CN103450356A

CN103450356A - 一种高纯度胸腺肽的制备方法

Info

Publication number: CN103450356A
Application number: CN2013104346235A
Authority: CN
Inventors: 杨春辉; 李灵娟; 柴保国; 吕凤霞; 张军强
Original assignee: Henan Soar Veterinary Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Henan Soar Veterinary Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-09-23
Filing date: 2013-09-23
Publication date: 2013-12-18

Abstract

本发明公开了一种高纯度胸腺肽的制备方法，包括以下步骤：将处理过的胎牛胸腺与pH为2.5-3.5的纯化水按照质量比为1∶（1-3）的比例进行混合，置于缝隙为8-9μm的胶体磨中研磨得匀浆液，用盐酸调节匀浆液pH为2.5-3.5，再进行研磨，得胸腺匀浆；加热胸腺匀浆至78-82℃，冷却后用NaOH调节胸腺匀浆pH为6.5-6.8，接着离心后取上清液；用超滤膜对上清液进行超滤，得胸腺肽超滤液；浓缩超滤液，胸腺肽浓缩液体积≥原超滤液体积的1/2，浓缩温度≤60℃；用6000道尔顿的超滤膜对浓缩液超滤，即得高纯度胸腺肽溶液。本发明方法简单，操作简便，制得的胸腺肽纯度高、活性强，适于大规模生产。

Description

一种高纯度胸腺肽的制备方法

技术领域

本发明属于生物药品制备技术领域，具体涉及一种高纯度胸腺肽的制备方法。

背景技术

胸腺肽是从冷冻的牛胸腺中经提取、部分变性、超滤等工艺过程制备出的一种具有高活力的混合肽，具有免疫调节作用。传统的胸腺肽制备工艺通常是将清理后的小牛胸腺等经过绞肉机破碎，加入pH2.0-4.0的缓冲溶液超声破碎并加热匀浆后沉淀蛋白，离心用滤纸或者大孔径30KDa滤芯进行过滤，上述的原料来源质量不稳定，且工艺不够精简，浪费较多的原料，得到的胸腺肽含有较多的大分子蛋白，纯度不高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高纯度胸腺肽的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种高纯度胸腺肽的制备方法，包括以下步骤：

（1）将处理过的胎牛胸腺与pH为2.5-3.5的纯化水按照质量比为1∶（1-3）的比例进行混合，置于缝隙为8-9μm的胶体磨中研磨得匀浆液，用盐酸调节匀浆液pH为2.5-3.5，再进行研磨，得胸腺匀浆；

（2）加热胸腺匀浆至78-82℃，保温时间≥10min，冷却后用NaOH调节胸腺匀浆pH为6.5-6.8，然后在4000-6000r/min下离心30-45min，弃去沉淀，取上清液；

（3）用6000道尔顿的超滤膜对上清液进行超滤，得胸腺肽超滤液；

（4）浓缩超滤液，胸腺肽浓缩液体积≥原超滤液体积的1/2，浓缩温度≤60℃；同时，较好的胸腺肽浓缩液的体积≤原超滤液体积的5/7。

（5）用6000道尔顿的超滤膜对胸腺肽浓缩液进行超滤，即得高纯度胸腺肽溶液。

上述方法中，步骤（1）所述胎牛胸腺处理方法为：将冷冻健康的新鲜胎牛胸腺置于纯化水中融化，水温≤40℃，再用纯化水冲洗至无明显血色，控干水分，剥离脂肪、筋膜及结缔组织后，用纯化水漂洗，控干水分。

较好的，步骤（1）中纯化水的pH用盐酸进行调节；胎牛胸腺和纯化水的质量比为1∶1。

上述方法步骤（2）中所述NaOH为10wt%的NaOH水溶液，所述加热在水浴罐中进行，冷却为水浴冷却，冷却温度至25℃。

本发明方法简单，操作简便，制得的胸腺肽纯度高、活性强，适于大规模生产。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的解释说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1

（1）取5kg冷冻的新鲜胎牛胸腺置于40℃纯化水中融化，再用纯化水冲洗至无明显血色，控干水分，剥离脂肪、筋膜及结缔组织后，用纯化水漂洗3次，控干水分；

（2）将处理过的胎牛胸腺与pH为3.5的纯化水按照质量比为1∶3的比例进行混合，置于缝隙为9μm的胶体磨中研磨得匀浆液，用30%盐酸（v/v）调节匀浆液pH为3.5，再进行研磨一次，得胸腺匀浆；

（3）在水浴罐中加热胸腺匀浆至82℃，保温时间10min，冷却后用质量浓度为10%的NaOH水溶液调节胸腺匀浆pH为6.8，然后在6000r/min下离心30min，弃去沉淀，取上清液；

（4）用6000道尔顿的超滤膜对上清液进行超滤，得胸腺肽超滤液；

（5）浓缩超滤液，胸腺肽浓缩液体积为原超滤液体积的1/2，浓缩温度为60℃；

（6）用6000道尔顿的超滤膜对胸腺肽浓缩液进行超滤，得到的高纯度胸腺肽溶液，其中胸腺肽的含量为16mg/ml。

实施例2

（1）取10kg冷冻的新鲜胎牛胸腺置于30℃纯化水中融化，再用纯化水冲洗至无明显血色，控干水分，剥离脂肪、筋膜及结缔组织后，用纯化水漂洗4次，控干水分；

（2）将处理过的胎牛胸腺与pH为2.5的纯化水按照质量比为1∶1的比例进行混合，置于缝隙为8μm的胶体磨中研磨得匀浆液，用20%盐酸（v/v）调节匀浆液pH为2.5，再进行研磨一次，得胸腺匀浆；

（3）在水浴罐中加热胸腺匀浆至78℃，保温时间20min，冷却后用质量浓度为10%的NaOH水溶液调节胸腺匀浆pH为6.5，然后在4000r/min下离心45min，弃去沉淀，取上清液；

（5）浓缩超滤液，胸腺肽浓缩液体积为原超滤液体积的2/3，浓缩温度为50℃；

（6）用6000道尔顿的超滤膜对胸腺肽浓缩液进行超滤，得到的高纯度胸腺肽溶液，其中胸腺肽的含量为24mg/ml。

实施例3

（1）取8kg冷冻的新鲜胎牛胸腺置于35℃纯化水中融化，再用纯化水冲洗至无明显血色，控干水分，剥离脂肪、筋膜及结缔组织后，用纯化水漂洗3次，控干水分；

（2）将处理过的胎牛胸腺与pH为3.0的纯化水按照质量比为1∶2的比例进行混合，置于缝隙为8.5μm的胶体磨中研磨得匀浆液，用10%盐酸（v/v）调节匀浆液pH为3.0，再进行研磨一次，得胸腺匀浆；

（3）在水浴罐中加热胸腺匀浆至80℃，保温时间18min，冷却后用NaOH固体调节胸腺匀浆pH为6.7，然后在5000r/min下离心40min，弃去沉淀，取上清液；

（5）浓缩超滤液，胸腺肽浓缩液体积为原超滤液体积的3/5，浓缩温度为55℃；

（6）用6000道尔顿的超滤膜对胸腺肽浓缩液进行超滤，得到的高纯度胸腺肽溶液，其中胸腺肽的含量为20mg/ml。

利用福林酚测定法对实施例2制得胸腺肽溶液中胸腺肽含量进行检测，具体步骤如下：

试剂：碱性铜试液的制备：取氢氧化钠10g，碳酸钠50g，加水400ml使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g，加水50ml使溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml使溶解，将两液混合，作为乙液。临用前，合并两液，并加水至500ml。

操作方法：(1)对照品溶液的制备：取牛血清白蛋白对照品，加水制成每1ml中含0.3mg的溶液。

(2)供试品溶液的制备：取实施例2制得胸腺肽溶液，稀释100倍得供试品溶液。

(3)标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.0ml、0.1ml、0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml，分别置具塞试管中（分别命名为0-5号管），各加水至1.0ml，再分别加入碱性铜试液1.0ml，摇匀，各加入福林酚试液(取福林试液中的贮备液1→16)4.0ml，立即混匀，置55℃水浴中准确反应5分钟，置冷水浴中10分钟，在650nm的波长处测定吸收度；同时以0号管作为空白。以吸收度为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。

(4)测定法：精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入碱性铜试液”起，依法测定，自标准曲线上查得供试品溶液的浓度，并乘以稀释倍数，最终得实施例2所得胸腺肽溶液浓度为24mg/ml。

利用脱E受体法测定胸腺肽的生物活性，该法系根据胸腺肽可使脱E受体后的胸腺肽细胞恢复其E受体功能，从而反映胸腺肽的生物活性。具体操作如下（下述操作中所述百分比为质量百分比）：

试剂：(1)Hank’s液的制备：将0.3％磷酸二氢钾溶液，0.76％磷酸氢二钠溶液，2％氯化钾溶液及20％氯化钠溶液依次按20:20:20:40比例混合，加葡萄糖1g，溶解混匀，用水稀释至1000ml，并用4％碳酸氢钠溶液调节pH值至7.2～7.3(临用时配制)。

(2)阿氏液的制备：取氯化钠0.420g，枸橼酸0.055g，枸橼酸钠0.766g，葡萄糖2.05g，加水溶解并稀释至100ml，灭菌。

(3)分离液为淋巴细胞分离液。

(4)羊血：取绵羊静脉血5ml，加入5ml阿氏液中，冰箱保存。

(5)固定液的制备：取25％戊二醛溶液，3.5％碳酸氢钠溶液及Hank’s液依次按体积比为1:1:38的比例混合。

(6)姬姆萨染色液原液：取姬姆萨染料0.5g，加甘油33ml，55～60℃加热至姬姆萨染料溶解，冷至室温，加入33ml甲醇，室温放置24小时后，用滤纸过滤，滤液即为原液。密封室温保存。

(7)染色液：取姬姆萨染色液原液2ml，加Hank’s液6ml，摇匀，以每分钟1500转离心10分钟，取上清液待用。

操作方法：(1)脱E受体胸腺肽细胞悬液的制备：取新鲜猪胸腺，去脂肪并剪碎，加Hank’s液使成细胞悬液，经100目筛过滤，每分钟1500转离心4分钟，弃去上清液，加入Hank’s液打匀，将此溶液加入已具有1/3滤液量的分离液的离心管中，以每分钟2000转离心20分钟，小心吸出中间层的细胞，放入另一离心管中，加Hank’s液洗涤，摇匀，以每分钟1500转离心5分钟，弃去上清液，洗涤一次后，在沉淀物中加入Hank’s液，混匀，45℃恒温水浴保温30分钟(每隔5分钟振摇一次)。以每分钟1500转离心4分钟，弃去上清液，再加入Hank’s液，混匀后，置45℃恒温水浴保温30分钟，取出后以每分钟1500转离心5分钟，弃去上清液（用此方法洗涤三次）。最后用Hank’s液适当稀释并计数，使最终浓度为每1ml中4×10⁶个细胞。

(2)绵羊红血球悬液的制备：取羊血，加入Hank’s液，混匀，45℃恒温水浴保温30分钟(每隔5分钟振摇一次)。以每分钟1500转离心4分钟，弃去上清液，再加入适量Hank’s液，混匀后，置45℃恒温水浴保温30分钟，取出后以每分钟1500转离心5分钟，弃去上清液（用此方法洗涤三次），加适量Hank’s液稀释并计数，使最终浓度为脱E受体胸腺肽细胞悬液浓度的9倍。

(3)供试品溶液的制备：取实施例2所得胸腺肽溶液，用Hank’s液配制成每1ml中约含0.2～1mg的溶液。

(4)测定：取小试管6支，其中3支各加Hank’s液0.1ml作对照管，另3支各加实施例2所得胸腺肽溶液0.1ml作测定管，每管中各加脱E受体T细胞悬液0.2ml，37℃保温1小时后，加入绵羊红血球悬液0.2ml，摇匀，以每分钟500转离心3分钟，放入4℃冰箱过夜，次日取出，弃去上清液，每管中各加入固定液一滴，轻轻摇匀，静置10分钟，加入染色液2滴并摇匀，静置15分钟后开始计数，显微镜视野中淡蓝色的较大的细胞为淋巴细胞，共数计数板16个大方格上所有淋巴细胞的个数(不少于200个)，统计其中的E玫瑰花结形成的细胞数(结合3个以上绵羊红细胞的淋巴细胞)，求得结花百分率，取平均值。即为测定管或对照管的平均值。

样品活力=供试品测定管E玫瑰花结百分率－对照管E玫瑰花结百分率，结果表明胸腺肽T细胞活力为27.9%，符合生物制品胸腺肽的T细胞活力标准。

Claims

1.一种高纯度胸腺肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（2）加热胸腺匀浆至78-82℃，保温时间≥10min，冷却后用NaOH调节胸腺匀浆pH为6.5-6.8，然后在4000-6000r/min下离心30-45min，取上清液；

（4）浓缩超滤液，胸腺肽浓缩液体积≥原超滤液体积的1/2，浓缩温度≤60℃；

2.如权利要求1所述的高纯度胸腺肽的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述胎牛胸腺处理方法为：将冷冻健康的新鲜胎牛胸腺置于纯化水中融化，水温≤40℃，再用纯化水冲洗至无明显血色，控干水分，剥离脂肪、筋膜及结缔组织后，用纯化水漂洗，控干水分。

3.如权利要求1所述的高纯度胸腺肽的制备方法，其特征在于，步骤（1）中纯化水的pH用盐酸进行调节；胎牛胸腺和纯化水的质量比为1∶1。

4.如权利要求1所述的高纯度胸腺肽的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述NaOH为10wt%的NaOH水溶液，所述加热在水浴罐中进行，冷却为水浴冷却，冷却温度至25℃。

5.如权利要求1-4任一所述的高纯度胸腺肽的制备方法，其特征在于，所得高纯度胸腺肽溶液的多肽含量≥16mg/ml。