CN107188988A - 一种生物医用海藻酸钠的纯化方法 - Google Patents

一种生物医用海藻酸钠的纯化方法 Download PDF

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周长忍
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    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
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Abstract

本发明属于生物材料提纯技术领域，公开了一种生物医用海藻酸钠的纯化方法。本发明纯化方法包括以下步骤：(1)将食品级海藻酸钠加入水中溶解后，加入氯仿和正丁醇的混合液，振荡，离心分离水相；(2)往水相中加入活性炭，搅拌后静置，滤膜过滤得到滤液；(3)将滤液滴入凝胶剂中制备凝胶珠，凝胶珠依次用醋酸溶液、柠檬酸钠溶液和乙醇处理；(4)将处理后凝胶珠溶于EDTA‑Na溶液，水透析，分离，冷冻干燥，得到纯化后生物医用海藻酸钠。本发明纯化方法制备过程简单，易操作，纯化过程对海藻酸钠的分子量影响不大，且产物中杂蛋白、多酚和内毒素的含量明显降低，纯化得到的海藻酸钠达到了生物医用级标准，是工业化生产的一种新途径。

Description

一种生物医用海藻酸钠的纯化方法
技术领域
本发明属于生物材料提纯技术领域，特别涉及一种生物医用海藻酸钠的纯化方法。
背景技术
海藻酸钠是从天然褐藻中提取的一种多糖，它是直链型(1→4)键合的β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古洛糖醛酸(G)的无规嵌段共聚物，分子链由一定长度的G嵌段、M嵌段和GM交替嵌段组成。海藻酸钠无毒，无刺激性，能在温和的生理条件下迅速结合钙离子形成水凝胶，并且具有良好的生物相容性。因此在组织修复材料、生化药物控制释放载体、细胞免疫隔离、细胞运输和释放等生物医用领域越来越受到人们的关注。
相关研究发现，海藻酸钠的纯度对材料的生物相容性有着显著影响，常见的污染物主要是蛋白、糖类、脂肪酸、脂多糖、磷脂、内毒素和多酚等。这些促有丝分裂和引发炎症的杂质导致移植部位的纤维组织过度增生，在微囊化免疫隔离中使微囊化细胞的营养物质和氧气运输中断，导致细胞坏死。材料植入体内会引起过敏、发热、出血、甚至休克等不良反应，杂质的存在大大降低了海藻酸钠的生物相容性。
目前我国商品化的海藻酸钠主要为工业级、食品级和药用级，在纺织、印染、食品工业中作为增稠剂、稳定剂、乳化剂和凝胶剂，在医药工业中作为牙科印模材料、止血剂、对放射性元素及有害金属的阻排剂和一些药膏、药片的添加剂。而组织工程用海藻酸钠至今尚未有工业化的产品，甚至关于组织工程用海藻酸钠制备的研究也鲜见报道。本发明从我国现有的工业化海藻酸钠产品出发，公开了一种简单高效的海藻酸钠提纯方法，为实现该类材料在组织工程、免疫隔离等领域的临床应用奠定基础。
发明内容
为了克服上述现有技术中商品化海藻酸钠纯度较低、无法满足生物医用材料要求的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种能够提高产品质量、适用于工业化生产要求的生物医用海藻酸钠的纯化方法。利用本发明纯化方法得到的海藻酸钠中杂蛋白、多酚和内毒素的含量明显降低，生物相容性得到了提高，能够满足植入体内的生物材料的相关指标要求。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种能够提高产品质量、适用于工业化生产要求的生物医用海藻酸钠的纯化方法，包括以下步骤：
(1)将食品级海藻酸钠加入水中溶解后，加入氯仿和正丁醇的混合液，振荡，离心分离水相；
(2)往水相中加入活性炭，搅拌后静置，滤膜过滤得到滤液；
(3)将滤液滴入凝胶剂中制备凝胶珠，凝胶珠依次用醋酸溶液、柠檬酸钠溶液和乙醇处理；
(4)将处理后凝胶珠溶于EDTA-Na溶液，水透析，分离，冷冻干燥，得到纯化后生物医用海藻酸钠。
所述氯仿和正丁醇的混合液中氯仿和正丁醇的体积比为0.5:1～5:1，优选为3:1～4:1。
本发明采用氯仿和正丁醇的混合液对海藻酸钠水溶液进行萃取除去杂质，两溶液的用量按照常规萃取用量即可，如可为体积比1:1。
所用活性炭的量优选为海藻酸钠质量的50～200％。
所述的凝胶剂为多价金属离子盐溶液，可为但不限于氯化钙、硫酸钙、氯化钡、硫酸钡等多价金属离子盐溶液。
所述的凝胶剂的溶液浓度为20～2000mmol/L。
所述将滤液滴入凝胶剂中制备凝胶珠的工艺为本领域常规凝胶珠的制备工艺即可。
所述醋酸溶液的pH范围为2.0～3.0。
所述柠檬酸钠溶液的pH范围为8.0～9.0。
所述乙醇的浓度为50～90％。
所述处理按照本领域凝胶珠常规处理工艺进行即可。如将凝胶珠依次浸泡醋酸溶液、柠檬酸钠溶液和乙醇进行处理。所述处理的时间可为1～48h。
所述用醋酸溶液、柠檬酸钠溶液和乙醇处理时，每次更换介质时都要用水洗后再进行下一步处理。
所述EDTA-Na溶液的浓度范围为100～800mmol/L。
所述将食品级海藻酸钠加入水中溶解得到的溶液浓度可为0.5～5wt％。
为了减少和避免提纯过程中引入新的杂质，所用的水优选为高纯水。
上述纯化方法得到的海藻酸钠，其蛋白、多酚和内毒素含量均显著降低，达到了植入材料的相关标准要求；且纯化处理对海藻酸钠分子量影响较小，处理后材料分子量与原料在相同数量级。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
本发明纯化方法制备过程简单，易操作，纯化过程对海藻酸钠的分子量影响不大，且产物中杂蛋白、多酚和内毒素的含量明显降低，纯化得到的海藻酸钠达到了生物医用级标准，是工业化制备生物医用海藻酸钠的一种有效的新途径。
附图说明
图1为本发明的纯化海藻酸钠试样与原料中蛋白含量的测定结果。
图2为本发明的纯化海藻酸钠试样与原料中多酚含量的测定结果。
图3为本发明的纯化海藻酸钠试样与原料中内毒素含量的测定结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例使用的试剂均可从商业渠道获得。
实施例1
将3g食品级海藻酸钠溶于100mL高纯水中，加100mL氯仿和正丁醇的混合液(氯仿/正丁醇＝4：1)，常温下振荡10h，3000r/min离心分离，在水相海藻酸钠溶液中加入3g活性炭，充分搅拌，静置，滤膜过滤后，将海藻酸钠溶液逐滴滴加到50mM的BaC12凝胶剂中，形成的凝胶珠于pH＝2的醋酸溶液中处理10h，pH＝8.3的柠檬酸钠溶液中处理8h，每次换介质时都要用超纯水洗，之后用50％乙醇处理凝胶珠8h。将珠子溶于200mM EDTA-Na溶液中24h，高纯水中透析3天，透析后的海藻酸钠水溶液经砂芯漏斗过滤，冷冻干燥得到纯化的海藻酸钠样品1.83g，产率为61％。
实施例2
将3g食品级海藻酸钠溶于100mL高纯水中，加100mL氯仿和正丁醇的混合液(氯仿/正丁醇＝3：1)，常温下振荡10h，3000r/min离心分离，在水相海藻酸钠溶液中加入2g活性炭，充分搅拌，静置，滤膜过滤后，将海藻酸钠溶液逐滴滴加到100mM的CaC12凝胶剂中，形成的凝胶珠于pH＝2.5的醋酸中处理10h，pH＝8的柠檬酸钠溶液中处理8h，每次换介质时都要用超纯水洗，之后用75％乙醇处理凝胶珠10h。将珠子溶于300mM EDTA-Na溶液中24h，高纯水中透析5天，透析后的海藻酸钠水溶液经砂芯漏斗过滤，冷冻干燥得到纯化的海藻酸钠样品1.95g，产率为65％。
实施例3
将5g食品级海藻酸钠溶于200mL高纯水中，加100mL氯仿和正丁醇的混合液(氯仿/正丁醇＝4：1)，常温下振荡15h，3000r/min离心分离，在水相海藻酸钠溶液中加入6g活性炭，充分搅拌，静置，滤膜过滤后，将海藻酸钠溶液逐滴滴加到150mM的CaC12凝胶剂中，形成的凝胶珠于pH＝2的醋酸溶液中处理14h，pH＝8.6柠檬酸钠溶液中处理10h，每次换介质时都要用超纯水洗，之后依次用50％和70％乙醇处理凝胶珠16h，之后用纯水洗涤。将珠子溶于400mM EDTA-Na的EDTA-Na溶液中24h，高纯水中透析7天，透析后的海藻酸钠水溶液经0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥得到纯化的海藻酸钠样品1.97g，产率为66％。
以上实施例所得样品的蛋白、多酚和内毒素含量与原料的比较如图1～图3所示，结果表明产物中杂蛋白、多酚和内毒素的含量明显降低，蛋白含量降低到4％以下，多酚含量降低到3AFU以下，内毒素含量降低到100EU/g以下，达到了植入材料的相关标准要求。粘度法测定试样的年均分子量，结果显示提纯后样品的分子量与原料在相同数量级，说明提纯过程对海藻酸钠分子量影响较小。采用实施例中所得的纯化试样与未纯化原料分别制备海藻酸钠膜，在膜表面进行细胞培养，细胞的增殖情况显示，纯化后的海藻酸钠膜上的细胞生长状况明显优于未纯化样品，经过5天培养后纯化海藻酸钠膜上生长的细胞数量已经超过未纯化组的两倍，材料的生物相容性得到了大幅度提高。本发明纯化方法制备过程简单，易操作，纯化过程对海藻酸钠的分子量影响不大，且产物中杂蛋白、多酚和内毒素的含量明显降低，纯化得到的海藻酸钠达到了生物医用级标准，是工业化制备生物医用海藻酸钠的一种有效的新途径。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种生物医用海藻酸钠的纯化方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将食品级海藻酸钠加入水中溶解后，加入氯仿和正丁醇的混合液，振荡，离心分离水相；
(2)往水相中加入活性炭，搅拌后静置，滤膜过滤得到滤液；
(3)将滤液滴入凝胶剂中制备凝胶珠，凝胶珠依次用醋酸溶液、柠檬酸钠溶液和乙醇处理；
(4)将处理后凝胶珠溶于EDTA-Na溶液，水透析，分离，冷冻干燥，得到纯化后生物医用海藻酸钠。
2.根据权利要求1所述的生物医用海藻酸钠的纯化方法，其特征在于：所述氯仿和正丁醇的混合液中氯仿和正丁醇的体积比为0.5:1～5:1。
3.根据权利要求1所述的生物医用海藻酸钠的纯化方法，其特征在于：所述氯仿和正丁醇的混合液中氯仿和正丁醇的体积比为3:1～4:1。
4.根据权利要求1所述的生物医用海藻酸钠的纯化方法，其特征在于：所用活性炭的量为海藻酸钠质量的50～200％。
5.根据权利要求1所述的生物医用海藻酸钠的纯化方法，其特征在于：所述的凝胶剂为多价金属离子盐溶液。
6.根据权利要求1所述的生物医用海藻酸钠的纯化方法，其特征在于：所述的凝胶剂为氯化钙、硫酸钙、氯化钡和硫酸钡中的至少一种的溶液。
7.根据权利要求1所述的生物医用海藻酸钠的纯化方法，其特征在于：所述的凝胶剂的溶液浓度为20～2000mmol/L。
8.根据权利要求1所述的生物医用海藻酸钠的纯化方法，其特征在于：所述醋酸溶液的pH范围为2.0～3.0；所述柠檬酸钠溶液的pH范围为8.0～9.0；所述乙醇的浓度为50～90％。
9.根据权利要求1所述的生物医用海藻酸钠的纯化方法，其特征在于：所述EDTA-Na溶液的浓度范围为100～800mmol/L。
10.一种生物医用海藻酸钠，其特征在于根据权利要求1～9任一项的纯化方法得到。
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