WO2024049058A1 - 경조직 재생용 조성물 - Google Patents

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WO2024049058A1
WO2024049058A1 PCT/KR2023/012069 KR2023012069W WO2024049058A1 WO 2024049058 A1 WO2024049058 A1 WO 2024049058A1 KR 2023012069 W KR2023012069 W KR 2023012069W WO 2024049058 A1 WO2024049058 A1 WO 2024049058A1
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composition
tgf
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hyaluronic acid
hard tissue
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PCT/KR2023/012069
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송석범
김필윤
홍은표
유미영
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(주)시지바이오
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/20—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances

Definitions

  • the present invention relates to a composition for hard tissue regeneration.
  • All materials implanted in the human body especially materials for hard tissue regeneration such as bone tissue or cartilage tissue, must have good processability and moldability, or must have good in-situ polymerization to fit well on the wound.
  • a suitable environment must be provided for the adhesion, growth, and differentiation of cells, and additional products from their decomposition must also be biocompatible.
  • the compressive strength and yield value are too low, it is difficult to maintain the positioning ability and appearance maintenance characteristics during the suturing or implant placement stage after injection or dense filling of the graft material.
  • the adhesion of the graft material is too high, it easily smears on the surgical tool during the procedure, making it difficult to easily fill the bone defect, which has the disadvantage of lowering workability.
  • One object of the present invention includes crosslinked hyaluronic acid and Transforming Growth Factor-beta (TGF- ⁇ ), wherein the crosslinked hyaluronic acid has an average size of 3 to 250 ⁇ m.
  • the object is to provide a composition for hard tissue regeneration, which is characterized by particles having a diameter.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for hard tissue regeneration, including the composition for hard tissue regeneration, a mixing means, and an injection means.
  • the composition of the present invention exhibits high adhesion, viscosity, and low discharge force, and has physical properties as a graft material suitable for hard tissue regeneration. Therefore, it can be easily injected into the defective area of the tissue, and can also maintain its shape during the period of tissue regeneration. , excellent clinical effects on hard tissue regeneration can be expected.
  • Figure 1 is a diagram showing the adhesive force according to particle size of hyaluronic acid in the composition of the present invention.
  • Figure 2 is a diagram showing the viscosity according to particle size of hyaluronic acid in the composition of the present invention.
  • Figure 3 is a diagram showing the adhesive strength according to the mixing ratio of hyaluronic acid and buffer solution in the composition of the present invention.
  • Figure 4 is a diagram showing the viscosity according to the mixing ratio of hyaluronic acid and buffer solution in the composition of the present invention.
  • Figure 5 is a diagram showing the extrusion force according to the mixing ratio of hyaluronic acid and buffer solution in the composition of the present invention.
  • Figure 6 is a diagram showing the production of a microfracture animal model with a defective area on a trochlear sphere prepared using a rabbit and a tissue regeneration method using the same.
  • Figure 7 is a diagram showing the scoring criteria of the OARSI evaluation system.
  • Figure 8 is a diagram showing the progress of the OARSI score according to administration of a composition for hard tissue regeneration in a microfracture animal model according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 9 is a diagram showing the scoring criteria of the subchondral bone grading system.
  • Figure 10 is a diagram showing the progress of subchondral bone grade according to administration of a composition for hard tissue regeneration in a microfracture animal model according to an embodiment of the present invention.
  • the first aspect of the present invention is a composition for hard tissue regeneration comprising crosslinked hyaluronic acid and Transforming Growth Factor-beta (TGF- ⁇ ). provides.
  • the cross-linked hyaluronic acid may be characterized as particles having an average diameter of 3 to 250 ⁇ m.
  • the tissue that can be regenerated by applying the composition of the present invention may be cartilage tissue or bone tissue, but is not limited thereto.
  • hyaluronic acid (HA) of the present invention is called hyaluronan, an anionic, non-sulfated glycosaminoglycan (hyaluronan) widely distributed throughout connective tissue, epithelial tissue, and nervous tissue. nonsulfated glycosaminoglycan). It is unique among glycosaminoglycans because it is the non-sulfated form, is formed in the plasma membrane instead of the Golgi apparatus, and can be very large.
  • the average 70 kg (150 lb) human contains about 15 g of hyaluronan in the body, about one-third of which is broken down and synthesized every day. It is one of the main components of the extracellular matrix, greatly contributing to cell proliferation and migration, and is also involved in the progression of many malignant tumors.
  • crosslinked hyaluronic acid in the present invention is a distinct category from the linear hyaluronic acid described above and can be divided according to the type of treatment and the composition of the acid.
  • the crosslink refers to the process of linking the linear hyaluronic acid molecules together to obtain a new structured material consisting of a plurality of hyaluronic acid filaments with a higher molecular weight. High molecular weight hyaluronic acid formed through cross-linking can lose the properties of individual molecules and reach a real gel-like state.
  • linear hyaluronic acid described above was the first to be used and marketed and consists of unchanged linear hyaluronic acid chains, whereas cross-linked hyaluronic acid is a more recently developed material that contains cross-links formed between several linear hyaluronic acid molecules during the production stage. It is characteristic. These cross-links are transversal bridges that join multiple chains together for the purpose of forming hyaluronic acid macromolecules of larger size, higher molecular weight and consequently greater density and persistence.
  • the cross-linked hyaluronic acid includes 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE), divinyl sulfone (DVS), and bis ethyl carbodiimide (bis ethyl carbodiimide).
  • BDDE 1,4-butanediol diglycidyl ether
  • DVS divinyl sulfone
  • bis ethyl carbodiimide bis ethyl carbodiimide
  • BCDI polyethylene glycol
  • EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • the composition may include cross-linked hyaluronic acid in an amount of 15 mg/mL to 30 mg/mL based on the volume of the final composition.
  • TGF- ⁇ transforming growth factor-beta
  • LTBP latent TGF-beta binding protein
  • LAP latency-associated peptide
  • TGF- ⁇ is a highly studied cytokine in the fields of cancer, autoimmune diseases, and infectious diseases due to its role in immune and stem cell regulation and differentiation.
  • the TGF- ⁇ superfamily includes endogenous growth inhibitory proteins.
  • TGF- ⁇ Increased expression of TGF- ⁇ is frequently associated with malignancy in many cancers and defects in the cell growth inhibitory response to TGF- ⁇ .
  • immunosuppressive function becomes dominant, it contributes to oncogenesis.
  • Such dysregulation of immunosuppressive functions is also related to the pathogenesis of autoimmune diseases, but its effects are mediated by other cytokines present in the environment.
  • the TGF- ⁇ includes, but is not limited to, proteins belonging to the TGF- ⁇ superfamily, a large group comprising structurally related cell regulatory proteins that interact with the TGF- ⁇ receptor.
  • the TGF- ⁇ may be one or more selected from the group consisting of TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2, TGF- ⁇ 3, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, and BMP-7.
  • the TGF- ⁇ may be TGF- ⁇ 3, and the TGF- ⁇ 3 may be a human recombinant TGF- ⁇ 3 derived from E. coli, but is not limited thereto.
  • TGF- ⁇ 3 is a protein encoded in humans by the TGFB3 gene. This is a type of protein known as a cytokine, which is involved in cell differentiation, embryogenesis, and development. Transforming growth factor-beta super, which includes the TGF- ⁇ family, bone morphogenetic proteins (BMPs), growth and differentiation factors (GDFs), inhibins and activins. It belongs to a large family of cytokines called the family.
  • the composition may include TGF- ⁇ , such as TGF- ⁇ 3, in an amount of 0.003 mg/mL to 1.0 mg/mL based on the volume of the final composition.
  • TGF- ⁇ such as TGF- ⁇ 3
  • the composition contains TGF- ⁇ in an amount of 0.005 mg/mL to 1.0 mg/mL, 0.006 mg/mL to 1.0 mg/mL, 0.005 mg/mL to 0.5 mg/mL, and 0.005 mg/mL based on the volume of the final composition. It may be from 0.3 mg/mL, or from 0.006 mg/mL to 0.2 mg/mL, but is not limited thereto.
  • TGF- ⁇ is included in less than the above amount, it may be difficult to achieve the synergistic effect resulting from the addition of TGF- ⁇ at the desired level, and even if TGF- ⁇ is included in excess of the above amount, additional effects are expected depending on the added amount. This can be difficult to do.
  • the composition may have an adhesive force of 2N to 15N.
  • the composition may have an adhesive force of 3N to 12N, or 4N to 10N, but is not limited thereto.
  • the composition may have a viscosity of 8,000 cP to 80,000 cP.
  • the composition may have a viscosity of 10,000 cP to 60,000 cP, 15,000 cP to 50,000 cP, or 20,000 cP to 40,000 cP, but is not limited thereto.
  • the composition may have a discharge force of 3N to 50N.
  • the composition may have a discharge force of 3N to 50N, 10N to 50N, 10N to 45N, 15N to 45N, or 15N to 35N, but is not limited thereto.
  • the composition of the present invention not only can be easily injected into damaged hard tissue, but also has excellent adhesion to the tissue even when injected in an environment existing in body fluids such as bone marrow, allowing it to maintain its shape at the injected site. there is.
  • the composition can reduce the OARSI (osteoarthritis research society international) score to 2.0 or less after 12 weeks from the time of injection into the hard tissue defect site.
  • OARSI osteoarthritis research society international
  • composition can reduce subchondral bone grading to 1.0 or less after 8 weeks from the time of injection into the hard tissue defect site.
  • osteoarthritis research society international (OARSI) score standardizes the evaluation of osteoarthritis (OA) histopathology according to the results of Safranin O/fast green staining. This is a score formulated by OARIS in 1998 to do this.
  • OARSI score represents a comprehensive evaluation based on the severity and extent of OA in articular cartilage in a range of 0 to 6. Specific criteria were consistent with those previously reported, with higher OARSI scores indicating more severe cartilage damage occurred in the joint.
  • the term “subchondral bone grading” refers to the grading of subchondral bone based on previous studies describing changes in subchondral bone and schematic observations of osteoarthritis sample material by two investigators, OMA and PL. It is an evaluation system that indicates the status on a scale of 0 to 3. Specifically, the subchondral bone grade indicates structural changes in the bone connected to cartilage, and the higher the grade, the harder or thicker the bone becomes. The subchondral bone is located between cartilage and bone marrow. If the subchondral bone becomes thick, the supply of active factors for maintaining cartilage structure from the bone marrow is blocked, which can accelerate cartilage damage.
  • the composition of the present invention when injected into the hard tissue defect area, reduced the OARIS score to a very low level of 2.0 or less after 12 weeks and/or the subchondral bone grade to a very low level of 1.0 or less after 8 weeks, which values are This means that the defected area has been regenerated to a level similar to the cartilage and/or subchondral bone before the defect.
  • the composition can be used by mixing cross-linked hyaluronic acid and TGF- ⁇ immediately before injection into the hard tissue defect site.
  • a second aspect of the present invention provides a kit for hard tissue regeneration, comprising the composition for hard tissue regeneration of the first aspect, a mixing means, and an injection means.
  • the mixing means may be a mixing syringe, a vial transfer device, or a connector
  • the injection means may be a syringe or an injection needle, but are not limited thereto.
  • the kit of the present invention can be injected into a hard tissue defect area with a needle, or directly into an open affected area using a syringe or the like as an auxiliary means after a surgical procedure.
  • the kit may be provided with double sterilized packaging to minimize the possibility of infection that may occur during handling, but there is no difference in the method or principle of use.
  • Cross-linked hyaluronic acid was prepared by reacting hyaluronic acid (molecular weight: 500,000 to 1.5 million Da) with 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) as a cross-linking agent. Specifically, 1 g/g of hyaluronic acid, 0.8 g/g of NaOH, 3.2 g/g of purified water, and 0.02 g/g of BDDE were mixed and stirred to form a gel. After completion of synthesis, crosslinking was performed in a stirring incubator (stirring speed: 80 rpm, temperature: 30°C, reaction time: 19 hours). The cross-linked gel was coarsely ground to a size of 15 mm ⁇ 10 mm and then dialyzed. The dialyzed gel was passed through a standard sieve to obtain particles of a certain size.
  • BDDE 1,4-butanediol diglycidyl ether
  • Example 1 Evaluation of physical properties according to size of cross-linked hyaluronic acid
  • Samples were prepared by dividing the cross-linked hyaluronic acid prepared according to Preparation Example 1 into six groups according to particle size. Specifically, samples containing average particle sizes of 5 ⁇ m, 80 ⁇ m, 200 ⁇ m, 300 ⁇ m, 800 ⁇ m, and 1000 ⁇ m in PBS buffer at a concentration of 20 mg/mL were prepared to measure adhesive force and viscosity ( viscosity) was measured, and the results are shown in Figures 1 and 2, respectively.
  • the adhesion was measured at a speed of 200 ⁇ m/sec by using an antopa rheometer, after injecting the sample into the plate, lowering the spindle to a position of 0.25 mm so that it touches the sample, and the viscosity was measured using a Bluefield viscometer.
  • 0.5 cc of sample was placed in a sample cup and measured at a speed of 0.5 rpm.
  • samples containing cross-linked hyaluronic acid particles with an average size of 5 to 200 ⁇ m showed higher adhesion and viscosity than samples containing larger particles.
  • Example 2 Evaluation of physical properties according to mixing ratio of a composition for hard tissue regeneration containing cross-linked hyaluronic acid and TGF- ⁇ 3
  • a 20 mg/mL solution was prepared in PBS buffer using the cross-linked hyaluronic acid prepared according to Preparation Example 1, and recombinant human Transforming Growth Factor-beta3 (rhTGF- ⁇ 3) and 10
  • rhTGF- ⁇ 3 recombinant human Transforming Growth Factor-beta3
  • a series of compositions were prepared by mixing at a predetermined volume ratio while changing the ratio from :0 to 6:4. Adhesion, viscosity, and extrusion force were measured for the series of compositions, and the results are shown in Figures 3 to 5, respectively.
  • adhesion and viscosity were measured in the same manner as in Example 1, and the discharge force was measured by filling 2 cc of the sample in a 3 cc syringe using a universal tester, then connecting a 21 G syringe, and discharging the filled syringe. was fixed to a jig and measured by pressing at a speed of 30 mm/min.
  • a microfracture animal test model was created, the prepared composition was injected into the defect area, and the degree of regeneration was confirmed by observing for 4, 8, and 12 weeks.
  • the control group was an untreated group (A) and the carrier group (B) treated only with cross-linked hyaluronic acid, and the experimental group was treated with 20 mg/mL of cross-linked hyaluronic acid and TGF- ⁇ 3 at final concentrations of 6 ppm and 30 ppm, respectively. , 60 ppm, 100 ppm, and 200 ppm were used (sequentially C to G).

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Abstract

본 발명은 경조직 재생용 조성물에 관한 것이다.

Description

경조직 재생용 조성물
본 발명은 경조직 재생용 조성물에 관한 것이다.
인체에 이식되는 모든 재료들, 특히 골조직 또는 연골조직과 같은 경조직 재생을 위한 재료들은 가공성 및 성형성이 좋거나, 상처 위에 잘 맞도록 제자리 중합성(in-situ polymerization)이 좋아야 한다. 세포들의 접착과 성장 그리고 분화를 위한 적합한 환경을 제공해주어야 하며, 그들의 분해에 의한 부가적인 생성물도 생체적합성을 가져야 한다. 특히, 골 재생을 위한 이식용 재료의 경우 압축강도와 항복치가 너무 낮으면 이식재의 주입 혹은 치밀 충진 후 봉합이나 임플란트 식립 단계에서의 위치 고정능력과 외형 유지 특성을 유지하기 어렵다. 또한, 이식용 재료의 부착성이 너무 높으면 시술 시 시술 도구에 잘 묻어나와 골 결손부에 용이하게 충진시키기 어려워 작업성이 떨어지는 단점이 있다.
이러한 경조직 재생을 위한 이식용 생체재료들의 개발 초기에는 생체 내에서 불활성을 갖는 특징에 의존하였으나, 시술 후 주위 조직의 감염 및 염증반응에 의해 사용에 많은 제약이 있었다. 이후 금속, 세라믹, 고분자를 이용한 생체재료 기술의 급속한 발달과 함께 생체불활성(bioinert)보다는 생체적합성(biocompatible)을 갖는 재료를 설계 및 개발하여 사용부위 및 목적에 따라 다양한 종류의 골조직 재생용 생체활성 지지체의 개발에 이르렀다. 이러한 골조직 재생용 생체활성 지지체는 이식되는 위치에 따라 사용되는 물리적 성질이 다르고 주위조직에 대한 독성반응이 없어야 하며 다른 인공장기에 비해 비교적 높은 기계적 물성이 요구된다. 이러한 골조직 재생용 생체활성 지지체는 그 원재료의 특성과 사용목적에 따라 다양한 생체재료로 시판 및 개발되고 있다.
한편 경조직의 경우 조직의 특성상 손상 부위의 형태가 일정하지 않은 경우가 많아 결손 부위에 맞는 이식재를 선택하는데 어려움이 있다. 따라서, 적합한 강도를 가짐은 물론 주변 조직에의 부착력이 우수하며, 불규칙한 손상 부위에 채워질 수 있도록 주입이 용이하고, 무엇보다도 조직 재생을 촉진할 수 있는 소재를 발굴할 필요가 있다.
본 발명의 하나의 목적은 가교된 히알루론산(crosslinked hyaluronic acid), 및 형질전환성장인자-베타(Transforming Growth Factor-beta; TGF-β)를 포함하며, 상기 가교된 히알루론산은 평균 3 내지 250 μm 직경을 갖는 입자인 것이 특징인, 경조직 재생용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 경조직 재생용 조성물, 혼합 수단, 및 주입 수단을 포함하는, 경조직 재생용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 조성물은 높은 점착력과 점도 및 낮은 토출력을 나타내어 경조직 재생에 적합한 이식재로서의 물성을 가지므로 조직의 결손 부위에 용이하게 주입할 수 있을 뿐만 아니라 해당 조직인 재생되는 기간 동안 그 형태를 유지할 수 있으므로, 경조직 재생에 대한 우수한 임상적 효과를 기대할 수 있다.
도 1은 본 발명의 조성물 중 히알루론산의 입자 크기에 따른 점착력(adhesive force)을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 조성물 중 히알루론산의 입자 크기에 따른 점도(viscosity)를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 조성물 중 히알루론산과 완충액의 혼합 비율에 따른 점착력을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 조성물 중 히알루론산과 완충액의 혼합 비율에 따른 점도를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 조성물 중 히알루론산과 완충액의 혼합 비율에 따른 토출력(extrusion force)을 나타낸 도이다.
도 6은 토끼를 이용하여 제조한 활차 구 상에 결손 부위를 갖는 미세골절 동물모델의 제조 및 이를 이용한 조직 재생방법을 나타낸 도이다.
도 7은 OARSI 평가 시스템의 채점 기준을 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세골절 동물모델에서 경조직 재생용 조성물 투여에 따른 OARSI 스코어의 경과를 나타낸 도이다.
도 9는 연골하골등급 시스템(subchondral bone grading system)의 채점 기준을 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세골절 동물모델에서 경조직 재생용 조성물 투여에 따른 연골하골등급의 경과를 나타낸 도이다.
본 발명에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
아울러, 본 발명의 명세서 전체에 있어서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위한, 본 발명의 제1양태는 가교된 히알루론산(crosslinked hyaluronic acid), 및 형질전환성장인자-베타(Transforming Growth Factor-beta; TGF-β)를 포함하는, 경조직 재생용 조성물을 제공한다.
이때, 가교된 히알루론산은 평균 3 내지 250 μm 직경을 갖는 입자인 것이 특징일 수 있다.
예컨대, 본 발명의 조성물을 적용하여 재생시킬 수 있는 조직은 연골조직 또는 골조직일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "히알루론산(hyaluronic acid; HA)"은 히알루로난(hyaluronan)이라 불리며, 결합조직, 상피조직, 및 신경조직에 걸쳐 널리 분포하는 음이온성, 비황산화 글리코사미노글리칸(nonsulfated glycosaminoglycan)이다. 이는 비황산화 형태이므로 글리코사미노글리칸 중 고유하며, 골지체 대신 플라즈마 멤브레인에서 형성되고, 매우 클 수 있다. 평균 70 kg(150 lb)의 인간은 체내에 약 15 g의 히알루로난을 포함하며, 이중 1/3 정도가 매일 분해되고 합성된다. 이는 세포외기질의 주요한 성분 중 하나로, 세포 증식 및 이동에 크게 기여하며, 많은 악성 종양의 진행에도 관여한다.
본 발명의 용어, "가교된(crosslinked) 히알루론산"은 전술한 선형 히알루론산과는 구별되는 범주의 것으로 처리 유형 및 산의 조성에 따라 구분될 수 있다. 상기 가교(crosslink)는 상기 선형 히알루론산 분자를 함께 연결하여 더 높은 분자량을 갖는 복수의 히알루론산 필라멘트로 구성된 새로운 구조의 물질을 얻는 과정을 의미한다. 가교를 통해 형성된 고분자량의 히알루론산은 개별 분자의 특성을 잃고 실제 젤과 같은 상태에 도달할 수 있다. 전술한 선형 히알루론산은 최초로 사용 및 시판된 물질로서 변하지 않은 히알루론산 선형 사슬로 구성된 반면, 가교된 히알루론산은 보다 최근에 개발된 물질로 생산 단계에서 수개의 선형 히알루론산 분자 간에 형성된 가교를 포함하는 것이 특징이다. 이러한 가교는 더 큰 크기, 더 높은 분자량 및 결과적으로 더 큰 밀도와 지속성을 갖는 히알루론산 거대분자를 형성하기 위한 목적으로 복수의 사슬을 함께 합치는 횡단교(transversal bridges)이다.
예컨대, 상기 가교된 히알루론산은 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether; BDDE), 디비닐설폰(divinyl sulfone; DVS), 비스에틸 카보디이미드(bis ethyl carbodiimide; BCDI), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG), 및 1-에틸3-(3-3-디메틸아미노프로필 카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide; EDC)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 가교제에 의해 가교된 것일 수 있다.
예컨대, 상기 조성물은 가교된 히알루론산을 최종 조성물의 부피를 기준으로 15 mg/mL 내지 30 mg/mL의 함량으로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "형질전환성장인자-베타(Transforming Growth Factor-beta; TGF-β)"는, LTBP(latent TGF-beta binding protein) 및 LAP(latency-associated peptide)의 두가지 다른 폴리펩타이드와 복합된 잠재적 형태(latent form)로, 대식세포를 비롯한 많은 세포 유형에서 분비된다. 이의 주된 기능 중 하나는, 특히 장에서, 염증 과정을 조절하는 것이며, 또한 TGF-β는 T세포 조절 및 분화 뿐만 아니라 줄기세포 분화에서 중요한 역할을 한다. TGF-β는 면역 및 줄기세포 조절 및 분화에서 이의 역할로 인해 암, 자가면역질환 및 전염병 분야에서 고도로 연구되고 있는 사이토카인이다. TGF-β 슈퍼패밀리는 내인성 성장 저해 단백질을 포함한다. TGF-β의 발현 증가는 자주 많은 암들의 악성 및 TGF-β에 대한 세포 성장 억제 반응의 결함과 관련있다. 이의 면역억제 기능이 우세해지면 발암(oncogenesis)에 기여한다. 이와 같은 면역억제 기능 조절 장애는 자가면역질환의 병인과도 유관하나, 그 효과는 존재하는 다른 사이토카인 환경에 의해 매개된다.
예컨대, 상기 TGF-β는, TGF-β 수용체와 상호작용하는, 구조적으로 연관된 세포 조절 단백질들을 포함하는 큰 그룹인 TGF-β 슈퍼패밀리에 속하는 단백질을 제한없이 포함한다. 구체적으로, 상기 TGF-β는 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, 및 BMP-7로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 TGF-β는 TGF-β3일 수 있고, 상기 TGF-β3은 대장균 유래 인간 유전자 재조합 TGF-β3일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "TGF-β3"은 TGFB3 유전자에 의해 인간에서 암호화되는 단백질이다. 이는 세포 분화, 배아 발생 및 발달에 관여하는 사이토카인으로 알려진 단백질의 한 유형이다. TGF-β패밀리, 골형성단백질(bone morphogenetic proteins; BMP), 성장 및 분화 인자(growth and differentiation factors; GDFs), 억제호르몬(inhibins) 및 액티빈(activins)을 포함하는 형질전환성장인자-베타 슈퍼패밀리라 불리는 거대 사이토카인 계열에 속한다.
예컨대, 상기 조성물은 상기 TGF-β, 예컨대, TGF-β3를 최종 조성물의 부피를 기준으로 0.003 mg/mL 내지 1.0 mg/mL의 함량으로 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 조성물은 TGF-β를 최종 조성물의 부피를 기준으로 0.005 mg/mL 내지 1.0 mg/mL, 0.006 mg/mL 내지 1.0 mg/mL, 0.005 mg/mL 내지 0.5 mg/mL, 0.005 mg/mL 내지 0.3 mg/mL, 또는 0.006 mg/mL 내지 0.2 mg/mL일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 함량 미만으로 TGF-β를 포함할 경우 원하는 수준의 TGF-β 첨가에 따른 시너지적 효과를 달성하기 어려울 수 있고, 상기 함량을 초과하도록 TGF-β를 포함하더라도 부가된 함량에 따른 추가적인 효과를 기대하기 어려울 수 있다.
예컨대, 상기 조성물은 2N 내지 15N의 점착력을 가질 수 있다. 예컨대, 상기 조성물은 3N 내지 12N, 또는 4N 내지 10N의 점착력을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 조성물은 8,000 cP 내지 80,000 cP의 점도를 가질 수 있다. 예컨대, 상기 조성물은 10,000 cP 내지 60,000 cP, 15,000 cP 내지 50,000 cP, 내지 20,000 cP 내지 40,000 cP의 점도를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
나아가, 상기 조성물은 3N 내지 50N의 토출력을 가질 수 있다. 예컨대, 상기 조성물은 3N 내지 50N, 10N 내지 50N, 10N 내지 45N, 15N 내지 45N, 또는 15N 내지 35N의 토출력을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이상과 같은 물성으로 인해 본 발명의 조성물은 손상된 경조직에 주입시 용이하게 주입할 수 있을 뿐만 아니라 골수 등 체액에 존재하는 환경 하에 주입되어도 해당 조직에 대한 부착력이 우수하여 주입된 부위에서 형태를 유지할 수 있다.
예컨대, 상기 조성물은 경조직 결손 부위에 주입시점으로부터 12주 후 OARSI(osteoarthritis research society international) 스코어를 2.0 이하로 감소킬 수 있다.
또한, 상기 조성물은 경조직 결손 부위에 주입시점으로부터 8주 후 연골하골등급(subchondral bone grading)을 1.0 이하로 감소시킬 수 있다.
본 발명의 용어, "OARSI(osteoarthritis research society international) 스코어"는 사프라닌 O/패스트 그린 염색(Safranin O/fast green staining) 결과에 따라 골관절염(osteoarthritis; OA) 조직병리학(histopathology)의 평가를 표준화하기 위하여 1998년 OARIS에 의해 공식화된 점수이다. 상기 OARSI 스코어는 관절연골(articular cartilage)에서 OA의 심각성(severity)과 정도(extent)에 기반한 종합적인 평가를 0 내지 6단계의 범위로 나타낸다. 특정 기준은 이전에 보고된 바와 일치하였으며, 보다 높은 OARSI 스코어는 관절에서 보다 심각한 연골 손상이 발생했음을 나타낸다.
본 발명의 용어, "연골하골등급(subchondral bone grading)"은 연골하골에서의 변화를 묘사하는 이전의 연구와 2명의 연구자, OMA 및 PL에 의한 골관절염 시료 물질의 개략적인 관찰에 기초하여 연골하골의 상태를 0 내지 3단계의 범위로 나타내는 평가 시스템이다. 구체적으로, 연골하골등급은 연골과 연결된 뼈의 구조변화를 나타내는 것으로, 등급이 높아질수록 뼈가 경화되거나 두꺼워짐을 나타낸다. 연골하골은 연골과 골수의 중간에 위치하는데, 연골하골이 두꺼워지면 골수로부터 연골구조유지를 위한 활성인자의 공급이 차단되어 연골손상을 가속화할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 경조직 결손 부위에 주입하여 12주 후 OARIS 스코어를 2.0 이하로, 및/또는 8주 후 연골하골등급을 1.0 이하로 매우 낮은 수준까지 감소시켰으며, 이러한 수치는 결손 부위가 결손 이전의 연골 및/또는 연골하골과 유사한 수준으로 재생되었음을 의미하는 것이다.
예컨대, 상기 조성물은 경조직 결손 부위에 주입 직전에 가교된 히알루론산과 TGF-β를 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 제2양태는 제1양태의 경조직 재생용 조성물, 혼합 수단, 및 주입 수단을 포함하는, 경조직 재생용 키트를 제공한다.
예컨대, 상기 혼합수단은 혼합실린지, 바이알이송장치, 또는 커넥터일 수 있고, 상기 주입수단은 실린지 또는 주사바늘일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예컨대, 상기 본 발명의 키트는 경조직 결손 부위에 주사바늘로 주입하거나, 외과적 시술 후 보조적 수단으로 개방된 환부에 실린지 등으로 직접 주입할 수 있다.
구체적으로, 바이알이송장치에 TGF-β가 담긴 바이알과 빈 실린지를 연결하고 TGF-β를 빈 실린지로 이송한 후, 실린지를 분리한 뒤 커넥터를 사용하여 가교된 히알루론산이 충진된 실린지와 연결하여 TGF-β와 가교된 히알루론산을 혼합한다. 혼합된 상기 실린지에 주사바늘을 연결하여 경조직 결손부위에 직접 주입하거나, 외과적 수술 후 경조직 결손 부위에 주입할 수 있다. 외과적 수술과 병행하여 사용하는 경우 취급 과정에서 발생할 수 있는 감염 가능성을 최소화하기 위하여 키트에 이중 멸균 패키징 등을 적용하여 제공할 수 있으나, 사용 방식이나 원리에는 차이가 없다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 가교된 히알루론산의 제조
히알루론산(분자량 50만 내지 150만 Da) 및 가교제로 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether; BDDE)을 반응시켜 가교된 히알루론산을 준비하였다. 구체적으로, 히알루론산 1 g/g, NaOH 0.8 g/g, 정제수 3.2 g/g, 및 BDDE 0.02 g/g을 혼합하고 교반하여 젤을 형성하였다. 합성을 완료한 후 교반 인큐베이터에서 가교시켰다(교반속도: 80 rpm, 온도: 30℃, 반응시간: 19시간). 가교된 젤을 15 mm×10 mm 크기로 조분쇄한 후 투석하였다. 투석한 젤을 표준체로 걸려 일정한 크기의 입자를 수득하였다.
실시예 1: 가교된 히알루론산의 크기에 따른 물성 평가
상기 제조예 1에 따라 준비한 가교된 히알루론산을 입자 크기에 따라 6개 군으로 구분하여 시료를 준비하였다. 구체적으로, 평균 입자 크기 5 μm, 80 μm, 200 μm, 300 μm, 800 μm 및 1000 μm 크기의 입자를 PBS 완충액에 20 mg/mL 농도로 함유하는 시료를 준비하여 점착력(adhesive force) 및 점도(viscosity)를 측정하고, 그 결과를 각각 도 1 및 2에 나타내었다. 구체적으로, 점착력은, 안토파 레오미터를 사용하여, 시료를 플레이트를 주입한 후 스핀들을 시료에 닿도록 0.25 mm 위치로 내리고 200 μm/sec 속도로 측정하였으며, 점도는, 블루필드 점도계를 사용하여, 0.5 cc의 시료를 시료컵에 넣고 0.5 rpm의 속도로 측정하였다.
도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 평균 5 내지 200 μm 크기의 가교된 히알루론산 입자를 포함하는 시료의 경우 이보다 큰 크기의 입자를 포함하는 시료에 비해 높은 점착력 및 점도를 나타내었다.
실시예 2: 가교된 히알루론산 및 TGF-β3를 포함하는 경조직 재생용 조성물의 혼합 비율에 따른 물성 평가
상기 제조예 1에 따라 준비한 가교된 히알루론산을 사용하여 PBS 완충액으로 20 mg/mL 용액을 준비하고, 재조합 인간 형질전환성장인자-베타3(recombinant human Transforming Growth Factor-beta3; rhTGF-β3)와 10:0으로부터 6:4까지 비율을 변화시키면서 소정의 부피비로 혼합하여 일련의 조성물을 준비하였다. 상기 일련의 조성물에 대해 점착력, 점도 및 토출력(extrusion force)을 측정하고, 그 결과를 각각 도 3 내지 5에 나타내었다. 구체적으로, 점착력 및 점도는 상기 실시예 1에서와 동일한 방법으로 측정하였으며, 토출력은, 만능시험기를 사용하여, 3 cc 주사기에 시료를 2 cc 충진한 후 21 G 주사기를 연결하고, 충진된 주사기를 지그에 고정시킨 후 30 mm/min 속도로 눌려 측정하였다.
도 3 내지 5에 나타난 바와 같이, 가교된 히알루론산의 비율이 감소함에 따라 점착력, 점도 및 토출력 모두 감소하는 경향을 나타내었다.
실시예 3: 실험 동물을 이용한 연골 재생능 확인
도 6에 나타낸 바와 같이, 미세골절(microfracture) 동물실험 모델을 제작하여, 해당 결손 부위에 준비한 조성물을 주입하고, 이후 4주, 8주 및 12주까지 관찰하면서 재생 정도를 확인하였다. 대조군으로는 무처치군(A) 및 캐리어 즉, 가교된 히알루론산만을 처리한 군(B)을, 실험군으로는 가교된 히알루론산 20 mg/mL에 TGF-β3을 각각 최종 농도 6 ppm, 30 ppm, 60 ppm, 100 ppm, 및 200 ppm으로 포함하는 조성물을 주입한 군(차례로 C 내지 G)을 사용하였다. 헤마톡실린 및 에오신 염색(hematoxylin & eosin stain; H&E 염색) 및 사프라닌 O-패스트 그린 염색(safranin O-fast green stain; SO-FG 염색)을 이용하여 도 7 및 8에 개시한 기준으로 채점하여 OARSI 스코어 및 연골하골등급(subchondral bone grade)을 산출하고, 각각의 결과를 도 9 및 10에 나타내었다. 나아가, 이들 수치를 하기 표 1에 종합적으로 요약하였다.
구분 시험물질 OARSI 스코어 연골하골등급
(subchondral bone grade)
4주 8주 12주 4주 8주 12주
대조군(A) 무처치군;
미세골절(microfracture)		 4.0±0.0 3.7±0.6 3.5±1.5 1.3±0.6 1.3±0.6 1.0±0.0
대조군(B) 캐리어 단독;
미세골절
+가교 HA(20mg/mL)		 3.7±0.6 3.0±1.0 2.6±0.6 1.3±0.6 1.3±0.6 0.8±0.6
실험군(C) 미세골절
+가교 HA(20mg/mL)
+TGF-β3(6ppm)		 4.0±1.0 2.7±0.6 1.7±0.0 1.7±0.6 0.3±0.6 0.3±0.6
실험군(D) 미세골절
+가교 HA(20mg/mL)
+TGF-β3(30ppm)		 5.0±0.8 2.8±0.7 1.7±0.0 2.3±0.5 0.7±0.0 0.5±0.0
실험군(E) 미세골절
+가교 HA(20mg/mL)
+TGF-β3(60ppm)		 3.7±1.5 2.7±0.6 1.0±0.6 2.0±0.0 0.7±0.6 0.0±0.0
실험군(F) 미세골절
+가교 HA(20mg/mL)
+TGF-β3(100ppm)		 4.3±1.5 2.0±1.0 1.0±1.2 1.0±1.0 0.7±1.2 0.3±0.6
실험군(G) 미세골절
+가교 HA(20mg/mL)
+TGF-β3(200ppm)		 5.0±1.0 2.3±1.5 1.4±2.0 1.0±1.0 0.7±0.6 0.5±0.6
도 9, 도 10 및 표 1에 나타난 바와 같이, 조성물 주입 후 4주 경과시에는 일부 실험군에서 대조군에 비해 열악한 수치를 나타내었으나, 8주 및 12주까지 경화함에 따라 각 실험군은 대조군에 비해 현저히 개선된 수치를 나타내었으며, 이는 조성물 주입 후 재생을 위한 충분한 시간이 경과한 이후로는 본 발명의 조성물이 손상된 연골에 대해 우수한 재생 효과를 발휘함을 나타내는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

  1. 가교된 히알루론산(crosslinked hyaluronic acid), 및 형질전환성장인자-베타(Transforming Growth Factor-beta; TGF-β)를 포함하며,
    상기 가교된 히알루론산은 평균 3 내지 250 μm 직경을 갖는 입자인 것이 특징인,
    경조직 재생용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조직은 연골조직 또는 골조직인 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 가교된 히알루론산은 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르(1,4-butanediol diglycidyl ether; BDDE), 디비닐설폰(divinyl sulfone; DVS), 비스에틸 카보디이미드(bis ethyl carbodiimide; BCDI), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG), 및 1-에틸3-(3-3-디메틸아미노프로필 카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide; EDC)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 가교제에 의해 가교된 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 가교된 히알루론산을 최종 조성물의 부피를 기준으로 15 mg/mL 내지 30 mg/mL의 함량으로 포함하는 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 TGF-β는 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, 및 BMP-7로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 TGF-β를 최종 조성물의 부피를 기준으로 0.003 mg/mL 내지 1.0 mg/mL의 함량으로 포함하는 것인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 2N 내지 15N의 점착력을 갖는 것인, 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 8,000 cP 내지 80,000 cP의 점도를 갖는 것인, 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 3N 내지 50N의 토출력을 갖는 것인, 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 경조직 결손 부위에 주입시점으로부터 12주 후 OARSI 스코어를 2.0 이하로 감소시키는 것인, 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 경조직 결손 부위에 주입시점으로부터 8주 후 연골하골등급을 1.0 이하로 감소시키는 것인, 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 경조직 결손 부위에 주입 직전에 가교된 히알루론산과 TGF-β를 혼합하는 것인, 조성물.
  13. 제1항의 경조직 재생용 조성물, 혼합 수단, 및 주입 수단을 포함하는, 경조직 재생용 키트.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 혼합수단은 혼합실린지, 바이알이송장치 또는 커넥터인 것인, 키트.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 주입수단은 실린지 또는 주사바늘인 것인, 키트.
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