JP2021515088A - 架橋ヒアルロン酸及びprp/bmcとの組み合わせ - Google Patents
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Abstract
Description
1) 粉末または繊維のような物理形状にあるポリマーが緩衝媒体に溶解される、最初の水和ステップ
2) 架橋剤が添加され、特定のpH条件において特定の温度で特定の時間にわたって反応が行われる、架橋ステップ
3) 通常、適用環境が人体であることを考慮した、必要な中和フェーズ
及び
4) 未反応の架橋剤を除去するために必要な最後の精製フェーズ
本方法は、本明細書では「ワンポット」方法と呼ばれる場合がある。「ワンポット」合成は、化学反応の効率を改善するための戦略として定義され、これにより、反応物は1つの反応器だけで連続的な化学反応に供される。特定の一連の反応が同じ反応器内で実行される限り、それは本明細書では「ワンポット」であると見なされる。
- 動粘度が最大約5Pa.s (パスカル秒).
- 1500KDa (500KDaと2000KDaの間)、
- 濃度2%(1%から2.5%の間)、
- 架橋度が約3%
a) 上記の容器は、
i) 少なくとも1種の抗凝固剤、および/または
ii) 赤血球(RBC)の分離を可能にする少なくとも1つのフィルターおよび/または組成物、好ましくはまたは必要に応じてセルセレクターゲル(CSG)、好ましくはまたは必要に応じてチキソトロピーゲル、好ましくはまたは必要に応じて不活性ポリエステルCSG、および
iii) 必要に応じて、ヒアルロン酸、キトサン、絹タンパク質またはフィブロインから選択される少なくとも1種の生体材料好ましくはまたはそれらの任意の組み合わせ、および
iv) 必要に応じて、少なくとも1種の血液、骨髄、細胞および/または血小板の保存および/または刺激溶液、好ましくはまたは必要に応じて、プラズマライトA
を含むかまたは予め充填されており、且つ
b) 必要に応じて、好ましくはまたは必要に応じて安全ロックおよび翼状針である付属品を好ましくまたは必要に応じて備えた収集ホルダーを含むまたは前記収集ホルダーからなる収集デバイスは、血液および/または骨髄を前記容器に収集するため、前記容器に取り付けられてもよく、前記収集は、好ましくはまたは必要に応じて真空により、好ましくはまたは必要に応じて閉回路において、好ましくはまたは必要に応じて自動的に行われ、且つ
c) 必要に応じて、収集デバイスは、トロンビン血清、好ましくはまたは必要に応じて自家トロンビン血清を前記容器に収集するために、前記容器に取り付けられてもよく、前記収集は好ましくはまたは必要に応じて閉回路で、好ましくはまたは必要に応じて自動的に行われ、且つ
d) 必要に応じて、移送デバイスを前記容器に取り付けて、前記PCおよび/または前記BMCを別の容器に移送することができ、前記容器は、好ましくはまたは必要に応じてチューブまたは注射器であり、好ましくはまたは必要に応じて真空下にあり、前記移送は、好ましくはまたは必要に応じて真空により、好ましくはまたは必要に応じて2つの容器間の直接接触によって、あるいいはデバイスの手段によって、好ましくはまたは必要に応じて閉回路で、好ましくはまたは必要に応じて自動的に行われ、且つ
e) 必要に応じてまたは好ましくはリンパ球に対し、他の血液成分および/または骨髄成分を分離するための少なくとも1つのフィルターまたは物質を必要に応じてさらに含み、
f) 前記容器は必要に応じて真空下にあり、
前記容器は、
i) 骨髄および/または全血を前記容器に収集すること、および
ii) 遠心分離、および
iii) 必要に応じて、前記容器の真空引きおよび/または混合および/または反転
に適しており、且つ、
iv) 前記容器からの前記PCおよび/またはBMCの収集、および/または
v) 前記PCおよび/またはBMCの別の容器への移送
のどちらかまたは両方に適している。
i) 少なくとも1種の抗凝固剤、または
ii) 赤血球(RBC)の分離を可能にする少なくとも1つのフィルターおよび/または組成物、好ましくはまたは必要に応じてセルセレクターゲル(CSG)、または
iii) 少なくとも1種の抗凝固剤と以下の組み合わせ:
a. 少なくとも1つのフィルター、または
b. 赤血球(RBC)の分離を可能にする組成物、好ましくはまたは必要に応じてセルセレクターゲル(CSG)、または
c. 少なくとも1つのフィルターと赤血球(RBCs)の分離を可能にする組成物との組み合わせ、好ましくはまたは必要に応じてセルセレクターゲル(CSG)。
a) 前記容器は、好ましくはまたは必要に応じてヒアルロン酸、キトサン、絹タンパク質またはフィブロイン、細胞抽出物から選択される生体材料またはそれらの任意の組み合わせを含むか、または予め充填されており、且つ
b) 必要に応じて、収集装置は、好ましくはまたは必要に応じて収集ホルダーを含み、PCおよび/またはBMCを前記容器に収集するために、前記容器に取り付けられてもよく、且つ
c) 必要に応じて、少なくとも1つの生体材料と組み合わせた前記PCおよび/またはBMCを、好ましくはまたは必要に応じて閉回路で収集することができ、且つ
d) 必要に応じて、前記容器は、好ましくはまたは必要に応じてトロンビン血清、グルコン酸カルシウムおよび/または塩化カルシウムから選択される凝固促進剤をさらに含むか、または予め充填されており、且つ
e) 上記の容器は必要に応じて真空下にあり、
f) 前記容器は必要に応じて2つ以上のチャンバーを含み、各チャンバーは物質、生体材料、細胞抽出物、PCまたはBMCおよび/または凝固活性剤から選択される組成物を含み、前記組成物はそれぞれのチャンバーで互いに分離され、前記組成物は、必要に応じて互いに接触するか、または前記容器の内部または外部で一緒に混合されてよく、前記チャンバーは、化学的または生物学的な物質、膜または他の分離手段によって分離され、このような分離手段は、必要に応じて経時的に崩壊するか、または生分解性であってよく、
前記容器は、
i) 前記移送が必要に応じて閉回路で行われ、好ましくはまたは必要に応じて自動的に、好ましくはまたは必要に応じて真空により、好ましくは必要に応じて2つの容器間の直接の接触または収集デバイスを介して、PCおよび/またはBMC容器、好ましくはまたは必要に応じて第1の態様の容器からの、PCおよび/またはBMCの収集、及び
ii) 必要に応じて遠心分離、および
iii) 好ましくはまたは必要に応じて注射器、好ましくはまたは必要に応じて閉回路で、好ましくはまたは必要に応じて自動的に行われる、少なくとも1つの生体材料と組み合わせた前記PCおよび/またはBMCの収集または別の装置への移送、および
iv) 必要に応じて混合および/または反転
に適している。
a) 前記注射器は、好ましくはまたは必要に応じて生体材料を含むか、または予め充填されていることが好ましく、前記生体材料は、ヒアルロン酸、キトサン、フィブロインまたはフィブロイン絹タンパク質、細胞抽出物、またはそれらの任意の組み合わせから選択され、
b) 必要に応じて、収集装置、好ましくは又は必要に応じて収集ホルダーは、PC及び/又はBMCを前記注射器に収集するために、前記注射器に取り付けることができ、
c) 必要に応じて、前記注射器は、凝固活性剤を含むか、または凝固活性剤で予め充填されており、前記凝固活性剤は、好ましくはまたは必要に応じて、トロンビン血清、グルコン酸カルシウムおよび/または塩化カルシウムから選択され、
d) 前記注射器は、必要に応じて2つ以上のチャンバーを含み、各チャンバーは物質、生体材料、細胞抽出物、PCまたはBMCおよび/または凝固活性剤から選択される組成物を含むことができ、前記組成物は、それぞれのチャンバーで互いに隔離され、前記組成物は、必要に応じて互いに接触するか、または前記注射器の内部または外部で一緒に混合されてもよく、前記チャンバは、化学的または生物学的物質、膜または任意の他の分離手段によって分離され、そのような分離手段は、経時により分解するか、生分解性であってよく、
前記注射器は、
i) PCおよび/またはBMC容器からのPCおよび/またはBMCの収集であって、好ましくはまたは必要に応じて本発明の第1の態様の容器からの収集であり、前記収集は好ましくはまたは必要に応じて、前記注射器間の直接接触による閉回路で行われ、前記容器または収集装置を介して、好ましくはまたは必要に応じて自動的に行われる収集、および
ii) 必要に応じて反転、および
iii) 少なくとも1つの生体材料と組み合わせた前記PCおよび/またはBMCの、好ましくはまたは必要に応じて閉回路で、好ましくはまたは必要に応じて自動的に行われる、人または動物への適用または注入
に適している。
i) 少なくとも1つの抗凝固剤、および/または
ii) 赤血球(RBC)、好ましくはまたは必要に応じてセルセレクターゲル(CSG)、好ましくはまたは必要に応じてチキソトロープゲル、好ましくはまたは必要に応じて不活性ポリエステルCSGの分離を可能にする少なくとも1つのフィルターおよび/または組成物、および/または
iii) 必要に応じて、好ましくはまたは必要に応じてヒアルロン酸、キトサン、絹タンパク質またはフィブロインまたはそれらの任意の組み合わせから選択される、少なくとも1つの生体材料、および/または
iv) 必要に応じて、少なくとも1つのPCまたはBMC保存溶液、必要に応じて、または好ましくはプラズマライトA、および/または
v) 必要に応じて、少なくとも1つの凝固促進剤、トロンビン血清、リン酸三カルシウム(TCP)、代用骨、ヒアルロン酸組成物、グルコン酸カルシウム、サッカリン酸カルシウム、キトサン、フィブロイン、フィブロイン絹タンパク質またはフィブロインタンパク質、成長因子、マンニトール、コラーゲン、アルブミン、アスコルビン酸、クリーム、脂肪細胞、脂肪組織、骨髄濃縮物、ルブリシン、cd−ゼラチン、ボツリヌス毒素および/または1つ以上の細胞抽出物、好ましくは、ケラチノサイト、骨髄、線維芽細胞、骨膜または角膜細胞、メラノサイトおよびランゲルハンス細胞、脂肪細胞、筋芽細胞および衛星細胞などの筋肉細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、臍帯細胞、幹細胞、間葉系幹細胞(MSC)、前脂肪細胞、脂肪細胞、前内皮細胞、シュワン細胞またはアキレス腱細胞の抽出物から選択される自己細胞抽出物。
a) 少なくとも2つの容器、少なくとも1つの容器と1つの注射器、または少なくとも2つの注射器は、物質、材料、PC、BMC、細胞抽出物、または組成物を1つの容器または注射器から他の容器または注射器へ移送できる接続デバイスを介して、一緒に接続されていてよく、
b) 容器がチューブであり、且つ/または
c) 前記チューブまたは注射器は、約1ml〜約20mlの全血、骨髄、PCまたはBMC、好ましくはまたは必要に応じて約2ml〜約10ml、好ましくはまたは必要に応じて約4mlの回収が可能であり、
d) 前記容器および/または注射器は、無菌および/または非発熱性であり、且つ/または
e) 前記容器は、PRP、自家PRP、PC、自家PCおよび/または自家BMCの調製に適しており、且つ/または
f) 前記容器は、約2ml〜約10ml、好ましくはまたは必要に応じて約3ml〜約6ml、好ましくはまたは必要に応じて約4mlのPRP、自家PRP、自家PCおよび/または自家BMCの調製に適しており、且つ/または
g) 前記注射器は、約0.5ml〜約5mlの生体材料、好ましくはまたは必要に応じて約2mlの生体材料が予め充填されているか、または含まれており、且つ/または
h) 前記容器は、約1ml〜約4mlのセルセレクターゲル好ましくはまたは必要に応じて約1.5ml〜約3.5ml、好ましくはまたは必要に応じて約1.5ml、約2ml、約2.5mlまたはセルセレクターゲル約3ml、が予め充填されているか、またはそれを含み、且つ/または
i) 前記容器は、約0.2ml〜約1mlの抗凝固剤、好ましくはまたは必要に応じて約0.6mlの抗凝固剤、好ましくはまたは必要に応じてクエン酸ナトリウム、約2%〜約6%、好ましくはまたは必要に応じて約4%が含まれるか、または予め充填されており、および/または
j) 前記容器または注射器は、約1ml〜約5mlのヒアルロン酸、好ましくはまたは必要に応じて約2mlのヒアルロン酸を含み、且つ/または
k) 前記ヒアルロン酸がゲルの形態であり、且つ/または
l) 前記ヒアルロン酸は、緩衝液、好ましくはまたは必要に応じてリン酸緩衝液に存在しており、前記緩衝液は、好ましくはまたは必要に応じて塩化ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリウムおよび水を含むか、またはこれらからなり、且つ/または
m) 前記ヒアルロン酸は、注射、メソセラピー、および/または塗布に適しており、且つ/または
n) 前記ヒアルロン酸は、容器あたり約40mg〜約200mg、好ましくはまたは必要に応じて容器あたり約80mgであり、且つ/または
o) 前記ヒアルロン酸の分子量は、約1000KDa〜約2000KDa、好ましくはまたは必要に応じて約1550KDaであり、且つ/または
p) 前記ヒアルロン酸は、約0.1%〜約3%、好ましくは約1%〜約2%であり、且つ/または
q) 前記ヒアルロン酸は、発酵により得られ、且つ/または
r) 前記容器は、
1.製造プロセス中において、および/または
2.遠心分離前、血液または骨髄を前記容器に収集する前および/または後において、且つ/または
3.少なくとも1つの物質、生体材料、ゲルおよび/または抗凝固剤またはそれらの任意の組み合わせにより、予め充填され、キットまたは医療デバイスに含まれる。
a) 任意の態様または実施形態による少なくとも1つの容器および/または少なくとも1つの注射器。
b) 本発明の第1の態様の少なくとも1つの容器、本発明の第2の態様の少なくとも1つの容器および/または本発明の第3の態様の少なくとも1つの注射器またはそれらの任意の組み合わせ、
c) 本発明の第1の態様の少なくとも1つの容器および本発明の第2の態様の少なくとも1つの容器、
d) 本発明の第1の態様の少なくとも1つの容器および本発明の第3の態様の少なくとも1つの注射器、
e) 本発明の第1の態様の少なくとも1つの容器、本発明の第2の態様の少なくとも1つの容器、および本発明の第3の態様の少なくとも1つの注射器、
f) 本発明の第2の態様の少なくとも1つの容器および本発明の第3の態様の少なくとも1つの注射器、
g) PCの調製のための本発明の第1の態様の少なくとも1つの容器およびBMCの調製のための本発明の第1の態様の少なくとも1つの容器、
h) PCの調製のための本発明の第1の態様の少なくとも1つの容器および/またはBMCの調製のための本発明の第1の態様の少なくとも1つの容器、および、細胞抽出物が含まれるか、または予め充填された本発明第2の態様の少なくとも1つの容器、およびヒアルロン酸、キトサン、絹タンパク質、またはフィブロイン、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるかまたは予め充填された本発明第2の態様の少なくとも1つの容器、
i) PCの調製のための本発明の第1の態様の少なくとも1つの容器および/またはBMCの調製のための本発明の第1の態様の少なくとも1つの容器、および、細胞抽出物が含まれるかまたは予め充填された本発明の第2の態様の少なくとも1つの容器、およびヒアルロン酸、キトサン、絹タンパク質またはフィブロインまたはそれらの任意の組み合わせが含まれるかまたは予め充填された本発明の第3の態様の少なくとも1つの注射器、
j) PCの調製のための本発明の第1の態様の少なくとも1つの容器および/またはBMCの調製のための本発明の第1の態様の少なくとも1つの容器、および細胞抽出物が含まれるかまたは予め充填された本発明の第3の態様の少なくとも1つの注射器、およびヒアルロン酸、キトサン、絹タンパク質、またはフィブロイン、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるかまたは予め充填された本発明の第2の態様の少なくとも1つの容器。
ここで、前記医療デバイスまたはキットは、必要に応じてさらに以下を含む。
k) 本発明の第1の態様の少なくとも1つの容器、本発明の第2の態様の容器および/または本発明の第3の態様の注射器またはそれらの任意の組み合わせ、および/または
l) トロンビン血清、好ましくは自家トロンビン血清を調製するための少なくとも1つの容器、および/または
m) 任意の物質、材料、PC、BMC、細胞抽出物、または組成物を1つの容器または注射器から別の容器または注射器に移送できる接続デバイス。
a) 本発明の第1の態様による容器、および
b) 本発明の第1の態様の容器、本発明の第2の態様の容器、または本発明の第3の態様の注射器、および
c) 必要に応じて、血液または骨髄を収集するための収集デバイスであって、好ましくはまたは必要に応じて、安全ロックおよび蝶針を備えた収集ホルダーを好ましくはまたは必要に応じて含むかまたは当該収集ホルダ―からなる収集デバイス、および
d) 必要に応じて、収集ホルダーと、PCまたはBMCを本発明の第1の態様の前記容器、本発明の第2の態様の前記容器および/または本発明の第3の態様の前記注射器へ移送するための移送デバイスとを含むかまたはそれらからなる収集デバイス、および
e) 必要に応じて付属品および/または使い捨ての瀉血材料。
a) 真空下約4mLの血液または骨髄を採取してPRPまたはBMCを調製することができるチューブであって、以下を含むチューブ。
ii. 約2.5mLの不活性セルセレクターゲル
iii. 約0.6mLの抗凝固剤、好ましくはまたは必要に応じて約4%のクエン酸ナトリウム、
b) 真空下において、チューブa)から約4mLのPRPまたはBMCを取り出せるチューブであって、リン酸緩衝液に約2mLのヒアルロン酸ゲルを含み、好ましくはまたは必要に応じて塩化ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリウム、および注射用水を含むチューブ。
c) 安全ロックと蝶針を備えた収集ホルダーからなる、血液および/または骨髄を収集するための収集デバイス。
d) 好ましくはまたは必要に応じて、収集ホルダーと、前記チューブa)から前記チューブb)へPCおよび/またはBMCを収集するための移送デバイスとからなる収集デバイス。
a) PRPまたはBMCを真空下で調製するためのチューブであって、以下を含む約4mLの血液または骨髄の採取を可能にするチューブ。
i. 約2.5mLの不活性セルセレクターゲル
ii. 約0.6mLの抗凝固剤、好ましくはまたは必要に応じて約4%のクエン酸ナトリウム、
b) チューブa)約4mLのPRPまたはBMCを、からから引き出すことができる注射器であって、リン酸緩衝液に約2mLのヒアルロン酸ゲルを含み、好ましくはまたは必要に応じて塩化ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリウム、および注射用水を含む注射器。
c) 安全ロックと蝶針を備えた収集ホルダーからなる、血液および/または骨髄を収集するための収集デバイス。
d) 好ましくはまたは必要に応じて、収集ホルダーと、前記チューブa)から前記注射器b)へPCおよび/またはBMCを収集するための移送デバイスとからなる収集デバイス。
a.収集ホルダーと組み立てられた安全ロックバタフライニードル
b.事前に組み立てられた移送デバイス
c.血液を引き出すことができる、真空下におけるチューブであって以下を含む。
i)約2.5mLの不活性セルセレクターゲル、
ii)約0.6mLの抗凝固剤(例えば、クエン酸ナトリウム4%)、
d.PRPを回収できる真空下におけるチューブであって、リン酸緩衝液(塩化ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリウム、注射用水)に約2mLのヒアルロン酸ゲルを含み、1つのチューブあたり好ましくは約80mgのヒアルロン酸を約1550KDaで含み、好ましくは発酵から得られる。
左側の部分構造1A4(A)は、一般的な架橋鎖(A)を一般式で示しており、ジエポキシ架橋剤(架橋剤)(構造1A3)と、2つのHAポリマー鎖の−OH基との反応によって形成される。
右側の部分構造1A4(B)は、1つのHAまたはXLHAポリマー鎖のみに連結された一般的な側鎖または基(B)を一般式で示しており、i)一般的なジエポキシド架橋剤(構造1A3)の1つのエポキシ基と、1つのHAポリマー鎖の−OH基との反応、およびii)単一のHA結合リンカーの2つ目のエポキシ基の(例えば水または水酸化物による)加水分解によって形成される。
G* は複素剪断弾性率
G’は同相貯蔵弾性率及び
G’’は異方性損失係数; G* = √(G’2 + G’’2)。
さらに、本発明は、再生目的(細胞療法、免疫療法、神経変性療法など)で患者自身の細胞を培養するためのウシ胎児血清(FBS)の代用として使用される、患者自身の血液または骨髄から多血小板血漿、血清または単核細胞の標準化された調製物を製造するための非常に革新的で効率的で迅速かつ再現性のあるGMP医療デバイスを提供する。
i)例えばチューブまたは注射器等の容器。 好ましくは、チューブはホウケイ酸塩でできている。好ましくは、チューブはシリコーンを含み、発熱物質が除去されている。 好ましくは、チューブはストッパー付きで真空下にある。
ii)重力による細胞分離のための添加剤としての複合ニュートンポリマー。 好ましくは、複合ニュートンポリマーはチキソトロピーゲルである。 好ましくは、チキソトロピーゲルは、粘度および密度に依存する作用機序を有する大きなポリマー複合体である。 好ましくは、チキソトロピーゲルは、オリゴマーであり、好ましくは、ポリオレフィンハイドロカーボンオリゴマーまたはアクリル樹脂混合物である。チキソトロピーゲルは、PEG−シリカゲルであってもよい。
i) 添加剤として、密度が約1.03〜約1.05g/cm3のチキソトロピーゲルを含むデバイスであり、本明細書では、CC−PRPと呼ばれる。このようなデバイスは、「純粋な」PRPの収集を可能にする。好ましくは、密度は、約1.04〜約1.05g/cm3である。当該デバイスはさらに、添加剤として抗凝固剤、好ましくはクエン酸ナトリウムを、好ましくは0.1Mの濃度で含む。好ましくは、当該デバイスはこれらの2つの添加剤、すなわちチキソトロープゲルおよび抗凝固剤のみを含む。チキソトロピーゲルは、好ましくは、デバイスにおいて、例えばチューブの閉じた端から、第1層として存在し、抗凝固剤からなる第2層がこれに続く。有利なことに、このようなデバイスは、RBCおよび多核細胞を除くPCまたはBMC、単核白血球(MNC)のないPCまたはBMC、白血球除去PRP、PCまたはBMCの迅速な調製を可能にする。
ii) 添加剤として、密度が約1.05〜約1.095g/cm3のチキソトロープゲルを含むデバイスであり、ここでは、MC−PRPと呼ばれる。有利なことに、そのようなデバイスは、患者の血液または骨髄からの血液単核細胞の特異的かつ迅速な分離を可能にする。有利なことに、そのようなデバイスは、患者の単核白血球(MNC)、白血球リッチなPC、BMCまたはPRPとともに、PRP、PCまたはBMCの準備を可能にする。好ましくは、密度は、約1.08〜約1.09g/cm3、または1.075〜約1.09g/cm3である。最も好ましくは、密度は約1.075〜約1.08g/cm3である。当該デバイスはさらに、添加剤として抗凝固剤、好ましくはクエン酸ナトリウムを、好ましくは0.1Mの濃度で含む。好ましくは、当該デバイスはこれらの2つの添加剤、すなわちチキソトロピーゲルおよび抗凝固剤のみを含む。チキソトロピーゲルは、好ましくは、デバイスにおいて、例えばチューブの閉じた端から、第1の層として存在すし、抗凝固剤からなる第2層がこれに続く。
iii) 添加剤として、密度が約1.03〜約1.05g/cm3のチキソトロピーゲルのみを含むデバイスであり、本明細書では、CC−Sと呼ばれる。有利なことに、このようなデバイスは、トロンビン血清の迅速な調製を可能にする。
iv) 本明細書でCC−HAと呼ばれる、デバイスであり、以下を添加剤として含有するデバイス。
a. 密度が約1.03〜約1.05g/cm3のチキソトロピーゲル、または上記のi)で述べたチキソトロピーゲル、
b. 好ましくは0.1Mの濃度の抗凝固剤、好ましくはクエン酸ナトリウム、および
c. ヒアルロン酸。ヒアルロン酸は、架橋されていなくても、架橋されていてもよい。好ましくは、ヒアルロン酸は、約1500Kdaの分子量を有し、約1.5%〜約2%、好ましくは約2%である。ヒアルロン酸は、本明細書に記載の方法から得られる架橋ヒアルロン酸であってよい。分子量は500KDa〜9000KDaの範囲である。
好ましくは、当該デバイスはこれらの3つの添加剤、すなわちヒアルロン酸、チキソトロピーゲルおよび抗凝固剤のみを含む。ヒアルロン酸は、好ましくは、デバイスにおいて、例えばチューブの閉じた端から、第1層として存在し、チキソトロープゲルからなる2番目の層、抗凝固剤からなる3番目の層がこれに続く。有利なことに、このようなデバイスは、HAと組み合わせたPCまたはBMCの迅速な準備を可能にする。HAは別の生体材料に置き換えることができる。
v) 本明細書でMC−HAと呼ばれるデバイスであり、以下を添加剤として含有する。
d. 密度が約1.05〜約1.09g/cm3のチキソトロピーゲル、または上記のポイントii)で述べたチキソトロピーゲル、
e. 好ましくは0.1Mの濃度の抗凝固剤、好ましくはクエン酸ナトリウム、および
f. ヒアルロン酸。ヒアルロン酸は、架橋されていなくても、架橋されていてもよい。好ましくは、ヒアルロン酸は、約1500Kdaの分子量を有し、約1.5%〜約2%、好ましくは約2%である。ヒアルロン酸は、本明細書に記載の方法から得られる架橋ヒアルロン酸であってよい。分子量は500KDa〜9000KDaの範囲である。
好ましくは、当該デバイスはこれらの3つの添加剤、すなわちヒアルロン酸、チキソトロピーゲルおよび抗凝固剤のみを含む。ヒアルロン酸は、好ましくは、デバイスにおいて、例えばチューブの閉じた端から、第1層として存在し、チキソトロープゲルからなる2番目の層、抗凝固剤からなる3番目の層がこれに続く。有利なことに、このようなデバイスは、HAと組み合わせたPCまたはBMCの迅速な準備を可能にする。HAは別の生体材料に置き換えることができる。
CC−S+MC−PRP:PRP:CC−Sに存在する自家トロンビンは、PRP製剤の凝固を再活性化し、単核細胞と血小板が閉じ込められているフィブリンマトリックスを形成を可能にする。
CC−PRP+MC−PRP:2つの異なる製剤からのPRPを組み合わせ、MC−PRPデバイスにより、特異的に分離された単核細胞とともに、その成長効果を最大化する。
CC−HA:細胞培養に適した所定の密度で、同じ製剤におけるPRPとヒアルロン酸を組み合わせることを可能にする、単一のデバイス。
本発明は、以下の組み合わせを包含するが、これらに限定されない。
−骨髄からのCC−PRP+MC−PRP
−CC−PRP+同じ患者からの分離細胞(ケラチノサイト、線維芽細胞、骨髄、骨膜または角膜細胞、メラノサイトおよびランゲルハンス細胞、脂肪細胞、筋細胞(筋芽細胞、衛星細胞)、骨芽細胞、軟骨細胞、臍帯細胞、シュワン細胞、腱細胞、異なる起源の間葉系幹細胞)
−CC−PRPから取得したHPL+血液からのMC−PRP
−CC−PRPから取得したHPL+骨髄からのMC−PRP
−CC−PRPから取得したHPL+同じ患者からの分離細胞(ケラチノサイト、線維芽細胞、骨髄、骨膜または角膜細胞、メラノサイトおよびランゲルハンス細胞、脂肪細胞、筋細胞(筋芽細胞、衛星細胞)、骨芽細胞、軟骨細胞、臍帯細胞、シュワン細胞、腱細胞、異なる起源の間葉系幹細胞)
−血液からのCC−S+MC−PRP
−骨髄からのCC−S+MC−PRP
−CC−S+同じ患者からの分離細胞(ケラチノサイト、線維芽細胞、骨髄、骨膜または角膜細胞、メラノサイトおよびランゲルハンス細胞、脂肪細胞、筋細胞(筋芽細胞、衛星細胞)、骨芽細胞、軟骨細胞、臍帯細胞、シュワン細胞、腱細胞、異なる起源の間葉系幹細胞)
−血液からのCC−S+CC−PRP+MC−PRP
−骨髄からのCC−S+CC−PRP+MC−PRP
−同じ患者からのCC−S+CC−PRP+分離細胞(ケラチノサイト、線維芽細胞、骨髄、骨膜または角膜細胞、メラノサイトおよびランゲルハンス細胞、脂肪細胞、筋細胞(筋芽細胞、衛星細胞)、骨芽細胞、軟骨細胞、臍帯)臍帯細胞、シュワン細胞、腱細胞、異なる起源の間葉系幹細胞)
−CC−HA+血液からのMC−PRP
−CC−HA+骨髄由来のMC−PRP
−CC−HA+同じ患者かのら分離細胞(ケラチノサイト、線維芽細胞、骨髄、骨膜または角膜細胞、メラノサイトおよびランゲルハンス細胞、脂肪細胞、筋細胞(筋芽細胞、衛星細胞)、骨芽細胞、軟骨細胞、臍帯細胞、シュワン細胞、腱細胞、異なる起源の間葉系幹細胞)
−血液からのMC−HA+MC−PRP
−骨髄からのMC−HA+MC−PRP
−MC−HA+同じ患者からの分離細胞(ケラチノサイト、線維芽細胞、骨髄、骨膜または角膜細胞、メラノサイトおよびランゲルハンス細胞、脂肪細胞、筋細胞(筋芽細胞、衛星細胞)、骨芽細胞、軟骨細胞、臍帯細胞、シュワン細胞、腱細胞、異なる起源の間葉系幹細胞)
−細胞療法:疾患の治療のための細胞療法における幹細胞、多能性細胞、またはリプログラむされた成体細胞を使用するには、ex vivo(生体外)条件で細胞を成長させる必要がある。CC−PRPとCC−Sは、自家細胞療法においてFBSに取って代わる効率的な製品である。治療分野には、再生医療、皮膚、創傷治癒、創傷ケア、組織再生、美容および形成外科処置における皮膚充填、スキンケア、筋骨格(MSK)、肝臓再生、ウロギネコロジーおよび血管新生が含まれるが、これらに限定されない。
−組織工学:損傷した組織の再生には、患者自身の細胞が増殖でき、各組織型の生物学的機能を維持できる足場材の作成が必要となる。細胞培養製品(CC−PRPとCC−Sの組み合わせ)は、細胞増殖と組織再生をサポートする成長因子が豊富な3次元フィブリン足場材を形成する。
−免疫療法:がんと闘う戦うためにリンパ球を使用するには、リンパ球を患者自身の体から採取する必要がある。その後、リンパ球は患者に再注入される前に、生体外で活性化される。MC−PRPを使用すると、免疫療法で使用するリンパ球を迅速かつ簡単に分離できる。
i)CC−PRPの場合:
キットは6×CC−PRPチューブ(10ml)
チューブの内容
−セパレーターゲル
−クエン酸ナトリウム(抗凝固剤)
ii)MC−PRPの場合:
6×MC−PRPチューブ(10ml)
iii)CC−Sの場合:
キットは6×CC−Sチューブ(10ml)を含む
−採血付属部品セット
−水平ヘッド(スイングバケット)または45°の固定ローター遠心分離機。
CC−PRP:血小板回収率:80%、血小板濃縮係数:1.6x
MC−PRP:血小板回収率:95%、血小板濃縮係数:1.7x、単核球の回収を含む。
実施例1−ヒアルロン酸
本明細書に記載の方法を使用して、架橋ヒアルロン酸(本明細書ではXLHAとも呼ばれる)は、細菌発酵HAから出発して合成され、以下の仕様の製品が得られた。
1.HAの最大含有率2%
2.最大20%の架橋
3.複素粘度の最高値として60Pa.s
4.残留BDDEの最大濃度2ppm
5.カニューレ22G1/2または27G1/2で簡単に注射可能
−発酵により得られたHAからの架橋ヒアルロン酸。
−架橋率:10−50%
−架橋剤:基本的な条件でのBDDE
−架橋HA再吸収時間:3〜4か月(吸収可能な製品の範囲=3〜6か月)
−HA濃度:2%
−BDDE残留物:<2ppm
−均質なゲル
−粘弾性ゲル
−カニューレ22G1/2または27G1/2で簡単に注射可能
−複素粘度:注射器で最大60Pa.s
−弾性:最大50%
−局所的過架橋による「きらめき」がない
−架橋HAは、遠心分離後に分離ゲルの上に遊走するために、密度を分離ゲルよりも低くする必要がある
−PRP+HAまたはBMC+HAの調製用チューブ(HAはPRPまたはBMCと簡単に混合できる)および注射器2mlおよび35mlで使用できる
−ISO 10993に準拠した生体適合性
−蒸気による滅菌
−非発熱性
−製造プロセスは再現可能で安定している
1)ポリマー繊維/粉末は反応器に移され、そして反応器が閉じられる。次に、溶媒を、供給容器を撹拌しながら、濾過しながら加える(220μm)。別の方法として、反応器がすでに閉じている状態で、固体吹出口を使用して粉末を加え、その後上記のようにして溶媒を加える。
2)混合物を均質化した後、架橋剤を含む塩基性溶液を添加し、pHを測定する。
3)次に、温度を50℃まで上げる。2時間後、混合物を室温に戻す。
4)中和ステップは酸の添加により行われる。濾過しながら、PBS中のHCl溶液を、供給容器を通して加える。pHをチェックして、生理学的条件に到達したことを確認する。中性のpH下では、ヒドロキシル基のプロトン化が低下し、反応性が低下するため、HAの反応性はすでに低下している。
5)混合物を4℃で一晩撹拌し続け、このフェーズの最後にpHを再度チェックする。低温下でも、システムの反応性が低下し、さらなる架橋なしに完全な均質化が可能となる。
6)最後に、混合物を室温に戻し、一定量の非架橋HAを加えて、分離ゲルを維持しPRPと混合するのに必要な粘度を得る。ポリマーは供給容器を通して加えられ、完全に均質化されるまで攪拌される。
7)この時点でゲルはろ過された状態で収集される(280μm)。
このようにして、合成プロセス全体が、ゲルを汚染の可能性にさらすことなく閉鎖環境で実行される。連続したプロセスにより、プロセス全体で合成混合物の均質化が向上し、操作がゼロに削減されるため、時間は常に短くなる。
架橋ヒアルロン酸(XLHA)は、細菌発酵ヒアルロン酸(HA)から合成され(この特定の合成では、HAはポリアニオン型であり、ナトリウム塩として存在する)、下記の特定の特性を有する製品が得られる。
HAの最大含有量2%(例えば、WO2004/014399 A1、「無菌の高分子量ヒアルロン酸製剤の調製方法」を参照);
架橋度最大20%(例えば、Jeon、O.、et al.,Carbohydrate Polymers、70、(2007)、251―257を参照);
複素粘度の最高値として60Pa.s(例えば、http://www.rheosense.com/applications/viscosity/drug−injectability、および/またはNicholls,M.et al,Clinical Medicine Insights:Arthritis and MusculoskeletalDisorders,(2018)、11、1―5を参照);
残留BDDEの最大濃度2ppm(例えば、De Boulle,K.,et al,Dermatol.Surg.,2013;39:1758―1766を参照);
型/ゲージ22G1/2または27G1/2のカニューレ(針)で簡単に注射可能。
ヒアルロン酸(「HA」、ヒアルロナンとも呼ばれる)は、[D−グルクロン酸とN−アセチル−D−グルコサミン]の二糖単位の繰り返し(1、2、3以上)を含む糖類(特にグリコサミノグリカン)(例えば、以下の構造1A1を参照)である。
・pHがヒドロキシル基のpKa値よりも低い場合、HAのヒドロキシキル基の脱プロトン化される量または割合は少なくなり、HAのアニオン性カルボキシレート基が、HAの支配的なアニオンになる。これらの条件により、架橋剤のエポキシド基とHAの(主に)アニオン性カルボキシレート基が反応し、エステル結合の形成が促進される。
・ペンダント架橋剤:一方の端でのみHAと反応したBDDE分子、即ち、1つのエポキシド基のみが1つのHA鎖と反応(アルキル化)している。BDDEのもう一方の端にある2つ目のエポキシド基は、一般的に水または水酸化物と反応する。このようにして、単連結BDPEが形成される(構造スキーム1A2における構造B)(例えばJeon,O.,et al.,Carbohydrate Polymers,70,(2007),251―257および/またはKablik,J.,et al.,Dermatol.Surg.,2009;35:302―312を参照)。
・不活性化された架橋剤:両端で水または水酸化物と反応して遊離BDPE(完全に加水分解されたBDDE)を形成するBDDE分子(構造スキーム1A2における構造C)(例えばJeon,O.,et al.,Carbohydrate Polymers,70,(2007),251―257および/またはKablik,J.,et al.,Dermatol.Surg.,2009;35:302―312を参照)。
・残留架橋剤:HAまたは水または水酸化物と反応していないBDDE分子(構造スキーム1A2における構造D)。残留架橋剤の存在に関連するリスクは、架橋生成物の精製によりほぼ完全に排除される(例えば、Kablik,J.,et al.,Dermatol.Surg.,2009;35:302―312を参照)。
構造スキーム1A2:ヒアルロン酸(HA)鎖と架橋剤BDDEとの架橋反応を示す概略図。上記の構造スキーム1A2では、HA原料は、HAの一種以上のポリカルボキシナトリウム塩(脱プロトン化および/またはポリアニオン)形態で示されているが、たとえばここで定義されているように、任意の形態のHAが使用できる。したがって、任意の形態の架橋HAを形成できる。また、異なる(非BDDE)ジエポキシド架橋剤をBDDEの代わりにおよび/またはBDDEと共に使用することができる。HAとジエポキシド架橋剤(好ましくはBDDE)の架橋反応中に生成された生成物A、B、CおよびDに関して、ジエポキシド(好ましくはBDDE)由来の4つの生成物(AからD)すべての合計は5mg/mL未満、または5,000ppm未満であるため、ジエポキシド(好ましくはBDDE)の原始形態Dの痕跡レベル(痕跡レベルは2ppm未満、つまり水性ゲル等の水性溶媒1Lあたり2mg未満))が、架橋反応の生成物(AからD)の合計において占める割合は非常に小さい。
XLHAは、多くの企業によって、異なるさまざまなプロセスで製造されている。得られたXLHAゲルは、主に、皮膚科治療で使用するための注射器の調製に用いられている。一般的に、使用される架橋剤(好ましくはBDDE)の量および/または合成に採用される物理パラメーターに応じて、架橋のパーセンテージを調整でき、さまざまな粘弾性特性と滞留時間を有するゲルを生産できる。
)。
a)特許出願その一(WO 2012/077054 A1; Meunier、S.およびBourdon,F.;「架橋ゲルの調製方法」)において、押出ステップを含んだXLHAの合成を説明している。
b)特許出願その二(WO 2015/015407 A1; Meunier、S.およびBourdon,F.;「ヒアルロン酸とメピバカインを含む組成物」)において、製剤における麻酔薬の使用を紹介している。
c)特許出願その三(WO 2010/131175 A1; Bourdon、F .;「架橋ゲルの調製方法」)において、変形可能なポーチを使用してゲルを均質化する新たな方法を開示している。
1.粉末または繊維の物理形態のポリマー(具体的には、HA)を緩衝媒体、典型的には緩衝水性媒体に溶解する、最初の水和ステップ。
2.架橋剤を添加して、特定のpH条件下、特定の温度で特定の時間反応を行う架橋ステップ。
3.最終的なXLHA製品の適用(使用)環境が人体であるという典型的な場合に必須である中和フェーズ。
4.未反応の架橋剤の量(すなわち、モル数または分子数)を除去および/または低減する(好ましくは、50%以上、または70%以上、または90%以上、または95%以上または、99%以上を除去および/または低減する)ための精製の最後フェーズ。
医療機器および/または医薬組成物の分野において、Regen LabTMは、ヒアルロン酸(HA)を含む製品(医薬組成物)を製造し、特に皮膚科および/または整形外科の治療および/または予防(好ましくは人体)に用いられることが知られている。特に、Cellular MatrixTM(例えば、WO 2013/061309 A2,Turzi,A.,「New a−prp medical device & tissue engineering composition, manufacturing machines and process」を参照)は、広く使用されている製品であり、その中に含まれる2種類の活性製品、つまりPRP(多血小板血漿)とヒアルロン酸(HA)には、皮膚の若返り作用を有する(たとえば、Lana JFSDら,J.Stem Cells Regen Med.,2016;12(2);および/またはUlusal,BG,Journal of Cosmetic Dermatology,2017;16(1):112−119を参照)。
特に、本発明によるこのような新たなXLHAおよび/またはXLHA含有製品は、好ましくはいずれも次のとおりである。
(a)注射可能な医薬組成物の調製に用いられ、関節痛症状および/または関節可動性改善および/または他の関節関連障害(好ましくは人体における)の治療および/または予防に用いられ、好ましくは注射により投与され、より好ましくは前記治療および/または予防を必要とする関節への注射により投与され、および/または
(b)注射可能な医薬組成物の調製に用いられ、真皮中層から真皮深層(好ましくは人体における)への注射により投与され、
好ましくは、
(b1)萎縮性瘢痕(好ましくは外傷性および/または術後に起因する萎縮性瘢痕)の矯正および/または修正に用いられ、好ましくは人体に用いられ、および/または
(b2)皮膚の脱水の治療および/または予防に用いられ、好ましくは人体に用いられ、および/または
(b3)顔面のしわ(好ましくは中程度から重度の顔面のしわ)および/または鼻唇溝などのひだの解剖学的構造の矯正および/または修正に用いられ、好ましくは人体に用いられる。
本発明において、2種類の異なる量(濃度および/またはモル百分率)のBDDEを使用して、2種類の異なる合成が行われ、それにより、2つの異なる架橋の最終百分率がもたらされた。
ステップ1.HAポリマー繊維または粉末を反応器に移し、その後反応器を閉じる。続いて、供給容器を通して撹拌しつつ、濾過しながら(好ましくは220μmメッシュフィルターを使用して濾過して)溶媒を添加するか、または濾過した後、溶媒を添加する。別の方法として、反応器がすでに閉じている状態で、固体の投入口を用いてHAポリマー粉末を添加し、次に上記のように溶媒を添加する。この時点での温度は、好ましくは室温(典型的には10〜40℃、好ましくは15〜30℃、より好ましくは17〜25℃)である。
ステップ2.前記混合物を攪拌して均質化した後、架橋剤を含む塩基性(アルカリ性)水溶液を加え、pHを測定する。
ステップ3.前記混合物を攪拌しながら、温度を50℃まで上昇させる。50℃で2時間攪拌後、反応混合物を冷却するか、または室温(典型的には10〜40℃、好ましくは15〜30℃、より好ましくは17〜25℃)に冷却させる。
ステップ4.次いで、酸、好ましくは酸の水溶液の添加により反応混合物を中和する。好ましくは、例えば供給容器を介して、好ましくは濾過されながら、HClのPBS(リン酸緩衝生理食塩水)水溶液が反応混合物に添加される。pHをチェックして、生理学的条件(つまり、中性pH、pH約7)に到達したことを確認する。中性pHは、高pH時に比べてHAおよび/またはXLHAのヒドロキシル基の脱プロトン化がはるかに少ないため、ヒドロキシル基の反応性がより低くなり、これにより、残りの架橋剤に対するHAおよび/またはXLHAの反応性を低下させる。
ステップ5.混合物を4℃に冷却または冷却させ、約4〜5℃で一晩(つまり、約8〜20時間、好ましくは約10〜16時間)攪拌し続ける。このフェーズの最後に、混合物のpHを再度チェックする。低温もまたシステム(例えば、HAおよび/またはXLHA)の反応性を低下させ、および/またはさらなる架橋なしに、完全な均質化および/または実質的な均質化を可能にするはずである。
ステップ6。最後に、混合物を加温するか昇温させ、室温(通常、10〜40℃、好ましくは15〜30℃、より好ましくは17〜25℃)に戻す。望ましい粘度を得るために、(Cellular MatrixTMチューブで一般的に使用される型/グレードの)一定量の非架橋HA(ほぼ同じ分子量、M.W.)を添加する。所望の粘度は、好ましくは、分離ゲルを保持するために必要な粘度、および/または[XLHAおよび好ましくはHA]とPRPとの混合物(好ましくは効果的かつ/または均一な混合物)を形成できるために必要な粘度であってよい。好ましくは、供給容器を通して非架橋HAポリマーを前記混合物に添加し、前記反応混合物の完全および/または実質的な均質化が達成されるまで、前記混合物を撹拌し続ける。
ステップ7.この時点で、ゲルが反応器から収集され、(好ましくは280μmメッシュフィルターを使用して)ろ過される。
このようにして、合成プロセスのほとんどまたはすべて(好ましくは実質的に合成プロセス全体)は、(好ましくは)閉鎖環境で、好ましくはゲルを実質的に汚染の可能性にさらすことなく行われる。
1.はじめに/報告の範囲
上記の実施例1Aおよび/または以下の実施例1Cに開示されるように、ワンポット法とさまざまな量の架橋剤(BDDE)を使用して、架橋ヒアルロン酸(XLHA)の合成を行った。
10個の試料について、SEC−TDA(サイズ排除クロマトグラフィーと、光散乱、屈折率測定および粘度測定で構成されたトリプル検出器アレイを組み合わせたもの)により、試料の可溶性画分の定性的および定量的な流体力学的特徴付けに供された。
その後、3つの検証バッチから収集された別の6つの試料(滅菌の前後)が検査に供された。前記バッチはすべて、以前に説明したワンポット法により、塩基性条件下でBDDEと架橋する1500kDaのHAファイバーを使用して合成されている。
さらに、Regen Labが作成した線形HAの試料がリファレンスとして検査に供された。SEC−TDAを使用して、新しい試料の可溶性画分について定性的および定量的な流体力学的特徴付けを行った。
さらに、レオロジー研究、酵素分解、凝集性試験及び膨潤を行うことにより、選択された試料に対し、物理化学的観点から特徴付けを行っている。
この研究に関する方法と結果は、DMSから送信された報告書に従って記述される。
これらの試料の特徴付けは、XLHAの合成に使用される合成プロセスで同じ型のゲルを生成できるかどうか、したがって前記プロセスが再現可能かどうか、または使用されるパラメーター間に相関があるかどうかを理解するために必要である。
実行した分析は、3つの検証バッチの可溶性画分の定性的−定量的特徴付け、及び代表的な一つの試料のグループの物理化学的特徴付けに再び焦点を当てた。特に、さまざまな生理学的関連周波数でのゲルのレオロジー挙動を理解するために、無菌試料に対して研究が行われた。
ここでは、分析された試料のリストを含む表が示されて。灰色は以前に可溶性画分が特徴付け及び議論された試料が示されており、黒色は以下に分析を報告する検証バッチが示されている。一部の選択されたバッチの滅菌済み試料のみを、レオロジーの観点から研究している。リストには、バッチが製造順に示され、線形HAの分析に使用される注射器のリファレンスが示されている。
バッチ6、7、および8の合成は、過剰なBDDEをHAの溶液(モル比1:453)に添加することによって実行される。
4.1 可溶性画分の抽出
分析は、試料26C18−D BS、26C18−D AS、04D18−D BS、04D18−D AS、10D18−D BS、10D18−D AS、ARV−HA−40−3 18D04およびARV−HA40−3 18D04(線形HAを含む最終滅菌製品に対して行った。前記試料は、pH7.4のリン酸塩緩衝液(PBS)で5倍(最終容量の1.5〜2ml)に希釈されている。前記懸濁液を37℃で18時間振蕩し、10000xgの速度で5分間遠心分離する。
HA含有量(mg/ml)は、2つの技術(比色試験とSEC−TDA分析)を使用して測定されています。可溶性HAの含有量は、各試料に対して実行された希釈を考慮して計算されています。
各分析試料に含まれるHAの可溶性画分の流体力学的パラメーターは、トリプル検出器(TDA−光散乱、屈折率測定、および粘度測定)を備えたサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって測定される。上記の段落で説明した方法で調製された試料に対して分析を実行した。
1)GPCmax VE 2001:ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)用の専用ポンプおよびオートサンプラーで構成される統合システムであって、管路に接続された溶媒を脱気するためのもの。
2)TDA305モジュラス(トリプル検出器アレイ):カラムに用いる恒温オーブンと、屈折率のトリプル検出器(RI、4つのキャピラリーブリッジを備えた粘度計(VSおよび光散乱(LS))が含まれ、後者は、非常に優れた信号対雑音比を備えた直角光散乱(RALS)、および革新的な低角度散乱(LALS)の2つの部分から構成される。
レオロジー挙動の研究は、La Gattaらiiによって報告された方法を使用して、0.9mmのギャップを有する50mmのステンレス鋼プレートで構成される計測システムを備えたレオメーターAnton Paar Physica 301により行われた。
値は0.159および15.90Hzの2つの周波数で測定されている。
試料のうちの1つの酵素分解に焦点を当て、初歩的な動力学研究を行った。この実験は、酵素活性に曝されたときのHAの挙動を理解することを目的としている。文献iiiに記載されている手順に従って、試料30A18−DとBTH(ウシ精巣ヒアルロニダーゼ)を共に培養した。
各試料の凝集性は、SundaramとCoiが説明する方法を使用して評価される。各試料1mlをトルイジンブルーの1%溶液10mlで着色し、1ml注射器に入れ、さらにMilliQ水700mlが入ったビーカーに注入した。ゲルがビーカーの底に触れたときから、溶液を磁気的に攪拌した。試験は、注入から15インチ、70インチ、95インチで撮影したビデオと写真で記録されています。
試験は、送られて分析されたすべての試料(12B18−D BS、12B18−D AS、26C18−D BSおよび10D18−D AS)から選択された明らかな不溶性HA画分を持つ試料に対して実行された。
5.1 可溶性画分
すべての試料に可溶性画分が存在する。バッチ10D18−D ASおよび26C18−BSは、他のバッチと比較して、可溶性画分が少なかった。すべてのバッチが同等のHA合計濃度(可溶性+不溶性)を有することを考慮すると、当該バッチは、不溶性HA(化学修飾)の割合が高くなっている。一方、試料04D18−D BSおよびARV−HA−40−3 18D04には、高い割合で可溶性HAが含まれており、修飾の程度が低くなっている。この結果は、ARV−HA−40−3 18D04が線形HAであるという事実と合致している、04D18−D BSが同じ結果を有することは、化学修飾が発生していないか、非常に低いことを示している。
表1:Mw、Mn、Mw/Mn、[η]、及びRhの結果のまとめ。白色箇所は、滅菌されていない試料(BS)の結果を表す。青色箇所は、一組目の実験中に得られた滅菌試料(AS)の結果を表す。緑色箇所は、二組目の実験で得られ、このレポートで議論された結果であり、黄色箇所は線形HAに関する結果である。
反対に、バッチ04D18−Dは、2018年6月5日のレポートn°HARET_ CHARAC_2018_06で説明されている試料02J17ですでに観察されているように、可溶性画分の減少とMwの増加を示している。
透析後にBDDEのより高い残留物がバッチに存在したため、滅菌中にも架橋反応が継続した可能性があると推定される。
バッチ10D18−Dの場合は状況が異なり、滅菌試料で可溶性画分の明らかな減少が観察されたが、Mwはわずかに減少した。
試料04D18−Dおよび02J17も、同じ解釈がなされる。
実際、Mwが1/2減少した試料以外は、観察された変動はいずれも非常に小さく、各数値の誤差の範囲内に収まり、顕著な変化は発生しなかったと言える。
すべての試料は、いずれもMwが700kDaを超える可溶性画分がある。特に、試料26C18−D BSおよび10D18−D BSおよびASのMwは1100〜1200kDaである。多分散性指数は一般に1.4〜1.8である。実際、おそらく架橋中の温度の影響(50℃で2時間継続)により、試料BSの値の減少がすでに観察されている。
以上を鑑みると、分析した試料は、すべて化学修飾されていると言える。
レオロジー研究は、0.159〜15.9Hzのさまざまな周波数で行われた。
ここで、図8のグラフは、さまざまな周波数(Hz)の関数としてG’とG’’の値を示す。図9に、異なる周波数(Hz)の関数としての複素粘度の値のグラフを示す。両グラフは、図に挙げた同じバッチの結果を示す。下の表2に、0.5および2.5HzでのG’、複素粘度、およびタンデルタの値を示す。
図9:G’とG’’vs周波数。図9に、異なる周波数(Hz)の関数としての複素粘度の値のグラフを示す。
XLHAのヒアルロニダーゼに対する耐性に関する予備情報を得るため、および生体内での可能な滞留時間についての示唆を得るため、ウシ精巣ヒアルロニダーゼの効果を検討した。
図10:試料21K17−D AS(■)と線形HA(□)をBTH 0.5U/mlと共に培養した時に記録されたMW。
図11は、MW>500kDaおよびMW<200kDaの試料画分の変動(wt%)を示すグラフである。
図11:MW>500kDa(a)およびMW<200kDa(b)の試料画分の変動(wt%)。
以下、図12に、検証済みの方法による凝集性スコア(文献(Sundaram et al.,Plast Reconstr Surg.2015)で報告された凝集性基準に基づいて、3回の異なる演算によって得られた値の平均)を示す。
1完全に分散
2ほぼ分散
3部分的に分散、部分的に凝集
4ほぼ凝集
5完全凝集。
n°10の試料以外は、一般的には、ゲルはほぼ凝集〜完全に凝集となっている。
テストは、不溶性画分が多い試料(即ち12B18−D BS、12B18−D AS、10D18−D−AS、および26C18−D−BS)でのみ実行されている。
得られた結果は以下のとおりである。
表3:水和度に対応する数値
SEC−TDA分析により、分析されたすべての試料が可溶性HAを含み、ARV−HA40−3 18D04を除くすべての試料が、MWが比較的高い(=1000 KDa)の化学修飾されたHAを含むことが確認された。
力学的特性を分析すると、12B18−D ASと10D18−D−ASが弾性挙動を示し、これが不溶性画分の値が高いことに関連している可能性があるため、比較的高い修飾度を有すると確認でき、考慮された周波数で10D18−D−ASはより硬く、粘性がある。粘性挙動のある試料間では、線形である試料ARV−HA40−3 18D04は、分析範囲でより高い粘度を有する。
粘性/弾性がより強い試料の可溶性画分の値がより高く、これによって前記結果が実証された。
3つのバッチ26C18−D−AS、04D18_D_AS、および10D18−D−ASは同じ方法を使用して合成されたが、それでも可溶性画分とレオロジー挙動は、いくつかの違いがあった。3つの合成に関するレポートを詳細に分析することにより、総架橋時間において違いが観察された。前記総架橋時間とは、50℃(架橋温度)に到達するために費やされた時間と50℃に保つために費やされた時間を合わせたものである。
表4:バッチと試験のまとめ
※可溶性・不溶性画分の調査。
色は操作の順序を表す。緑(中位の陰影):第一;黄色(明るい色):第二;赤(濃い色):第三。陰影なし:既に実行済み
多分散性指数は、ポリマーの分子量分布の広さの特徴付けのために使用され、次のように定義される。
G* は複素剪断弾性率
G’は同位相の貯蔵弾性率及び
G’’は異方性損失係数; G* = √(G’2 + G’’2)。
6.はじめに/構想
以下のレポートは、架橋ヒアルロン酸(XLHA)の生産のために行われたさまざまな合成をまとめたものである。
すべての試薬はさらなる精製なしに使用した。MWが1550kDaのHTL HA繊維を使用した。BDDE(1,4−ブタンジオールジグリシジルエーテル)およびペレット状のNaOHはSigma Aldrichから購入した。HCl1NはCarl Roth Internationalから購入した。すべての混合物と溶液は、精製プロセスで使用するものと同じPBSを使用して調製した。
3.1バッチ12B18−D
60gのHA(MW 2800kDa)を576.18gのNaOH0.25M(PBS溶液)に溶解し、均一なゲルが形成されるまで2時間45分混合した。同時に、5.45gのBDDEを、1.17gのNaOH 0.25Mで希釈した後、HAゲルに添加した。ゲルを室温で30分間混合した後、48℃で1時間34分放置した。その後、1764.86gのHCl溶液1Nを添加し、温度を下げて中和を開始した。ゲルを5℃で17時間47分混合した。同時に6.23gのHAを300gのNaOH 0.25M(PBS溶液)に溶解した後、形成された269.07gのゲルを、中和済みのXLHAに加えた。前記混合物を2時間撹拌した後、透析(カットオフMWが2−14kDaの膜)により得られたゲルを24時間精製した。
20gのHA(MW 1550kDa)を192.27gのNaOH 0.25M(PBS溶液)に溶解し、均一なゲルが形成されるまで2時間20分混合した。同時に、1.11gのBDDEを、3.71gのNaOH 0.25Mで希釈した後、HAゲルに添加した。ゲルを室温で40分間混合した後、41〜50℃で70分間放置した。その後、588.39gのHCl溶液1Nを添加し、温度を下げて中和を開始した。ゲルを5℃で16時間45分間混合した。同時に3.39gのHAを150gのNaOH 0.25M(PBS溶液)に溶解した後、形成された89.64gのゲルを、中和済みのXLHAに加えた。前記混合物を3時間40分攪拌した後、透析(カットオフMWが25kDaの膜)により得られたゲルを24時間透析した。
20gのHA(MW 1550kDa)を192.45gのNaOH 0.25M(PBS溶液)に溶解し、均一なゲルが形成されるまで2時間混合した。同時に、1.13 gのBDDEを3.70gのNaOH 0.25Mで希釈した後、HAゲルに添加した。ゲルを室温で20分間混合した後、50℃で55分間放置した。その後、588.18 gのHCl溶液1Nを添加し、温度を下げて中和を開始した。ゲルを5℃で16時間45分間混合した。同時に、3.39gのHAを150gのNaOH 0.25M(PBS溶液)に溶解した後、形成された89.55gのゲルを中和済みのXLHAに加えた。前記混合物を4時間攪拌した後、透析(カットオフMWが25kDaの膜)により24時間透析した。
本発明により、PRP/BMCの調製のための医療デバイス(容器)を使用して、細胞培養を行い、以下の結果が得られた。
図3を参照。
当該デバイスの主な利点は、MNC(単核細胞)の成長を維持する能力(評価は、室温に保たれたMC−PRPにおいて、体外で行わる)である。上述の条件における血小板の半減期(7日)は、全血における半減期と類似している。
CC−Sを使用した細胞培養のプロトコル
フェーズ1:全血の採取
1.チューブのブリスターパックを開く。
静脈穿刺を行い、必要数のCC−Sチューブに全血を入れる。チューブ内を真空にすると、必要な量の血液(約10ml)が自動的に収集される。
フェーズ2:遠心分離
2.遠心分離機を起動する前に、正確にバランスを取ることが常に不可欠である。
血液がCC−Sチューブに収集されたら、必要に応じて平衡チューブ(別売のSF−82−CB−110を参照)に、CC−Sチューブの血液と同じ体積に達するまで水を入れ、平衡を取る。
機械のバランスを取るために、充填されたチューブを向かい合わせに遠心分離機に挿入する。
次のように遠心分離値を調整する。
−時間:10〜20分
−遠心力(RCF):1500g(遠心分離機のメーカの指示に応じて、対応するRPM速度を設定)
フェーズ3:遠心分離の結果
3.遠心分離後、血液は分留され、赤血球と白血球がゲルの下に閉じ込められ、フィブリン塊がセルセレクターゲルの上にある。血塊の液体部分は自家トロンビン血清である。血清は遠心分離の時間を延長するか、または収集注射器に取り付けられたカニューレで血塊を押すと、血塊から血清が抽出される。各チューブから約4.5mlの血清が得られる。
フェーズ4:使用
4.CC−Sは、自家培養サプリメントとして使用され、濃度は5〜20%v/vであり、各細胞株によって決まる。
CC−PRPを使用した細胞培養のプロトコル
フェーズ1:全血の採取
1a.チューブのブリスターパックを開く。
静脈全血、臍帯血または髄質血液穿刺を行い、必要数のCC−PRPチューブに全血を入れる。チューブ内を真空にすると、必要な量の血液(約10ml)が自動的に収集される。
1b.注意深くチューブを上下逆さまに反転させて、血液を抗凝固剤と混合する。
フェーズ2:遠心分離
2.遠心分離機を起動する前に、正確にバランスを取ることが常に不可欠である。
血液がCC−PRPチューブに収集されたら、必要に応じて平衡チューブ(別売のSF−82−CB−110を参照)に、CC−PRPチューブ内の血液と同じ体積に達するまで水を入れ、平衡を取る。
機械のバランスを取るために、充填されたチューブを向かい合わせに遠心分離機に挿入する。
次のように遠心分離値を調整する。
−時間:5分
−遠心力(RCF):1500g(遠心分離機のメーカの指示に応じて、対応するRPM速度を設定)
フェーズ3:遠心分離の結果
3.遠心分離後、血液が分留され、赤血球と白血球がゲルの下に閉じ込められ、血小板がゲルの表面に沈殿する。
フェーズ4:均質化
4.CC−PRPチューブを数回静かに反転させ、血小板沈着物を再度血漿上清に懸濁させる。各チューブごとに約5mlのPRPが得られる。
血小板がゲルから完全に分離していることを確認する。上清の透明な血漿は混濁するはずである。血小板凝集体が存在する場合は、それらを血漿とともに収集する必要がある。
フェーズ5:使用
5. CC−PRPは、自己培養サプリメントとして使用され、濃度は5〜20%v/vであり、各細胞株によって決まる。フィブリン塊の形成を回避するには、培養基に2単位/mlのヘパリンを添加する必要がある。
MC−PRPを使用した細胞培養のプロトコル
フェーズ1:全血の採取
1a.チューブのブリスターパックを開く。静脈穿刺を行い、必要数のMC−PRPチューブに全血を入れる。チューブ内の真空にすると、必要な量の血液(約10ml)が自動的に収集される。
1b.注意深くチューブを上下逆さまに反転させて、血液を抗凝固剤と混合する。
フェーズ2:遠心分離
2.遠心分離機を始動する前に、正確にバランスを取ることが常に不可欠である。
血液がMC−PRPチューブに収集されたら、必要に応じて平衡チューブ(別売)に、CC−PRPチューブ内の血液と同じ体積に達するまで水を入れ、平衡を取る。
機械のバランスを取るために、充填されたチューブを向かい合わせに遠心分離機に挿入する。
次のように遠心分離値を調整する。
−時間:8分
−遠心力(RCF):1500g(遠心分離機のメーカの指示に応じて、対応するRPM速度を設定)
フェーズ3:遠心分離の結果
3.遠心分離後、血液は分留され、赤血球と白血球がゲルの下に閉じ込められ、単核球と血小板がゲルの表面に沈殿する。
フェーズ4:均質化
4a−方法1:MC−PRPチューブを数回静かに反転させることにより、細胞沈着物を再度上清に懸濁される。各チューブごとに約5mlの細胞懸濁液が得られる。
4b−方法2:より高い細胞濃度を得るために、細胞を再懸濁させる前に、長いカニューレ(未提供)で慎重に、無細胞血漿上清の上層2mlを取り除く。その後チューブを静かに反転させ、細胞沈殿物を再度残りの2mlに懸濁させる。
細胞とゲルが完全に分離していることを確認する。上清の透明な血漿は混濁するはずである。凝集体が存在する場合は、それらを血漿とともに収集する必要がある。
フェーズ5:使用
5.MC−PRPは、通常、多血小板血漿における細胞懸濁液が得られ、元々の試料に存在する単核細胞の回収率は70+/−10%である。
CC−HAを使用した細胞培養のプロトコル
フェーズ1:全血の採取
1a.最初のブリスターパックを開き、続いて2番目のパックを慎重に開きく。
1b.付属品セットから必要な瀉血材料を使用して静脈穿刺を行い、CC−HAチューブに全血を入れる。チューブ内を真空にすると、必要な量の血液(約6ml)が自動的に収集される。
1c.チューブを慎重に数回反転させる。
1d.適切な方法を使用して採血針を廃棄し、汚染された血液製剤を除去する。
フェーズ2:遠心分離
遠心分離機を起動する前に、正確にバランスを取ることが常に不可欠である。必要に応じて、平衡チューブ(別売)に、CC−HAチューブ内の血液と同じレベルになるまで水を入れ、平衡を取る。そして、機械のバランスを取るために、充填されたチューブを向かい合わせに遠心分離機に挿入する。
次のように遠心分離値を調整する。
・時間:5分
・遠心力(RCF):1500g(遠心分離機のメーカの指示に応じて、対応するRPM速度を設定)
フェーズ3:遠心分離の結果
遠心分離後、血液が分留され、赤血球がゲルの下に閉じ込められ、細胞要素がゲルの表面に沈殿する。ヒアルロン酸が血漿の上にある。
フェーズ4:均質化
4a.チューブを上下逆さまにして垂直にし、HAがチューブの壁から外れて血漿層の上部に浮くまでこの状態を維持する。
4b.血小板が再懸濁するまで、チューブを少なくとも20回注意深く反転させる、
4c.すべてのHAがチューブの壁から離れ、製剤が均一になるまで、二指の間で前記チューブを水平位置に回す。各チューブごとに約5mlのHA/PRP混合物が得られる。
4d.CC−HAチューブからHA/PRP混合物を収集するには、付属品セットの移送デバイスを使用する。
フェーズ5:使用
5.CC−HAは、自家培養サプリメントとして使用され、濃度は10〜40%v/vであり、各細胞株によって決まる。フィブリン塊の形成を回避するには、培養基に2単位/mlのヘパリンを添加する必要がある。この製剤では、血小板がヒアルロン酸マトリックス中にトラップされている。当該製剤は、単層細胞培養のコーティングマトリックスとして使用でき、具体的には各細胞株によって決まる。
この例では、通常のAT−MSC(脂肪組織由来の間葉系幹細胞、およびNHDF(通常のヒト皮膚線維芽細胞)の培養条件と比較して(図5および6)、本発明のデバイスを用いてPRPを細胞培養に用いた場合に優れた効果が得られることを実証する。
1. AT−MSC
AT−MSC分離
0.01%コラゲナーゼI型(Sigma−Aldrich、ミズーリ州セントルイス)により、純粋な脂肪を、37℃において穏やかに攪拌しながら45分間消化した。1400rpmで10分間遠心分離した後、消化されなかった脂肪組織を取り出した。間質血管画分(SVF)と呼ばれる、残りのペレットを赤血球溶解バッファーに5分間懸濁した(Qiagen、ヒルデン、ドイツ)。次に、基礎培地を用いて洗浄した。前記基礎培地は、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)−低糖型であり、1g/Lグルコース、l−グルタミン、25mM HEPES(Invitrogen、Carlsbad、CA)、補足成分としてペニシリンとストレプトマイシン10,000mg/mL(Bioconcept、Salem、NH)、および2単位/mLヘパリン(Liquemin 5000、Roche、バーゼル、スイス)を含む。
1200rpmで5分間遠心分離した後、SVFをDMEMと補足成分に再懸濁させ、100mmナイロンセルストレーナー(BD Biosciences)でろ過した。分離されたSVFの平均細胞密度は30×104細胞/mLであった。
SVF細胞を48ウェルのプレート(BD Biosciences)に5000セル/cm2で播種し、異なる培地培養条件で培養した。10%FBS(Gibco、Carlsbad、CA)をコントロールとして、または1%、5%、10%、20%、40%、および60%のnPRPまたはtPRPのいずれかが基礎DMEMおよびサプリメントに添加された(各条件はいずれも1mL培地)。24〜48時間の培養後に得られたプラスチック付着細胞集団は、AT−MSCとして決定された。細胞は、FBSおよびPRP条件の培地を変更せずに、5%CO2の標準インキュベーター内で37℃で10日間培養した。
すべての条件で、AT−MSCは培養期間中、典型的な紡錘線維芽細胞の形状を維持した。10日間の培養後、異なるnPRP濃度で補充したすべての培地は、FBS含有培地と比較して、より高いAT−MSC数を示した(図3)。nPRPのこのようなプラス効果は、用量依存性のベル型の曲線をたどった。培養10日後、20%nPRPで補充した培地は、最適な条件を提供し、AT−MSC数が10%FBSの13.9倍(n=14、p<0.001)となった。比較すると、他の条件はあまり効果的ではなかった[たとえば、10%FBSと比較した場合(n=14、p<0.001)、10%および40%nPRP培地の場合、AT−MSC数をそれぞれ5.6倍および10.9倍増加させた](図3)。
NHDF分離
簡単に言うと、腹部形成術中に採取された組織は、14単位/mLのリベラーゼDLリサーチグレード(Roche)消化を受け、別々に処理された表皮と真皮の層を分離するするために使用された。NHDFは、刻まれた後、1%ウシ胎仔血清(FBS、Gibco)および1%抗生物質/抗真菌薬(AB/AM、Gibco)を含む0.3%トリプシン/PBSコラゲナーゼ(Gibco)において消化することにより分離された。次に、NHDFをろ過し、遠心分離し、播種した。NHDFはそれぞれ予想された丸石状およびスピンドルの形を呈し、汚染の兆候はなかった。10%FBSおよび1%P/Sを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Gibco)において、37℃、5%CO2で補充し、NHDF細胞を第1代〜第5代まで培養した。すべての細胞を80%のコンフルエンシーまで増殖させ、TrypleX溶液(Gibco)を使用して継代した。
NHDFを12ウェルのプレート(BD Biosciences)に1000セル/cm2で播種し、異なる培地培養条件で培養した。10%FBS(Gibco、Carlsbad、CA)コントロールとして、または1%、5%、10%、20%、非活性なPRP。細胞は、FBSおよびPRP条件の培地を変更せずに、5%CO2の標準インキュベーター内で37℃で5日間または7日間培養した。
すべての条件で、NHDFは培養期間中、典型的な紡錘線維芽細胞の形状を維持した。5日間の培養後、異なるnPRP濃度で補充したすべての培地は、FBS含有培地と比較して、より高いNHDF数を示した(図4)。培養5日後、20%nPRPで補充した培地は、最適な条件を提供し、NHDF数が10%FBSのほぼ4倍(n=3、p<0.001)となった。7日後、20%のPRP増殖効果は、さらに顕著であり、総細胞数が5〜6倍も増加し、フローサイトメトリー分析で示されるように、細胞の半分は高い増殖表現型を呈した。
図6:同じ患者におけるPRPのNHDFに対する増殖効果。A.NHDFは酵素消化により新鮮な皮膚試料から分離され、同じ密度で体外培養用に播種された。培養5日後、PRPの濃度を増加させると、細胞増殖が大幅に向上する(光学顕微鏡写真)。B.バイオレット色素取り込み後の細胞増殖のフローサイトメトリー分析。結果は倍数変化で表される。C.Bのグラフにプロットされたデータの代表的な密度プロット。
I.はじめに
本発明による3つの装置について試験を行う。
l MC−PRP:末梢血、臍帯血、骨髄穿刺から単核細胞を分離できる。
l CC−PRP:多血小板血漿(PRP)が調製でき、前記PRPは、合成培地において単にまたは添加物として使用され、動物由来の血清に代えて体外での細胞成長を促進する。
l CC−S:血清を取得でき、前記血清は、合成培地の添加物として使用でき、動物由来の血清に代えて体外での細胞成長を促進する。
これらの装置による調製に対応する製品は、それぞれ「MC−PRP製剤」、「CC−PRP製剤」、「CC−S製剤」と呼ばれる。
II.1.表現型の特徴付けと細胞の生存
この調査の目的は次のとおりである。
― フローサイトメトリー(Fortessa LSRII、BD Biosciences)により、MC−PRP製剤に存在する細胞亜集団の表現型の詳細な特徴付けを実行する
― CC−PRPおよびCC−Sデバイスに対し、6色フローサイトメトリーによるB、T、NK細胞および顆粒球のカウントを実行する
― MC−PRP、CC−PRPおよびCC−Sデバイス培養したの細胞の生存状況を研究する
免疫亜集団の詳細な表現型分析には以下が含まれる。
・CD3+Tリンパ球数、CD19+Bリンパ球、CD3−CD16+CD56+NKリンパ球数
・血中に存在する3つの単球亜集団の頻度のカウント及び分析:炎症性単球CD14+、中間型単球CD14+CD16+、および非古典的単球CD16+
・血中に存在する3つの樹状細胞の亜集団のカウント:DC骨髄性:mDC1 CD1c+;mDC2 CD141+および形質細胞様DC CD123+
・NKリンパ球亜集団(CD56−、CD56dim、CD56bright)の頻度の計算と分析
・TCD4およびCD8リンパ球亜集団(ナイーブ、中央記憶、CD45RA−エフェクター、CD45RA+記憶エフェクター)の頻度の列挙と分析
・ヘルパーTリンパ球の亜集団の頻度のカウントと分析(Th1 CXCR3+、Th2 CCR4+、Th17/Th22 CCR6+CCR4+、およびTFH亜集団CXCR5+)
・制御性T細胞の亜集団の頻度のカウントと分析(ナイーブCD45RA+、メモリー型CD45RA−FoxP3low、エフェクター型CD45RA−FoxP3high、および活性化HLA−DR+)
・Bリンパ球亜集団の頻度のカウントと分析(ナイーブCD27−IgD+、非スイッチCD27+IgD+メモリ型、CD27+IgD−、CD27−IgD−、CD27−IgD−、ダブルネガティブCD24highCD38high未熟/移行型CD27 、CD27形質芽細胞+CD38+CD138−およびCD27+CD38+CD138+形質細胞)
MC−PRPデバイスによって取得された細胞の表現型は、同じドナーでフィコール勾配遠心分離後に分離された末梢血単核細胞(PBMC)の表現型と比較される。したがって、フィコール後に「MC−PRP」条件と「CC−PBMC」条件の2つの条件が存在する。この2つの条件については、表現型分析の前に、前の開梱及びPBMCのカウントステップを行う必要がある。
・チューブ1:基準となる系統LB、LT、NKの番号付け
・チューブ2:3つの単球亜集団の特徴付け:古典型、中間型、非従来型。
・チューブ3:LT分化の分析であって、マーカーCD45RAおよびCCR7の差次的発現を利用して、ナイーブCD4およびCD8集団、中央記憶型、メモリーエフェクター型およびEMRAを特徴付けることができる。
・チューブ4:樹状細胞(DC骨髄性CD141+およびCD1c+)およびDC形質細胞様亜集団の分析。DC活性化のレベルは、HLA−DR分子と共刺激分子の発現レベルによって分析される。
・チューブ5:ヘルパーT細胞分析であって、Th1(CXCR3+)、Th2(CCR4+)、Th17/22(CCR6+、CCR4+)、Th1/Th17(CXCR3+、CCR6+)及び濾胞性T細胞(CXCR5+)の頻度を特定できる。
・チューブ6:CD16およびCD56マーカーの差次的発現に基づくNK亜集団の特徴付け。
・チューブ7:CD45RAおよびFoxP3マーカーの発現に基づく制御型LT亜集団の分析。HLA−DR、CD39、CD62L、およびCTLA−4分子の発現によって活性化が特徴付けられる。
・チューブ8:CD27とIgDの相対的発現に基づいてLB亜集団を分析し、ナイーブB細胞、非スイッチメモリ型、スイッチメモリ型を特徴付け、形質細胞と移行型Bについても特徴付けを行う。
本研究には最低10〜12mlの供血が必要である。
CC−PRPおよびCC−Sデバイスに対して:6色フローサイトメトリーによりB細胞、T細胞、およびNK細胞のカウントを行う。
両方の条件(MC−PRPとCC−S)について、いずれも、表現型を決定する前に、開梱してこれらの試料に存在する単核球をカウントする準備ステップが必要である。表現型の特徴付けには、LB、LT、およびNK(6つの抗体+生存率マーカー+カウントビーズ)という前記2つの条件のそれぞれに対応するチューブが含まれる。
この研究では、細胞汚染レベルを1%程度と想定する場合、最低10mlの供血が必要である。
オプション:CC−Sデバイスを使用して得られた血清における成長因子とドライチューブで得られた自家血清の成長因子の判定。
CC−Sおよびドライチューブで得られた自家血清における成長因子(TGF−β1、TGF−β2、PDGF−BB、PDGF−AB、VEGF、FGFベーシック、IGF−IおよヒトEGF)のELISAアッセイ。一組10名のドナーを利用して、統計調査を実施した。
培養前に単核球、血小板、顆粒球のカウントを行う。このカウント、この研究に必要な血液の量を定義する。さらに、24時間および48時間の培養後に、カウント、細胞生存能力評価、およびフローサイトメトリー(Bリンパ球、Tリンパ球、骨髄細胞及び顆粒球のカウント用の3つのチューブ)の特徴付けを行う。
培養48時間後に細胞生存率が70%を超える場合、72時間および96時間においてさらに、同様にカウント、細胞生存能力評価、6色フローサイトメトリーの特徴付けを含む2つのデータを取得する。
初歩的結果では、MNCを室温でPRP中に保存すると、倍増時間は6日であることが示された。
この研究の目的は、いくつかの型の細胞の培養に対するPRP製剤の影響を評価することにある。
−ヒト末梢血単核細胞(PBMC)
−ヒト間葉系幹細胞(MSC)
−ヒト軟骨細胞
特定の細胞亜集団の優先的な生存を実証するために、48時間において完全な免疫表現型検査により、PBMC培養に対するCC−PRPおよびCC−S製剤の効果を評価した。これは以下を含む。
― フローサイトメトリーにおいて培養前のすべてのリンパおよび骨髄細胞集団(J0)に対し表現型の特徴付けを行うことにより、骨髄細胞、NK細胞、制御性T細胞、ヘルパーTリンパ球、メモリー型T細胞、Bリンパ球の分析が可能となる。
― フローサイトメトリーにおいて、48時間培養後のすべてのリンパおよび骨髄細胞集団に対し表現型の特徴付けを行うことにより、骨髄細胞、NK細胞、制御性T細胞、ヘルパーTリンパ球、メモリー型T細胞、Bリンパ球の分析が可能となる。
・ドライチューブで収集された血液から得られた自家血清(培地において濃度10%で使用)
・CC−S(培地において濃度10%で使用)
・ドライチューブで収集された血液から得られた自家血清(濃度10%+ヘパリン2U/mlで使用)。(細胞表現型に対するヘパリンの影響が出ないよう制御する)
・CC−PRP(濃度10%+ヘパリン2単位/mlで使用)
フローサイトメトリーによって培養前のすべてのリンパ球および骨髄球集団(J0−1ポイント)に対して行う精密な表現型の特徴付けは、8本のチューブを含む。
・チューブ1:LB、LT、NKのカウント(6抗体+生存マーカー+カウントビーズ)。0.5×106PBMC/チューブにマーク
・チューブ2:単球亜集団の分析(13抗体+生存マーカー+カウントビーズ)。2×106PBMC/チューブにマーク
・チューブ3:LT分化の分析(11抗体+生存マーカー)。1×106PBMC/チューブにマーク
・チューブ4:樹状細胞亜集団の分析(17抗体+生存マーカー+カウントビーズ)。2×106PBMC/チューブにマーク
・チューブ5:ヘルパーT細胞分析(12抗体+生存マーカー)。2×106PBMC/チューブにマーク
・チューブ6:NK亜集団の分析(14抗体+生存マーカー)。1×106PBMC/チューブにマーク
・チューブ7:制御型LTの分析(抗体+生存マーカー)。1×106PBMC/チューブにマーク
・チューブ8:LB細胞亜集団の分析(13抗体+DAPI)2×106PBMC/チューブにマーク
フローサイトメトリーによる培養(48時間、4つのサンプリングサイト)後のすべてのリンパ球および骨髄細胞集団の精密な表現型の特徴付けには、4×8チューブが含まれる。
・チューブ1〜4:LB、LT及びNKカウント(6抗体+生存マーカー+カウントビーズ)。0.5×106PBMC/チューブにマーク
・チューブ5〜8:単球亜集団の分析(13抗体+生存マーカー+カウントビーズ)。 2×106PBMC/チューブにマーク
・チューブ9〜12:LT分化の分析(11抗体+生存マーカー)。1×106PBMC/チューブにマーク
・チューブ13〜16:樹状細胞の亜集団の分析(17抗体+生存マーカー+カウントビーズ)。2×106PBMC/チューブにマーク
・チューブ17−20:ヘルパーT細胞の分析(12抗体+生存マーカー)。2×106PBMC/チューブにマーク
・チューブ21〜24:NK亜集団の分析(14抗体+生存マーカー)。1×106PBMC/チューブにマーク
・チューブ25〜28:制御型LTの分析(15抗体+生存マーカー)。1×106PBMC/チューブにマーク
・チューブ29〜32:LB細胞亜集団の分析(13抗体+DAPI)。2×106PBMC/チューブにマーク(ヘルパーTリンパ球、メモリー型Tリンパ球、Bリンパ球)。
48時間の代わりに、またはそれに加えて、後の段階で試験が行うことができる。
研究―以下の目的で、新鮮な血液を使用できる。
― ウシ胎仔血清(陽性対照)と比較して、培養された間葉系幹細胞(MSC)の生存および増殖に対するCC−PRPおよびCC−S製剤の効果を評価するため。
― MSCの軟骨細胞、脂肪細胞、骨芽細胞の3つの系統への分化特性を研究するため。
3つの系統(軟骨細胞、脂肪細胞、骨芽細胞)におけるMSCの分化特性の研究は、特定の分化培地で細胞を21日間培養して対照培地と比較するすることにより行われる。
軟骨細胞分化の場合、分化効率は、一方で21日目の分化細胞を0日目の未分化細胞と比較し、他方でMSC軟骨細胞分化誘導因子TGFB3の存在下または非存在下で培養細胞を比較することによって評価される。したがって、CC−PRPおよびCC−Sが軟骨細胞の分化に及ぼす影響を評価するには、7つの条件が必要である。
・CSM+陽性対照J21
・CSM+陽性対照+TGFb3 J21
・CSM+CC−PRP J21
・CSM+CC−PRP+TGFb3 J21
・CSM+CC−S J21
・CSM+CC−S+TGFb3 J21
細胞が分化転換していないことを確認するために、培養が終了する際に線維芽細胞マーカーが必要になる場合がある。
・CSM +陽性対照J21、増殖培地
・CSM +陽性対照J21、分化培地
・CSM+CC−PRP J21、増殖培地
・CSM+CC−PRP J21、分化培地
・CSM+CC−S J21、増殖培地
・CSM+CC−S J21、分化の中間期
・CSM +陽性対照J21、増殖培地
・CSM +陽性対照J21、分化培地
・CSM+CC−PRP J21、増殖培地
・CSM+CC−PRP J21、分化培地
・CSM+CC−S J21、増殖培地
・CSM+CC−S J21、分化の中間期
骨芽細胞への分化について、RT−qPCR(分化細胞あたり5つのマーカーのパネル)および組織学的染色によって各系統に特異的なマーカーの誘導を評価し、これによって、分化を判定する。
CC−PRPおよびCC−Sチューブで得られた製剤の、ヒト軟骨細胞の生存、増殖および表現型に対する影響。
最初のステップは、最適なヒト軟骨細胞の2継代生存と増殖培養を実現するために、培養で使用するCC−PRPとCC−Sの有効用量(0、5、10、15、20、または25%)を決定することである。トリパンブルーカウントによって各継代のMSCの生存と増殖が特定される。RT−qPCRにより、軟骨細胞表現型の維持に対するCC−PRPおよびCC−Sの影響を特定し、FCSを含む陽性対照培地で細胞を培養した後に得られた結果と比較する。第1継代および第2継代において、軟骨細胞の特定マーカー(アグリカン、コラーゲンIIB、Sox9、コラーゲンX、MMP13)の発現について評価する。最終的な特徴付けにおいて、軟骨細胞の脱分化を評価するために、線維芽細胞マーカーが必要になる場合がある。
HepG2ヒト肝癌細胞株−C3AおよびHuH7の2つの細胞モデルを使用した、ヒト肝細胞の分化状態の増殖および維持ならびに成人肝細胞の初代の培養に対するCC−PRPおよび/またはCC−S製剤の効果。実験は同種で行われることに注意することが重要である。
1−肝細胞癌株の生存と増殖に対するPRPの影響の研究
最初の一連の実験では、CC−PRPおよびCC−S溶液の毒性をHepG2−C3AおよびHuH7細胞株で評価します。大用量の効果についてテストされる(5〜25%)。その後、これらの溶液の増殖に対する影響が評価される。次に、低用量を選択して、いくつかの継代での細胞増殖を分析する。
― 毒性の評価
細胞は、10%ウシ胎児血清(FCS)を補充した培地において、96ウェルのプレートで培養される。
−16時間の培養した後、培地は以下のサプリメントを含む基本培地に換えられる。
・2U/mlのヘパリンが補充された5、10、15、20、または25%CC−PRP
・2U/mlのヘパリンが補充された5、10、15、20、または25%照射CC−PRP
・5、10、15、20、または25%CC−S
・2U/mlのヘパリン
・10%FCS
・2U/mlのヘパリンが補充された10%FCS
48時間の培養後、Cell Titer−Glo Luminescent Viability Assay Kit(Promega)を使用して、細胞生存率が測定される。
細胞は、10%ウシ胎児血清(FCS)を補充した培地において、96ウェルのプレートで培養される。
−16時間の培養後、培地は以下のサプリメントを含む基本培地に換えられる。
・2U/mlのヘパリンが補充された5、10、15、20、または25%CC−PRPまたは照射CC−PRP
・5、10、15、20、または25%CC−S
・2U/mlのヘパリン
・10%FCS
・2U/mlのヘパリンを補充した10%FCS
−24、48、72時間の培養後、BrdU(細胞増殖ELISA、BrdU−Sigma)の取り込みを測定することによって増殖を評価する。
細胞は、10%ウシ胎児血清(FCS)を補充した培地において、24ウェルのプレートで培養される。
−16時間の培養後、培地は以下のサプリメントを含む基本培地に換えられる。
・2U/mlのヘパリンが補充されたx%、y%CC−PRPまたは照射CC−PRP
・x%、y%CC−S
・10%FCS
・2U/mlのヘパリンを補充した10%FCS
−細胞は各継代ごとにカウントされ、生存能力はトリパンブルーで測定される。
各実験ポイントにおいて、試験は3重に行われる(3継代のカウント2回)。結果は、3つの独立した実験に基づいて(したがって3つの異なるバッチのCC−PRP、CC−Sを使用して)分析される。
初代ヒト肝細胞は、CC−PRPが補充されているかされていない特定の培地(Pichard L、Raulet E、Fabre G、Ferrini JB、Ourlin JC、Maurel Moleth P. Molods 2006、320:283−93)で培養される。所定の時間が経過後、毒性、増殖、および分化状態の維持について分析される。実験は、3つの異なるバッチのCC−PRPの初代肝細胞製剤について行われることに注意すべきである。
注意:肝細胞癌系統で得られた結果を考慮して、使用するCC−PRPのパーセンテージを調整し、この種の照射溶液を使用するかどうかを決定する。
― 毒性の評価
肝細胞は、2%ウシ胎児血清(FCS)を補充した特定の培地(Pichard et al.,2006)において、コラーゲンIをコーティングした96ウェルプレートで培養する。
−16時間の培養後、培地は以下のサプリメントを含む基本培地に換えられる。
・2U/mlのヘパリンが補充された5、10、15、20、または25%照射CC−PRP
・2U/mlのヘパリン
・10%FCS
24時間および96時間の培養後、Cell Titer−Glo Luminescent Viability Assay Kit(Promega)を使用して、細胞生存率が測定される。
−肝細胞は、2%FCSを補充した特定の培地(Pichardら、2006)において、コラーゲンIをコーティングした96ウェルプレートで培養される。
16時間の培養後、培地は以下のサプリメントを含む基本培地に換えられる。
・2U/mlのヘパリンが補充された5、10、15、20、または25%CC−PRPまたは照射CC−PRP
・2U/mlのヘパリン
・10ng/mlのEGFとHGFおよび2U/mlのヘパリン
増殖は、BrdUの取り込みを測定(細胞増殖ELISA、BrdU−Sigma)することにより、24時間ごとに、72時間にわたって評価される。
−肝細胞は、2%FCSを補充した特定の培地(Pichardら、2006)において、コラーゲンIでコーティングされた24ウェルプレートで培養される。
−16時間の培養後、培地は以下のサプリメントを含む基本培地に換えられる。
・2U/mlのヘパリンが補充されたx%およびy%CC−PRPまたは照射CC−PRP
・2U/mlのヘパリン
約48時間に。
そして、RT−qPCRによってこれらのシグナル伝達経路の一連の標的遺伝子の発現(PXR、AhR、CYP3A4、CYP1A2アルブミン、HNF4)を測定することによって、生体異物代謝酵素の発現と誘導性の維持が評価される。
オプション1:2種類の用量のCC−PRPまたは照射CC−PRPを使用して、細胞を培養した後、ウエスタンブロット(western−blot)によってERK1/2およびAktシグナル伝達経路を評価する。EGFは陽性対照に用いる。
オプション2:CYP3A4およびCYP1A2活性の測定(KitsP450−Glo)。
オプション3:肝細胞組織のスフェロイド化を促進するために、CC−HA(ヒアルロン酸リッチな)を補充した培地で初代肝細胞を培養する。スフェロイドの形成に対するCC−PRPまたはCC−Sの影響を試験することも興味深い。実際、それらの形成は血清の存在に依存する。さらに、スフェロイドの形成は、すべてのバッチの肝細胞に有効でなわけではない。
肝細胞を、96ウェルプレートGravityTRAP(R)ULAプレートで定義培地(Pichardら、2006)で培養し、以下を補充する。
・10%SFV
・10%CC−HA
・10%CC−PRP
・10%CC−S
−7日間経過後、顕微鏡下でスフェロイドの形成が観察された。
スフェロイドにおける肝細胞の生存能力は、カルセイン−ヨウ化プロピジウム標識によって評価される。
2%FCSを補充した特定の培地において、コラーゲンIへの細胞の付着について制御(Pichardら、2006)が可能になった。
注意:肝細胞を試験溶液において直接培養するべきであるが、物流上の理由により、実験は、凍結保存された肝細胞で行う。
肝細胞のスフェロイドへの分化に対する異なる溶液の影響は、後で評価できる。この研究の相関性は、一方ではCC−PRP、CC−S溶液を用いたことによる肝細胞の2D分化の結果に依存し、他方では、はCC−PRP、CC−S溶液のスフェロイド形成への影響に依存する。
第1の目的は、ヒト神経幹細胞(NSC)の増殖および分化に対する、本発明のPRP製剤および異なる細胞培養デバイスの影響を特定することである。ヒト胚性幹細胞に由来するH9NSC(Gibco)系統、または非病理学性iPSCに由来するiPSC/NSC系統という2つの神経幹細胞株を使用することを提案する。
神経幹細胞とその神経派生物の移植後の運命ならびにそれらの分化に関して、多くの疑問が提起されている。また、これらの細胞は、ニューロスフェアの形で、または単層で成長することができる。ニューロスフェアでは、壊死と自発的分化の問題を掌握するのが困難である。一方、この型の培養は、単層培養の場合のように、細胞付着のためのマトリックスを必要としない。実際、単層培養では、NSCの増幅には、事前にマトリゲル、ポリオルニチン+ラミニン、またはポリオルニチン+フィブロネクチンでコーティングされた培養皿を使用する必要がありこれらの培養皿は、その由来に問題があった。そのため、単層培養のマトリックス代替物または浮遊培養の栄養サポートとしてのPRPの使用が検討された。
GIBCOから販売されているヒト胚性幹細胞のH9NSC系統の使用および、健康なiPSC(異なるプロトコルによって生成)から得られたNSCは以下にように分化する。単層での神経分化(30日超)、成熟した神経の3D神経分化(6〜12週間超)。アルツハイマー病に罹患している患者の線維芽細胞から生成されたiPSCを使用して、2アルツハイマー病に対して2年間のモデリングを行った。細胞の特性により、患者の細胞は、健康な対照とは異なる表現型を持っていることが示された。その特性とは、増殖の遅いこと、アポトーシスの増加、ROS(活性酸素)の生成、およびAbeta42/40の比率の増加であり、これらはアルツハイマー病の特徴に合致していた。目的は、アルツハイマー病患者のiPSCでのPRPをテストし、事前にアルツハイマー病について培養された健康な細胞の移植をテストすることである。アルツハイマー病の実験モデルにおいて、PRPまたはPRPとの同時注入をもちいる。
1−PRPの用量の決定
プロジェクトの最初のステップは、NSC培養に使用するPRPの適切な用量、つまり細胞死に至らない用量を決定することである。このために、異なる用量の異なるPRPをテストし、第一継代の細胞の生存と増殖を評価して、対照培地と比較することを提案する。
― 毒性/アポトーシスの評価:カスパーゼ3/7キット(Caspase−Glo(R)3/7アッセイ−プロメガ)を用いてLDH(CytoTox 96(R) Non−radioactive Cytotoxicity Assay−Promega)の放出と死亡を測定し、PRP溶液の毒性を評価する。
― 増殖評価:BrdUの取り込みを測定することによって(細胞増殖ELISA、BrdU−Sigma)、増殖を評価する。結果は3つの独立した実験に基づいて分析される。
H9NSCまたはiPSC/NSC細胞は、PRPの存在下で4継代にわたって24時間、48時間、72時間培養され、24時間、48時間、72時間における毒性、増殖、アポトーシスについて分析される。StemProNSC増殖培地で成長した細胞を対照として用いる。
― 毒性/アポトーシスの評価:カスパーゼ3/7キット(Caspase−Glo(R)3/7アッセイ−プロメガ)を用いてLDH(CytoTox 96(R) Non−radioactive Cytotoxicity Assay−Promega)の放出と死亡を測定し、PRP溶液の毒性を評価する。
― 増殖評価:BrdUの取り込みを測定することによって(細胞増殖ELISA、BrdU−Sigma)、増殖を評価する。結果は3つの独立した実験に基づいて分析される。
― 分化の評価:単層で30日、または3Dで6週間と12週間の分化について評価を行う。分化は、q−RT−PCRと9つの細胞系統および細胞機能マーカー(NSC、ニューロン、星状細胞、セロトニン作動性、GABA作動性、アセチルコリン作動性、ドーパミン作動性、グルタミン酸作動性、シナプス活性)の免疫蛍光によって評価する。
H9NSCまたはiPSCまたはNSCf細胞は、PRPの存在下で4継代にわたって24時間、48時間、72時間培養され、24時間、48時間、72時間における毒性、増殖、アポトーシスについて分析される。StemProNSC増殖培地で成長した細胞を対照として用いる。
― 毒性/アポトーシスの評価:カスパーゼ3/7キット(Caspase−Glo(R)3/7アッセイ−プロメガ)を用いてLDH(CytoTox 96(R) Non−radioactive Cytotoxicity Assay−Promega)の放出と死亡を測定し、PRP溶液の毒性を評価する。
― 増殖評価:BrdUの取り込みを測定することによって(細胞増殖ELISA、BrdU−Sigma)、増殖を評価する。結果は3つの独立した実験に基づいて分析される。
― 分化の評価:単層で30日、または3Dで6週間と12週間の分化について評価を行う。分化は、q−RT−PCRと9つの細胞系統および細胞機能マーカー(NSC、ニューロン、星状細胞、セロトニン作動性、GABA作動性、アセチルコリン作動性、ドーパミン作動性、グルタミン酸作動性、シナプス活性)の免疫蛍光によって評価する。
H9NSC、iPSCまたはNSCf細胞は、事前にPRP製剤でコーティングされたプレート上に、単層で24時間、48時間、72時間培養され、24時間、48時間、72時間における毒性、増殖、アポトーシスについて、4継代で分析される。StemProNSC増殖で成長した細胞を対照として用いる。
― 毒性/アポトーシスの評価:カスパーゼ3/7キット(Caspase−Glo(R)3/7アッセイ−プロメガ)を用いてLDH(CytoTox 96(R) Non−radioactive Cytotoxicity Assay−Promega)の放出と死亡を測定し、PRP溶液の毒性を評価する。
― ― 増殖評価:BrdUの取り込みを測定することによって(細胞増殖ELISA、BrdU−Sigma)、増殖を評価する。結果は3つの独立した実験に基づいて分析される。
― 分化の評価:単層で30日、または3Dで6週間と12週間の分化について評価を行う。分化は、q−RT−PCRと9つの細胞系統および細胞機能マーカー(NSC、ニューロン、星状細胞、セロトニン作動性、GABA作動性、アセチルコリン作動性、ドーパミン作動性、グルタミン酸作動性、シナプス活性)の免疫蛍光によって評価する。
分析は、1セル型のH9NSCまたはiPSC/NSCの健康な細胞により20週間行うことができます
― 器官培養および細胞運命分析における脳スライスへの細胞移植。
― C57Bl/6Jマウスへの細胞移植と細胞運命分析。
アルツハイマー病の3人の患者から3つのiPSC系統を生成した。2人の患者は遺伝型のキャリア(APP遺伝子のD694N変異またはPSEN1遺伝子のG217D変異)と散発型の患者であった。これらの細胞には、健康な細胞とは異なる表現型があった。PRPの作用、特にPRPの細胞死や分化した細胞の表現型の変化を防ぐ能力を評価する。また、ADの2つの主要特徴であるAβレベルとTauリン酸化を評価する。
―健康なiPSC/NSCを対照として、iPSC/NSC MAの生存、増殖、分化に対するPRPの影響を研究した。
・毒性/アポトーシスの評価:カスパーゼ3/7キット(Caspase−Glo(R)3/7アッセイ−プロメガ)を用いてLDH(CytoTox 96(R) Non−radioactive Cytotoxicity Assay−Promega)の放出と死亡を測定し、PRP溶液の毒性を評価する。
・増殖評価:BrdUの取り込みを測定することによって(細胞増殖ELISA、BrdU−Sigma)、増殖を評価する。結果は3つの独立した実験に基づいて分析される。
・分化の評価:単層で30日、または3Dで6週間と12週間の分化について評価を行う。分化は、q−RT−PCRと9つの細胞系統および細胞機能マーカー(NSC、ニューロン、星状細胞、セロトニン作動性、GABA作動性、アセチルコリン作動性、ドーパミン作動性、グルタミン酸作動性、シナプス活性)の免疫蛍光によって評価する。。
・分化した細胞へのPRP添加の評価:q−RT−PCRと9つの細胞系統および細胞機能マーカー(NSC、ニューロン、星状細胞、セロトニン作動性、GABA作動性、アセチルコリン作動性、ドーパミン作動性、グルタミン酸作動性、シナプス活性)の免疫蛍光によって、分化を評価する。
― 増殖細胞や分化細胞のAβ分泌レベルとTauリン酸化に対する、PRPの影響を研究する
・マルチプレックスELISAによりAβ40及びAβ42を測定し、Aβ40/Aβ42比率を評価する
・Tau/phospho Tau用量
概要
今日、皮膚修復における自家線維芽細胞の適用は、臨床的に多くの関心が示されている。ほとんどの場合、体外皮膚細胞培養が必須である。ただし、異種または同種培養培地を使用した細胞増殖には、感染伝播のリスクや細胞増殖の遅延など、いくつかの欠点がある。この研究では、患者自身の多血小板血漿(PRP)を用いて体外でヒト皮膚線維芽細胞を増殖させることのできる自己培養システムを開発した。腹部形成術を受けている患者からヒト皮膚線維芽細胞を分離し、CC−PRP医療デバイスを使用して血液を採取し、新鮮なPRPを調製した。ウシ胎児血清(FBS)またはPRPのいずれかをサプリメントとして添加した培地を使用して、最長7日間培養した。PRPを補充した培地で培養した線維芽細胞は、用量に依存する顕著に高い増殖速度(PRPの20%で7.7倍と高い増殖速度)を示し、FBSに比べて、体外創傷治癒における遊走が速くなり、同時に染色体の安定性も維持された。高濃度においては、PRPは線維芽細胞の形態を変化させ、細胞骨格の再配列とα−SMAおよびビメンチンの発現の増加を誘発した。これらの発見により、自己由来のPRPが線維芽細胞培養のための効率的で費用効果の高いサプリメントであり、体外細胞増殖のための異種/同種血液誘導体の安全な代替品として検討する必要があることが分かった。
自家皮膚線維芽細胞移植は、皮膚欠損の修復において重要な治療法であるが、ほとんどの場合、体外皮膚細胞培養が必須である。しかし、異種/同種培養培地を使用した細胞増殖には、感染伝播のリスクなど、いくつかの欠点がある。我々は、患者自身の多血小板血漿を用いた自家培養システムが、線維芽細胞培養のための効率的で費用効果が高く安全なサプリメントであることを実証した。優れた製造規範と監督機関の基準を満たしているため、これを異種または同種血液派生物の有力な代替品と見なし、将来的に体外細胞増殖に用いる臨床プロトコルを検証するべきである。
再生医療は、年齢、疾患、または外傷によって損傷を受けた組織や臓器を治癒または置換したり、先天性欠損を矯正したりする可能性がある。臨床前および臨床データは、慢性疾患および急性損傷または一部の癌の治療に有望であることを示している。1再生医療の「ツールボックス」では、細胞療法は、自己または同種細胞成分を患者の修復または再生のために患者に供することを目的とし、損傷した組織は生理学的機能を回復するために使用される。2細胞療法において、血液細胞や骨髄細胞、成熟および未成熟の固形組織細胞、成体幹細胞、そして最も論争の的になっている胚性幹細胞などを含む、多種の細胞を使用できる。皮膚は、人間の多機能保護バリアであり、必須の幹細胞集団と、さまざまな細胞型を含み、それらの細胞型は、その構造的完全性と機能の更新及び維持にとって非常に重要である。2治療性創傷の治癒と皮膚の構造と機能の回復は、血管新生と細胞マトリックスおよび細胞間相互作用の調節のための前駆細胞、細胞外マトリックス(ECM)成分、成長因子及びサイトカインを含む様々な因子に依存する。真皮の主要な細胞型である線維芽細胞は、真皮で主要なECMタンパク質を生成し、正常な皮膚ホメオスタシスと創傷治癒において細胞機能、遊走、細胞マトリックスおよび細胞間相互作用を調節するラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、弾性繊維、非コラーゲン分子、および成長因子を含む。3真皮線維芽細胞は、皮膚創傷治癒4、組織再生5における治療装置として、または美容および形成外科手術における真皮充填材として、すでに臨床的可能性が示されている。6一部の著者は、線維芽細胞は、間葉系幹細胞よりも実用的であり、潜在的に効果的な細胞療法として再生医療に使用できるとさえ考えている。7
細胞分離
NHDFは、ジュネーブ大学病院(スイス、ジュネーブ)の形成外科、整形外科および美容外科で腹部形成術を受けている10人の健康な女性から分離した。手順はヘルシンキ宣言の原則に準拠し、地域の組織倫理委員会(プロトコル#3126)の許可を得た。すべてのドナーからインフォームドコンセントを得た。NHDFは、他の箇所13で述べたように分離され、サプリメントとして10%FBS、1%HEPES 1M緩衝液(Life Technologies)、1%非必須アミノ酸混合物100×(Life Technologies)、1%L−グルタミン100×(Life Technologies)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン100×(Life Technologies)、1%ピルビン酸ナトリウム100×(Life Technologies)を含む完全成長培地(ダルベッコ改変イーグル培地[DMEM]; Life Technologies、Paisley、UK)で培養し、4℃で1か月保存した。手順によって、第1継代または第2継代を使用した。
PRPは、同じNHDFドナーの血液から、CC−PRP医療デバイスを使用して調製された。抗凝固剤としてクエン酸ナトリウムを含むこれらの専用のチューブは、特定のセパレーターゲルを介して、血小板と血漿を他の血液成分(例えば、赤血球と白血球)から分離する。具体的には、30mLのヒト末梢血を3本のCC−PRPチューブに収集した(10mL/チューブあたり)。収集した血液を標準の実験用遠心分離機で1500gにて5分間遠心分離した。その後、赤血球と白血球はセパレーターゲルの下のチューブの底に蓄積したが、血漿と血小板はゲル層の上に残った。5回チューブを反転させることによって血小板を含む血漿は均質化され、6.0mLのPRPが得られ、使用するまで、ポリプロピレンチューブ(Becton−Dickinson、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国)に採取された。血小板、赤血球、白血球、および全血中の平均血小板量を、遠心分離の前及び培地に添加する前に調製されたPRPについてカウントした(KX−21N; Sysmex、リンカンシャー、イリノイ州、USA)。
細胞増殖は、CellTraceTMバイオレット(Molecular Probes、Thermo Fischer Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム、USA)染色によって評価された。第2継代において、NHDFを24ウェルプレートに、8×103細胞/ウェルの密度で播種し、10%FBSで培養するか、または一連の濃度範囲(1〜50%)のPRPで7日間処理した。細胞増殖の定量は、製造元の規定に従って、Attuneアコースティックフォーカスサイトメーター(Life Technologies)を使用したフローサイトメトリーによって行われた。細胞周期分析を行うために、DNA含有量を測定した。簡単に言えば、NHDFを12ウェルプレートに、ウェルあたり4×105個の細胞の密度で播種し、10%FBSで培養するか、または一連の濃度範囲(1〜50%)のPRPで2日間および7日間処理した。Tryple Xを使用して細胞をトリプシン処理し、70%エタノールで固定した。次に細胞を透過処理し、核DNAの含有分を、室温でFxCycle PI溶液(Molecular Probes)で染色した。試料は、Attuneアコースティックフォーカスサイトメーター(Thermofisher Scientific)を使用して運用された。細胞周期分析は、FlowJoソフトウェアを使用して行われた。
細胞骨格の再配列を研究するために、0.5%FBSを補充したDMEM中に105細胞/mLの濃度で、細胞を底が透明な黒色96ウェルプレート(μClear、Greiner、Kremsmunster、オーストリア)に24時間播種し、その後、一連の濃度範囲(1〜50%)のPRPで7日間処理した。NHDFは4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、0.1%Triton X−100で5分間、室温で透過処理した。その後、50μLの5U/mLファロイジン(Life Technologies)で染色し、PBSで2回洗浄し、50μLの1μg/mL DAPIで5分間マーキングした。ビメンチンの発現を評価するために、2.5μg/mlのマウスモノクローナル抗ビメンチン抗体FITC(V9、eBiosciences、ThermoFischer Scientific)を室温で1時間使用した。α―SMAの発現を表すために、2μg/mlのウサギポリクローナル抗α―SMA(Abcam、ab 5694)を室温で1時間使用した後、2μg/mlの二次ヤギ抗ウサギポリクローナルAlexa fluor 594(Abcam、ab 150080)を室温で1時間使用した。Cytation3細胞イメージングマルチモードリーダー(BioTek)を使用して、免疫蛍光染色を可視化した。α−SMAタンパク質の発現を測定するために、NHDFを6ウェルプレートに5×105細胞/ウェルの密度で播種し、10%FBSで培養するか、または一連の濃度範囲(1〜50%)のPRPで4日間処理した。細胞をTryple Xで分離した後、2%パラホルムアルデヒドのPBS溶液で10分間固定した。PBSで洗浄した後、0.1%Triton X−100で5分間細胞を透過処理した。106/mlの単細胞懸濁液と最適濃度の抗αSMA抗体(Abcam、ab5694)とを2μg/mlの洗浄緩衝液(2%の正常ヤギ血清PBS)で室温で1時間培養し、3回洗浄した。その後、ヤギ抗ウサギIgG H&L(AlexaFluor(R)594、Abcam)と1時間培養した。フローサイトメトリーは、Attune Nxtフローサイトメーター(Life Tehnologies)で行った。対照試料は、一次抗体結合がない細胞で構成されていた。
テトラゾリウム塩3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)の還元は、細胞の酸化還元状態の指標である。ホルマザンの生成量は、細胞質の還元能を示し、したがって細胞生存能力を表す。これは、細胞増殖と細胞毒性を測定するための最も頻繁に使用される方法の1つである。MTTはエンドサイトーシスによって細胞に吸収され、エンドソーム/リソソームの区画でホルマザンに還元される。ホルマザンは青い顆粒として細胞内に沈着する。14特定の状況下では、エキソサイトーシスされ、針状のホルマザン結晶を形成する。NHDFを96ウェルプレートに104細胞/ウェルの密度で播種し、0.5%FBSを含むDMEMで一晩培養した。翌日、一連の濃度範囲(5〜20%)のPRPで細胞培養物を%)で48時間処理した後、10μLのMTT(最終濃度500μg/mL)を37℃で4時間かけて添加した。倒立顕微鏡(Nikon)で写真(倍率100倍)を撮影した。続いて、培地を吸引し、溶解してないホルマザン結晶をウェルあたり100μLのDMSOで溶解した。その後、プレートをシェーカーに5分間置いた(150rpm)。マイクロプレートリーダー(Biotek)により595nmの吸光度を読み取った。
ラミニンおよびI型コラーゲンへの細胞付着性を評価するために、96ウェルプレートで3回ずつ実験を行った。NHDFは、ラミニン(10μg/mL)とI型コラーゲン(50μg/mL)でプレコートされた96ウェルプレートに1×104細胞/ウェルの密度で播種した。細胞は、37℃、10%FBSまたは10%PRPで30分、1時間、または4時間付着させた。プレートをPBSで3回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、0.1%クリスタルバイオレットで染色し、試料を流水ですすぎ、風乾した。画像は倒立顕微鏡下で撮影した。試料を氷酢酸で溶解し、570nmでの光学密度を自動マイクロプレートリーダーを使用して特定した。
NHDFを4×104細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種し、24時間コンフルエントになるまで増殖させた。10μLのピペットチップを使用して、NHDF単層にスクラッチを設けた。ウェルをPBSで2回洗浄して、分離した細胞を除去し、各ウェルの中央で写真を撮った。次に、NHDFを10%FBSまたは一連の濃度範囲(1〜50%)のPRPで8時間培養した。培養後、NHDFをPBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固定した。ハイスループットのCytation 3細胞イメージングマルチモードリーダー(BioTek)で、ウェルごとに1つの画像(中心位置、時間0と同じ)を取得した。ImageJソフトウェアを使用して、時間0および8時間での創傷領域を測定することで定量化を行った。
ゲノムの安定性は、比較ゲノムハイブリダイゼーションアレイによって特定した。 FBS 10%またはPRP 10%で6日間処理したNHDFを、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)を使用して比較した。QIAGEN QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen、Hilden、ドイツ)を使用して、製造元の規定に従ってDNAを抽出した。アレイCGHは、Agilent SurePrint G3ヒトCGHマイクロアレイキット4_180K(デザインID 022060)を使用して実行され、全体の中央プローブ間隔は43kb(Agilent Technologies)とした。実際の解像度は約129Kbであった。培養されたNHDFから抽出されたDNAおよび対照DNA(Promega男性DNA、番号G1471)をプールした。ドナーDNAと性別を一致させたコントロールのDNA(各1μg)をそれぞれCy3−dUTPとCy5−dUTPでラベリングした(Sure Tagマークキット、Agilent Technologies)。ラベリングされた製品は、Amicon Ultra 30 Kフィルター(Millipore、Burlington、MA、USA)により精製した。ハイブリダイゼーションは、Agilentが提供するプロトコルに従って行われた。ドナーとコントロールのDNAをプールし、2mgのヒトCot−I DNAと65℃で24時間回転させて交雑した。アレイは、AgilentのSureScanマイクロアレイスキャナーとAgilentの特徴抽出ソフトウェア(v11.5)を使用して分析され、結果はAgilentゲノミックワークベンチ(v.7.0)によって提示された。
各細胞培養実験について、処理は三回ずつまたは四回ずつ行われた。特に明記しない限り、各実験は3回繰り返された。データは平均±SEMとして表す。1つの独立変数を使用した実験において、一元配置分散分析を用いて複数の比較を行った。Dunnetの検定は、有意な分散分析の事後分析に使用された。両グループ間の平均値の差は、p≦0.05のときに有意であった。
全血およびPRPにおける血球および血小板のカウント
遠心分離後、ほとんどの血小板は血漿の底にあるゲルセパレーターの上に蓄積した。ゲル上の血小板を血漿全体(平均容量6ml)に懸濁させ、この懸濁液をPRPとして使用した。PRPの最終的な平均血小板濃度は、2.5×105+/−1.21血小板/μLであった。この濃度は、遠心分離前の全血の1.53倍(1.64×105+/−0.64血小板/μL)であった。全血からのPRPの血小板回収率は96%であった。平均血小板量は、全血とPRPで同等だった(全血で8.7fL+/−0.87、PRPで8.2fL+/−0.82)。全血と比較すると、PRPにおける白血球の平均濃度顕著に低かった(それぞれ0.75×103+/−0.7細胞/μL及び6.75×103+/−2.88細胞/mL;p<0.05)。平均赤血球濃度も顕著に減少した(それぞれ0.03×106+/−0.001細胞/mLおよび4.17×106+/−0.49細胞/mL;p<0.05)(n=10)(図13A)。
培地を交換せずに7日間培養した後、異なるPRP濃度を補充した培地は、FBS含有培地と比較してより高い生存NHDF数を示した(図14)。PRPのこの増殖効果は、用量依存的な鐘型曲線をたどった。最適な培養条件はPRP20%であり、NHDFの数はFBS10%より7.7倍高かった(n=10;p<0.001)。48時間後、PRPで処理された試料は、FBS処理された対照細胞と比較して、有意な細胞周期の変化を示したことが観察された。「G0/G1」フェーズの細胞の平均パーセンテージは、FBS10%グループの74.5%から20%PRPグループの62%に変化した。「S」フェーズでは、FBS10%グループの9.5%からPRP20%グループの13%に増えた。「G2/M」フェーズでは、FBS10%グループの14%からPRP20%グループの23%まで増えた(図15AおよびB)。7日間の処理後、細胞はコンフルエントになり、DNA合成と有糸分裂は停止し、細胞は、PRPを補充した培地で静止状態のG0/G1フェーズに入った(図15C)。
細胞をテトラゾリウム塩MTTと培養すると、前記塩が還元されて紫色の水不溶性ホルマザンになる。この塩の細胞質内還元は、「細胞レドックス活性」の指標と見なされ、ミトコンドリア酵素に関連している。FBS処理した培地の顕微鏡検査(図16A)では、ホルマザン顆粒は細胞内小器官にあった。しかし、細胞をPRP(5〜20%)で48時間処理すると、細胞の表面に、針状の結晶が現れ、エキソサイトーシスされたMTTホルマザンを示した(図16A)。さらに、光学デンシトメトリーによって溶解したホルマザンの量を定量すると、PRP処理細胞の増加が直接細胞代謝活性の向上を反映していることが実証された(図16B)。20%PRP処理の細胞はピークに達し、FBS10%で48時間処理した細胞の3.12倍であった。
従来のFBS補充培地で培養されたNHDFは、規則的な扁平な細胞形状を示したのに対し、PRP(10〜50%)で処理されたNHDFはスピンドル形を呈し、3Dマトリックス培地または生体内環境に近い形態であった(図2)。7日間のPRP処理で発生した形態的変化(図17A)が表現型の変化と関連しているかどうかを調査した。まず、皮質アクチンの局在(FBS10%)から太い細胞間フィラメント(PRP20%)への顕著なF−アクチン再構築を実証した(図17B)。さらに、フローサイトメトリーと免疫蛍光分析により、PRP処理したα−SMA発現の変化を評価した(図18A)。 α−SMA発現は、高PRP濃度(40〜50%)で大幅に増加したが、FBSおよびPRP5〜10%処理細胞は、基底核染色を呈した(図18B)。免疫蛍光分析では、PRP20%の存在下においてビメンチン染色が増加したが、高PRP濃度(PRP50%)では完全に消失した。
NHDF生物学に対するPRPの生物学的効果をさらに特徴付けるために、ラミニンとI型コラーゲンの細胞付着に対するPRP処理の影響を評価した。図19Aに示すように、播種の4時間後にPRPは、ラミニンへのNHDFの全体的な付着を減少させた。この効果は15分後にすでに発生しており、全体的な細胞付着が21%減少した。コラーゲンIマトリックスへのNHDF付着でも同じ結果が得られた(図19B)(15分後に全細胞付着の41%)。PRPの作用を受けたNHDFの遊走特性を研究するために、体外スクラッチ試験を実施した(図20)。20%PRP処理を8時間行うと、FBSを使用した細胞培養と比較して、スクラッチマージンからスクラッチゾーンへの遊走細胞数が10%増加した。この遊走の前線は、集団的な細胞遊走であった。逆に、FBS10%の作用を受けたNHDFは、孤立した細胞遊走の特徴を示した。
増殖中の遺伝的安定性を記録するために、第2継代のNHDFを、FBS10%またはPRP10%を補充した培地で4日間培養した。2つの異なる培地で処理された細胞のアレイCGH分析では、不均衡な染色体再配列は見られなかった。PRP処理に応じて増加した増殖率はゲノムの不安定性を引き起こさなかった。例を挙げてデータを説明するが、FBS10%またはPRP10%で培養されたNHDFにおいて、第4染色体(領域q13.2)における良性ホモ接合性欠失とq29領域のchr3における良性ヘテロ接合性欠失は互いに重なる(図21)。
自己線維芽細胞治療は、さまざまな美容および形成外科手術において潜在的な発展可能性がある。16自己線維芽細胞療法に対するこの臨床的関心は、動物実験の後に起こったものであるが、動物実験では、成熟皮膚から分離された線維芽細胞が皮内注射の5か月後にも生体内で生存し続け且つ真皮の厚さを増加させたことが示された。17 2011年以来、初めて、成人の鼻唇襞のひだを改善するための、個人の自己線維芽細胞療法であるLAVIV(Azficel−T、Fibrocell Technologies、ペンシルバニア州エクストン、USA)が、FDAに承認された。18この技術の主な問題点は、注入前の細胞培養のコストと、時間が長いこと(11〜22週間)、および細胞を体外で増殖するためにFBSによって供給される成長因子が異種源であることにある。線維芽細胞を用いた細胞治療は、すべて、体外の細胞増殖に依存しているため、例えばFBSを細胞培地における成長と栄養素供給として使用するなど、非ヒト起源によるあらゆる要素を消し去る試みがなされてきた。8以前は、真皮または歯肉組織に由来する線維芽細胞の体外増殖のために、FBSをPRPに置き換えることを目的とした研究はほとんどなかった。19−23しかし、異種ライセートPRPまたは活性化PRPを使用した実験においては、細胞増殖の効率は制限されていた。Kakudoらは、20%活性化PRPは増殖を促進しなかったが、5%活性化PRPで7日間培養した後、ヒト真皮線維芽細胞増殖能力が2.5倍増強したことを実証した。19 NHDFを使用した別の研究では、5%の活性化PRPを追加した5日後に、増殖が1.5倍しか向上しなかったことが示されている。20最近、49人の患者のプールから調製された非活性化PRPは、7日間の培養後に軽い増殖作用(1.3倍)を奏することが実証された。23 しかし、この研究では、Nohらは、FBSをPRPに置き換えることはしなかった。彼らは未知の濃度のPRPをFBSを含む培地に加えた。我々の知る限り、本研究は、異なる濃度の自己非活性化PRPによってFBSを置換し、NHDFを増殖することの利点を初めて実証した。他の研究では、トロンビン、カルシウム、またはコラーゲンによるPRPの活性化は、15分から24時間までの間のみ、成長因子の即時かつ重要な放出を刺激する。したがって、細胞培養等の用途には、漸進的な血小板脱顆粒からの成長因子の緩やかな放出が必要とされるため、血小板の活性化は望ましくないと考えている。平均血小板体積(MPV)は、血小板活性の潜在的なマーカーと見なされ、密度の高い顆粒を含む大きな血小板は、小さな血小板よりも酵素的および代謝的に活性がより高い。24私たちの研究では、MPVは、全血とPRPの間で同等だった(全血中8.7fL、PRP中8.2fL)。PRP調剤はMVPを変えなかったので、処理過程において血小板の活性化を引き起こさないことを意味する。非活性化PRPを含む培地を用いた脂肪由来幹細胞の増殖に関する従来の研究では、TGF−B1とVEGFは0日目から10.25日目まで継続的に分泌し、一方PDGF−ABとFGFの濃度は5日目にピークに達し、10日以上安定していたことが実証された。これは、10日間の培養後の50%血小板生存能力と直接関係している。11さらに、非活性化PRPによるGFは数日間にわたり継続的かつ組織化された分泌を行うため、血小板を含まない他の培地サプリメント(FBS、PRPライセートなど)のように3日ごとに一回交換する必要がなく、7〜10日後に培養培地を交換すればよいという可能性が見出された。
この実証は、PRPで培養されたNHDFの適用を臨床環境に変換して法的規制要件を満たすために、重大な意義がある。
この研究では、培地中への安全な生物学的サプリメントとしてPRPを使用したNHDF増殖の完全自家モデルを初めて示した。PRPのさまざまな効果は、濃度及び治療の継続期間に応じて、細胞増殖の加速から、染色体の安定性を変えることなく細胞付着と遊走を調節することにまで及ぶ。この自家技術は、適正製造基準ガイドライン(Good Manufacturing Practice Guidelines)と監督機関の基準を満たしているため、PRPは線維芽細胞培養の効率的で費用効果が高い安全なサプリメントと見なすべきであり、将来の体外細胞増殖の臨床プロトコルの検証のための異種または同種血液誘導体の代替品と見なすことができる。
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Claims (94)
- 少なくとも1つの第1のポリマー(好ましくはヒアルロン酸)から架橋ゲル(好ましくは所望の分子量および/または濃度を有する)を製造するための方法であって、以下のステップを含む方法。
i) 前記第1のポリマーを均質化する、
ii) 塩基性溶液中で前記第1のポリマーを水和する、
iii) 室温よりも高い温度で少なくとも1つの架橋剤を添加することにより、前記塩基性溶液を架橋する、
iv) 酸性溶液中で前記塩基性溶液を中和する、
v) 前記溶液を均質化する、
vi) 前記溶液を、補足量の第2のポリマー(好ましくは、前記第1のポリマーと実質的に同じ分子量および/または濃度である第2のポリマー)と混合する、
vii) 前記溶液を精製する。 - 前記ステップが、連続した一連のプロセスにおいて、中断することなく実行される、請求項1に記載の方法。
- 前記方法が単一の反応容器内で実施される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記容器がアンカー攪拌容器である、前記請求項に記載の方法。
- 前記方法が連続気流中で行われる、請求項1、2または3に記載の方法。
- 前記第1および/または第2のポリマーが、少なくとも部分的に非架橋であるか、または完全に非架橋である、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリマーが繊維、粉末または結晶の形態である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記架橋ゲルが生体適合性ゲルおよび/または均質な二相性ゲルである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記架橋ゲルが均質な二相性ゲルである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記均質化が、所定量の前記ポリマーを用いて行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記均質化が、室温よりも低い温度で、または室温で行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記ポリマー均質化が溶媒を用いて行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記ポリマー均質化が、撹拌しながら行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記ポリマーを溶媒で均質化することが、ポリマーの攪拌下で行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記水和が塩基性溶液中で行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記塩基性溶液がリン酸緩衝液を含むか、またはリン酸緩衝液からなる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記塩基性溶液のpHが10以上である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記水和ステップの後に、または同時に、温度を30℃〜70℃、40℃〜60℃、45℃〜55℃、または約50℃に上昇させる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記架橋剤が過剰である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記架橋が攪拌下で行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記架橋が、室温よりも高い温度で行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記温度が、一定の期間において、30℃〜70℃、40℃〜60℃、45℃〜55℃の間であるか、または約50℃である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記期間が、10分から24時間、20分から12時間、30分から6時間、1時間から3時間、1.5時間から2.5時間、または約2時間である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記中和が、前記酸性溶液を徐々に添加することによって行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記中和が攪拌しながら行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記酸性溶液が緩衝溶液である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記酸性溶液の体積/量は、前記塩基性溶液の一定の式を有する関数である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記酸性溶液の体積/量により、架橋ゲルの最終濃度が1.5%、2%、2.5%、0.5〜10%、1%〜5%、1.5〜2.5%の範囲となる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記中和ステップ後、または中和ステップと同時に、温度が0℃〜10℃、2℃〜6℃、3℃〜5℃、または約4℃に低下する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記中和が、室温よりも低い温度または室温で行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記温度が、一定の期間において、0℃〜20℃、1℃〜10℃、2℃〜6℃、3℃〜5℃、または約4℃である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記期間が、10分から24時間、20分から12時間、30分から6時間、1時間から3時間、1.5時間から2.5時間、または約2時間である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記中和が攪拌しながら行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記溶液の均質化が、一定の期間において、0℃〜10℃、2℃〜6℃、3℃〜5℃の間の温度で、または約4℃で行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記期間が1時間から24時間、4時間から20時間、6時間から18時間、8時間から16時間、10時間から14時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、または約訳13時間である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記溶液の均質化がpH中性で行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記溶液と補足量の第2のポリマーとの混合が、撹拌しながら行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記架橋ゲルを濾過するステップをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記架橋ゲルを収集するステップをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記ろ過が、220〜280μmメッシュを有するフィルタを用いて実施される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記架橋ゲルを滅菌することをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記滅菌が蒸気によって行われる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 架橋を停止するステップが、透析によって実施されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記ポリマーが自然由来であることを特徴とする、前記請求項に記載の方法。
- 前記自然由来のポリマーが、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、セルロースおよびその誘導体、アルギネート、キサンタン、カラゲニン、タンパク質または核酸から選ばれる化合物であることを特徴とする、前記請求項に記載の方法。
- 少なくとも1つの自然由来のポリマーが、人体に自然に存在しないポリマーであり、セルロースおよびその誘導体、アルギネート、キサンタン、カラゲニン、少なくとも1つの人体に自然に存在するポリマーと架橋するポリマーから選ばれ、前記少なくとも1つの人体に自然に存在するポリマーは、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、タンパク質または核酸から選ばれることを特徴とする、前記請求項に記載の方法。
- 前記架橋剤が、エポキシ化合物、エピハロヒドリンおよびジビニルスルホンから選択される少なくとも1つの二官能性または多官能性分子または架橋剤であることを特徴とする、前記請求項に記載の方法。
- 前記多官能性架橋剤が、1,4−ブタンジオールジグリシジルエーテル(BDDE)、1,2−エタンジオールジグリシジルエーテル(EDDE)及びジエポキシオクタンから独立して選ばれる、前記請求項に記載の方法。
- 前記多官能性架橋剤が、1,4−ブタンジオールジグリシジルエーテル(BDDE)である、前記請求項に記載の方法。
- 前述の請求項のいずれかに記載の方法によって調製されたゲル。
- 少なくとも1つの分散された活性成分を含むゲルを構成することを特徴とする、前述の請求項に記載のゲル。
- 前述の請求項のいずれかに記載の方法によって得られた架橋ヒアルロン酸。
- 生体組織を分離、置換または充填するため、または前記組織の体積を増加させるため、または生体体液を補充または置換するための、請求項50から52のいずれかに記載のゲルの使用。
- 架橋ヒアルロン酸であって、動粘度が約1Pa.s〜約5.2Pa.s、または<=6Pa.s.、<=5.5Pa.s.、<=5.2Pa.s.<=5Pa.s.、<=4.5Pa.s.、または<=4Pa.s.である、架橋ヒアルロン酸。
- 弾性が<=100Pa.s、<=70Pa.s、<=60Pa.s、<=50Pa.s、<=40Pa.s、<=30Pa.s、<=20Pa.sまたは<=10Pa.s.である、前記請求項に記載の架橋ヒアルロン酸。
- 100KDaから6000KDa、500KDaから2000KDaの間、または約1300KDa、約1400KDa、約1500KDa、約1600KDaまたは約1700KDaの分子量を有する、前記請求項のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸。
- 濃度が、約0.5%から約10%、約1%から約2.5%、約1.5%または約2%であるの、前述の請求項のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸。
- 約0.5%から約10%、約1%から約5%、約2%から約4%、約2.5%、、約3%または約3.5%の架橋度を有する、前記請求項のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸。
- BBDE含有量が<=2.5ppm、<=2ppm、<=15ppm、または<=1ppmである、前述の請求項のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸。
- 密度が、チキソトロピーゲルの密度よりも低い、前述の請求項のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸。
- 動粘度<=5.2Pa.sであり、分子量が約1500KDaである、前述の請求項のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸。
- 動粘度<=5.2Pa.sであり、濃度が約2%である、前述の請求項のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸。
- 動粘度<=5.2Pa.s.であり、分子量が約1500KDaであり、濃度が約2%であり、架橋度が約3%である、前述の請求項のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸。 。
- 弾性<=60Pa.sであり、注射器中で使用される、前述の請求項のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸。
- 血小板濃縮物、多血小板血漿、骨髄濃縮物および/または生体材料と組み合わせた、前述の請求項のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸。
- 前述の請求項のいずれかに記載の架橋ヒアルロン酸を含む容器。
- 前記容器がチューブまたは注射器である、前述の請求項のいずれかに記載の容器。
- 少なくとも1つの抗凝固剤および/または少なくとも1つのチキソトロピーゲルをさらに含む、前述の請求項のいずれかに記載の容器。
- i) 25℃における粘度が100〜250Pa.sであること、および
ii) 密度が、約1.03から約1.05g/cm3、約1.08から約1.09g/cm3または約1.075から約1.08g/cm3から選択されること
を特徴とするチキソトロピーゲルを、唯一の添加剤として含む容器。 - 前記チキソトロピーゲルが、ポリオレフィン系オリゴマー、アクリル樹脂混合物、PEG−シリカゲル、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、前述の請求項のいずれかに記載の容器。
- トロンビン血清の調製のための請求項69または請求項70に記載の容器の使用。
- 抗凝固剤を添加剤としてさらに含み、前記チキソトロピーゲルの密度が約1.03〜約1.05g/cm3から選択される、前述の請求項のいずれかに記載の容器。
- 抗凝固剤を添加剤としてさらに含み、前記チキソトロピーゲルの密度が約1.08〜約1.09g/cm3から選択される、前述の請求項のいずれかに記載の容器。
- 前記容器が、前記チキソトロピーゲルおよび前記抗凝固剤からなる2つの添加剤のみを含み、前記チキソトロピーゲルが、前記容器の遠位端からの第1層であり、その後に抗凝固剤からなる第2層が続く、請求項72または73に記載の容器。
- 血小板濃縮物(PC)または骨髄濃縮物(BMC)の調製のための、請求項72〜74のいずれかに記載の容器の使用。
- 前記抗凝固剤がクエン酸ナトリウムである、前述の請求項のいずれかに記載の容器。
- 生体材料、ポリマー、ヒアルロン酸または請求項50〜52または55〜65のいずれかに1項に記載のヒアルロン酸を添加剤としてさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の容器。
- 前記ヒアルロン酸が非架橋または架橋されている、前記請求項に記載の容器。
- 前記ヒアルロン酸の分子量が約1500Kdaであり、約1.5%から約2%である、前記請求項に記載の容器。。
- 前記容器が、前記ヒアルロン酸、前記チキソトロピーゲルおよび前記抗凝固剤からなる3つの添加剤のみを含み、前記ヒアルロン酸が前記容器の遠位端からの第1層であり、その後前記チキソトロピー性ゲルからなる第2層が続き、さらに前記抗凝固剤からなる第3層が続く、前記請求項に記載の容器。
- 前記請求項に記載の容器、ゲルまたはヒアルロン酸であって、
凝固促進剤、トロンビン血清、リン酸三カルシウム(TCP)、骨代替物、ヒアルロン酸組成物、グルコン酸カルシウム、サッカリン酸カルシウム、キトサン、フィブロイン、フィブロイン絹タンパク質またはフィブロインタンパク質、成長因子、マンニトール、コラーゲン、アルブミン、アスコルビン酸、クリーム、脂肪細胞、脂肪組織、骨髄濃縮物、ルブリシン、cd−ゼラチン、ボツリヌス毒素および/または1つ以上の細胞抽出物、必要に応じてまたは好ましくは、ケラチノサイト、骨髄、線維芽細胞、骨膜または角膜細胞、メラノサイトおよびランゲルハンス細胞、脂肪細胞、筋芽細胞および衛星細胞などの筋細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、臍帯細胞、幹細胞、間葉幹細胞(MSC)、前脂肪細胞、前内皮細胞、シュワン細胞またはアキレス腱細胞の抽出物から選択される自己細胞抽出物をさらに含む容器、ゲルまたはヒアルロン酸。 - PCとHAまたはBMCとHAを含む組成物を調製するための、請求項77〜80のいずれか1項に記載の容器の使用。
- BMCおよびHAを含む組成物の調製のための、請求項77から80のいずれか1項に記載の容器の使用であって、前記チキソトロピーゲルの密度が約1.08〜約1.09g/cm3から選択される、前記容器の使用。
- 前記容器が管または注射器から選択される、前記請求項のいずれか記載の容器。
- 前記チューブが、
a.ホウケイ酸塩でできている、および/または
b.シリコーンを含む、および/または
c.発熱物質が除去されている、および/または
d.真空下にある、および/または
e.ストッパー付き
である、前記請求項に記載のチューブ。 - 前述の請求項のいずれかに記載の容器を1つまたは複数含むキット。
- 前記請求項に記載のキットであって、以下から選択されるキット。
i) PRP及びHAの調製のための請求項77〜80のいずれかによる容器と、トロンビン血清の調製のための請求項69または請求項70によるの容器との組み合わせ、または
ii) BMC及びHAの調製のための請求項77〜80のいずれかによる容器と、トロンビン血清の調製のための請求項69または請求項70によるの容器との組み合わせ、または
iii) PRP及びHAの調製のための請求項77〜80のいずれかによる容器と、PRP調製のための請求項72〜74のいずれかによるの容器との組み合わせ、または
iv) PRP及びHAの調製のための請求項77〜80のいずれかによるの容器と、BMC調製のための請求項72〜74のいずれかによる容器との組み合わせ、または
v) BMC及びHAの調製のための請求項77〜80のいずれかによる容器と、PRP調製のための請求項72〜74のいずれかによる容器との組み合わせ、または
vi) BMC及びHA調製のための請求項77〜80のいずれかによる容器と、BMC調製のための請求項72〜74のいずれかによる容器との組み合わせ、または
vii) トロンビン血清の調製のための請求項69または請求項70による容器と、PRP調製のための請求項72〜74のいずれかによる容器と組み合わせ、または
viii) トロンビン血清の調製のための請求項69または請求項70による容器と、BMC調製のための請求項72〜74のいずれかによる容器と組み合わせ、または
ix) PRP調製のための請求項72による容器と、PRP調製のための請求項73による容器の組み合わせ、または
x) BMC調製のための請求項72による容器と、PRP調製のための請求項73による容器との組み合わせ、または
xi) PRP調製のための請求項72による容器と、BMC調製のための請求項73による容器との組み合わせ、または
xii) BMC調製のための請求項72による容器と組み合わせた、BMC調製のための請求項73による容器、または
xiii) 前記請求項のいずれかに記載の容器と、少なくとも1つの細胞抽出物との組み合わせ、または
xiv) 上記の任意の組み合わせ。 - 前記容器が、トロンビン血清(TS)、または血小板濃縮物(PC)または骨髄濃縮物(BMC)、あるいはPCとBMCの両方、または任意の組成物と生体材料あるいはヒアルロン酸との組み合わせを調製するために用いられる、前記請求項のいずれかに記載の容器またはキット。
- 細胞培養における、前記請求項のいずれかに記載の容器またはキットの使用。
- 細胞培養における、前記請求項のいずれかに記載の容器またはキットによって得られたPRPの使用。
- 前記PRPが活性化されていない、前記請求項に記載の使用。
- 前記PRPが自家である、前記請求項のいずれかに記載の使用。
- 培地において、10%〜40%のPRP、15%〜25%のPRP、または約20%のPRPが使用される、前記請求項のいずれかに記載の使用。
- 前記細胞培養が、線維芽細胞、ケラチノサイト、筋芽細胞、衛星細胞、軟骨細胞、関節軟骨細胞、MSC、肝細胞、内皮細胞、粘膜細胞、膣粘膜細胞、陰核内皮細胞を培養するためのものである、前記請求項のいずれかに記載の使用。
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