肽的制备方法，其特征在于：所述灭活处理温度为100-105℃，时间为10-15min。
3.如权利要求1所述的羊胎盘活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述酶解液采用卧锣离心机进行过滤处理，所述滤液采用三相离心机进行离心脱脂处理。
4.如权利要求1所述的羊胎盘活性肽的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述离心液采用孔径为0.5nm的纳滤膜进行纳滤处理，透过液采用孔径为0.2nm的纳滤膜进行脱盐和浓缩处理。
5.如权利要求1-4任一项所述的羊胎盘活性肽的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，所述冷冻干燥处理方法为：于-45℃预冻1.25-1.35h，在温度为-42℃～-20℃，真空度为0.12mbar-0.15mbar条件下，升华干燥7.8-8.3h，再在温度为-10℃-30℃，真空度为0.15mbar-0.25mbar条件下，解析干燥2.5-3.5h。
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