CN110862561A - 一种体内植入用水不溶性海藻酸盐的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及体内植入用天然多糖技术领域，提供了一种体内植入用水不溶性海藻酸盐的制备方法。以市售食品级或药用辅料级水溶性海藻酸盐为原料，经活性炭吸附及微孔滤膜进行过滤，经二价金属盐溶液离子交联形成凝胶；此凝胶经酸性溶液洗脱后经碱性溶液直接溶解，并再次经二价金属盐溶液离子交联形成凝胶，得到水不溶性海藻酸盐沉淀，在无菌条件下经干燥、粉碎得到体内植入用水不溶性海藻酸盐。本发明利用物理吸附和化学螯合的协同作用方法将杂蛋白和内毒素等去除，可以作为体内植入材料使用；其原料成本低廉，制备成本低；制备过程不使用有机溶剂，降低生产、产品应用风险；过程无菌控制，不需终端灭菌，可以更好地保持产品稳定性。

Description

一种体内植入用水不溶性海藻酸盐的制备方法

技术领域

本发明涉及体内植入用天然多糖技术领域，具体涉及一种体内植入用水不溶性海藻酸盐的制备方法。

背景技术

海藻酸(Alginic acid，ALG)是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸通过1-4糖苷键混合共聚连接而成的天然多糖。海藻酸的钠、钾、铵等一价离子盐具有良好的水溶性，成为水溶性海藻酸盐(MALG，M为钠、钾、铵)。MALG溶液遇到Ca²⁺、Ba²⁺等二价离子时，形成不溶性藻酸盐凝胶(DALG，D为钙、钡、铜、锌等)，具有良好的食用安全性，在欧美、日本等国家已被列入食品添加剂，可作为凝胶增稠剂、补钙剂等。同时，DALG具有良好的网络结构、生物相容性和降解性，已广泛的应用于医学和临床研究，是组织工程热点材料之一。

海藻酸盐生物材料已有多年的临床应用历史，具有很好的临床安全性和有效性，海藻酸盐生物材料在人体内降解速率低，具有生物惰性和仿生结构，能够很好的维持细胞和组织表型。我国海藻酸钙医疗器械开发主要集中于创面敷料，已上市的产品多存在低水平重复，高端医疗器械产品研发滞后。北京圣医耀科技有限公司首先开发出拥有自主知识产权的海藻酸钠微球栓塞剂，可用于肿瘤治疗，器官消融，脑、脊髓神经介入栓塞和控制出血。更值得关注的是，海藻酸盐生物材料在一些急需解决的临床难题的治疗研究方面显示出良好的潜力和应用前景，相关报道在国内外前沿学术期刊中报道，并有相关专利申请，如中国专利CN103480037B，公开了心肌注射海藻酸盐水凝胶治疗心力衰竭、心肌梗死。将海藻酸盐水凝胶注射植入到左心室壁中，作为填充物起到支撑心室壁的作用，降低心室壁应力，增加射血分数，从而阻止心衰的恶化。

由于海藻酸盐原材料来源的特殊性，杂质的种类多样，控制困难，而杂质含量与产品质量密切相关。提取过程中残留的或由外界带入的杂蛋白、多酚及内毒素等杂质是影响材料生物相容性、制约临床应用的主要因素(如：杂蛋白可引发海洋多糖生物医用产品移植后的炎症反应及纤维化反应，多酚对宿主的肝、肾脏、黏膜组织、神经系统等可造成严重损伤，内毒素可使机体发热、组织缺氧甚至休克、使肝肾损伤等)。藻酸盐类产品需控制重金属和杂蛋白含量，对于用于组织工程或植入人体的产品还应控制内毒素、杂多酚限量，具体的限量要求还应结合产品的适用范围和使用风险综合评估。

目前国际上海藻酸钙粉末主要为工业级、食品级，在纺织、印染、食品中作为增稠剂、稳定剂、乳化剂和凝胶剂，而体内植入用的海藻酸钙粉末至今尚未有工业化的产品，甚至关于组织工程用的海藻酸钙制备的研究都鲜有报道。国内已公开的体内植入用海藻酸钙制备方法主要有专利CN105504087B、CN110387051A。两种工艺均需要使用无菌、无热源的海藻酸钠作为原料，但满足该标准的海藻酸钠极难获得，每公斤售价达数百万人民币，严重限制了原材料的使用。市售食品级或药用辅料级海藻酸钠等水溶性海藻酸盐廉价易得，每公斤售价仅百元以内，以此作为海藻酸钙等水不溶性体内植入用海藻酸盐生产原料，会大大降低生产成本。CN105504087B将海藻酸钠粉末分散在极性有机溶剂中加入可溶性钙盐来制备海藻酸钙的方法，使用有机溶剂做溶剂，如醇类、丙酮、乙腈等，无疑增加了生产成本和使用风险；专利CN110387051A最终产品需干热灭菌或者伽马灭菌，该灭菌过程将导致分子链断裂而对产品特性产生不可控影响。

发明内容

针对国内尚无经济、有效且适用于规模化、标准化生产的体内植入用海藻酸盐制备方法的现状，提出了一种新的体内植入用水不溶性海藻酸盐制备方法。本发明以市售食品级或药用辅料级水溶性海藻酸盐(MALG)为原料，在高效去除杂蛋白、内毒素等杂质基础上，选择合适的二价金属离子，制备可用于体内植入的水不溶性海藻酸盐(DALG)。该方法原料廉价易得，不引入有机溶剂，易于工业放大，且杂质去除更彻底。

本发明采用以下的技术方案：

一种体内植入用水不溶性海藻酸盐的制备方法，以市售食品级或药用辅料级水溶性海藻酸盐MALG为原料，经活性炭吸附及微孔滤膜过滤，经二价金属D盐溶液离子交联形成凝胶；此凝胶经酸性溶液洗脱后经碱性溶液直接溶解，并再次经二价金属D盐溶液离子交联形成凝胶，得到水不溶性海藻酸盐DALG沉淀，在无菌条件下经干燥、粉碎得到体内植入用水不溶性海藻酸盐DALG。

优选地，所述水溶性海藻酸盐为海藻酸钠、海藻酸钾和/或海藻酸铵。

进一步地，经活性炭吸附及微孔滤膜进行过滤，经二价金属D盐溶液离子交联形成凝胶的具体过程为：

S1.将原料溶解在纯化水中，得水溶性海藻酸盐溶液，浓度为0.2％～5％g/ml；

S2.向水溶性海藻酸盐溶液中加入活性炭，水溶性海藻酸盐原料与活性炭的质量比为5:1～0.1:1，室温条件下机械搅拌0.5～20小时，利用脱碳过滤器除去活性炭，再利用微孔滤膜过滤；

S3.将步骤S2所得海藻酸盐溶液经喷嘴喷入二价金属D盐溶液中形成DALG凝胶微球，经10～90分钟固化过程后，用纯化水充分洗涤DALG凝胶微球。

优选地，所述二价金属D盐溶液中金属D盐离子为Ba²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺或Zn²⁺；二价金属D盐溶液的浓度为50mM～200M。

进一步地，凝胶经酸性溶液洗脱的具体过程为：

将交联形成的凝胶转移至0.1M～2M稀酸溶液中，调节溶液pH 1.0～4.0，浸泡8～48小时，取出凝胶微球用纯化水充分洗涤，完成凝胶的酸性溶液洗脱。

优选地，所述酸溶液为盐酸、醋酸和/或硫酸。

进一步地，经碱性溶液直接溶解，并再次经二价金属D盐溶液离子交联形成凝胶，得到水不溶性海藻酸盐DALG沉淀的具体过程为：

K1.将经酸性溶液洗脱后的凝胶添加0.05M～2M碱性溶液，直至完全溶解，调节溶液pH6.0～8.0，得MALG溶液；

K2.将步骤K1所得MALG溶液无菌过滤，并在无菌条件下以雾滴或液流形式喷入到浓度为50mM-1000mM，pH6.0～8.0二价金属D盐溶液凝固浴中形成凝胶微粒或凝胶纤维，过滤除去滤液并以纯化水洗涤，得到水不溶性海藻酸盐DALG沉淀。

优选地，步骤K1中，所述碱性溶液为碳酸钠溶液、氢氧化钠溶液、碳酸钾溶液、氢氧化钾溶液和/或氨水。

优选地，步骤K2中，所述无菌过滤为使用0.22μm混合纤维素酯膜。

进一步地，在无菌条件下经干燥、粉碎的具体过程为：在无菌环境下，将得到的沉淀在无菌环境中冷冻干燥，并按需要粉碎至颗粒直径50～300μm，得到体内植入用水不溶性海藻酸盐。

本发明具有的有益效果是：

1、本发明所制备的水不溶性海藻酸盐DALG，利用物理吸附和化学螯合的协同作用方法将杂蛋白和内毒素等去除，可以作为体内植入材料使用；

2、本发明以市售食品级或药用辅料级水溶性海藻酸盐MALG作为原料，廉价易得，大大降低生产成本；

3、制备过程不使用有机溶剂，降低生产、产品应用风险；

4、过程无菌控制，不需湿热、干热、射线辐照等终端灭菌，能够更好地保持产品稳定性。

附图说明

图1为不同方法制备海藻酸钙杂蛋白含量检测结果；

其中，a为标准曲线；b中A为市售食品级海藻酸钙，B为采用食品级海藻酸钠为原料按专利CN105504087B方法制备的海藻酸钙，C为采用食品级海藻酸钠为原料按专利CN110387051A方法制备的海藻酸钙，D为本发明制备的海藻酸钙；

图2为不同方法制备海藻酸钙中内毒素含量检测结果；

其中，a为标准曲线；b中A为市售食品级海藻酸钙，B为采用食品级海藻酸钠为原料按专利CN105504087B方法制备的海藻酸钙，C为采用食品级海藻酸钠为原料按专利CN110387051A方法制备的海藻酸钙，D为本发明制备的海藻酸钙。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行具体的说明：

一种体内植入用水不溶性海藻酸盐的制备方法，以市售食品级或药用辅料级水溶性海藻酸盐MALG为原料，经活性炭吸附及微孔滤膜进行过滤，经二价金属D盐溶液离子交联形成凝胶；此凝胶经酸性溶液洗脱后经碱性溶液直接溶解，并再次经二价金属D盐溶液离子交联形成凝胶，得到水不溶性海藻酸盐DALG沉淀，在无菌条件下经干燥、粉碎得到体内植入用水不溶性海藻酸盐DALG。

具体地，包括以下步骤：

(1)将市售食品级或药用辅料级水溶性海藻酸盐MALG(所述水溶性海藻酸盐为海藻酸钠、海藻酸钾和/或海藻酸铵)为原料，将原料溶解在纯化水中，得水溶性海藻酸盐溶液，浓度为0.2％～5％g/ml；

(2)向水溶性海藻酸盐溶液中加入活性炭，水溶性海藻酸盐原料与活性炭的质量比为5:1～0.1:1，室温条件下机械搅拌0.5～20小时，利用脱碳过滤器除去活性炭，再利用微孔滤膜(0.8μm混合纤维素酯膜)过滤；

(3)将步骤(2)所得海藻酸盐溶液经喷嘴喷入二价金属D盐溶液中形成DALG凝胶微球，经10～90分钟固化过程后，用纯化水充分洗涤DALG凝胶微球；

所述二价金属D盐溶液中金属D盐离子为Ba²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺或Zn²⁺；二价金属D盐溶液的浓度为50mM-200M。

(4)将交联形成的DALG凝胶微球转移至0.1M～2M稀酸溶液中，调节溶液pH 1.0～4.0，浸泡8～48小时，取出凝胶微球用纯化水充分洗涤，完成凝胶的酸性溶液洗脱；

所述酸溶液为盐酸、醋酸和/或硫酸。

(5)将经酸性溶液洗脱后的凝胶添加0.05M～2M碱性溶液，直至完全溶解，调节溶液pH 6.0～8.0，得MALG溶液；

所述碱性溶液为碳酸钠溶液、氢氧化钠溶液、碳酸钾溶液、氢氧化钾溶液和/或氨水。

(6)将步骤(5)所得MALG溶液无菌过滤(0.22μm混合纤维素酯膜)，并在无菌条件下以雾滴或液流形式喷入到浓度为50mM-1000mM，pH6.0～8.0二价金属D盐溶液(二价金属离子为Ba²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺或Zn²⁺)凝固浴中形成凝胶微粒或凝胶纤维，过滤除去滤液并以纯化水洗涤；

(7)在无菌环境下，将得到的沉淀在无菌环境中冷冻干燥，并按需要粉碎至颗粒直径50～300μm，得到体内植入用水不溶性海藻酸盐DALG。

实施例1

1.将市售食品级海藻酸钠10g加入到2L蒸馏水中，使用机械搅拌进行溶解，机械搅拌转速为1500rpm，搅拌时间为6小时，得到含量为0.5％(w/v，g/ml)的海藻酸钠溶液；

2.向步骤1所得溶液中加入50g活性炭，室温下机械搅拌6小时，脱碳过滤器滤去活性炭，滤液再依次经0.8μm的混合纤维素酯膜过滤，除去海藻酸钠溶液中残留的水不溶性杂质；

3.将步骤2得到的海藻酸钠溶液，通过喷嘴喷入10L含量为1％的(w/v，g/ml)氯化钙溶液中，反应形成凝胶球，60分钟后捞出，使用纯化水洗涤2次；

4.将步骤3中得到的凝胶球浸泡到5L稀盐酸(pH 3.0)溶液中，8小时后将凝胶微球滤出，纯化水洗涤2次；

5.向步骤4所得凝胶微球中加入浓度为0.5M、pH 12.0碳酸钠溶液，边搅拌边溶解，形成海藻酸钠溶液，最终溶液调节至pH 7.5。

6.将步骤5所得的NaALG溶液无菌过滤(0.22μm混合纤维素酯膜)，并在无菌条件下通过喷嘴喷入2％氯化钙中形成凝胶微粒，过滤除去滤液并以纯化水洗涤凝胶3次。

7.将步骤6所得沉淀在无菌环境中冷冻干燥，并按需要粉碎至100％通过80目，得到体内植入用水不溶性海藻酸钙。

所制得的体内植入用水不溶性海藻酸钙的外观为白色粉末，而市售食品级海藻酸钙的外观为淡黄色粉末。

采用瑞士TECAN公司Ifinite M200PRO多功能酶标仪以BCA法测定不同方法制备的海藻酸钙中杂蛋白残余量。其结果见图1所示，本发明的标准曲线见图1中a所示；不同方法制备海藻酸钙杂蛋白含量见图1中b所示，市售食品级海藻酸钙中的杂蛋白的含量为0.416％(图1-b-A)，按专利CN105504087B(图1-b-B)、CN110387051A(图1-b-C)处理方法，以市售食品级海藻酸钠为原料制备得到的海藻酸钙杂蛋白含量分别为0.321％、0.275％，本发明制备的海藻酸钙中杂蛋白含量为0.098％(图1-b-D)。结果表明：本发明制备的海藻酸钙中杂蛋白去除率约为76％，效果最好。

采用美国ACC公司PKF64细菌内毒素检测仪，按照《中华人民共和国药典》(2015版)四部通则1143规定的浊度法进行测定不同纯化方法制备的海藻酸钙中内毒素物质残余量。本发明的标准曲线见图2中a所示；不同方法制备海藻酸钙中内毒素含量见图2中b所示，市售食品级海藻酸钙中内毒素含量为7.3X10⁵EU/g(图2-b-A)，按专利CN105504087B(图2-b-B)、CN110387051A(图2-b-C)处理方法，以市售食品级海藻酸钠为原料制备得到的海藻酸钙内毒素含量分别为5.2X10⁵EU/g、9.7X10⁴EU/g，本发明制备的海藻酸钙内毒素含量为1.09X10²EU/g(图2-b-D)。结果表明，本发明制备的海藻酸钙中内毒素去除率达98.5％，效果最好。

实施例2

1.将市售食品级海藻酸钠20g加入到1L蒸馏水中，使用机械搅拌进行溶解，机械搅拌转速为1500rpm，搅拌时间为3小时，得到含量为2％(w/v，g/ml)的海藻酸钠溶液；

2.向步骤1所得溶液中加入40g活性炭，室温下机械搅拌8小时，脱碳过滤器滤去活性炭，滤液再依次经0.8μm的混合纤维素酯膜过滤，除去海藻酸钠溶液中残留的水不溶性杂质；

3.将步骤2得到的海藻酸钠溶液，经喷嘴喷入5L含量为2％的(w/v，g/ml)氯化钙溶液中，反应形成凝胶球，30分钟后捞出，使用纯化水洗涤2次；

4.将步骤3中得到的凝胶球浸泡到5L稀醋酸(pH 3.0)溶液中，12小时后将凝胶微球过滤出来，纯化水洗涤2次，重复泡稀醋酸酸一次，过滤微球并再次纯化水洗涤；

5.向步骤4所得凝胶微球中加入浓度为0.3M氢氧化钠溶液，边搅拌边溶解，形成海藻酸钠溶液，最终溶液调节至pH8.0。

6.将步骤5所得的NaALG溶液无菌过滤(0.22μm混合纤维素酯膜)，并在无菌条件下以液流形式喷入1％氯化钡溶液中，过滤除去滤液并以纯化水洗涤凝胶3次。

7.将步骤6所得沉淀在无菌环境中冷冻干燥，并按需要粉碎至特性目数得到体内植入用海藻酸钡。

实施例3

1.原料为海藻酸钾，其他条件同实施例1。

2.同实施例1；

3.同实施例1；

4.同实施例1；

5.碱溶液为氢氧化钾，其余同实施例2；

6.同实施例1；

7.同实施例1。

当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种体内植入用水不溶性海藻酸盐的制备方法，其特征在于，以市售食品级或药用辅料级水溶性海藻酸盐为原料，经活性炭吸附及微孔滤膜进行过滤，经二价金属盐溶液离子交联形成凝胶；此凝胶经酸性溶液洗脱后经碱性溶液直接溶解，并再次经二价金属盐溶液离子交联形成凝胶，得到水不溶性海藻酸盐沉淀，在无菌条件下经干燥、粉碎得到体内植入用水不溶性海藻酸盐。

2.根据权利要求1所述的一种体内植入用水不溶性海藻酸盐的制备方法，其特征在于，所述水溶性海藻酸盐为海藻酸钠、海藻酸钾和/或海藻酸铵。

3.根据权利要求1所述的一种体内植入用水不溶性海藻酸盐的制备方法，其特征在于，经活性炭吸附及微孔滤膜进行过滤，经二价金属盐溶液离子交联形成凝胶的具体过程为：

S1.将原料溶解在纯化水中，得水溶性海藻酸盐溶液，浓度为0.2％～5％g/ml；

S2.向水溶性海藻酸盐溶液中加入活性炭，水溶性海藻酸盐原料与活性炭的质量比为5:1～0.1:1，室温条件下机械搅拌0.5～20小时，利用脱碳过滤器除去活性炭，再利用微孔滤膜过滤；

S3.将步骤S2所得海藻酸盐溶液经喷嘴喷入二价金属盐溶液中形成凝胶微球，经10～90分钟固化过程后，用纯化水充分洗涤凝胶微球。

4.根据权利要求3所述的一种体内植入用水不溶性海藻酸盐的制备方法，其特征在于，所述二价金属盐溶液中金属盐离子为Ba²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺或Zn²⁺；二价金属盐溶液的浓度为50mM-200M。

5.根据权利要求1所述的一种体内植入用水不溶性海藻酸盐的制备方法，其特征在于，凝胶经酸性溶液洗脱的具体过程为：

将交联形成的凝胶转移至0.1M～2M稀酸溶液中，调节溶液pH 1.0～4.0，浸泡8～48小时，取出凝胶微球用纯化水充分洗涤，完成凝胶的酸性溶液洗脱。

6.根据权利要求5所述的一种体内植入用水不溶性海藻酸盐的制备方法，其特征在于，所述酸溶液为盐酸、醋酸和/或硫酸。

7.根据权利要求1所述的一种体内植入用水不溶性海藻酸盐的制备方法，其特征在于，经碱性溶液直接溶解，并再次经二价金属盐溶液离子交联形成凝胶，得到水不溶性海藻酸盐沉淀的具体过程为：

K1.将经酸性溶液洗脱后的凝胶添加0.05M～2M碱性溶液，直至完全溶解，调节溶液pH6.0～8.0；

K2.将步骤K1所得溶液无菌过滤，并在无菌条件下以雾滴或液流形式喷入到浓度为50mM-1000mM，pH6.0～8.0二价金属盐溶液凝固浴中形成凝胶微粒或凝胶纤维，过滤除去滤液并以纯化水洗涤，得到水不溶性海藻酸盐沉淀。

8.根据权利要求7所述的一种体内植入用水不溶性海藻酸盐的制备方法，其特征在于，步骤K1中，所述碱性溶液为碳酸钠溶液、氢氧化钠溶液、碳酸钾溶液、氢氧化钾溶液和/或氨水。

9.根据权利要求7所述的一种体内植入用水不溶性海藻酸盐的制备方法，其特征在于，步骤K2中，所述无菌过滤为使用0.22μm混合纤维素酯膜。

10.根据权利要求1所述的一种体内植入用水不溶性海藻酸盐的制备方法，其特征在于，在无菌条件下经干燥、粉碎的具体过程为：在无菌环境下，将得到的沉淀在无菌环境中冷冻干燥，并按需要粉碎至颗粒直径50～300μm，得到体内植入用水不溶性海藻酸盐。

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