CN109468357A - 一种脾氨肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及动物脾脏的深加工技术领域，尤其涉及一种脾氨肽的制备方法。该方法采用新鲜牲畜脾脏为主要原料，经过前处理、酶解、固液分离、脱脂纯化、纳滤、浓缩纯化，得到脾氨肽的浓缩液。该浓缩液可经冻干后即得到冻干产品。本发明所提供的制备方法生产周期短、成本低、对环境无污染，而且所得产品安全性高，纯度高、活性高、分子量可控，可广泛应用于食品、特医食品、保健品、药品等领域。

Description

一种脾氨肽的制备方法
技术领域
本发明涉及动物脾脏的深加工技术领域，尤其涉及一种脾氨肽的制备方法。
背景技术
脾脏是机体最大的免疫器官，占全身淋巴组织总量的25％，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心。脾脏有滤血的功能，其边缘区和脾索是滤血的主要场所。脾内的大量巨噬细胞可以清除衰老的血细胞(比如红细胞)、抗原和异物。侵入机体血内的抗原可在脾脏内激发免疫反应。此外，脾脏还能够储藏血液，如，马的脾脏则存储了马体内大约30％的红细胞。胚胎发育早期，脾脏有造血的功能。但出生后脾脏的造血功能基本消失，仅在部分条件刺激下才能够恢复。
以动物脾脏为原料生产的脾氨肽能增加CD3细胞的数量，促进T淋巴细胞活性，从而对T淋巴细胞介导的细胞免疫发挥作用。因此，脾氨肽作为免疫体调节剂，能改善细胞免疫功能低下所引起的损伤机体健康的多种情况，提高机体免疫力。现有的用动物脾脏生产脾氨肽的方法中有蛋白酶酶解、色谱分离提取、透析等，分别存在产品分子量偏大、小分子多肽的提取效率低、使用有机溶剂以及操作时间长等问题。
发明内容
针对现有生产脾氨肽的技术存在的产品分子量偏大、小分子多肽的提取效率低的问题，本发明提供一种脾氨肽的制备方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下技术方案：
一种脾氨肽的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤a、将新鲜牲畜脾脏处理成碎块，作为原料；
步骤b、依次用脂肪酶、内切蛋白酶、外切蛋白酶对所述原料进行酶解；其中所述脂肪酶为微生物脂肪酶和固定化脂肪酶；
步骤c、固液分离，将所得液体进行脱脂纯化，纳滤，浓缩纯化。
本发明所提供的脾氨肽的制备方法中的酶解先采用脂肪酶和内切蛋白酶共同进行酶解，脂肪酶分解了动物脾脏中的脂肪，让蛋白质成分从脾脏组织里分离出来，再由内切蛋白酶对组织分离出来的蛋白质进行酶解得到脾氨肽，从而提高了从原料中提取肽的提取率，即，从单位重量的脾脏中提取出更多脾氨肽；同时，脂肪酶减少了酶解液中的脂肪成分，使酶解液粘稠度降低，更容易过滤，使更多的脾氨肽进入下一工序，有利于提高脾氨肽的收率，即，终产品中的脾氨肽占脾脏中提取出的脾氨肽的比例；将微生物脂肪酶和固定化脂肪酶结合使用，能够克服微生物脂肪酶单用的不稳定性，使脂肪分解更彻底；蛋白质大分子经内切蛋白酶的酶解后，肽链中的疏水性氨基酸暴露出来，接触味蕾时会产生苦味，外切蛋白酶能够切除酶解后肽键两端的苦味基团，使产品口感更好，充分满足食品和保健品对原料的口感要求；通过纳滤能够分离得到所需分子量的脾氨肽，使产品更适用于药品或保健食品的要求。本方法中的脾脏来源包括猪、牛、羊等，价廉易得，原料丰富。
本发明所提供的脾氨肽制备方法生产周期短、成本低、不需使用有机试剂、对环境无污染，不产生任何有毒有害物质，所得产品安全性高、纯度高、活性高、分子量可控、无异味、无苦味，可广泛应用于食品、保健食品、药品等。
优选地，步骤a中将牲畜脾脏处理成碎块的方法为冷冻后粉碎。冷冻后的脾脏有较高的脆性，易于粉碎。该粉碎方法能够避免脾氨肽因高温而受到破坏，更好地保存脾氨肽活性。
优选地，步骤b中所述微生物脂肪酶为霉实假单胞菌产脂肪酶，所述固定化脂肪酶为固定化脂肪酶TL 1M。霉实假单胞菌产脂肪酶只作用于1或3位酯键，分解脂肪的特异性强；固定化脂肪酶TL 1M能区域性和立体选择性地催化酯水解，特别适用于包括三甘油酯在内的1、3位酯交换反应。二者结合使用，能使脂肪分解更彻底，所得酶解液更容易过滤。
优选地，步骤b中所述内切蛋白酶为中性蛋白酶。中性蛋白酶酶解反应温和，与碱性蛋白酶相比，不会破坏原料中的活性物质，并使分子量酶切均匀，从而提高小分子量脾氨肽的比例。
优选地，所述中性蛋白酶为栖土曲霉蛋白酶。栖土曲霉蛋白酶具有很高的酶解活性，能提高酶解效率，使酶解更充分，获得的脾氨肽分子量更小。
优选地，所述外切蛋白酶为乳酸菌氨肽酶。经脂肪酶和中性蛋白酶水解后，肽链末端残留的脯氨酸使产品具有苦味，通过乳酸菌氨肽酶的进一步水解可以使其脱除苦味。如，乳酸菌氨肽酶Accelase(乳酸乳球菌的氨肽酶)。
优选地，步骤b中酶解的具体操作为：向所述原料中加入相当于所述原料重量4～6倍的纯化水，搅拌均匀，升温至35～40℃，加入相当于所述原料重量0.5～1.0％的所述霉实假单胞菌产脂肪酶，保持20～30min，再升温至55～60℃，加入相当于所述原料重量0.4～0.8％的所述固定化脂肪酶TL 1M和相当于所述原料重量1～1.5％的所述中性蛋白酶，保持20～30min，然后加入相当于所述原料重量0.3～0.5％的所述乳酸菌氨肽酶，保持3.0～4.0h，最后升温至90～95℃，保持10～15min灭酶。不同的脂肪酶或蛋白酶均有不同的最适温度，该操作方法经过温度、酶解时间的优化，使酶解时间缩短、效率提高，同时保存了脾氨肽的活性。
优选地，在步骤c中，所述固液分离的操作为离心后过滤，离心转速为3400～3800r/min，以去除酶解液中脂肪和不溶物。作为优选的实施方式，该离心操作可采用卧锣离心机，更适合粘稠液体的固液分离。
所述脱脂纯化在三相离心机中进行。
所述浓缩纯化的操作为：将纳滤后的滤液浓缩，用离子过滤器纯化，用双效浓缩器进一步浓缩。该操作在常温下进行、无相态变化、不需使用有机试剂。滤液浓缩后可节省后续工序的操作时间、降低能耗。
所述纳滤的具体操作为：先用孔径为0.45～0.55nm的纳滤膜过滤，再用孔径为0.18～0.22nm的纳滤膜脱盐。先用孔径较粗的纳滤膜，能够脱除大于500道尔顿的肽，再用较小孔径的纳滤膜，能够脱除单个氨基酸和盐分，使产品能保持更好的纯度。通过本操作能使产品中二肽到五肽(分子量为180-500道尔顿)的含量由57％提高到99％，使产品能更好地被人体吸收，吸收率可达100％。
优选地，所述制备方法还包括将步骤c所得产物进行冻干，使产品能更方便地添加在药品、食品或保健食品中使用，并且冻干工艺的低温操作能更好地保持小分子肽的活性。
优选地，所述冻干的程序为：在-45～-40℃预冻1.25～1.35h，再在-42℃～-20℃、真空度0.10～0.15mbar条件下冻干7.8～8.3h，然后在-10℃～-30℃、真空度0.15mbar～0.25mbar条件下解析冻干3h～4h，即得到脾氨肽冻干产品。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本实施例提供了一种脾氨肽的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤a、选取新鲜猪脾脏1000g，冷冻至-20℃后粉碎，作为原料；
步骤b、向原料中加入5000mL纯化水，搅拌均匀，升温至35℃，加入5g霉实假单胞菌产脂肪酶，保持30min，再升温至55℃，加入4g固定化脂肪酶TL 1M和10g栖土曲霉蛋白酶，保持30min，然后加入3g乳酸菌氨肽酶，保持温度4h，最后升温至90℃，保持15min灭酶；
步骤c、灭酶后用卧锣离心机过滤(离心转速为3400r/min)，过滤液再用三相离心机脱脂纯化；纯化液先用纳滤膜孔径为0.45nm的纳滤机过滤，再用纳滤膜孔径为0.18nm的纳滤机脱盐并浓缩，浓缩液用离子过滤器进一步纯化，然后用双效浓缩器进一步浓缩；
步骤d、浓缩液在-45℃预冻1.25h；然后在-42℃、真空度0.12mbar的条件下冻干7.8h，再在-10℃、真空度0.15mbar的条件下解析冻干3h，即得到脾氨肽冻干产品。
实施例2
本实施例提供了一种脾氨肽的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤a、选取新鲜牛脾脏10kg，冷冻至-25℃后粉碎，作为原料；
步骤b、向原料中加入60L纯化水，搅拌均匀，升温至37℃，加入70g霉实假单胞菌产脂肪酶，保持25min，再升温至55℃，加入60g固定化脂肪酶TL1M和120g栖土曲霉蛋白酶，保持25min，然后加入40g乳酸菌氨肽酶，保持温度3.5h，最后升温至93℃，保持12min灭酶；
步骤c、灭酶后用卧锣离心机过滤(离心转速为3600r/min)，过滤液再用三相离心机脱脂纯化；纯化液先用纳滤膜孔径为0.5nm的纳滤机过滤，再用纳滤膜孔径为0.2nm的纳滤机脱盐并浓缩，浓缩液用离子过滤器进一步纯化，然后用双效浓缩器进一步浓缩；
步骤d、浓缩液在-42℃预冻1.3h；然后在-30℃、真空度0.10mbar的条件下冻干8.0h，再在-20℃、真空度0.2mbar的条件下解析冻干3.5h，即得到脾氨肽冻干产品。
实施例3
本实施例提供了一种脾氨肽的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤a、选取新鲜羊脾脏100kg，冷冻至-30℃后粉碎，作为原料；
步骤b、向原料中加入400L纯化水，搅拌均匀，升温至40℃，加入1kg霉实假单胞菌产脂肪酶，保持20min，再升温至60℃，加入0.8kg固定化脂肪酶TL 1M和1.5kg栖土曲霉蛋白酶，保持20min，再加入0.5kg乳酸菌氨肽酶，保持温度3h，最后升温至95℃，保持10min灭酶；
步骤c、灭酶后用卧锣离心机过滤(离心转速为3800r/min)，过滤液再用三相离心机脱脂纯化；纯化液先用纳滤膜孔径为0.55nm的纳滤机过滤，再用纳滤膜孔径为0.22nm的纳滤机脱盐并浓缩，浓缩液用离子过滤器进一步纯化，然后用双效浓缩器进一步浓缩；
步骤d、浓缩液在-40℃预冻1.35h；然后在-20℃、真空度0.15mbar的条件下冻干8.3h，再在-30℃、真空度0.25mbar的条件下解析冻干4h，即得到脾氨肽冻干产品。
对比例
本对比例提供了一种脾氨肽的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤a、选取新鲜牛脾脏100g，冷冻至-25℃后粉碎，作为原料；
步骤b、向原料中加入600mL纯化水，搅拌均匀，升温至37℃，加入1.3g胰脂肪酶和1.2g栖土曲霉蛋白酶，保持25min，然后加入0.4g乳酸菌氨肽酶，保持温度3.5h，最后升温至93℃，保持12min灭酶；
步骤c、灭酶后用卧锣离心机过滤(离心转速为3600r/min)，过滤液再用三相离心机脱脂纯化；纯化液先用纳滤膜孔径为0.5nm的纳滤机过滤，再用纳滤膜孔径为0.2nm的纳滤机脱盐并浓缩，浓缩液用离子过滤器进一步纯化，然后用双效浓缩器进一步浓缩；
步骤d、浓缩液在-42℃预冻1.3h；然后在-30℃、真空度0.10mbar的条件下冻干8.0h，再在-20℃、真空度0.2mbar的条件下解析冻干3.5h，即得到脾氨肽冻干产品。
效果例
对实施例1～3以及对比例所得脾氨肽提取率、小分子脾氨肽收率的考察，结果见表1。其中
脾氨肽提取率＝步骤b酶解后所得脾氨肽的质量/原料质量；
小分子脾氨肽收率＝步骤c所得产品中180-500道尔顿的脾氨肽质量/步骤b酶解后所得脾氨肽的质量。
表1
由表1试验结果可见，实施例1～3所得产品中分子量180-500道尔顿的脾氨肽收率可达79.2％以上。实施例2与对比例所用原料均来自于牛脾脏，实施例2的收率明显高于对比例。可见，本发明提供的方法具有更高的收率，可制得更多的分子量小且均一的脾氨肽。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种脾氨肽的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤a、将新鲜牲畜脾脏处理成碎块，作为原料；
步骤b、依次用脂肪酶、内切蛋白酶、外切蛋白酶对所述原料进行酶解；其中所述脂肪酶为微生物脂肪酶和固定化脂肪酶；
步骤c、固液分离，将所得液体进行脱脂纯化，纳滤，浓缩纯化。
2.根据权利要求1所述的脾氨肽的制备方法，其特征在于，步骤a中将牲畜脾脏处理成碎块的方法为冷冻后粉碎。
3.根据权利要求1所述的脾氨肽的制备方法，其特征在于，步骤b中所述微生物脂肪酶为霉实假单胞菌产脂肪酶，所述固定化脂肪酶为固定化脂肪酶TL1M。
4.根据权利要求3所述的脾氨肽的制备方法，其特征在于，步骤b中所述内切蛋白酶为中性蛋白酶。
5.根据权利要求4所述的脾氨肽的制备方法，其特征在于，所述中性蛋白酶为栖土曲霉蛋白酶。
6.根据权利要求4所述的脾氨肽的制备方法，其特征在于，所述外切蛋白酶为乳酸菌氨肽酶。
7.根据权利要求6所述的脾氨肽的制备方法，其特征在于，步骤b中酶解的具体操作为：向所述原料中加入相当于所述原料重量4～6倍的纯化水，搅拌均匀，升温至35～40℃，加入相当于所述原料重量0.5～1.0％的所述霉实假单胞菌产脂肪酶，保持20～30min，再升温至55～60℃，加入相当于所述原料重量0.4～0.8％的所述固定化脂肪酶TL 1M和相当于所述原料重量1～1.5％的所述中性蛋白酶，保持20～30min，然后加入相当于所述原料重量0.3～0.5％的所述乳酸菌氨肽酶，保持3.0～4.0h，最后升温至90～95℃，保持10～15min灭酶。
8.根据权利要求1所述的脾氨肽的制备方法，其特征在于，在步骤c中：
所述固液分离的操作为离心后过滤，离心转速为3400～3800r/min；和/或
所述脱脂纯化在三相离心机中进行；和/或
所述浓缩纯化的操作为：将纳滤后的滤液浓缩，用离子过滤器纯化，用双效浓缩器进一步浓缩；和/或
所述纳滤的具体操作为：先用孔径为0.45～0.55nm的纳滤膜过滤，滤液用孔径为0.18～0.22nm的纳滤膜脱盐。
9.根据权利要求1所述的脾氨肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将步骤c所得产物进行冻干。
10.根据权利要求9所述的脾氨肽的制备方法，其特征在于，所述冻干的程序为：在-45～-40℃预冻1.25～1.35h，再在-42℃～-20℃、真空度0.10～0.15mbar条件下冻干7.8～8.3h，然后在-10℃～-30℃、真空度0.15mbar～0.25mbar条件下解析冻干3h～4h，即得到脾氨肽冻干产品。
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