KR101582380B1

KR101582380B1 - 손상 조직에 대한 세포 전달 및 조직 재생용 생체재료와 제조방법

Info

Publication number: KR101582380B1
Application number: KR1020130109135A
Authority: KR
Inventors: 장지욱; 김상철; 김현정
Original assignee: 주식회사 제네웰
Priority date: 2013-09-11
Filing date: 2013-09-11
Publication date: 2016-01-05
Also published as: KR20150029988A

Abstract

본 발명은 손상된 조직 재생을 위한 세포치료제 전달체 및 조직 재생용 지지체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포치료제를 손상된 연골에 이식하기 위한 개질된 가교 히알루론산에 관한 것이다. 상기 히알루론산은 겔타입으로 세포치료제와 혼합하여 사용 가능하며, 세포를 유지할 수 있는 점탄성과 4주 이상의 분해기간을 가져 관절에서 쉽게 분해되지 않고 손상된 연골 부위를 효과적으로 치료할 수 있다. 본 발명에 따른 겔타입 히알루론산은 연골 재생뿐만 아니라, 피부, 골 등의 연조직 및 경조직의 세포전달체로 사용될 수 있다.

Description

손상 조직에 대한 세포 전달 및 조직 재생용 생체재료와 제조방법 {Biomaterials for cell delivery and tissue regeneration for damaged tissue and method for preparing them}

본 발명은 손상 조직에 대한 세포 전달 및 조직 재생용 생체재료와 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 손상 조직에 대한 세포전달체 및 조직재생용 지지체로 사용하기 위하여 히알루론산을 가교, 정제, 멸균 공정을 통해 제조된 겔로서 점탄성 특성과 분해기간, 세포 부착능 및 조직 재생 효과를 가지는 세포 전달 및 조직 재생용 생체재료와 제조방법에 관한 것이다.

연골손상은 노화, 사고 등으로 인하여 연골이 손상되는 질환이다. 연골은 신경과 혈관이 없는 세포외기질로 구성된 조직으로 손상 받으면 자가 치유가 극히 제한적이어서 결국 골관절염을 초래하게 된다. 손상된 연골을 치료하기 위한 전통적인 방법은 연골 하골의 골수를 유출시키는 골수자극술이 있으며, 골수자극술은 방법에 따라 골천공술(bone drilling), 미세골절술(microfracture), 마모성형술(abrasion arthroplasty)로 나눌 수 있다. 하지만, 골수자극술은 재생된 연골이 정상 연골인 초자연골(hyaline cartilage)이 아닌 섬유연골(fibro artilage)로 재생되는 문제점이 있다.

이러한 문제점을 극복하기 위하여 자가 연골 이식술(autologous chondrocytes implantation, ACI)이 개발되었다. 자가 연골 이식술은 하중을 받지 않는 정상부위의 연골을 채취하여 생체외 환경에서 연골세포를 분리 배양한 후 손상부위에 주입하는 방법으로, 세포를 이식하기 위하여 골막을 손상 부위에 덮어 봉합한 후 이식하였다. 하지만, 골막은 연골을 과다 증식시켜 수술 후 환부의 동통을 초래할 수 있고 2차 연골 손상을 유발할 수 있다. 또한, 연골 세포의 채취와 주입의 2단계 수술 과정이 필요하고 골막을 매우 촘촘히 봉합해야 하는 번거로움이 있다.

최근 자가 연골 이식술의 단점을 극복하고자 타인의 연골세포, 제대혈 줄기세포 및 형질전환증식인자β(TGF-β)를 방출하는 세포를 이용한 치료법이 제품화되었거나 진행 중에 있다. 이러한 타가 세포 이식술은 자가 연골세포를 채취하는 불편함이 없고 면역반응이 없어 자가 연골세포 이식술을 대체하고 있다. 특히, 제대혈 유래 줄기세포를 관절연골 손상부위에 주입하는 방법이 많이 연구되고 있다. 한국특허등록 제10-0494265호는 제대혈로부터 줄기세포의 분리, 증식 및 분화한 세포와 배지 및 생체적합성 고분자로 이루어진 주사제 조형물을 제시하고 있다. 한국특허공개 제2000-0072904호에서는 TGF-β cDNA가 삽입된 세포의 제조 및 이를 이용한 연골재생에 대하여 제시하고 있다.

또한 골막의 문제점을 극복하기 위하여 콜라겐 및 히알루론산 유래 멤브레인을 개발되어 판매하고 있다. 대표 제품은 Anika 사의 Hyalograft는 히알루론산 3차원 부직포형태의 제품으로 연골손상에 사용하는 제품이다. 하지만, 스폰지나 멤브레인 타입은 연골에 고정하기 어렵고 관절경 시술에 제한이 있는 문제점이 있다. US공개 제2007/0202084호에서는 가교된 히알루론산 부직포를 연골손상에 적용하는 방법에 대해 제시하고 있다. 이러한 스폰지 및 멤브레인 타입 세포전달체의 문제점을 해결하기 위하여 피브린, 히알루론산 및 콜라겐 등을 이용한 겔 타입의 세포전달체가 연구되고 있다. 겔타입의 세포전달체는 세포와 혼합이 쉽고 주사 가능하여 관절경 시술에 제약이 없는 장점을 가지고 있다. 한국특허공개 제10-2012-0046430호에서는 히알루론산, 콜라겐, 피브리노젠 등의 하이드로겔을 이용한 연골 이식용 조성물에 대해 제시하고 있다. 하지만, 연골 손상부위에 주사 후 주변환경 특히, 연골에서 관절 활액에 의해 겔이 분해되거나 희석되어 손상부위에서 조직이 재생 될 때까지 세포를 유지시키는 것이 어려운 문제점들이 제기 되고 있다.

스폰지 및 멤브레인 기술들은 연골 환경에서 우수한 강도와 분해기간을 가졌지만, 3차원 형태로 시술이 어렵고, 겔 타입은 연골조직이 완전히 재생되기 전에 분해 및 흡수되어 정상 연골 재생이 어렵다는 한계를 가지고 있다.

히알루론산은 다당류의 일종으로 N-아세틸-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 구성된 반복단위가 선형으로 연결되어 있는 생체고분자 물질이다. 1934년 Meyer와 Palmer가 처음으로 소의 유리체로부터 분리하여 소개하였으며, 그 이름은 유리질이란 의미의 hyalos와 성분 중의 하나인 우론산의 합성으로 명명하였다. 세포외기질의 주요성분 분자인 히알루론산은 조직의 증식 및 재생, 그리고 창상 치유 시에 양이 증가하며, 수분을 함유하는 능력을 갖고 있어 조직의 수분 함유를 유지하여 세포외공간을 유지하고, 전해질과 영양소의 이동을 촉진시킨다. 히알루론산은 인체 내에 유리기 형태와 조직결합 형태로 존재하는데 안정기에는 대부분이 콜라겐 및 다른 고분자 물질과 교차 결합되어 존재하며, 따라서 유리히알루론산의 농도는 상대적으로 낮지만 조직 손상 직후에는 급격히 증가한다.

이러한 히알루론산 기반 생체재료는 세포전달체로서 세포와 간단하게 혼합이 가능하고 관절경을 통한 시술이 가능한 장점이 있다. 또한, 이식 후 세포가 부착, 성장할 수 있는 3차원 지지체 환경과 영양분 공급 pH유지 등의 생리학적 환경을 유지시켜 주며 활액 및 압력으로부터 세포가 손상부위로부터 유출되는 것을 막아 주어 초자 연골 재생을 극대화할 수 있다.

또한, 기존 골수자극술에 본 히알루론산 생체재료를 사용하면 골수로부터 유출된 줄기세포와 혈액이 형성한 혈병을 활액 및 압력으로부터 분해 및 손상 받는 것을 막아주는 역할을 한다. 즉, 히알루론산 생체재료는 줄기세포가 유출되는 것을 막아주어 초자 연골 재생을 극대화할 수 있다.

이에 본 발명은 기존 피브린, 콜라겐 및 히알루론산 겔 타입 세포전달체가 관절 활액 환경에서 쉽게 분해되거나 희석되어 연골조직이 완전히 재생되기 전에 분해와 흡수가 완료되는 문제점을 해결하고자 히알루론산을 기반으로 하여 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명의 목적은 손상 조직에 대한 세포전달체 및 조직재생용 지지체로 사용하기 위하여 히알루론산을 가교, 정제, 멸균 공정을 통해 제조된 겔로서 점탄성 특성과 4주 이상의 분해기간, 세포 부착능 및 조직 재생 효과를 가지는 세포전달체 및 조직재생용 생체 재료 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명에 따르면, 생체재료 총 중량 기준으로, 비드, 겔, 혹은 이들의 혼합 형태를 갖는 가교 히알루론산을 유효 성분으로 포함하고, 체내 반감기가 14 내지 60일이고, 0.02 내지 1 Hz 진동수에서 3회 측정한 점도 평균이 100,000 내지 6,000,000 cp이고, 0.02 Hz 진동수에서 측정한 탄성 계수가 10 내지 800 Pa이고, 상기 혼합 형태는 점도 평균이 100,000 내지 6,000,000 cp이고, 탄성 계수가 10 내지 800 Pa인 손상 조직에 대한 세포 전달 및 조직 재생용 생체재료를 제공한다 (도 1 참조).

또한, 본 발명에 따르면, (a) 히알루론산과 가교제를 pH 9 이상의 용액에서 -4 ~ 60 ℃ 하에 1 ~ 72시간 반응시켜 가교 히알루론산을 수득하는 단계; (b1) 상기 가교 히알루론산을 중화 및 90 ~ 99% 농도의 알코올로 침전시켜 0.02 내지 1 Hz 진동수에서 3회 측정한 점도 평균이 100,000 내지 1,500,000 cp이고 0.02 Hz에서 측정한 탄성 계수가 10 내지 250 Pa인 겔 타입 건조물을 수득하거나, 혹은 (b2) 상기 반응물을 중화, 분쇄, 10 ~ 70% 농도의 알코올로 알코올 침전 및 건조시켜 점도 평균이 1,000,000 내지 5,000,000 cp이고, 탄성 계수가 100 내지 600 Pa이고, 입경이 100 내지 1000 ㎛인 비드 타입 건조물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 (b1)의 겔 타입 건조물, (b2)의 비드 타입 건조물 혹은 이들의 혼합 형태 건조물,을 용매에 1 ~ 30%의 중량비로 용해시킨 후 고압 멸균시켜 체내 반감기가 14 내지 60일인 생체재료를 수득하되, 상기 혼합 형태 건조물은 상기 비드 1 ~ 29 wt% 및 상기 겔 29 ~ 1 wt%의 혼합으로서, 0.02 내지 1 Hz 진동수에서 3회 측정한 점도 평균이 100,000 내지 6,000,000 cp이고, 0.02 Hz에서 측정한 탄성 계수가 10 내지 800 Pa인 단계;를 포함하는 손상 조직에 대한 세포 전달 및 조직 재생용 생체재료의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 세포치료제를 손상된 연골에 이식하기 위한 개질된 가교 히알루론산을 제공할 수 있는 것으로, 히알루론산의 겔타입으로 세포치료제와 혼합하여 사용가능하며, 세포를 유지할 수 있는 점탄성과 4주 이상의 분해기간을 가져 관절에서 쉽게 분해되지 않고 손상된 연골 부위를 효과적으로 치료할 수 있다. 특히 겔타입 히알루론산은 연골 재생뿐만 아니라, 피부, 골 등의 연조직 및 경조직의 세포전달체로 사용될 수 있다.

도 1 내지 2는 본 발명에 따라 수득된 지지체의 기계적 특성 분석결과를 도시한 그래프이다.
도 3는 본 발명에 따라 수득된 가속 분해효소 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 4은 본 발명에 따라 수득된 세포독성 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따라 수득된 생체 외(in vitro) 세포 생장률 확인 시험 결과를 도시한 그래프 및 사진이다.
도 6는 본 발명에 따라 수득된 생체 내(in vivo) 분해 특성 결과를 도시한 사진이다.
도 7은 본 발명에 따라 수득된 래빗 모델을 이용한 분해성 확인(생체 내)을 도시한 사진이다.
도 8 내지 9은 본 발명에 따라 수득된 래빗 모델을 이용한 유효성 확인(생체 내)을 도시한 사진이고,
도 10은 본 발명에 따라 수득된 래빗 모델을 이용한 유효성 확인(생체 내) 관련 ICRS 등급 분석테이블이다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 생체재료 총 중량 기준으로, 비드, 겔, 혹은 이들의 혼합 형태를 갖는 가교 히알루론산을 유효 성분으로 포함하고, 체내 반감기가 14 내지 60일이고, 0.02 내지 1 Hz 진동수에서 3회 측정한 점도 평균이 100,000 내지 6,000,000 cp이고, 0.02 Hz 진동수에서 측정한 탄성 계수가 10 내지 800 Pa이고, 상기 혼합 형태는 점도 평균이 100,000 내지 6,000,000 cp이고, 탄성 계수가 10 내지 800 Pa인 손상 조직에 대한 세포 전달 및 조직 재생용 생체재료를 제공한다.

참고로, 상기 용어 “체내 반감기”는 달리 특정하지 않는 한, 본 발명의 생체재료가 체내에서 절반의 함량이 분해되는데 소요되는 기간을 지칭한다.

또한 상기 용어 “손상 조직에 대한 세포 전달 및 조직 재생용 생체재료”는 달리 특정하지 않는 한, 손상 조직에 대한 세포전달체, 조직 재생용 지지체, 혹은 이들을 겸용하여 사용하는 생체재료를 지칭한다.

상기 히알루론산은 연골 구성성분의 하나로 생체적합성이 우수하고 생체내 효소에 의해 완전히 분해되는 특징을 가지는 것으로, 생체 재료 총 중량 기준으로, 1 ~ 30 wt% 범위 내일 수 있다.

상기 히알루론산은 분자량에 관계없이 적용 가능한 것으로 일례로, 중량평균 분자량(Mw)이 100,000 내지 5,000,000 Dalton 범위 내일 수 있다.

상기 가교제는 일례로 1,4-부탄디올디글리시딜에테르, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드, N-히드록시숙신이미드, 에틸렌글리콜 디글리시딜에테르, 1,6-헥산디올 디글리시딜에테르, 프로필렌글리콜 디글리시딜에테르, 폴리프로필렌글리콜 디글리시딜에테르 및 디글리세롤 폴리글리시딜에테르 중에서 선택된 1 이상일 수 있다.

상기 가교제는 일례로 상기 가교 히알루론산을 구성하는 히알루론산 함량 기준으로 5 내지 30 mol% 범위, 혹은 10 ~ 20 mol% 범위로 포함하는 것일 수 있다. 상기 가교제 함량을 wt%로 환산하면 2 내지 14 wt%, 혹은 4 내지 10 wt% 범위일 수 있다.

상기 생체재료는 일례로 비드 타입, 겔 타입 혹은 이들의 혼합 타입일 수 있다.

상기 비드 타입의 생체재료는 구체적인 예로, 점도가 1,000,000 ~ 5,000,000 cp이고, 탄성계수가 100 ~ 600 Pa인 것일 수 있다.

특히, 상기 비드는 입경이 100 내지 1000 ㎛인 마이크로비드 타입일 수 있다.

상기 겔 타입의 생체재료는 구체적인 예로, 점도가 100,000 ~ 1,500,000 cp 이고, 탄성계수가 10 ~ 250 Pa인 것일 수 있다.

상기 혼합 타입의 생체재료는 구체적인 예로, 100,000 내지 6,000,000 cp이고, 탄성 계수가 10 내지 800 Pa인 것일 수 있다.

상기 혼합 타입의 생체 재료는 일례로 상기 비드 타입의 생체 재료 1 내지 29 중량%에 겔 타입의 생체 재료 29 내지 1 중량%로 구성된 것으로 전체적인 최종물의 중량%의 범위는 1 ~ 30wt% 일 수 있다.

삭제

상기 혼합타입은 비드타입 1g에 겔 1g이 혼합된 것, 비드 29g에 겔 1g이 혼합된 것 등을 포함하여 전체 wt%가 1~30wt%를 만족하는 것이다.

상기 생체재료는 일례로 연골, 피부, 근육, 성대 중에서 선택된 연조직, 또는 골과 같은 경조직 재생용 지지체인 것일 수 있다.

또한 상기 생체재료는 세포 전달체 겸용, 혹은 세포 전달체 단독으로 사용가능한 것으로, 상기 세포는 일례로 연골세포, 줄기세포, 제대혈세포, 골수세포, 지방줄기세포 등 모든 이식세포 중에서 선택된 1 이상일 수 있다.

또한, 본 발명의 손상 조직에 대한 세포 전달 및 조직 재생용 생체재료의 제조방법은, 일례로 (a) 히알루론산과 가교제를 pH 9 이상의 용액에서 -4 ~ 60 ℃ 하에 1 ~ 72시간 반응시켜 가교 히알루론산을 수득하는 단계; (b1) 상기 가교 히알루론산을 중화 및 90 ~ 99% 농도의 알코올로 침전시켜 0.02 내지 1 Hz 진동수에서 3회 측정한 점도 평균이 100,000 내지 1,500,000 cp이고 0.02 Hz에서 측정한 탄성 계수가 10 내지 250 Pa인 겔 타입 건조물을 수득하거나, 혹은 (b2) 상기 반응물을 중화, 분쇄, 10 ~ 70% 농도의 알코올로 알코올 침전 및 건조시켜 점도 평균이 1,000,000 내지 5,000,000 cp이고, 탄성 계수가 100 내지 600 Pa이고, 입경이 100 내지 1000 ㎛인 비드 타입 건조물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 (b1)의 겔 타입 건조물, (b2)의 비드 타입 건조물 혹은 이들의 혼합 형태 건조물,을 용매에 1 ~ 30%의 중량비로 용해시킨 후 고압 멸균시켜 체내 반감기가 14 내지 60일인 생체재료를 수득하되, 상기 혼합 형태 건조물은 상기 비드 1 ~ 29 wt% 및 상기 겔 29 ~ 1 wt%의 혼합으로서, 0.02 내지 1 Hz 진동수에서 3회 측정한 점도 평균이 100,000 내지 6,000,000 cp이고, 0.02 Hz에서 측정한 탄성 계수가 10 내지 800 Pa인 단계;를 포함하여 구성될 수 있다.

구체적으로, 상기 (a) 단계에서 pH 9이상의 용액은 NaOH 용액, 혹은 KOH 용액과 같은 알칼리금속의 수산화용액으로서 pH 약 11인 용액일 수 있다.

상기 (a) 단계는, pH 9 이상의 용액에 히알루론산을 혼합한 다음 상기 혼합된 용액에 가교제를 40 ~ 80 분 균질 혼합하고 -4 ~ 60 ℃ 하에 1 ~ 72시간, 혹은 30 ℃ ~ 37℃에서 18 ~ 30시간 반응시키는 것일 수 있다.

상기 반응 조건 내 온도 및 시간 조절에 따라 물성을 조절할 수 있다.

구체적으로 상기 (b1) 혹은 (b2) 단계는, (a)의 가교단계 후 시행하는 정제 단계로서 미반응 가교제의 제거 및 염기성 혼합물을 중성화하여 가교 반응을 종결시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제 단계는 정제수 등을 사용하여 반응한 고형물의 40배 부피 이상으로 최소 5회 이상 진행하며 수세 후 pH는 6 ~ 8 사이로 중화되는 것을 목표로 한다.

상기 (b2) 단계에서, 분쇄는 분자체를 사용하여 100 ~ 1,000 ㎛ 입자 크기를 선별하는 것일 수 있다.

상기 (b1),(b2)에서 중화는, 30분씩 2회, 이후 60분씩 교반하면서 생리식염수 용액(Saline)을 최소 7회에서 18회 교체하며, 최종 측정한 pH가 6 ~ 8 범위 내인 것일 수 있다. 일례로, 상기 중화는 비드 타입의 경우 평균 7회 정제수 교환하고, 겔 타입의 경우 평균 14회 정제수를 교환할 수 있다.

상기 (b1)에서 침전은 90~100%, 혹은 90~99% 농도의 알코올, 구체적으로는 에탄올로 수행하는 것일 수 있다.

상기 (b2)에서 침전은 10~70%, 혹은 60~70% 농도의 알코올, 구체적으로는 에탄올로 수행하는 것일 수 있다.

상기 (c) 단계는 건조물을 정제수, PBS, 및 셀라인(saline) 용액 중에서 선택된 1 이상의 용매에 1 ~ 30 wt%, 범위 비율로 혼합하고 실린지에 충진한 다음 멸균 처리할 수 있다. 상기 멸균 처리는 고압증기멸균법(오토클레이브, 통상 121 ℃, 15~20분)으로 실시할 수 있으며, 결과 수득된 제품의 멸균과 점착성을 증가시킬 수 있다.

상기 실린지는 일례로 고정된 혼합비율의 내용물이 담겨있는 프리필드 실린지, 혹은 A관은 겔타입이 B관은 비드타입이 담겨져 있는 더블 프리필드실린지 키트 등일 수 있다.

[ 실시예 ]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명을 이에 한정하는 것은 아니다.

< 제조예 1> 히알루론산 지지체 반응

증류수에 0.25N NaOH로 pH 9 이상의 용액을 준비한 다음 히알루론산 10 wt%를 혼합하였다. 혼합 용액에 가교제로서 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르를 히알루론산 대비 10 mol%(4.5 wt%) 로 첨가하여 60분 동안 균질하게 혼합하였다.

이후 30 ℃ 하에 24시간 유지하면서 반응 후 최소 40배 부피에 해당하는 생리식염수(saline)에 넣고 반응을 종결시켰다.

< 제조예 2>　히알루론산 지지체 정제 및 비드 /겔 타입 지지체 제조

제조예 1에서 수득된 히알루론산 지지체를 정제시 최초 2회는 30분씩, 이후부터는 60분씩 교반하면서 생리식염수(Saline)를 최소 7 ~ 18회 이상 교체하였다. 정제수는 수득된 히알루론산 지지체 최소 40배 이상의 부피를 사용하였고 최종 정제시 pH가 6 ~ 8인 것을 확인하였다.

상기 생리식염수(Saline) 정제 후 고형물을 분쇄기로 분쇄 후 분자체를 사용하여 100 ~ 500 ㎛ 입자 크기로 선별한 다음 선별된 비드를 최소 4배 부피의 90 ~ 99% 농도의 에탄올로 침전시킨 후 자연 건조하고 비드 타입의 지지체를 수득하였다.

한편, 상기 생리식염수(Saline) 정제 후 분쇄 공정 없이 60 ~ 70% 농도의 에탄올에 침전시킨 후 자연 건조하고 겔 타입의 지지체를 수득하였다.

< 제조예 3> 히알루론산 지지체 멸균

상기 제조예 2에서 제조한 비드 타입의 지지체, 겔 타입의 지지체를 1:4 중량비로 혼합하여 5 wt%로 PBS에 혼합하고 프리필드 실린지에 충진한 다음 고압증기멸균법(오토클레이브, 통상 121 ℃, 20분)으로 멸균 처리하였다.

< 제조예 4> 히알루론산 지지체 비교예

6개월에서 1년간의 지속효과를 나타내는 시판 히알루론산 제품 10 mg/ml의 제제를 3회 투여한 군과 제조예 3에서 만들어진 최종물을 1회 투여한 군을 생체내에서 비교한 생분해능을 도 7에 나타냈다. 또한 유효성 실험을 통해 그린플라스트의 피브린과 비교를 도 8 내지 도 9에 나타내었다.

<시험 항목>

1. 지지체의 기계적 특성 분석:

조직 수복용으로, 생체 적합성을 가지며 연골에서 활액에 의해 분해되지 않을 정도의 기계적 강도를 나타내는지 시험하도록 제조예 3의 고온고압 멸균 처리된 비드 타입 단독 지지체, 겔 타입 단독 지지체, 이들의 1:4 중량비 혼합 지지체에 대하여 0.02 ~ 1Hz의 진동수에서 레오미터(HAAKE MARSⅡ, Thermo Scientific. inc)를 이용하여 점도와 탄성 계수(0.02 Hz)를 각각 3회씩 측정하고 평균치 및 표준 편차를 하기 표 1 및 도 2에 정리하였다.

	비드 타입	겔 타입	혼합 타입
점도평균	150만 cp	31만 cp	170만 cp
표준편차	± 11만	± 3만	± 11만
탄성계수	194 Pa	40 Pa	227 Pa
표준편차	± 16 Pa	± 4 Pa	± 18 Pa

상기 표 1에서 보듯이, 본 발명에서 수득된 비드 타입 지지체, 겔 타입 지지체 및 혼합 지지체는 각각 점도 평균 30 ~ 200만 cp 범위, 탄성 계수 40 ~ 300 Pa을 갖는 것을 확인할 수 있었다.

2. 효소 분해실험

골수세포 또는 이식한 세포가 연골조직으로 재생되기 위해서는 최소한 한달 정도의 기간이 필요하다고 알려져 있다. 따라서 제조된 샘플의 생체내 지속성을 예측하기 위하여 Hyaluronidase(Sigma-Aldrich)를 이용한 가속 분해효소 실험을 실시하였다. 샘플 0.6 g에 Hyaluronidase(1 units/㎕)를 6㎕ 처리하여 37℃에서 농도 및 시간별 점성을 측정하였다.

가속 분해효소 실험 결과를 도시한 도 3의 그래프에서 보듯이, 비드 타입의 샘플에서 7일 정도의 분해기간을 확인할 수 있었다.

3. 세포독성 실험

ISO 10993-5 세포독성 실험법에 준하여 실험을 실시하였으며, L929 셀라인에 비교액 및 용출액을 넣어 세포독성을 평가하였다. 세포독성 실험 결과를 도시한 도 4의 그래프에서 보듯이, 각 지지체간의 흡광도 값이 음성대조군과 유사한 수준으로 세포독성이 없음을 확인하였다.

4. 생체 외(in vitro) 세포 생장률 확인 시험

제조예 3에서 제조된 각 히알루론산 지지체에 세포를 접종 배양하여 성장률을 분석하였다. 먼저 175 ㎠ 조직배양플라스크(tissue culture flask)에 토끼 연골세포를 분리하여 10% FBS(fetal bovine serum), 페니실린이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)으로 배양하였다. 제조한 겔에 계대배양 2차의 토끼 연골세포 2 × 10⁵을 0.1 ㎖로 농축하여 혼합하였다.

Insert(SPL, Korea)를 사용하여 겔을 6well 플레이트에서 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 이때 배지는 3일에 한번씩 10% FBS, 페니실린이 함유된 DMEM으로 교환하였다. 세포 접종 후 0일차, 3일차, 6일차에 지지체내의 세포 증식률을 MTT를 사용하여 분석하였다. 각 Well에 MTT용액을 첨가하여 살아있는 세포로부터 기인되는 포마잔 결정을 형성하고 원심분리 후, 겔을 분해하기 위해 Hyaluronidase(100units/㎕)을 200㎕ 첨가하여 50℃에서 2시간 동안 지지체를 분해시켰다.

겔이 분해된 것을 확인하고 3000rpm에서 10 분간 원심분리하여 하층액만을 취해 DMSO 100㎕를 넣어 포마잔을 용해시켰다. 570nm microplate reader에서 흡광도로 측정하여 지지체의 세포증식율을 측정하였다. 연골세포는 단층 배양 시 탈분화가 일어나고 삼차원 배양 시 세포의 증식이 크게 일어나지 않는 경향이 있으므로 3일에서 6일차 사이 약 7% 성장한 단층 배양된 세포와 비교 시 비드타입은 13% 성장하였으며, 겔타입은 8%의 성장, 혼합타입은 8% 성장하는 세포 생장률을 확인하였다(도 5 참조).

5. 생체 내( in vivo ) 분해 특성

생체 내 분해 특성은 쥐(SD Rat, 8W, 250 ~ 300 g)를 사용하여 실험하였다. 마취후 등을 제모하고 포비돈을 처치하여 등쪽 피부와 근육사이에 각 후보군을 0.6ml씩 주입하였다. 1, 2, 4 및 8주 경과 후 부검을 통해 후보군의 분해 정도 및 염증 정도를 육안과 조직학적 분석하였다.

도 6에서 보듯이, 8주차까지 주입부분에서 육안으로 지지체가 존재함을 확인할 수 있었으며, 조직학 분석을 위해 샘플을 1, 2, 4 및 8 주 후에 채취한 결과 여전히 분해되지 않고 남아있음을 확인할 수 있었다.

육안 관찰 결과 염증의 반응을 관찰할 수 없었으며 크기는 처음보다 커진 것을 확인할 수 있었다. 이는 지지체의 분해 특성으로 주변의 조직액을 흡수한 것으로 판단된다. 8주차부터 크기의 감소를 보였으며 지지체가 분해되는 것으로 판단되었다. H&E 염색 결과 특이 반응을 발견할 수 없었으며, 이식샘플과 근육 경계 부분에 세포가 지지체로 침투되는 것을 확인할 수 있었다.

결과 생체 내(In vivo) 분해기간은 모든 지지체들이 8주 이상임을 확인하였다.

6. Rabbit 모델을 이용한 분해특성 확인( in vivo )

연골세포 전달체의 분해특성을 확인하기 위하여 토끼 관절염 모델로 분해특성 및 손상관절의 보호 정도를 평가하였다.

토끼(NZW, 수컷, 4±0.3 kg, 16주)의 인대손상을 통한 관절염 모델로 십자인대를 절재 후 관절강내를 생리식염수로 세척한 다음 봉합하였다. 수술 1주일 후 타사제품은 D사의 관절활액 제품을 1주 간격으로 3회, 자사 후보군 겔타입과 비드타입이 4:1 혼합된 샘플을 1주간 1회 주입하여 6주, 12주에 토끼를 안락사 시킨 후 연골조직을 채취하여 육안분석 및 조직학 분석을 통해 연골 손상정도 및 분해기간을 분석하였다. (도 7 참조).

7. Rabbit 모델을 이용한 유효성 확인( in vivo )

연골세포 전달체의 유효성을 평가하기 위하여 토끼 연골손상 모델로 연골 재생능을 평가하였다.

토끼(NZW, 수컷, 3 ~ 3.5 kg, 14주)의 무릎 연골부위에 손상(지름 4 ㎜ X 깊이 2 ㎜)을 만든 후 세포전달체를 이식하였다. 이식 세포는 생후 1주 이내의 어린 토끼의 연골세포를 채취 후 배양하여 사용하였다. 수술 3주, 6주 및 12주차에 토끼를 안락사 시킨 후 연골조직을 채취하여 육안 분석 및 조직학 분석을 통해 연골재생 정도를 ICRS 등급으로 분석하였다(도 10의 등급 분석테이블 참고). 조직학적 분석은 Masson′s trichrome, Safranin-O 염색과 Type II collagen 면역염색으로 연골 재생정도를 분석하여 재생 효과를 확인하였다. (도 8,9 사진 참조).

Claims

생체재료 총 중량 기준으로, 비드, 겔, 혹은 이들의 혼합 형태를 갖는 가교 히알루론산을 유효 성분으로 포함하고, 체내 반감기가 14 내지 60일이고,
0.02 내지 1 Hz 진동수에서 3회 측정한 점도 평균이 100,000 내지 6,000,000 cp이고, 0.02 Hz 진동수에서 측정한 탄성 계수가 10 내지 800 Pa이고,
상기 혼합 형태는 점도 평균이 100,000 내지 6,000,000 cp이고, 탄성 계수가 10 내지 800 Pa이되, 상기 가교 히알루론산은 가교제 및 히알루론산을 반응시킨 것임을 특징으로 하는 손상 조직에 대한 세포 전달 및 조직 재생용 생체재료.
제1항에 있어서,
상기 비드는 점도 평균이 1,000,000 내지 5,000,000 cp이고, 탄성 계수가 100 내지 600 Pa이고, 입경이 100 내지 1000 ㎛이고, 상기 겔은 점도 평균이 100,000 내지 1,500,000 cp이고 탄성 계수가 10 내지 250 Pa인 것을 특징으로 하는
손상 조직에 대한 세포 전달 및 조직 재생용 생체재료.
제1항에 있어서,
상기 가교 히알루론산은 생체재료 총 중량 기준으로, 1 ~ 30 wt%이되, 상기 혼합 형태의 가교 히알루론산은 상기 비드 1 ~ 29 wt% 및 상기 겔 29 ~ 1 wt%의 혼합이고; 상기 가교 히알루론산을 제외한 잔부는 정제수, PBS, 및 셀라인(saline) 용액 중에서 선택된 1 이상의 용매로 구성된 것을 특징으로 하는
손상 조직에 대한 세포 전달 및 조직 재생용 생체재료.
제1항에 있어서,
상기 가교제는 1,4-부탄디올디글리시딜에테르, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드, N-히드록시숙신이미드, 에틸렌글리콜 디글리시딜에테르, 1,6-헥산디올 디글리시딜에테르, 프로필렌글리콜 디글리시딜에테르, 폴리프로필렌글리콜 디글리시딜에테르 및 디글리세롤 폴리글리시딜에테르 중에서 선택된 1 이상인 것을 특징으로 하는
손상 조직에 대한 세포 전달 및 조직 재생용 생체재료.
제1항에 있어서,
상기 가교제는 상기 가교 히알루론산을 구성하는 히알루론산의 함량 기준으로 5 내지 30 mol% 범위로 포함하는 것을 특징으로 하는
손상 조직에 대한 세포 전달 및 조직 재생용 생체재료.
제1항에 있어서,
상기 손상 조직의 조직은 피부, 근육, 성대, 연골, 및 골 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는
손상 조직에 대한 세포 전달 및 조직 재생용 생체재료.
제1항에 있어서,
상기 세포 전달의 세포는 연골세포, 줄기세포, 이식세포, 및 골수세포 중에서 선택된 1 이상인 것을 특징으로 하는
손상 조직에 대한 세포 전달 및 조직 재생용 생체재료.
(a) 히알루론산과 가교제를 pH 9 이상의 용액에서 -4 ~ 60 ℃ 하에 1 ~ 72시간 반응시켜 가교 히알루론산을 수득하는 단계;
(b1) 상기 가교 히알루론산을 중화 및 90 ~ 99 v/v% 농도의 알코올로 침전시켜 0.02 내지 1 Hz 진동수에서 3회 측정한 점도 평균이 100,000 내지 1,500,000 cp이고 0.02 Hz에서 측정한 탄성 계수가 10 내지 250 Pa인 겔 타입 건조물을 수득하거나, 혹은 (b2) 상기 가교 히알루론산을 중화, 분쇄, 10 ~ 70 v/v% 농도의 알코올로 알코올 침전 및 건조시켜 점도 평균이 1,000,000 내지 5,000,000 cp이고, 탄성 계수가 100 내지 600 Pa이고, 입경이 100 내지 1000 ㎛인 비드 타입 건조물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 (b1)의 겔 타입 건조물, (b2)의 비드 타입 건조물 혹은 이들의 혼합 형태 건조물,을 용매에 1 ~ 30%의 중량비로 용해시킨 후 고압 멸균시켜 체내 반감기가 14 내지 60일인 생체재료를 수득하되,
상기 혼합 형태 건조물은 상기 비드 1 ~ 29 wt% 및 상기 겔 29 ~ 1 wt%의 혼합으로서, 0.02 내지 1 Hz 진동수에서 3회 측정한 점도 평균이 100,000 내지 6,000,000 cp이고, 0.02 Hz에서 측정한 탄성 계수가 10 내지 800 Pa인 단계;를 포함하는
손상 조직에 대한 세포 전달 및 조직 재생용 생체재료의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 (a) 단계는, pH 9 이상의 용액에 히알루론산을 혼합한 다음 상기 혼합된 용액에 가교제를 40 ~ 80분간 균질 혼합하고 -4 ~ 60 ℃ 하에 1 ~ 72시간 반응시키는 것을 특징으로 하는
손상 조직에 대한 세포 전달 및 조직 재생용 생체재료의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 (b2) 단계에서, 분쇄는 분자체를 사용하여 100 ~ 1,000 ㎛ 입자 크기를 선별하는 것을 특징으로 하는
손상 조직에 대한 세포 전달 및 조직 재생용 생체재료의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 (b1),(b2)의 중화는, 30분씩 2회, 이후엔 60분씩 교반하면서 생리식염수(Saline) 용액을 7 ~ 14회 교체하며, 최종 측정한 pH가 6 ~ 8 범위 내인 것을 특징으로 하는
손상 조직에 대한 세포 전달 및 조직 재생용 생체재료의 제조방법.
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제8항에 있어서,
상기 (c) 단계는 정제수, PBS, 및 셀라인(saline) 용액 중에서 선택된 1 이상의 용매에 혼합하고 실린지에 충진한 다음 고압 증기로 멸균 처리한 것을 특징으로 하는
손상 조직에 대한 세포 전달 및 조직 재생용 생체재료의 제조방법.