CN114096289A - 含有骨无机质成分的复合脱钙骨组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用一步法制备复合脱钙骨组合物的制备方法。根据本发明的复合脱钙骨组合物通过生物体源骨制备得到。此外，通过本发明制备的复合脱钙骨组合物中，按照骨原有比例含有骨无机质，可以提供最接近于体内骨形成环境的无机质含量条件。另外，含有骨形成蛋白质(BMP‑2)，从而可以带来稳定且优异的骨形成效果。

Description

含有骨无机质成分的复合脱钙骨组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种含有骨无机质和脱钙骨的复合脱钙骨组合物及其制备方法。另外，本发明涉及一种含有骨无机质、脱钙骨及高分子赋形材的复合剂型骨移植用组合物。
具体来说，本发明是从生物体源骨(bone)得到的骨无机质，按照与骨原有比例相似的组成比例，与脱钙骨混合而成的复合无机质-脱钙骨(以下简称复合脱钙骨)组合物，制备其的制备方法一步法，以及，维持复合脱钙骨组合物的剂型的生物体源高分子赋形材。
背景技术
随着人口的老龄化、产业社会的多样化、外科事故率的增加以及医疗手术的发展等，用于骨再生的骨移植材料的需求和必要性不断增加，对具有更安全、更有效、更优异的骨再生能力的骨移植材料，对其技术要求也越来越高。
通常，骨移植材料可以分为自体骨移植材料、异种骨移植材料、合成骨移植材料和同种异体骨移植材料等。自体骨移植(autograft)与非自体骨移植或合成骨移植相比，相对来说，由于没有排异反应而具有比较自由的优点。就自体骨移植而言，不仅是移植患者骨的基质，自细胞也一起移植，因此在骨的再生能力(Osteogeness)方面，与其他移植材料相比相对有利，且骨诱导能力(Osteoiductivity)和骨传导能力(Osteoconductivity)上具有优点。然而，难以获得手术所需的自体骨充分量，也难以获得所需形状的自体骨。而且，在供骨部的追加手术中可能会发生切开、出血、血肿和骨折和需要输血，还会发生神经损伤、感觉消失和供骨部的慢性疼痛和不稳定性等问题。虽然异种骨移植材料没有骨诱导能力，但为了弥补采取自体骨的缺点而提出。但是，上述异种骨移植材料的骨生成速度及新生骨形成能力与自体骨及同种骨相比，具有较低的缺点。没有骨诱导能力的合成骨移植材料是利用天然珊瑚提取碳酸钙，或者采用化学方法使用碳酸钙和磷酸钙制成而得。由于以钙与磷的比例(Ca/P ratio)为1.67的方式合成，这与人体骨组织中的钙与磷的比例(Ca/P ratio)类似。虽然在人体内具有低毒的优点，但合成材料的体内吸收率问题和强度低等问题仍为缺点。最后，与自体骨移植材料不同，同种异体骨移植材料由于没有成骨细胞，因此没有直接的骨再生能力。此外，没有使骨原细胞受刺激而分化成骨细胞的骨诱导能力，只有骨传导性能力，即提供待植入的患处的邻近组织中用于骨形成的空间。然而，同种异体骨移植材料的优点在于，可以获得足够数量的用于手术的移植材料，所以无需艰难地获取自体骨。同种异体骨移植材料只有骨传导能力而没有骨诱导的原因是被磷酸钙(一种矿物质)捕获的骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)不能正常工作。因此，脱钙骨(脱矿骨基质(Demineralized Bone Matrix)，DBM)是为使BMP适当参与骨诱导而开发的同种异体骨移植材料。一般来说，脱钙骨是通过从骨头中去除无机质成分的脱钙过程形成的。脱钙通常利用酸性溶剂，根据酸性溶剂的种类，存在多种脱钙方法。由于这种脱钙步骤，脱钙骨在原来的骨中除去无机质的有机质成分(细胞外基质及微量的骨形成蛋白质)被去除，因此存在如下工艺上的缺点，即在有助于形成骨的骨无机质缺乏的情况下制备。
骨无机质占人体骨的65～70％，骨无机质是有助于骨再生的成分，由钙(Ca)、磷(P)、铁(Fe)、钾(K)、镁(Mg)、钠(Na)和锌(Zn)等构成。上述骨无机质大部分都是由钙和磷组成的羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HAp)的形式存在，且含有微量的铁、钾、镁、钠、锌等矿物质。合成HAp产品是只有钙和磷组成的单一组成，显然与实际人体骨无机质的矿物质组成比率不尽相同。
将能够从同种骨中得到的骨无机质与脱钙骨一起移植的情况下，能够形成与人体在自然状态下的骨形成条件非常接近的环境，作为骨无机质，氢氧化磷灰石系列的骨移植材料具有骨传导能力，由同种异体骨移植材料制成的脱钙骨的骨诱导能力也非常优异。因此，将骨无机质和脱钙骨一起移植的情况与只使用脱钙骨的情况相比，还包括骨形成能力和骨传导能力，能够提供相对优秀的骨形成能力。本发明的骨移植用复合脱钙骨组合物，不仅含有骨无机质成分，还包括脱钙骨成分，因此同时具备了骨形成所需的骨传导能力和骨诱导能力。同时，骨无机质具有骨形成所必要的矿物质，因此具有优秀的骨形成能力。
通常，在制备脱钙骨时，只获取脱钙骨，脱钙后生成的脱钙溶液将废弃。或者，将获得脱钙骨的过程和从脱钙骨溶液中提取骨无机质成分的过程分为不同的制备过程进行，即，利用两步法制备脱钙骨粉末和骨无机质粉末的两种产物。在两步法中，在脱钙之后，脱钙骨和脱钙骨溶液完全分离，脱钙骨经过数次清洗后，通过冻结干燥过程，获得粉末状态的脱钙骨。另一方面，分离回收的脱钙溶液依次经过过滤、中和、离心分离、蒸馏水清洗、冻结干燥等过程后，得到细微粉末状态的骨无机质粉末。在这种重复的制备过程中，脱钙骨和骨无机质在最终获取前都会发生损失。另外，即使以脱钙骨或骨无机质中任意一组分为基准混合，也不能满足骨原有的组成成分比例。也就是说，如果没有人为被丢弃的产物，那么在脱钙骨和骨无机质混合时，只能以任意比例混合。
另外，在两步法中，作为从脱钙溶液中获得骨无机质的必须工艺，使用通过pH滴定的中和方法，通常使用NaOH，滴定的pH范围为6.0～7.5左右。在中和反应之后，从脱钙溶液中作为沉淀物生成骨无机质成分，从脱钙骨中游离出的蛋白质形态的部分生物活性物质也和骨无机质一起作为沉淀物生成。例如，当pH6.2以上时，BMP-2作为沉淀物生成，当pH为6.2以下时，BMP-2是被溶解的状态。作为制备骨无机质的现有技术，并没有公开脱钙骨中游离出的这些生物活性物质与骨无机质一起获取的方法。而且，现有技术中，在骨无机质沉淀过程之后，通过使用蒸馏水实施精制和清洗过程，获得了精制的骨无机质粉末，在用蒸馏水进行数次清洗的过程中，生物活性物质将再次溶解在蒸馏水中而发生损失现象。
因此，在本发明提出，无需通过各自的制备过程将脱钙骨和骨无机质分别制备，而是在一个制备方法中，可以同时获得脱钙骨和骨无机质的一步法，本发明提供了复合脱钙骨组合物的制备方法，维持骨无机质含量比率最接近于原始的人体骨所含有的无机质组成比率。
此外，在本发明中，还提供通过一步法中使用弱酸溶剂，将BMP-2等一部分生物活性物质暴露于脱钙骨外部的方法，以及制备在脱钙骨以及骨无机质时，可同时获得暴露的生物活性物质的方法。
另外，在本发明中，提出能够最大限度地提高骨形成的生物适应性水凝胶成型的赋形材制备方法，本发明的组合物在体内移植时，不会分散到粉末状态，而是以患处为中心，很好地凝集在一起的状态下得以移植。具体来说，本发明将在通过一步法获得的复合脱钙骨组合物中，适用包括生物体源的高分子玻尿酸的赋形材，提出成形性优秀的膏状(paste)骨移植用组合物的制备方法。
非专利文献
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发明内容
本发明的目的在于提供一种复合脱钙骨组合物及其制备方法，含有从生物源性骨中获得的骨无机质，且含量最接近人体骨本来的组成比例。
另外，本发明的目的是提供一种复合脱钙骨组合物及其制备方法，含有对骨生长和骨形成有效的生物活性物质。
另外，本发明的目的是提供一种复合脱钙骨组合物的一步法的制备方法，所含骨无机质符合骨本来的组成比例。
另外，本发明的目的在于提供一种糊状(paste)骨移植用组合物，为了提高优秀的凝集性和医疗目的的使用便利性，使用生物相容性高分子赋形材。
本发明是提供利用一步法制备复合脱钙骨(Demineralized bone matrix(DBM)complex)组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
脱钙步骤，用酸溶液对骨组织进行脱钙处理；
骨无机质析出步骤，用碱溶液中和上述脱钙处理过的脱钙溶液，析出骨无机质；
BMP-2提取步骤，离心分离上述析出完成的溶液，在沉淀物中加入酸溶液，提取BMP-2；以及
复合脱钙骨组合物制备步骤，用碱溶液中和上述提取BMP-2的溶液，析出脱钙骨、骨无机质和BMP-2。
另外，本发明还提供复合脱钙骨组合物，其利用上述一步法制备的制备方法制备得到，含有脱钙骨、骨无机质和BMP-2。
另外，本发明进一步提供骨移植用组合物，包含上述的复合脱钙骨组合物；以及生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物。
发明效果
在本发明中，脱钙骨和骨无机质无需通过各自的获取过程，在一个制备方法(One-step工艺)中，可以同时获得上述脱钙骨和骨无机质，可以制备出最接近人体骨所含的骨无机质组成比例的骨无机质含量比率的复合脱钙骨组合物。
因此，根据本发明的一步法制备的复合脱钙骨组合物，按照骨原有的组成比例含有从生物源性骨中获得的骨无机质，可以提供最接近于体内骨形成环境的无机质含量条件，从而更加稳定。另外，含有充分的体现出骨生长和骨形成效果的蛋白质，骨传导能力和骨诱导能力非常优异。因此，可以带来优异的骨形成效果。
另外，在本发明中，复合脱钙骨组合物与水凝胶(hydrogel)性状的赋形材混合，在体内移植时不会分散为粉末状态，而是以患处为中心凝集的状态移植，将骨形成最大化，且可以赋予生物相容性。
附图说明
图1是通过一步法和两步法制备的复合脱钙骨组合物的收率及上述复合脱钙骨组合物内BMP-2含量测定的结果。
图2示出复合脱钙骨组合物中骨无机质的SEM图像。
图3示出对骨无机质所具有的固有结晶结构的X射线衍射分析结果。
图4表示根据本发明的HA-CMC赋形材(载体)的制备过程。
图5表示根据本发明实施例制备的HA-CMC赋形材及复合脱钙骨组合物的复数粘度测量结果。
图6表示根据本发明实施例制备的复合脱钙骨组合物的ALP测定(assay)结果。
图7和8显示了体内(In vivo)骨诱导能力评价结果。
具体实施方式
本发明涉及利用一步法制备复合脱钙骨(Demineralized bone matrix(DBM)complex)组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
脱钙步骤，用酸溶液对骨组织进行脱钙处理；
骨无机质析出步骤，用碱溶液中和上述脱钙处理过的脱钙溶液，析出骨无机质；
BMP-2提取步骤，离心分离上述析出完成的溶液，在沉淀物中加入酸溶液，提取BMP-2；以及
复合脱钙骨组合物制备步骤，用碱溶液中和上述BMP-2提取过的溶液，析出脱钙骨、骨无机质和BMP-2。
通过本发明的实施例，通过一步法制备复合脱钙骨组合物，确认到上述制备的复合脱钙骨组合物具有最接近于人体骨所含的骨无机质组成比例的骨无机质含量比率。
另外，制备包含上述复合脱钙骨组合物和生物相容性高分子的交联物(HA-CMC赋形材)的骨移植用组合物，确认到上述骨移植用组合物具有优异的粘弹性特性。另外，对上述骨移植用组合物进行了体内(In vivo)实验，确认了根据本发明的组合物具有优异的骨诱导能力。
以下，更详细地说明本发明的复合脱钙骨组合物的制备方法。
在本发明中，术语脱钙骨(Demineralized Bone Matrix，DBM)被称为脱钙骨基质，作为半透明且柔软的橡胶形态的物质，包含促进骨生长的骨形成蛋白质(BMP；BoneMorphogenetic Protein)。上述脱钙骨(DBM)为促进骨形成的移植材料的好原料。
在本发明中，术语脱钙(Demineralized)是指脱矿，是指在含有钙等无机质的生物组织中使用螯合剂(chelating agent)等提取无机质。一般来说，脱钙骨的“脱钙溶液”中含有大量构成人体骨头的磷酸钙等无机质成分。
在本发明中，术语一步法是指，不会通过各自的制备过程分离制得脱钙骨和骨无机质，而是在一个反应器内同时制备脱钙骨和骨无机质。
另外，在本发明中，由于一步法可以同时获得脱钙骨和骨无机质，因此可以将上述一起获得的组合物称作复合脱钙骨(复合无机质-脱钙骨)组合物。
一般来说，骨移植用组合物含有脱钙骨和骨无机质，在制备上述骨移植用组合物时，利用独立的制备过程分开进行的两步法，分别经过制备脱钙骨的过程和从脱钙溶液中提取骨无机质成分的过程。这样，利用两步法的制备方法，制备脱钙骨和骨无机质的最终产品之前都会发生损失，即使以脱钙骨或骨无机质中任意产物为基准混合，也不能满足骨原有的组成成分比例。另外，现有的两步法不包括例如BMP-2这样的生物活性物质。
因此，在本发明中，利用一步法制备复合脱钙骨组合物，在一个制备法中可以同时获得脱钙骨和骨无机质，从而简化工程，可以制备出最接近人体骨所含有的无机质组成比例的骨无机质含量比率的组合物。另外，还可以制备含有生物活性物质的组合物。
根据本发明的利用一步法的复合脱钙骨组合物的制备方法，包括以下步骤：(S1)脱钙步骤；(S2)骨无机质析出步骤；(S3)BMP-2提取步骤；以及(S4)复合脱钙骨组合物制备步骤。
在本发明中，在执行步骤(S1)之前，可以追加进行清洗骨组织的清洗步骤。洗涤溶剂可以使用异丙醇、灭菌蒸馏水或它们的混合物。通过上述步骤可以去除骨组织内的杂质。
在本发明中，(S1)脱钙步骤是用酸溶液对骨组织进行脱钙处理的步骤。
在本发明中，骨组织可能是同种源或异种源骨组织。上述同种骨组织是指来自人类的骨组织，异种源骨组织是指人类以外的动物，即来自猪、牛、马等哺乳类的骨组织。
在一个具体例子中，骨组织可能是皮质骨(cortical bone)。
在一个具体例子中，骨组织可以作为粉末提供。这时，骨组织的平均粒径可能是20到800um。
在一个具体例子中，对于酸溶液的种类，只要能对骨组织进行脱钙即可，就不会特别限制，可以使用选自盐酸、EDTA(ethylenediaminettraacetic acid)、甲酸(formicacid)、柠檬酸(citric acid)、乙酸(acetic acid)、硝酸(nitric acid)和亚硝酸(nitrousacid)等组成的组中一个以上的酸溶液。
上述酸溶液的浓度及使用含量可根据选定的酸适当调节。
在一个具体例子中，相对于每1g骨组织，使用0.5到1.5当量浓度(N)的盐酸溶液10到50ml进行脱钙。
在一个具体例子中，脱钙可以在pH 1到3范围内实施。
另外，在一个具体例子中，脱钙可以实施1到10小时。
在本发明中(S2)骨无机质析出步骤是将在步骤(S1)中进行脱钙处理的脱钙溶液用碱溶液中和，从而析出骨无机质的步骤。
上述步骤(S1)完成的脱钙溶液由上清液和沉淀物构成，在这里，沉淀物包含脱钙骨。本发明采用了一步法的制备方法，无需分离上述沉淀物脱钙骨，也可以制备出与人体骨所含的骨无机质组成比例相近的骨无机质含量比例的复合脱钙骨组合物。
在一个具体例子中，碱溶液的种类不受特别限制，可以使用由氢氧化钠(NaOH)和磷酸缓冲溶液(phosphate buffered saline)等组成的组中选择的一个以上。或使用市面上销售的生理盐水、0.9％氯化钠溶液及灭菌蒸馏水多次清洗或添加进行中和。
在一个具体例子中，骨无机质析出步骤可使用0.5至4.0M的氢氧化钠(NaOH)溶液中和。
在一个具体例子中，中和反应进行至脱钙溶液的pH达到5.5到7.0。
另外，在一个具体例子中，骨无机质的析出步骤可以进行0.5到4个小时。
本发明中，(S3)BMP-2提取步骤是，对步骤(S2)中提取结束的溶液进行离心分离，在沉淀物中添加酸溶液提取BMP-2的步骤。
根据上述离心分离，在步骤(S1)中制备的脱钙骨沉淀，并且在步骤(S2)中析出的骨无机质也沉淀，形成沉淀物。因此，在本发明中，可以通过离心分离去除上清液，并获得含有有效成分的沉淀物。
在一个具体例子中，离心分离可以在1000到8000rpm范围内进行10分钟到30分钟，进行离心分离后，可以用灭菌蒸馏水清洗得到的沉淀物。
在一个具体例子中，上述离心分离和清洗可以反复进行1到3次。
另一方面，骨形成蛋白质BMP(Bone Morphogenetic Protein)将参与骨诱导。这种BMP，尤其是BMP-2在pH6.2以上时生成为沉淀物，pH6.2以下为溶解状态。就获得骨无机质的现有技术而言，从骨无机质的沉淀过程开始，通过蒸馏水的精制和清洗过程，获得了精制的骨无机质粉末，在蒸馏水进行数次清洗的过程中，生物活性物质会再次溶解在蒸馏水中消失。
在本发明中，还提供了用于提取BMP-2的另一工艺，可以制备出不仅含有脱钙骨和骨无机质，还含有丰富的生物活性成分的复合脱钙骨组合物。
在一个具体例子中，以提取BMP-2的酸溶液为上述的酸溶液，即盐酸、盐酸胍(guanidine hydrochloride)、EDTA(ethylenediaminetic acid)、甲酸(formic acid)、柠檬酸(citric acid)、乙酸(acetic acid)、硝酸(nitric acid)和亚硝酸(nitrous acid)等组成的组中选择的一个以上的酸溶液。本发明可使用尿素(urea)代替上述酸溶液。
上述酸溶液的浓度及使用含量可根据选定的酸适当调节。
在一个具体例子中，BMP-2提取可以在沉淀物中添加乙酸进行提取。
在一个具体例子中，BMP-2提取可以在pH 4到6.5下进行。在上述pH范围内，BMP-2容易提取，可进行定量。
另外，在一个具体例子中，BMP-2提取可以进行1到72小时。
在本发明中，(S4)复合脱钙骨组合物的制备步骤是，用碱溶液中和步骤(S3)中提取BMP-2的溶液，从而析出脱钙骨、骨无机质和BMP-2的步骤。
在一个具体例子中，碱溶液的种类不受特别限制，可以使用由氢氧化钠(NaOH)和磷酸缓冲溶液(phosphate buffered saline)等组成的组中选择的一个以上。
在一个具体例子中，中和反应可进行至溶液的pH到6.2到6.8。
在一个具体例子中，上述复合脱钙骨组合物制备步骤使用0.5至4.0M的氢氧化钠(NaOH)溶液实施中和，可以析出脱钙骨、骨无机质及BMP-2。
另外，在一具体例子中，上述步骤可执行0.5至72小时。
在本发明中，在进行步骤(S4)复合脱钙骨组合物制备步骤后，还可以实施包括清洗析出物的清洗步骤。
在一个具体例子中，可以用灭菌蒸馏水清洗1到3次的析出沉淀物，也可以进行离心分离。
另外，在本发明中，在进行步骤(S4)复合脱钙骨组合物制备步骤及/或上述清洗步骤后，可以进一步实施干燥步骤。
在具体例子中，干燥可通过冻结干燥实施，上述冻结干燥可在-50至-80℃下进行24至96小时。
在本发明中，干燥物的水分含量在10％以下，优选是1到8％。
根据本发明的制备方法制备的复合脱钙骨组合物，混合脱钙骨和骨无机质时按照与人体骨的组成比例近似范围混合，脱钙骨和骨无机质无需经过各自的制备方法，仅通过一步(One-step)法工艺可以获得复合脱钙骨组合物。
另外，本发明涉及通过上述制备方法制备的复合脱钙骨组合物。
根据本发明，利用一步法制备的复合脱钙骨组合物包含脱钙骨、骨无机质和BMP-2，混合的脱钙骨和骨无机质比例与人体骨组成比例相近似。
在一具体例子中，脱钙骨的含量相对于组合物总重量，可以是5至30重量％，或者，10至20重量％。另外，骨无机质的含量相对于组合物总重量，可以为10至50重量％，或者20至40％重量％。
在一具体例子中，骨无机质可包括34至47重量％的钙、15至21重量％的磷、0.358至0.373重量％的镁、0.079至0.143重量％的钠、0.014至0.015重量％的锌、0.015至0.02重量％的钾及0.00015至0.0025重量％的铁。
在一个具体例子中，复合脱钙骨组合物可以包含1ng/g到100ng/gBMP-2。含量的最小/最大差异可能是起因于供体变异(Donor variation)。
另外，本发明还包括根据上述制备方法制备的复合脱钙骨组合物的骨移植用组合物。
根据本发明的骨移植用组合物可以包含上述复合脱钙骨组合物和生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物。由于上述骨移植用组合物包含生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物，因此具有膏状，可以将上述骨移植用组合物称为骨移植用膏，还可以称为复合脱钙骨膏。
在一个具体例子中，复合脱钙骨组合物可以作为粉末提供，上述粉末的平均粒径可以适当地调节到适合注入生物体的大小。
在一具体例子中，复合脱钙骨组合物的含量相对于骨移植用组合物的总重量(100重量份)，可以是10到90重量份、10到30重量份或20到30重量份。在上述范围内显示出优异的骨再生能力。
在本发明中，生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物可以提高骨移植用组合物的粘弹性特性，提高体内体积维持力。在本发明中，这种生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物可以被称为赋形材(或载体)。
在一个具体例子中，生物相容性高分子的交联物是指化学交联的一种以上的生物相容性高分子。
在一个具体例子中，生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物的分子量可以是10kDa或2MDa。
在一个具体例子中，生物相容性高分子可以使用选自胶原蛋白、玻尿酸、壳聚糖、羧甲基纤维素、藻蛋白酸盐和明胶组成的组中一个以上高分子。
在一个具体例子中，生物相容性高分子的交联物可以是选自由胶原蛋白、玻尿酸、壳聚糖、羧甲基纤维素、藻蛋白酸盐和明胶组成的组中一个以上的生物相容性高分子的交联物。具体来说，本发明可以使用玻尿酸(Sodium hyaluronate，HA)和羧甲基纤维素(Sodiumcarboxymethyl cellulose，CMC)的交联物。
在一个具体例子中，生物相容性高分子由交联剂交联而得，所述交联剂选自丁二醇二缩水甘油醚(1,4-butandiol diglycidyl ether,BDDE)、乙二醇二缩水甘油醚(ethylene glycol diglycidyl ether,EGDGE)、己二醇二缩水甘油醚(1,6-hexanedioldiglycidyl ether)、丙二醇二缩水甘油醚(propylene glycol diglycidyl ether)、聚丙二醇二缩水甘油醚(polypropylene glycol diglycidyl ether)、聚丁二醇二缩水甘油醚(polytetramethylene glycol diglycidyl ether)、新戊二醇二缩水甘油醚(neopentylglycol diglycidyl ether)、聚甘油聚缩水甘油醚(polyglycerol polyglycidyl ether)、双甘油聚缩水甘油醚(diglycerol polyglycidyl ether)、甘油聚缩水甘油醚(glycerolpolyglycidyl ether)、三甲基丙烷聚缩水甘油醚(tri-methylpropane polyglycidylether)、双环氧丙氧基乙烯(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene)、季戊四醇聚缩水甘油醚(pentaerythritol polyglycidyl ether)、山梨糖醇聚缩水甘油醚(sorbitolpolyglycidyl ether)构成的组的一个以上交联剂。
在一个具体例子中，生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物的含量相对于骨移植用组合物总重量(100重量份)，可以为5至90重量份、5至30重量份，或5至20重量份。在上述范围内，可以提高生物相容性高分子的物性。
在一个具体例子中，骨移植用膏的复数粘度为1000到100000Pa·s。复数粘度是指由旋转型流变仪分析仪(频率：0.1～10Hz，温度：25℃，变形率：1％)测量的结果值。
复数粘度(complex visciosity)是振动测定法中计算的频率依赖性粘度，上述数值反映了G’(粘性模量(损失弹性模量)、viscous modulus)、G’(弹性模量(储存弹性模量)、elastic modulus)和测量的振动数值。
在一具体例子中，本发明的骨移植用组合物可以注入或插入人体内。这种骨质移植用组合物可以作为常规的医疗用材料使用。
另外，本发明涉及上述骨移植用组合物的制备方法。
上述骨移植用组合物的制备方法包括，混合复合脱钙骨组合物；以及生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物的步骤。
在本发明中，复合脱钙骨组合物可以使用由上述制备方法制备的复合脱钙骨组合物。
具体而言，包括以下步骤：
脱钙步骤，用酸溶液对骨组织进行脱钙处理；
骨无机质析出步骤，用碱溶液中和上述脱钙处理过的脱钙溶液，析出骨无机质；
BMP-2提取步骤，离心分离上述析出完成的溶液，在沉淀物中加入酸溶液，提取BMP-2；以及
复合脱钙骨组合物制备步骤，用碱溶液中和上述BMP-2提取过的溶液，析出脱钙骨、骨无机质和BMP-2。
在本发明中，生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物可以使用市面上销售的产品。另外，上述交联物可以利用生物相容性高分子在实验室等中制备后使用。
上述生物相容性高分子的交联物可通过以下步骤制备：
利用交联剂将生物相容性高分子的交联的交联步骤；以及
透析上述交联物的透析步骤；以及
粉碎上述透析后的交联物的粉碎步骤。
在本发明中，交联步骤是利用交联剂将生物相容性高分子的交联的交联步骤。在上述步骤中，生物相容性高分子及交联剂可以使用如上所述种类。
在一个具体例子中，生物相容性高分子可以通过酰胺键(amide bond)来结合。
在一个具体例子中，交联剂的含量相对于生物相容性高分子，为0.5到10重量份。
在本发明中，在进行冻结干燥之前，可以进一步实施清洗已交联的反应产物的步骤。此时，清洗溶液可使用磷酸缓冲食盐水(phosphate-buffered saline(PBS)和/或灭菌蒸馏水。
在本发明中，在透析步骤之前，还可以包括实施切断交联物的步骤。
在本发明中，透析步骤可以使用磷酸缓冲溶液进行。
另外，粉碎步骤可以利用本技术领域常用的破碎机进行。本发明可在粉碎步骤前进一步实施冷冻干燥。
在本发明中，复合脱钙骨组合物；以及生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物可以通过物理混合混合得到。
在一具体例子中，在上述物理混合的混合物中，复合脱钙骨组合物的含量可为10至90重量份、10至30重量份或20至30重量份。
另外，在混合物中，生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物含量可为5至90重量份、5至30重量份或5至20重量份。
在一个具体例子中，上述混合物可以在溶剂中溶解生物相容性高分子的交联物后，与复合脱钙骨组合物混合制备。这时溶剂可以使用生理盐水。
本发明可进一步包括上述混合物的灭菌步骤。
通过上述灭菌步骤，可以消除骨移植用组合物内的免疫性(Immunity)，有效地破坏细菌等。
在一个具体例子中，上述灭菌步骤可以进行放射线照射，放射线的照射范围可以是10到30kGy。
另外，本发明涉及所述骨移植用组合物的使用。
根据本发明，骨移植用组合物可以在移植到体内后诱导骨再生。
最佳实施方式
以下，通过实施例更具体地说明本发明。但是，本发明的范围不限定于以下实施例，本领域的技术人员可以理解，在不脱离记载于权利要求的思想导出的技术思想的范围内，可进行多种变形、修改或者应用。
实施例
实施例1.通过一步法(one-step)获得复合脱钙骨组合物
用异丙醇(2-Propanol for analysis
Figure BDA0003459057470000151
ACS,ISO,Reag.Ph Eur、Merck)清洗皮质骨(cortical bone)后，进行了用灭菌蒸馏水清洗的前处理工序。
此后，利用0.5至1.5当量浓度(N)的盐酸溶液(Hydrochloric acid 35.0-37.0％，JUNSEI CHEMICAL CO.，LTD.)10至50ml，在常温下将1g皮质骨进行脱钙4小时。上述脱钙结束后，在上清液和沉淀物组成的混合液中使用0.5至4.0M的氢氧化钠(NaOH、Sodiumhydroxide、Merck)溶液，诱导混合液内析出骨无机质，使得与脱钙骨一起沉淀。将完成沉淀及析出的混合溶液在1000至8000rpm下进行10至30分钟的离心分离，除去上清液。上述离心分离后，去除上清液，用灭菌蒸馏水反复清洗沉淀物1～3次。
将洗好的沉淀物利用乙酸提取BMP-2。提取完成的混合液，使用0.5至4.0M的氢氧化钠溶液，滴定至混合液的pH为6.2至6.8，从而析出脱钙骨、骨无机质和提取的BMP-2。将析出的沉淀物用灭菌蒸馏水清洗1～3次并离心分离后，进行冷冻干燥使得水分含量在10％以下，优选是1～8％的范围。
冷冻干燥完成后获得的物质，即复合脱钙骨组合物，其脱钙骨和骨无机质混合比例与人体骨组成比例近似。在本发明中，脱钙骨和骨无机质没有经过各自的获取工程，仅通过单一工艺就得到复合脱钙骨组合物。
比较例1.通过两步法(two-step)获得复合脱钙骨组合物的粉末
将皮质骨(cortical bone)10g、0.5N的盐酸200ml在室温下搅拌，进行2小时脱钙处理。回收脱钙溶液，回收脱钙骨粉末后，按照DBM加工工艺加工DBM。
为了去除残留的细小骨头粉末，过滤了脱钙溶液。(定性滤纸Wet StrengthenedGrades，Grade 91，10um)在转动磁条(Magnetic bar)的状态下，慢慢添加了5M的氢氧化钠(NaOH)，随时确认pH值，当pH在7.0～7.5时停止了中和过程。将中和溶液从1500rpm中离心分离5分钟后，去除上清液，用蒸馏水清洗5次(1500rpm，每次离心分离5分钟)。最终获得的残留物冷冻干燥或高温干燥。
将完成上述加工的DBM和完成干燥的残留物全部混合，获得复合脱钙骨组合物。
实验例1：利用一步法和两步法的复合脱钙骨组合物的收率及BMP-2含量比较
比较了通过实施例1的一步法制备的复合脱钙骨组合物及比较例1的两步法制备的复合脱钙骨组合物的收率。
图1的A表示比较收率的结果。
如上述图1的A所示，通过本发明的单一工程一步法制备复合脱钙骨组合物时，与分别获得脱钙骨和骨无机质的两步法相比，可以确认到收率优异。
另外，比较了通过实施例1的一步法制备的复合脱钙骨组合物中BMP-2的含量及比较例1的两步法制备的复合脱钙骨组合物中BMP-2的含量。
图1的B表示BMP-2含量比较结果。
如上述图1的B所示，通过一步法制备复合脱钙骨时，可以确认BMP-2含量更佳。
实验例2.人体骨无机质获取方法验证_骨无机质的SEM测定
对在实施例1中获得的复合脱钙骨组合物中的骨无机质进行了SEM(ScanningElectron Microscopy)图的拍摄。
图2表示拍摄后的图像。
如上述图2所示，所获得的骨无机质具有常规自然状态骨无机质所具有的六角柱形态的结晶结构。
实验例3.骨无机质的X射线衍射图(X-Ray Diffraction(XRD)pattern)
在实施例1中获得的复合脱钙骨组合物中，测定了骨无机质的X射线衍射图，确认了骨无机质固有的结晶结构的X射线衍射分析结果。
图3表示了对骨无机质所具有的固有结晶结构的X射线衍射分析结果。
如上述图3所示，骨无机质的固有特征峰值2θ＝25.9、32.0、39.7可以看到峰值。
实验例4.复合脱钙骨组合物的钙/磷(Ca/P)含量比率及矿物质含量比率测定
根据实施例1获得的复合脱钙骨组合物由脱钙骨、骨无机质和BMP-2组成。在本实验例中，从获得的复合脱钙骨组合物中物理分离出骨无机质后，分析了骨无机质含量。
具体而言，获得的每克物质中使用0.5到1.5当量浓度(N)的盐酸溶液10到50ml，将pH降低到1至3，然后取上清液，获得溶解有骨无机质的溶液。之后，使用0.5至4.0M的氢氧化钠(NaOH)溶液，物理析出骨无机质并分离。而且，对于析出物，利用电感耦合等离子体光谱仪(Inductively Coupled Plasma Spectrometer，ICP-OES.PerkinElmer，Optima 8300)分析了上述骨无机质的成分。
分析结果示于表1中。
表1
·ICP-OES(PerkinElmer，Optima 8300)(wt％)
Figure BDA0003459057470000181
(wt％)
Figure BDA0003459057470000182
LOQ：定量限(limit of quantitation)，RSD(％)：相对标准偏差(relativestandard deviation)
Figure BDA0003459057470000183
分析结果显示，组合物中矿物质含量比率与自然状态的人体所构成的骨无机质中矿物质含量比率相似。
测定得到的钙含量比率为34.369重量％至47.687重量％，磷含量比率为15.199重量％至21.235重量％，因此，钙和磷的比率Ca/P数值范围为2.245至2.256。另外，对于只在生物体源骨无机质中存在的矿物质，测定到镁含量为0.358至0.373重量％，钠含量为0.079至0.143重量％，锌含量为0.014至0.015重量％，钾含量为0.015至0.02重量％及铁含量为0.00015至0.0025重量％。
另一方面，根据实施例1制备得到的组合物，以脱钙前原材料为1克骨粉时，经过骨无机质的一步法后，测定得到的骨无机质为0.45克。相反，然而，经过两步法的情况下，测定得到的骨无机质为0.21g(图1A)，此外，经BMP-2测定(assay)结果，测定到提取的BMP-2的含量为，一步法时是56ng/g，经过两步法时是31ng/g(图1B)。
实施例2.骨移植用组合物(复合脱钙骨膏)的制备
(1)玻尿酸/羧甲基纤维素赋形材的制备
根据实施例1制得的复合脱钙骨组合物制备成膏状的骨移植用组合物。为此，首先，由N-乙酰葡糖胺(N-Acetylglucosamine)和葡糖醛酸(Glucuronic acid)组成的生物源性高分子玻尿酸(Sodium Hyaluronate(HA)by Shiido(CAS 9067-32-7)，日本)和羧甲基纤维素(Sodium carboxymethyl cellulose(CMC)与Sigma-Aldrich)，与作为交联剂的BDDE(1,4-丁二醇二缩水甘油醚(1,4-Butanediol diglycidyl ether)，Sigma-Aldrich)混合制备了HA-CMC赋形材(载体)。
具体而言，在加热到50℃的0.2N氢氧化钠水溶液100ml中加入BDDE 1到10ml，与添加有CMC 1到10g的溶液中加入HA1到10g的溶液混合。混合溶液在50℃下加热3小时，经过了交联反应。对于完成交联反应的混合物，在填充有5升磷酸缓冲溶液(Phosphate BufferedSaline，Lonza Walkersville，Inc.)的烧杯(beaker)上利用透析膜(dialysis membrane)(透析管纤维素膜(Dialysis tubing celllose membrane)，Typical molecular weightcut-off＝14000。利用Sigma-Aldrich)，在常温下透析2小时。更换为5升的50％EtOH后，在常温下1小时透析，之后再将5升灭菌蒸馏水装在烧杯(beaker)上，利用透析膜(dialysismembrane)在常温下透析72小时。之后，将HA-CMC赋形材冻结干燥(lyophilization)后粉碎(图4)。
(2)骨移植用组合物(复合脱钙骨膏)的制备
制备的膏状复合脱钙骨组合物中，复合脱钙骨组合物粉末含量为10至30重量％。
首先，将干燥完成的HA-CMC赋形材与灭菌生理盐水以1:9到9:1的比例混合，制备HA-CMC溶液，将复合脱钙骨组合物的粉末和HA-CMC溶液以1:9到9:1的比例最终混合。
之后，进行了伽玛射线(γ射线)灭菌(25kGy)。
由此，将复合脱钙骨组合物制备成膏状组合物。
实验例5.根据HA-CMC赋形材的浓度和复合脱钙骨组合物的粉末含量确认复数粘度
测定了伽玛射线灭菌(25kGy)完成的复合脱钙骨膏的复数粘度(shear rate modeRheometer-AR)。另外，为了寻找成形性优异的最佳组成比例，追加测定了仅HA-CMC赋形材的复数粘度和、与上述赋形材混合的随复合脱钙骨组合物含量的复数粘度。
上述测量结果也在图5中显示。
图5的A表示将HA-CMC赋形材的浓度调节为3种(5重量％、10重量％、20重量％)的HA-CMC溶液的复数粘度测定的结果。
如上述图5的A中所示，当HA-CMC赋形材含量为20％时，与其他含量相比，得到更高的复数粘度。
因此，将最适合成形性的20％浓度的HA-CMC赋形材与复合脱钙骨组合物粉末混合，制备复合脱钙骨膏。这时，将复合脱钙骨组合物的粉末含量分别调节为10～30重量％，测定上述膏的复数粘度。
图5的B示出将复合脱钙骨组合物的含量调节为3种(10重量％、20重量％、30重量％)后，测量的复数粘度的结果。
如上述图5的B所示，当包含30％复合脱钙骨组合物时，复数粘度测定为65000Pa·s。由此判断，这是适合骨移植材料的成形性和凝集力的数值。
实验例6.复合脱钙骨膏的体外(in vitro)骨诱导能力评价
评价了实施例2中制备的复合脱钙骨膏的骨诱导能力。
具体来说，利用前成骨细胞(preosteoblast)MC3T3-E1(C57BL/6mouse的小胎儿(embryo/fetus)的头骨组织(calvaria preosteoblast)分离的细胞ATCC、CRL-2594、2596、2596)进行了体外实验。利用包含成形性性最合适、能够最大限度地提高骨诱导能力的30％的复合脱钙骨组合物的复合脱钙骨膏(使用含有20％的HA-CMC赋形材的HA-CMC溶液)，在细胞株中进行碱性磷酸分解酶活性分析(ALP-assay，Alkaline phosphatase assay)。作为阳性对照组，使用了rhBMP-2；作为活性对照组，使用了10mg脱钙骨；并且作为阴性对照组，使用了HA-CMC赋形材。
在图6中显示上述评估结果。
如上述图6所示，使用根据本发明的复合脱钙骨膏(复合脱钙骨组合物30％)时，与活性对照组和阴性对照组相比，碱性磷酸分解酶活性优异。
实验例7复合脱钙骨膏的体内(in vivo)骨诱导能力评价
将复合脱钙骨组合物或复合脱钙骨膏移植到裸鼠(BALB/c nude mice male，体重22g，8周龄)腹部肌肉(muscle pouch)内，且以脊椎中央线为基准，在其左右两边各移植一个，评价其骨诱导能力。
这时，实验组1采用包含30％的实施例1中制备的复合脱钙骨组合物的样品(One-step脱钙骨移植材料)，实验组2采用包含30％比较例1中制备的复合脱钙骨组合物的样品(Two-step脱钙骨移植材料)，实验组3采用实施例2中制备的复合脱钙骨膏(复合脱钙骨组合物含量25％)的样品(一步法复合脱钙骨组合物膏)，另外实验组4使用了只含有脱钙骨的常用脱钙骨医疗器械产品(只含有脱钙骨的常用脱钙骨移植材料)。
通过利用苏木精和伊红(hematoxylin and eosin)的组织染色照片确认骨再生程度，通过ASTM F 2529 13“含脱矿骨材料(DBM)的骨诱导潜在性体内评估的标准指南(Standard guide for in vivo evalation of osteoinductive potential formaterials containing demineralized bone(DBM))”，按照表2的基准进行了定量评价。
在本发明中，图7表示使用组织染色照片确认的实验组的骨再生程度的结果。
另外，按照表2的基准进行定量评价的结果显示，如图8所示，含有骨无机质的实验组3(One-step process复合脱钙骨组合物膏)显示37％的骨诱导能力，显示4等级，实验组1(One-step脱钙骨移植材料)显示出31％的骨诱导能力，显示4等级，实验组2(Two-step脱钙骨移植材料)为20％，显示2等级。另外，实验组4的常用脱钙骨移植材料为30％，显示了3等级。因此，实验组3的一步法(One step)复合脱钙骨组合物膏比其他实验组的骨诱导能力相对优异。
表2
Figure BDA0003459057470000221
工业利用性
根据本发明的一步法制备的复合脱钙骨组合物，按照骨原有的组成比例含有从生物源性骨中获得的骨无机质，可以提供最接近于体内骨形成环境的无机质含量条件，从而更加稳定。另外，含有充分的体现出骨生长和骨形成效果的蛋白质，骨传导能力和骨诱导能力非常优异。因此，可以带来优异的骨形成效果。
另外，在本发明中，复合脱钙骨组合物与水凝胶(hydrogel)性状的赋形材混合，在体内移植时不会分散为粉末状态，而是以患处为中心凝集的状态移植，将骨形成极大化，可以赋予生物相容性。

Claims (16)

1.一种利用一步法制备复合脱钙骨组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
脱钙步骤，用酸溶液对骨组织进行脱钙处理；
骨无机质析出步骤，用碱溶液中和上述脱钙处理的脱钙溶液，来析出骨无机质；
BMP-2提取步骤，离心分离完成上述析出的溶液，在沉淀物中加入酸溶液来提取BMP-2；以及
复合脱钙骨组合物制备步骤，用碱溶液中和上述提取BMP-2的溶液，从而析出脱钙骨、骨无机质和BMP-2。
2.根据权利要求1所述的利用一步法制备复合脱钙骨组合物的制备方法，其特征在于：骨组织为皮质骨，平均粒径为20～800um。
3.根据权利要求1所述的利用一步法制备复合脱钙骨组合物的制备方法，其特征在于：
脱钙步骤中，针对每1g骨组织，使用10到50ml的、0.5到1.5当量浓度的盐酸溶液进行脱钙处理。
4.根据权利要求1所述的利用一步法制备复合脱钙骨组合物的制备方法，其特征在于：
骨无机质析出步骤中，使用0.5至4.0M的氢氧化钠溶液进行中和。
5.根据权利要求1所述的利用一步法制备复合脱钙骨组合物的制备方法，其特征在于：
BMP-2提取步骤中，在沉淀物中添加乙酸进行提取。
6.根据权利要求1所述的利用一步法制备复合脱钙骨组合物的制备方法，其特征在于：
复合脱钙骨组合物制备步骤中，使用0.5至4.0M的氢氧化钠溶液进行中和，从而析出脱钙骨、骨无机质及BMP-2。
7.根据权利要求1所述的利用一步法制备复合脱钙骨组合物的制备方法，其特征在于，还包含：
在实施复合脱钙骨组合物制备步骤后，对析出的析出物进行干燥的步骤。
8.一种复合脱钙骨组合物，其特征在于：
根据权利要求1所述的利用一步法的复合脱钙骨组合物的制备方法制备得到，其含有脱钙骨、骨无机质和BMP-2。
9.根据权利要求8所述的复合脱钙骨组合物，其特征在于：
骨无机质包含34至47重量％的钙、15至21重量％的磷、0.358至0.373重量％的镁、0.079至0.143重量％的钠、0.014至0.015重量％的锌、0.015至0.02重量％的钾及0.00015至0.0025重量％的铁。
10.根据权利要求8所述的复合脱钙骨组合物，其特征在于：含有1ng/g到100ng/g的BMP-2。
11.一种骨移植用组合物，其特征在于，包含：
根据权利要求8所述的复合脱钙骨组合物；以及
生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物。
12.根据权利要求11所述的骨移植用组合物，其特征在于：
相对于骨移植用组合物总重量，所述复合脱钙骨组合物的含量为10～90重量份。
13.根据权利要求11所述的骨移植用组合物，其特征在于：
生物相容性高分子含有选自胶原蛋白、玻尿酸、壳聚糖、羧甲基纤维素、藻蛋白酸盐和明胶组成的组中一个以上；
生物相容性高分子的交联物为选自由胶原蛋白、玻尿酸、壳聚糖、羧甲基纤维素、藻蛋白酸盐和明胶组成的组中一个以上的生物相容性高分子的交联物。
14.根据权利要求11所述的骨移植用组合物，其特征在于：
生物相容性高分子由交联剂交联而得，
所述交联剂选自丁二醇二缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、己二醇二缩水甘油醚、丙二醇二缩水甘油醚、聚丙二醇二缩水甘油醚、聚丁二醇二缩水甘油醚、新戊二醇二缩水甘油醚、聚甘油聚缩水甘油醚、双甘油聚缩水甘油醚、甘油聚缩水甘油醚、三甲基丙烷聚缩水甘油醚、双环氧丙氧基乙烯、季戊四醇聚缩水甘油醚、山梨糖醇聚缩水甘油醚构成的组中的一个以上。
15.根据权利要求11所述的骨移植用组合物，其特征在于：
相对于骨移植用组合物总重量，所述生物相容性高分子或生物相容性高分子的交联物的含量为10～90重量份。
16.根据权利要求11所述的骨移植用组合物，其特征在于：骨移植用组合物的复数粘度为1000到100000Pa·s。
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