CN109457007A - 一种胸腺肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及动物胸腺的深加工技术领域，尤其涉及一种胸腺肽的制备方法。该方法采用新鲜牲畜胸腺为主要原料，经过前处理、酶解、固液分离、脱脂纯化、纳滤、浓缩纯化，得到胸腺肽的浓缩液。该浓缩液可经冻干后即得到冻干产品。本发明方法生产周期短、成本低、对环境无污染，而且所得产品安全性高，纯度高、产品活性高、分子量可控，可广泛应用于食品、特医食品、保健品、药品等领域。

Description

一种胸腺肽的制备方法
技术领域
本发明涉及动物胸腺的深加工技术领域，尤其涉及一种胸腺肽的制备方法。
背景技术
胸腺不仅是免疫器官，也是内分泌器官，是淋巴细胞的源泉，不仅是T细胞分化的场所，也有B细胞存在，在动物幼年早期发挥了重要的免疫作用。近年来的研究资料中提出，成人胸腺有助于T细胞的重建。在治疗获得性免疫缺陷疾病患者抗逆转录病毒过程中，增加的幼稚淋巴细胞大部分是从胸腺释放的。胸腺可分泌胸腺素(包括胸腺素α1与胸腺素β4)和促胸腺生成素，胸腺素α1是一种免疫活性肽，主要作用于胸腺细胞成熟的早期和晚期，可增加T细胞表面Th1，2和Lyt-1，2，3的表达，在体外影响TH细胞成熟。胸腺素α1在体外还可调节胸腺细胞末端的脱氧核苷酸转移酶水平，刺激巨噬细胞移动抑制因子(干扰素(interferon，IFN)、白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2))及其受体产生。最近研究表明，小分子胸腺肽可刺激树突细胞的生长。
以动物胸腺为原料提取的胸腺肽和化学合成的胸腺五肽作为免疫调节药，具有调节和增强人体细胞免疫功能的作用，能促使有丝分裂原激活后的外周血中T淋巴细胞成熟，增加T细胞在各种抗原或致有丝分裂原激活后各种淋巴因子(如：α、γ干扰素、白介素2和白介素3)的分泌，增加T细胞上淋巴因子受体的水平。它同时通过对T4辅助细胞的激活作用来增强淋巴细胞反应。因此，本品具有调节和增强人体细胞免疫功能的作用。
在现有技术中，医药用胸腺肽的提纯度高，肽的种类单一，专门针对性治疗某一种疾病，其制作工艺为以氨基酸为原材料，用化学试剂进行人工嫁接、合成。因有化学试剂残留，不可避免的会对人体产生一定的毒副作用和不良反应。而从动物胸腺中提取胸腺肽的生产方法得到的产品分子量偏大，小分子多肽的提取效率低、吸收利用情况欠佳，而且多采用喷雾干燥，产品活性不好控制。
发明内容
针对现有生产胸腺肽的技术存在的化学试剂残留、产品分子量偏大、小分子多肽的提取效率低、的问题，本发明提供一种胸腺肽的制备方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下技术方案：
一种胸腺肽的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤a、将新鲜牲畜胸腺进行液氮研磨，作为原料；
步骤b、向所述原料中加入相当于所述原料重量4～6倍的水，超声20～30min，再依次用微生物脂肪酶、内切蛋白酶、外切蛋白酶对所述原料进行酶解；其中所述外切蛋白酶为乳酸菌氨肽酶；
步骤c、固液分离，将所得液体进行脱脂纯化，纳滤，浓缩纯化。
本发明所提供的胸腺肽的制备方法中采用液氮研磨的方法对牲畜胸腺进行前处理，利用液氮的低温使组织变硬，脆性增加而易于磨碎，又能使胸腺组织中的成分不易被破坏或降解；再结合研磨，使胸腺细胞的结构被破坏，从而有利于胸腺肽的提取；液氮研磨后进行超声处理，进一步促进细胞中活性成分的释放，从而能够提高提取收率。
酶解先采用脂肪酶和内切蛋白酶共同进行酶解，脂肪酶分解了动物胸腺中的脂肪，让蛋白质成分从胸腺组织里分离出来，再由内切蛋白酶对组织分离出来的蛋白质进行酶解得到胸腺，从而提高了从原料中提取胸腺肽的提取率，即，从单位重量的胸腺中提取出更多胸腺肽；同时，脂肪酶减少了酶解液中的脂肪成分，使酶解液粘稠度降低，更容易过滤，使更多的胸腺肽进入下一工序，有利于提高胸腺肽的收率，即，终产品中的胸腺肽占胸腺中提取出的胸腺肽的比例。
微生物脂肪酶为假丝酵母菌脂肪酶和/或黑曲霉脂肪酶。假丝酵母菌脂肪酶只作用于1或3位酯键，分解特异性强；黑曲霉脂肪酶不仅可以作用于1或3位酯键，还可以作用于2位酯键。二者单独使用时，即可达到一定的分解脂肪效果，结合使用则使脂肪分解更彻底，所得酶解液更容易过滤。
蛋白质大分子酶解后，肽链末端的疏水性氨基酸暴露出来，接触味蕾时会产生苦味，外切蛋白酶能够切除酶解肽键两端的苦味基团，使产品口感更好，充分满足食品和保健品对原料口感的要求。
本发明通过纳滤能够控制胸腺肽的分子量，使产品更适用于药品或保健食品的要求，并且比化学合成更容易操作，产品生物活性更高，无化学试剂，制备过程中不产生有机试剂污染，对人体健康和环境保护更有利。按本发明所提供的方法生产出的胸腺肽产品安全性高、纯度高、活性高、分子量可控，且无异味、无苦味，可广泛应用于食品、保健食品、药品等。其中牲畜包括猪、牛、羊等。
优选地，步骤b中所述内切蛋白酶为中性蛋白酶。中性蛋白酶酶解反应温和，与碱性蛋白酶相比，不会破坏原料中的活性物质，并使分子量酶切均匀。
优选地，所述中性蛋白酶为枯草芽孢杆菌蛋白酶。枯草芽孢杆菌蛋白酶具有较高的酶解活性，对于蛋白质的水解度高。枯草芽孢杆菌蛋白酶与微生物脂肪酶合用，能够使胸腺中的蛋白质酶解更彻底，使胸腺肽的提取率提高。
优选地，所述外切蛋白酶为乳酸菌氨肽酶。经脂肪酶和中性蛋白酶水解后，肽链中残留的脯氨酸使产品具有苦味，通过乳酸菌氨肽酶的进一步水解可以使其脱除苦味。如，乳酸菌氨肽酶Accelase。
优选地，步骤b中酶解的具体操作为：将超声后的原料浆液升温至35～45℃，加入相当于所述原料重量0.8～1.2％的所述微生物脂肪酶和相当于所述原料重量1～1.5％的所述枯草芽孢杆菌蛋白酶，保持30～40min，然后加入相当于所述原料重量0.3～0.5％的所述乳酸菌氨肽酶，保持3.0～4.0h，最后升温至90～95℃，保持10～15min灭酶。不同的脂肪酶或蛋白酶均有不同的最适温度，该操作方法经过温度、酶解时间的优化，使酶解时间缩短、效率提高，同时保存了胸腺肽的活性。
优选地，在步骤c中，所述固液分离的操作为离心后过滤，离心转速为3400～3800r/min，以去除酶解液中脂肪和不溶物。作为优选的实施方式，该离心操作可采用卧锣离心机，更适合粘稠液体的固液分离。
所述脱脂纯化在三相离心机中进行。
所述浓缩纯化的操作为：将纳滤后的滤液浓缩，用离子过滤器纯化，用双效浓缩器进一步浓缩。该操作在常温下进行、无相态变化。滤液浓缩后可节省后续工序的操作时间、降低能耗。
优选地，步骤c中所述纳滤的具体操作为：先用孔径为0.45～0.55nm的纳滤膜过滤，再用孔径为0.18～0.22nm的纳滤膜脱盐。先用孔径较粗的纳滤膜，能够脱除大于500道尔顿的肽，再用较小孔径的纳滤膜，能够脱除单个氨基酸和盐分，使产品能保持更好的纯度。通过本操作能使产品中二肽到五肽(分子量为180-500道尔顿)的含量达到99％，使产品能够被人体更好地吸收，吸收率可达100％。
优选地，所述制备方法还包括将步骤c所得产物进行冻干，使产品能更方便地添加在药品、食品或保健食品中使用，并且冻干的低温操作能更好的保持小分子肽的活性。
优选地，所述冻干的程序为：在-45～-40℃预冻1.25～1.35h，再在-42℃～-20℃、真空度0.10～0.15mbar条件下冻干7.8～8.3h，然后在-10℃～-30℃、真空度0.15mbar～0.25mbar条件下解析冻干3h～4h，即得到胸腺肽冻干产品。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本实施例提供了一种胸腺肽的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤a、选取新鲜猪胸腺1000g，用液氮研磨机进行液氮研磨，作为原料；
步骤b、向原料中加入5000mL纯化水，搅拌均匀，超声20min后，升温至35℃，加入8g假丝酵母菌脂肪酶和10g枯草芽孢杆菌蛋白酶，保持40min，然后加入3g乳酸菌氨肽酶，保持温度4h，最后升温至90℃，保持15min灭酶；
步骤c、灭酶后用卧锣离心机过滤(离心转速为3400r/min)，过滤液再用三相离心机脱脂纯化；纯化液先用纳滤膜孔径为0.45nm的纳滤机过滤，再用纳滤膜孔径为0.18nm的纳滤机脱盐并浓缩，浓缩液用离子过滤器进一步纯化，然后用双效浓缩器进一步浓缩；
步骤d、浓缩液在-45℃预冻1.25h；然后在-42℃、真空度0.12mbar的条件下冻干7.8h，再在-10℃、真空度0.15mbar的条件下解析冻干3h，即得到胸腺肽冻干产品。
实施例2
本实施例提供了一种胸腺肽的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤a、选取新鲜牛胸腺10kg，用液氮研磨机进行液氮研磨，作为原料；
步骤b、向原料中加入60L纯化水，搅拌均匀，超声25min后，升温至40℃，加入50g假丝酵母菌脂肪酶、50g黑曲霉脂肪酶和120g枯草芽孢杆菌蛋白酶，保持35min，然后加入40g乳酸菌氨肽酶，保持温度3.5h，最后升温至93℃，保持12min灭酶；
步骤c、灭酶后用卧锣离心机过滤(离心转速为3600r/min)，过滤液再用三相离心机脱脂纯化；纯化液先用纳滤膜孔径为0.5nm的纳滤机过滤，再用纳滤膜孔径为0.2nm的纳滤机脱盐并浓缩，浓缩液用离子过滤器进一步纯化，然后用双效浓缩器进一步浓缩；
步骤d、浓缩液在-42℃预冻1.3h；然后在-30℃、真空度0.10mbar的条件下冻干8.0h，再在-20℃、真空度0.2mbar的条件下解析冻干3.5h，即得到胸腺肽冻干产品。
实施例3
本实施例提供了一种胸腺肽的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤a、选取新鲜羊胸腺100kg，用液氮研磨机进行液氮研磨，作为原料；
步骤b、向原料中加入400L纯化水，搅拌均匀，超声30min后，升温至45℃，加入1.2kg黑曲霉脂肪酶和1.5kg枯草芽孢杆菌蛋白酶，保持30min，再加入0.5kg乳酸菌氨肽酶，保持温度3h，最后升温至95℃，保持10min灭酶；
步骤c、灭酶后用卧锣离心机过滤(离心转速为3800r/min)，过滤液再用三相离心机脱脂纯化；纯化液先用纳滤膜孔径为0.55nm的纳滤机过滤，再用纳滤膜孔径为0.22nm的纳滤机脱盐并浓缩，浓缩液用离子过滤器进一步纯化，然后用双效浓缩器进一步浓缩；
步骤d、浓缩液在-40℃预冻1.35h；然后在-20℃、真空度0.15mbar的条件下冻干8.3h，再在-30℃、真空度0.25mbar的条件下解析冻干4h，即得到胸腺肽冻干产品。
对比例
本实施例提供了一种胸腺肽的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤a、选取新鲜牛胸腺100g，用液氮研磨机进行液氮研磨，作为原料；
步骤b、向原料中加入600mL纯化水，搅拌均匀，超声25min后，升温至40℃，加入100g胰脂肪酶和120g枯草芽孢杆菌蛋白酶，保持35min，然后加入40g乳酸菌氨肽酶，保持温度3.5h，最后升温至93℃，保持12min灭酶；
步骤c、灭酶后用卧锣离心机过滤(离心转速为3600r/min)，过滤液再用三相离心机脱脂纯化；纯化液先用纳滤膜孔径为0.5nm的纳滤机过滤，再用纳滤膜孔径为0.2nm的纳滤机脱盐并浓缩，浓缩液用离子过滤器进一步纯化，然后用双效浓缩器进一步浓缩；
步骤d、浓缩液在-42℃预冻1.3h；然后在-30℃、真空度0.10mbar的条件下冻干8.0h，再在-20℃、真空度0.2mbar的条件下解析冻干3.5h，即得到胸腺肽冻干产品。
效果例
对实施例1～3以及对比例所得产品进行提取率、小分子胸腺肽收率的考察，结果见表1。其中
胸腺肽提取率＝步骤b酶解后所得胸腺肽的质量/原料质量；
小分子胸腺肽收率＝步骤c所得产品中180-500道尔顿的胸腺肽质量/步骤b酶解后所得胸腺肽的质量。
表1
由表1试验结果可见，实施例1～3所得产品中分子量180-500道尔顿的胸腺肽收率可达77.5％以上。实施例2与对比例所用原料均来自于牛胸腺，实施例2的收率明显高于对比例。可见，本发明提供的胸腺肽制备方法具有更高的收率，用该方法生产出的胸腺肽产品具有小而均一的分子量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种胸腺肽的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤a、将新鲜牲畜胸腺进行液氮研磨，作为原料；
步骤b、向所述原料中加入相当于所述原料重量4～6倍的水，超声20～30min，再依次用微生物脂肪酶、内切蛋白酶、外切蛋白酶对所述原料进行酶解；其中所述微生物脂肪酶为假丝酵母菌脂肪酶和/或黑曲霉脂肪酶；
步骤c、固液分离，将所得液体进行脱脂纯化，纳滤，浓缩纯化。
2.根据权利要求1所述的胸腺肽的制备方法，其特征在于，步骤b中所述内切蛋白酶为中性蛋白酶。
3.根据权利要求2所述的胸腺肽的制备方法，其特征在于，所述中性蛋白酶为枯草芽孢杆菌蛋白酶。
4.根据权利要求3所述的胸腺肽的制备方法，其特征在于，所述外切蛋白酶为乳酸菌氨肽酶。
5.根据权利要求4所述的胸腺肽的制备方法，其特征在于，步骤b中酶解的具体操作为：将超声后的原料浆液升温至35～45℃，加入相当于所述原料重量0.8～1.2％的所述微生物脂肪酶和相当于所述原料重量1～1.5％的所述枯草芽孢杆菌蛋白酶，保持30～40min，然后加入相当于所述原料重量0.3～0.5％的所述乳酸菌氨肽酶，保持3.0～4.0h，最后升温至90～95℃，保持10～15min灭酶。
6.根据权利要求1所述的胸腺肽的制备方法，其特征在于，在步骤c中：
所述固液分离的操作为离心后过滤，离心转速为3400～3800r/min；和/或
所述脱脂纯化在三相离心机中进行；和/或
所述浓缩纯化的操作为：将纳滤后的滤液浓缩，用离子过滤器纯化，用双效浓缩器进一步浓缩。
7.根据权利要求1所述的胸腺肽的制备方法，其特征在于，步骤c中所述纳滤的具体操作为：先用孔径为0.45～0.55nm的纳滤膜过滤，滤液用孔径为0.18～0.22nm的纳滤膜脱盐。
8.根据权利要求1所述的胸腺肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将步骤c所得产物进行冻干。
9.根据权利要求8所述的胸腺肽的制备方法，其特征在于，所述冻干的程序为：在-45～-40℃预冻1.25～1.35h，再在-42℃～-20℃、真空度0.10～0.15mbar条件下冻干7.8～8.3h，然后在-10℃～-30℃、真空度0.15mbar～0.25mbar条件下解析冻干3h～4h，即得到胸腺肽冻干产品。
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