KR20120007513A

KR20120007513A - 연골 복구

Info

Publication number: KR20120007513A
Application number: KR1020117024873A
Authority: KR
Inventors: 아비바 셔들린; 티모시 제이 버틀러; 마이클 필브룩; 피터 케이 자렛
Original assignee: 젠자임 코포레이션
Priority date: 2009-03-23
Filing date: 2010-03-22
Publication date: 2012-01-20
Also published as: WO2010111161A2; BRPI1012278A2; CA2755974A1; US20120088721A1; AU2010228971A1; EP2411064A2; WO2010111161A3; IL215335A0; SG174505A1; IL215335A; JP2012521270A; CN102395390A; MX2011009855A

Abstract

본 발명은 조성물, 이의 제조 방법, 및 연골 복구를 위한 이의 용도에 관한 것이다.

Description

연골 복구{CARTILAGE REPAIR}

연골 손상은 인간에서 흔하게 존재한다. 치료하지 않으면, 손상이 점진적으로 악화될 수 있고 골관절염 등의 만성 병태를 초래할 수 있다. 수많은 상이한 치료법이 현재 손상된 연골을 복구시키는데 사용되고 있다. 예시적인 방법으로는, 골연골 결함부로 연골세포 또는 중간엽 줄기 세포의 직접 이식 또는 세포 전달 비히클을 통한 이식법, 또는 복구 과정을 촉진하기 위한 성장 인자 이용법 등이 포함된다(Gao, et al. Clinical Orthopaedics and Related Research 2004, S62-66). 복구 조직의 내구성, 초기 최적 성장 인자 용량의 확실성, 또는 복수 생체인자간 상호작용에 대한 지식이 중요하지만 때때로 문제가 되곤 한다(Gao, et al. Clinical Orthopaedics and Related Research 2004, S62-66).

본 발명자들은 연골 복구를 위해 확실한 조성물 및 방법을 개발하였다.

일 측면에서, 본 발명은 약 25 중량%∼약 40 중량%의 탈회 골기질(DBM), 약 3.5 중량% 내지 약 25 중량%의 히알루론산 염, 및 약 40 중량%∼약 72 중량%의 생물학적으로 적합한 액체를 포함하는 형성성(formable) 조성물을 특징으로 한다.

일부 구체예에서, 히알루론산 염은 히알루론산의 나트륨 염, 칼륨 염 또는 칼슘 염일 수 있다.

일부 구체예에서, 형성성 조성물은 생물학적으로 적합한 액체를 포함할 수 있고, 이는 PBS, 물, 염수 또는 LRS, 예를 들어, PBS일 수 있다.

형성성 조성물은 유동성 개질제, 예를 들어, 글리세롤 또는 카르복시메틸 셀룰로스를 더 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 형성성 조성물은 35 중량% 이하의 탈회 골기질, 예를 들어, 약 25 중량%∼약 35 중량%의 탈회 골기질을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 형성성 조성물은 약 6 중량% 이상의 히알루론산 염을 포함할 수 있다. 일정 구체예에서, 형성성 조성물은 약 6 중량%∼약 15 중량%의 히알루론산 염을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 형성성 조성물은 약 6 중량%∼약 9 중량%의 히알루론산 염을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 히알루론산 염은 평균 분자량이 약 500,000 달톤 이상일 수 있다.

일부 구체예에서, 형성성 조성물은 2종 이상의 히알루론산 염의 혼합물을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 형성성 조성물은 2종의 히알루론산 염, 예를 들어 제1 평균 분자량이 약 0.05 내지 약 1.0 밀리온 달톤 범위인 히알루론산 염, 및 제2 평균 분자량이 약 1.0 내지 약 5.0 밀리온 달톤 범위인 히알루론산 염의 혼합물을 포함할 수 있다. 제1 평균 분자량의 히알루론산 염 대 제2 평균 분자량의 히알루론산 염의 평균 분자량 비율은 1:5∼5:1 범위일 수 있다.

일부 구체예에서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염과 제2 평균 분자량의 히알루론산 염 간 평균 분자량 차이는 약 0.5 밀리온 달톤 이상일 수 있다.

일부 구체예에서, 형성성 조성물은 테스트로 더욱 특징규명될 수 있다. 예를 들어, 인스트론 시린지 압출력(Instron Syringe Extrusion Force; ISEF) 테스트를 실시한 경우, 조성물은 압출력이 약 12.0 뉴톤∼약 30.0 뉴톤으로 나타날 수 있다. 일부 구체예에서, 압출력은 약 18.0 뉴톤∼약 26.0 뉴톤일 수 있다. 구체예에서, 압출력은 직경이 8.6 mm인 3 mL 시린지 및 15 게이지 1∼1/1 바늘에서 측정된다.

형성성 조성물은 약학적 활성 성분을 더 포함할 수 있다. 약학적 활성 성분은 골 형성능 단백질, 조직 성장 인자, 인슐린 성장 인자, 항산화제, 항생제 또는 성장 인자의 조합일 수 있다. 구체예에서, 약학적 활성 성분은 BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, TGF-β, IGF-1, 아스코르베이트, 피루베이트, BHT, 젠타마이신, 반코마이신, TGF-β와 BMP-2의 조합, 및 TGF-β와 IGF-1의 조합에서 선택될 수 있다.

일부 구체예에서, 약학적 활성 성분은 히알루론산 염과 접합될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 약 60 중량%∼약 92 중량%의 탈회 골기질, 약 3.5 중량%∼약 38 중량%의 히알루론산 염, 및 약 3 중량%∼약 10 중량%의 생물학적으로 적합한 액체를 포함하는 건조 블렌드 조성물을 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 히알루론산 염은 평균 분자량이 약 200,000 달톤 이상이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 약 25 중량%∼약 88 중량%의 탈회 골기질 및 약 3.5 중량%∼약 38 중량%의 히알루론산 염 및 약 3 중량%∼약 20 중량%의 생물학적으로 적합한 액체를 포함하는 플러그를 특징으로 한다. 일부 구체예에서, 조성물은 약 5 중량%∼약 10 중량%의 생물학적으로 적합한 액체를 포함한다. 일부 구체예에서, 히알루론산 염은 평균 분자량이 약 200,000 달톤 이상이다. 일부 구체예에서, 플러그는 약 10% 이하의 생물학적 액체를 포함한다. 일정 구체예에서, 플러그는 약 5 중량% 이하의 생물학적 액체를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 생물학적으로 적합한 액체는 물일 수 있다. 예를 들어, 생물학적으로 적합한 액체는 건조시 손실로 측정될 수 있는 잔류 수분이다. 일부 구체예에서, 플러그는 일축 압축 응력이 약 1.55 MPa 이상(예를 들어, 약 1.60 MPa 이상, 또는 약 1.65 MPa 이상, 또는 약 1.70 MPa 이상)으로 나타난다. 일정 구체예에서, 플러그는 일축 압축 응력이 약 1.55 MPa 내지 약 1.70 MPa로 나타난다.

일 측면에서, 조성물의 유효량을 연골 조직의 결함 부위에서 피험체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 조성물은 탈회 골기질 및 히알루론산 염을 포함하는 것인 피험체에서 연골을 복구시키는 방법을 특징으로 한다. 상기 조성물은 형성성 조성물, 건조 블렌드 조성물, 또는 플러그일 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 약 25 중량%∼약 40 중량%의 탈회 골기질, 약 3.5 중량%∼약 25 중량%의 히알루론산 염, 및 약 40 중량%∼약 72 중량%의 생물학적으로 적합한 액체를 포함하는, 형성성 조성물의 제조 방법을 특징으로 하고, 이 방법은 고체 성분을 혼합한 후, 액체 성분을 부가하는 것을 포함한다. 고체 성분은 탈회 골기질 및 히알루론산 염을 포함할 수 있다. 히알루론산 염은 평균 분자량이 약 200,000 달톤 이상일 수 있다. 일부 구체예에서, 액체 성분은 의도하는 사용 전에 부가될 수 있다. 일부 구체예에서, 액체 성분은 물이다. 조성물이 약학적 활성 성분을 포함하는 경우, 약학적 활성 성분은 히알루론산 염과 접합될 수 있다. 다른 구체예에서, 약학적 활성 성분은 고체 성분, 예컨대 탈회 골기질 및 히알루론산 염과 혼합될 수 있다. 일정 구체예에서, 약학적 활성 성분은 액체 성분과 혼합될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 a) 탈회 골기질 및 히알루론산 염의 분말을 제공하는 단계, b) 분말을 혼합하는 단계, c) 액체 성분을 부가하여 퍼티 유사 물질을 형성시키는 단계, d) 퍼티를 몰드에 위치시키는 단계, 및 e) 성형된 퍼티를 건조시켜 플러그를 형성시키는 단계를 포함하는, 플러그를 형성시키는 방법을 특징으로 한다.

대체로 "퍼티"는 단단하지만 유연하다. 부스러지지 않는다. 손으로 성형할 수 있거나, 또는 수동 압력을 이용해 뼈 공극 또는 해면 간극에 틈입시킬 수 있는 가단(malleable) 일관성이 있다.

일부 구체예에서, 분말은 가소제 예컨대 글리세롤 또는 PEG를 더 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 건조는 동결건조, 공기 건조, 또는 오븐 또는 진공 건조일 수 있다.

일정 구체예에서, 플러그는 수분 함량이 약 3∼20 중량%(예를 들어, 5 중량% 이상)에 도달하도록 더욱 조건화될 수 있다. 일부 구체예에서, 수분 함량은 약 5 중량%∼약 10 중량%이다. 다른 구체예에서, 수분 함량은 약 5 중량%∼약 15 중량%이다.

본원에서 사용되는, "형성성 조성물(formable composition)"은 실질적으로 글로브에 부착없이, 그리고 우수한 외과술과 일관되게 외과의가 원하는 형상으로 조작할 수 있는 것이다. 예를 들어, 형성성 조성물은 수술 결손부의 윤곽에 맞게 성형될 수 있다. 퍼티가 형성성 조성물의 한 유형일 수 있으며 환자에 사용될 수 있다. 보다 전형적으로, 본 발명자는 이 용어를 본 출원의 다른 곳에서는 플러그러 건조되는 중간 물질을 설명하는데 사용한다.

본원에서 사용되는 "평균 분자량은 Mw = ΣNi² Mi²/ ΣNi Mi의 식으로 계산될 수 있는 중량 평균 분자량(Mw)를 의미하며, 상기 식에서 Ni는 분자량 Mi의 분자 수이다.

본원에서 사용되는, "생물학적으로 적합한 액체"는 생리학적으로 허용되고, 허용되지않는 세포 손상을 야기하지 않는 액체이다. 이러한 액체의 예로는 물, 완충액, 염수, 단백질 용액, 및 당 용액 등이 있다.

본원에서 사용되는 용어 "피험체 " 또는 "환자"는 상호교환적으로 사용되고, 포유동물을 포함하는, 임의의 동물, 바람직하게는 마우스, 래트, 다른 설치류, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 말, 또는 영장류, 가장 바람직하게는 인간을 의미한다.

본원에서 사용되는 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 다른 임상의가 조직, 계, 동물, 개체 또는 인간에서 추구하는 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 활성 화합물 또는 약학 제제의 양을 의미한다.

본원에서 사용하는 용어 "복구"는 제한없이 조직의 복구, 재생, 복원, 재구성 또는 팽화를 의미하고자 하는 의도이다.

본 발명의 1 이상의 구체예에 대한 상세 설명은 이하에 기술한다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점은 이하 설명 및 청구항을 통해 분명해진다.

본 발명은 적어도 부분적으로, 일정 조성물이 연골을 복구시키는데 사용될 수 있다는 예상치않은 발견을 기초로 한다.

조성물

연골을 복구시키는데 사용될 수 있는 조성물은, 이에 제한되는 것은 아니고, 형성성 조성물, 건조 블렌드 조성물, 및 플러그를 포함한다.

형성성 조성물은 탈회 골기질(DBM)을 약 20 중량%∼약 40 중량%, 바람직하게 약 25 중량%∼약 40% 또는 약 25 중량%∼약 35%, 보다 바람직하게 약 30 중량%∼약 40%, 가장 바람직하게 약 30 중량%∼약 35 중량%로 포함할 수 있다. DBM과 히알루론산 염 간 중량 비율은 약 1:1 내지 약 25:1, 또는 약 2:1 내지 약 20:1, 또는 약 2:1 내지 약 15:1, 또는 약 2.5:1 내지 약 7.5:1 범위일 수 있다.

형성성 조성물은 또한 생물학적으로 적합한 액체 성분, 예컨대 물 또는 염수를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 액체 성분은 락트산 링거액(LRS)일 수 있다. 다른 구체예에서, 액체 성분은 생리학적으로 허용되는 완충 염수액 예컨대 인산 완충 염수액(PBS)을 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 형성성 조성물은 액체 성분을 약 40 중량%∼약 72 중량%(예를 들어, 약 45 중량%∼약 66%, 또는 약 50 중량%∼약 66%, 또는 약 60 중량%∼약 66%, 또는 약 62 중량%∼약 65%)로 포함할 수 있따. 일부 구체예에서, 액체 성분은 유기 용매가 실질적으로 없다. 유기 용매의 예로는 에탄올, 이소프로판올, N-메틸피롤리돈, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 저분자량 폴리에틸렌글리콜, 및 DMSO 등이 포함된다.

형성성 조성물은 히알루론산 염을 약 3.5% 이상(예를 들어, 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 9% 이상, 약 12% 이상, 또는 약 15% 이상, 또는 약 20 중량% 이상)으로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 약 6 중량% 이상의 히알루론산 염을 포함한다.

일부 구체예에서, 형성성 조성물은 히알루론산 염을 약 3.5 중량%∼약 25 중량%(예를 들어, 약 5 중량%∼약 25 중량%, 약 6 중량%∼약 25 중량%, 약 9 중량%∼약 25 중량%)로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 형성성 조성물은 히알루론산 염을 약 3.5 중량%∼약 20 중량%(예를 들어, 약 5 중량%∼약 20 중량%, 약 6 중량%∼약 20 중량%, 약 9 중량%∼약 20 중량%)로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 형성성 조성물은 히알루론산 염을 약 3.5 중량%∼약 15 중량%(예를 들어, 약 5 중량%∼약 15 중량%, 약 6 중량%∼약 15 중량%, 또는 약 9 중량%∼약 15 중량%)로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 히알루론산 염을 약 3.5 중량%∼약 10 중량%(예를 들어, 약 5 중량%∼약 10 중량%, 약 6 중량%∼약 10 중량%, 또는 약 9 중량%∼약 10 중량%)로 포함할 수 있다. 일정 구체예에서, 형성성 조성물은 약 3.5 중량%∼약 9 중량%(예를 들어, 약 5 중량%∼약 9 중량% 또는 약 6 중량%∼약 9 중량%)의 히알루론산 염을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 형성성 조성물은 인스트론 시린지 압출력(ISEF) 테스트를 수행시 압출력이 약 12.0 내지 약 30.0 뉴톤으로 나타난다. 예를 들어, 형성성 조성물은 압출력이 약 14.0 내지 약 26.0 뉴톤(예를 들어, 약 14.0 내지 약 23.0 뉴톤, 또는 약 14.0 내지 약 21.0 뉴톤, 또는 약 14.0 내지 약 19.0 뉴톤, 또는 약 14.0 내지 약 16.0 뉴톤)일 수 있다. 다른 구체예에서, 형성성 조성물은 압출력이 약 16.0 내지 약 26.0 뉴톤(예를 들어, 약 18.0 내지 약 26.0 뉴톤, 또는 약 20.0 내지 약 26.0 뉴톤, 또는 약 22.0 내지 약 26.0 뉴톤)일 수 있다.

일부 구체예에서, 형성성 조성물은 유동성 개질제, 예를 들어, 글리세롤 또는 카르복시메틸 셀룰로스를 더 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 히알루론산 염은 평균 분자량이 약 500,000 달톤(Da) 이상(예를 들어, 약 0.8 MDa 이상, 약 1.0 MDa 이상, 약 1.2 MDa 이상, 약 1.5 MDa 이상, 약 1.8 MDa 이상, 또는 약 2.0 MDa 이상)이다.

조성물이 건조 블렌드 조성물인 경우, 건조 블렌드 조성물은 약 60 중량%∼약 92 중량%(예를 들어, 약 70 중량%∼약 92 중량%, 약 80 중량%∼약 92 주량%, 85 중량%∼약 92 중량%, 또는 약 90 중량%∼약 92 중량%)의 DBM을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 건조 블렌드 조성물은 약 3.5 중량%∼약 38 중량%(예를 들어, 약 4 중량%∼약 38 중량%, 약 6 중량%∼약 38 중량%, 약 9 중량%∼약 38 중량%, 약 9 중량%∼약 30 중량%, 약 9 중량%∼약 25 중량%, 약 9 중량%∼약 20 중량%)의 히알루론산 염을 포함할 수 있다. 구체예에서, 건조 블렌드 조성물은 약 3 중량%∼약 10 중량%(예를 들어, 약 3 중량%∼약 9 중량%, 약 3 중량%∼약 7 중량%, 약 3 중량%∼약 5 중량%)의, DBM과 히알루론산 염 둘모두로부터 유래되는 잔류 수분을 포함할 수 있다.

조성물이 플러그로서 제조되는 경우, 플러그 내 DBM의 양은 전체 조성물의 25 중량%∼약 88 중량%(예를 들어, 약 35 중량%∼약 88 중량%, 약 55 중량%∼약 88 중량%, 약 60 중량%∼약 88 중량%, 약 65 중량%∼약 88 중량%, 약 75 중량%∼약 88 중량%, 또는 약 85 중량%∼약 88 중량%) 범위일 수 있다.

플러그 중 히알루론산 염의 양은 전체 조성물 중 약 3.5 중량%∼약 38 중량%(예를 들어, 약 5 중량%∼약 38 중량%, 또는 약 6 중량%∼약 38 중량%, 약 6 중량%∼약 28 중량%, 약 6 중량%∼약 24 중량%, 약 6 중량%∼약 18 중량%, 또는 약 6 중량%∼약 15 중량%, 또는 약 7 중량%∼약 15 중량%) 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, 히알루론산 염의 중량은 전체 조성물 중 약 6 중량% 이상(예를 들어, 약 7 중량% 이상, 약 15 중량% 이상, 또는 약 20 중량% 이상)이다. 일부 구체예에서, 플러그는 생물학적으로 적합한 액체를 약 3 중량%∼약 20 중량%, 예를 들어 10 중량% 이하로 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 생물학적으로 적합한 액체는 물일 수 있다. 예를 들어, 생물학적으로 적합한 액체는 약 3 중량%∼약 20 중량%(예를 들어, 약 5 중량%∼약 10 중량%, 약 5 중량%∼약 15 중량%)일 수 있는 잔류 수분이다. 잔류 수분 또는 다른 저휘발성 용매는 건조 방법 시 손실을 통해 측정될 수 있다. 일정 구체예에서, 건조시 손실은 약 3 중량%∼약 20 중량%(예를 들어, 약 3 중량%∼약 17 중량%, 약 5 중량%∼약 12 중량%, 약 5 중량%∼약 10 중량%)이다.

형성성 조성물, 건조 블렌드 조성물, 및 플러그 중 DBM의 적절한 입자 크기는 약 70 미크론∼약 850 미크론, 예를 들어, 약 150 미크론∼약 800 미크론 또는 200 미크론∼약 800 미크론 범위일 수 있다. 히알루론산 염의 적절한 입자 크기는 약 600 미크론, 또는 약 500 미크론, 또는 약 400 미크론일 수 있다.

일부 구체예에서, 형성성 조성물 중 히알루론산 염은 평균 분자량이 약 500,000 달톤 이상(예를 들어, 약 0.8 MDa 이상, 약 1.0 MDa 이상, 약 1.2 MDa 이상, 약 1.5 MDa 이상, 약 1.8 MDa 이상, 또는 약 2.0 MDa 이상)이다. 일부 구체예에서, 건조 조성물 또는 플러그 내 히알루론산 염은 평균 분자량이 약 200,000 달톤 이상(예를 들어, 약 0.4 MDa 이상, 약 0.6 MDa 이상, 약 0.8 MDa 이상, 약 1.0 MDa 이상, 또는 약 1.2 MDa 이상)일 수 있다.

본 발명의 조성물은 형성성 조성물, 건조 블렌드 조성물, 또는 플러그일 수 있다.

조성물은 2종 이상의 히알루론산 염의 혼합물, 예를 들어, 2종의 히알루론산 염의 혼합물 또는 2종 보다 많은(예를 들어, 3종 또는 4종) 히알루론산 염의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 제1 평균 분자량의 히알루론산 염 및 제2 평균 분자량의 히알루론산 염을 포함하는, 2종의 히알루론산 염의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 0.05∼1.0 밀리온 달톤(MDa)(예를 들어, 약 0.05 MDa, 약 0.1 MDa, 약 0.3 MDa, 약 0.6 MDa, 약 0.8 MDa, 또는 약 1.0 MDa)이다.

일부 구체예에서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 0.1∼1.0 밀리온 달톤이다. 일부 구체예에서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 0.3∼1.0 밀리온 달톤이다. 일정 구체예에서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 0.3∼0.8 밀리온 달톤, 예를 들어, 약 0.3∼0.6 밀리온 달톤이다.

일부 구체예에서, 제2 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 1.0∼5.0 밀리온 달톤(MDa)(예를 들어, 약 1.0 MDa, 약 1.4 MDa, 약 2.0 MDa, 약 2.5 MDa, 약 3.0 MDa, 약 4.0 MDa, 또는 약 5.0 MDa)이다.

일부 구체예에서, 제2 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 1.2∼4.0 밀리온 달톤이다. 일정 구체예에서, 제2 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 1.0∼3.0 밀리온 달톤이다. 예를 들어, 제2 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 1.0∼2.0 밀리온 달톤, 예를 들어, 약 1.0∼1.4 밀리온 달톤일 수 있다.

본 발명의 조성물은 제1 평균 분자량의 히알루론산 염 및 제2 평균 분자량의 히알루론산 염을 포함하는, 2종의 히알루론산 염의 혼합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 측면에서, 조성물 중 2종의 히알루론산 염은 조성물의 유동성을 조작할 수 있게 한다.

일부 구체예에서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 0.05∼1.0 밀리온 달톤일 수 있고, 제2 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 1.0∼5.0 밀리온 달톤일 수 있다. 예를 들어, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 0.1∼1.0 밀리온 달톤일 수 있고, 제2 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 1.0∼3.0 밀리온 달톤일 수 있다. 일정 구체예에서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염은 0.3∼0.8 밀리온 달톤일 수 있고 제2 평균 분자량의 히알루론산 염은 1.0∼2.0 밀리온 달톤일 수 있다. 다른 구체예에서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염은 0.3∼0.6 밀리온 달톤일 수 있고 제2 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 1.0∼1.6 밀리온 달톤일 수 있다. 예를 들어, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염은 0.4∼0.6 밀리온 달톤일 수 있고 제2 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 1.1∼1.6 밀리온 달톤일 수 있다.

제1 평균 분자량의 히알루론산 염 대 제2 평균 분자량의 히알루론산 염의 중량 비율은 약 1:5 내지 약 5:1(예를 들어, 약 1:5, 약 1:2, 약 1:1, 약 2:1, 약 3:1, 약 4:1, 또는 약 5: 1)일 수 있다. 일부 구체예에서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염 대 제2 평균 분자량의 히알루론산 염의 중량 비율은 약 1:4 내지 약 4:1(예를 들어, 약 1:3 내지 약 1:1, 또는 약 1:1 내지 약 3:1)일 수 있다. 일정 구체예에서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염 대 제2 평균 분자량의 히알루론산 염의 중량 비율은 약 1:3 내지 약 1:1일 수 있다.

일부 구체예에서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염과 제2 평균 분자량의 히알루론산 염 간 평균 분자량 차이는 약 0.5 밀리온 달톤(MDa) 이상(예를 들어, 약 0.5 MDa 이상, 약 0.7 MDa 이상, 약 0.9 MDa 이상, 또는 약 1.2 MDa 이상)이다.

조성물은 약학적 활성 성분을 더 포함할 수 있다. 약학적 활성 성분은골 형성능 단백질, 조직 성장 인자, 인슐린 성장 인자, 항산화제, 항생제, 또는 이의 조합일 수 있다.

조성물은 뼈 및 연골의 형성을 유도할 수 있는 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 골 형성능 단백질, 예컨대 BMP-2, BMP-4, BMP-6, 및 BMP-7 등이다.

조성물은 또한, 조직 성장 인자, 예를 들어, TGF-β의 유효량(천연적으로 존재하거나 또는 의도적으로 부가)을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 인슐린 성장 인자, 예를 들어, IGF-1을 가질 수 있다. 일정 구체예에서, 조성물은 항산화제를 가질 수 있다. 예시적인 항산화제에는 아스코르베이트, 피루베이트, 및 BHT가 포함된다. 다른 구체예에서, 조성물은 항생제 예컨대 젠타마이신 및 반코마이신을 포함할 수 있다.

조성물은 조직 성장을 촉진하는데 유효한 양으로 2 이상의 약학적 활성 성분의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 골 형성능 단백질과 조직 성장 인자의 혼합물, 예를 들어, TGF-β와 BMP-2의 혼합물, 또는 인슐린 성장 인자와 조직 성장 인자의 혼합물, 예를 들어, TGF-β와 IGF-1의 혼합물일 수 있다.

조성물은 또한, 본원에 기술된 병태용 또는 일부 다른 병태용이건 무관하게, 다른 치료제, 예를 들어, 통증 경감제를 포함할 수 있다.

이들 예는 단지 예시 목적이며 문헌에 기술된 임의의 다른 제제들을 사용할 수도 있다.

약학적 활성 성분이 조성물에 사용되는 경우, 이들은 분말 형태인 히알루론산 염 및 탈회 골기질(DBM)과 간단히 혼합되거나 또는 액체 성분과 블렌딩될 수 있다. 다르게, 약학적 활성 성분은 또한 히알루론산 염과 접합될 수 있다.

본원에서 사용되는, 탈회 골기질(DBM)은 당분야의 숙련가에게 잘 알려진 방법들을 이용해 제조될 수 있다. 일반 합성법은 문헌, 예를 들어, [Yee et al. Spine (2003), 28 (21) and Colnot et al. Clinical Orthopaedics and Related Research (2005), (435), 69-78]에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 탈회 골기질(DBM)은 동종 뼈의 산추출에 의해, 대부분의 미네랄 성분이 손실되지만 성장 인자를 포함하여, 콜라겐과 비콜라겐 단백질은 보유시켜 제조될 수 있다. DBM은 분쇄된 과립, 분말 또는 조작으로서 처리될 수 있다. 이는 과립, 겔, 스폰지재 또는 퍼티로서 사용을 위해 제제화될 수 있고 보관을 위해 냉동 건조될 수 있다. 부가적으로, DBM은 예컨대 Tissue Banks International(TBI)(캘리포니아주, 산 라파엘 소재) 또는 Exactech(플로리다주, 게인스빌 소재) 등의 공급처에서 얻을 수 있다.

히알루론산은 반복되는 D-글루쿠로네이트 및 N-아세틸글루코사민 디사카라이드 유닛을 포함하는 선형의 장쇄 다당류이다. 이는 예를 들어, 동물 조직, 예컨대 수탉의 닭벼슬 및 탯줄로부터 추출하거나(Klein, J., & Meyer, F. A., 1983, Biochem. & Biophys. Acta, 755(3), 400∼411), 또는 박테리아 종, 예컨대 스트렙토코커스로부터 히알루론산 캡슐 물질을 분리하여(Van Brunt, J., 1986, Biotechnology, 4, 780∼782) 얻을 수 있다.

히알루론산은 원하는 분자량 감소가 일어날 수 있게 감마선 조사가 추가로 가해질 수 있다(Miller, R. & Shiedlin, A. U.S. 특허 제6,383,344호). 일부 구체예에서, 히알루론산은 실질적으로 물에 가용성이다.

히알루론산은 개질된 히알루론산일 수 있다. 예를 들어, 히알루론산의 글루쿠론산 부분의 카르복실 기를 치환된 아미드 기로 전환시킬 수 있다. 상기 치환된 아미드 기의 적절한 치환체는 아미노알킬 기(1 이상, 즉, 예를 들어 1 내지 8개, 바람직하게는 1 내지 3개의 히드록실 기)로 치환될 수 있는 알킬렌 사슬); 아미노(폴리알킬렌옥시)알킬 기; 아미노(폴리알킬렌아미노)알킬 기; 머캅토(폴리알킬렌아미노)알킬 기; 아크릴로일옥시알킬 기; 아크릴로일아미노알킬 기; 및 아크릴로일아미노(폴리알킬렌옥시)알킬 기를 포함할 수 있다.

또한, 개질된 히알루론산은 또한 보통은 분자량이 높은 가교된 히알루론산일 수도 있다. 고분자량의 히알루론산은 강화된 그 점탄성때문에 보다 효과적일 수 있다.

생리적 pH에서, 히알루론산은 염일 수 있다. 히알루론산 염이 무기 염기, 예컨대 알칼리 금속(예를 들어, 리튬, 나트륨, 또는 칼륨) 또는 알칼리토 금속(마그네슘 또는 칼슘)과의 염인 경우, 이러한 염은 예를 들어, 히알루론산을 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속을 함유하는 염기와 반응시켜 쉽게 얻어진다. 히알루론산 염(예를 들어, 은 염)은 또한 미국 특허 제4,784,991호 및 제5,472,950호에 개시된 방법으로 제조될 수 있다 또한, 히알루론산 염은 다양한 공급처에서 구매할 수 있다.

조성물은 개질 또는 천연 다당류, 예컨대 키토산, 키틴, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 헤파린 및 헤파린 설페이트 등을 더 포함할 수 있다.

조성물은 천연, 재조합 또는 합성 단백질 예컨대 가용성 콜라겐 또는 가용성 젤라틴 또는 폴리아미노산, 예컨대 폴리리신 등을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 조성물은 임의의 지질은 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, 조성물은 지질을 12 중량% 미만(예를 들어, 10 중량% 미만, 또는 8 중량% 미만, 또는 5 중량% 미만, 또는 3 중량% 미만)으로 포함한다.

사용 방법

본 발명의 조성물은 피험체에서 연골을 복구시키는데 사용될 수 있다. 조성물은 피험체에게 연골 조직의 결함 부위 또는 뼈와 연골 결함의 조합 예컨대 골연골 결함부에 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 뼈 또는 다른 조직 예컨대 반달연골, 인대, 힘줄, 및 추간판환의 결함을 복구하는데 사용될 수 있다. 유효 용량은 예컨대 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중 및 일반적 상태 등의 인자들에 따른 참관 임상의의 판단과, 치료하려는 질환 상태에 따라 좌우된다.

환자에 투여되는 조성물은 본원에 기술된 약학 조성물(예를 들어, 형성성 조성물, 건조 블렌드 조성물, 또는 플러그)의 형태일 수 있다. 그러한 이유로, 건조 블렌드 및 플러그는 사용 전에 생물학적 유체로 수화될 수 있다. 수화된 조성물의 pH는 바람직하게 6.5 내지 7.8, 또는 바람직하게 6.8 내지 7.4이다. 조성물은 통상의 멸균법으로 멸균되거나, 또는 멸균 여과될 수 있다. 조성물은 그대로 사용을 위해 포장되거나, 또는 동결건조될 수 있고, 동결건조된 조성물은 투여 전 멸균된 액체 성분과 배합된다.

본 발명의 조성물은 연골 복구가 필요한 부위 및/또는 조직에 직접 적용될 수 있다. 일부 구체예에서, 신체에서 치료 부위는 비정상 조직을 제거하는 것에 의해 외과적으로 준비된 후, 결손 부위에 본 발명의 조성물을 위치시킬 수 있다. 다르게, 외과적 준비는, 세포 또는 골수가 플러그 또는 퍼티로 이동하기 위한 채널을 생성시키기 위해 인접한 조직 영역 또는 혈관 영역에 대한 피어싱, 마모 또는 드릴링을 포함한다. 본 발명의 조성물은 골연골 결함부, 또는 미세골절을 포함하는 결함부, 또는 연골 결함부를 채우는데 사용될 수 있다.

조성물의 제조

조성물 제조에서, DBM과 히알루론산 염 둘 모두는 다른 성분과 배합되기 전에, 적절한 입자 크기, 예를 들어, 600 미크론 이하 또는 850 미크론 이하로 제공되도록 밀링될 수 있다.

DBM 및 히알루론산 염은 공지의 밀링법 예컨대 건식 또는 습식 밀링법을 사용하여 밀링되어 퍼티 또는 플러그 및 다른 제형 유형에 적절한 입자 크기로 얻어진다. 본 발명의 화합물의 미분 조제물은 당분야에 공지된 방법, 예를 들어, 국제 공개 특허 출원 WO 2002/000196에 개시된 방법으로 제조될 수 있다.

본 발명의 형성성 조성물은 히알루론산 염 및 탈회 골기질(DBM)의 건조 블렌드를 액체 성분(예를 들어, PBS)과 혼합하여 제조될 수 있다. 본 발명의 중요한 측면에서, 히알루론산 염 및 DBM을 포함하여, 모든 고체 분말 성분은, 액체 성분, 예를 들어, PBS를 부가하기 전에, 사전혼합된다.

히알루론산 염 및 탈회 골기질(DBM)은 약 10∼24 시간(예를 들어, 약 10 시간, 약 12 시간, 약 18 시간, 약 20 시간, 또는 약 24 시간) 동안 사전혼합되어 DBM과 히알루론산 염의 균질 혼합물을 포함하는 고체 조성물을 형성시킬 수 있다. 조성물이 균질하다는 것은, 대체로 조성물 전체에 성분들이 균일하게 분산되어, 이 조성물이 동일하게 유효한 단위 용량 제형으로 쉽게 세분될 수 있다는 것이다. 2종 이상의 히알루론산 염의 혼합물이 조성물에 사용되는 경우, 모든 히알루론산 염은 DBM과 사전혼합된다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 혼합은 균질한 분말 혼합물이 형성될 때까지 기계적으로(예를 들어, 고속 진탕기, 예컨대 Turbula T2F) 수행될 수 있다. 액체 성분, 예컨대 PBS은 균질한 분말 혼합물에 부가될 수 있다. 얻어진 혼합물은, 예컨대 고속 진탕기에서, 추가 약 12∼36 시간(예를 들어, 약 12 시간, 약 20 시간, 약 24 시간, 약 30 시간, 또는 약 36 시간) 동안 혼합될 수 있다. 일부 구체예에서, 액체 성분은 DBM 및 히알루론산 염(들)이 혼합된 직후에 부가될 수 있다. 다른 구체예에서, 액체 성분은 의도하는 사용 직전에 부가될 수 있다.

본 발명의 다른 중요한 측면은, 분자량이 다른 2종의 히알루론산 염을 이용하여 유동성 및 생물학적 특성이 개선되고 제어된 페이스트/퍼티를 만들 수 있다는 것이다. 직접 최종 조성물에 또는 혼합 공정 동안 조성물에 물질을 부가하는 것에 의해 본 발명의 교시를 활용해 다수의 의학적으로 유용한 물질을 제조할 수 있다. 인시츄 약물 전달을 위한 비히클로서 DBM 및 히알루론산 염(들)의 혼합물을 사용하기 위해, 약물을 DBM과 히알루론산 염(들)의 분말과 혼합하고 이어서 조성물을 수화시킬 수 있다. 다르게, 약물을 액체 성분, 예컨대 PBS와 혼합한 후, 사전 혼합된 분말 조성물에 부가할 수 있다. 또한, 약물을 히알루론산 염(들)과 접합시킨 후, 조성물에 부가할 수 있다.

본 발명의 방법은 조성물 중 히알루론산 염의 농도가 약 3.5% 이상인 유용한 뼈 퍼티 또는 페이스트의 제조를 가능하게 한다. 고농도의 히알루론산 염을 사용하는 장점으로는 페이스트의 점탄성 개선이 포함된다. 또한, 본 발명의 방법으로 제조되는 퍼티 또는 페이스트는 우수한 응집성 및 최소 접착성을 보인다. 예를 들어, 퍼티는 라텍스 글로브에 접착하지 않고 취급 과정 동안 응집성을 유지하며, 부서지거나 또는 "작환(pill)"되지 않는다. 또한, 우수한 가단성(malleability)도 역시 관찰되었다. 예를 들어, 다양한 형상(예를 들어, 구형)으로 성형될 수 있고, 의도하는 형상을 유지할 수 있다. 일부 구체예에서, 퍼티는 이식 전에 줄기 세포 또는 골수 세포와 사전혼합된다. 일부 구체예에서, 조성물은 결함부에서 퍼티를 조작함으로써 결함부로 이식된다. 다른 구체예에서, 조성물은 시린지 바늘을 통한 주사에 의해 결함부로 이식된다.

본 발명의 조성물은 플러그로서 제조될 수도 있다. 플러그는 뼈 또는 연골의 복구 및 대체를 위해 고유하게 디자인된, 생흡수성(bioresorbable) 스캐폴드이다. 본 발명에 따른 HA 및 DBM의 조합을 이용하여, 이 물질은 뼈/연골 유입 및 리모델링을 지원하기 위한 고도의 다공성 스케폴드로 디자인된다. 이는 유체 및 영양분을 흡수하여 생물학적으로 친밀하며 골수가 스캐폴드로 들어가게 고유하게 디자인된다.

플러그는 습식 관절경 무릎 수술 동안 스캐폴드 전달에 보다 편리한 수단을 제공할 수 있다. 탈회 골기질(DBM) 및 히알루론산 염을 포함하는 다공성의, 골전도 구조의 플러그는 HA와 DBM를 혼합한 후 이 분말 혼합물을 수화하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 플러그는 플러그 성능을 최적화하고 골연골 결함부에 적합화시키기 위한, 고객맞춤 디자인된 몰드에서, 동결건조 또는 다른 건조 공정을 통해 DBM과 히알루론산 염의 혼합물로부터 제조될 수 있다. 플러그는 DBM과 히알루론산 염의 건조 제형이므로 실온에서 안정성이 강화된다. 일부 구체예에서, 플러그는 가소제를 포함할 수 있다. 바람직한 가소제는 글리세롤 또는 PEG일 수 있다. 가소제는 분말 혼합물, 예를 들어 탈회 골기질 및 히알루론산 염과 혼합될 수 있다. 일부 구체예에서, 플러그는 이식 전에 줄기 세포 또는 골수와 사전혼합된다.

본원에 개시된 발명을 보다 효과적으로 이해할 수 있도록, 이하에 실시예를 제공한다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적이며 임의 방식으로 본 발명을 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다.

실시예 1-3: 골 퍼티 또는 페이스트의 제조

실시예 1

재료:

히알루론산 염(HA) 분말을 Genzyme Corporation의 스트렙토코커스 주우에피더미커스(Streptococcus zooepidemicus) 발효물로부터 정제하였다: MW=1.2 MDa, 물리적 형태(미분) 탈회 골기질(DBM)은 Tissue Banks International(TBI)(캘리포니아주, 산 라파엘 소재)에서 받았다.

방법 1:

2.4 그램의 HA 및 21.4 mL의 액체 성분, PBS를 24 시간 동안 고속 진탕기(Turbula T2F, Glen Mills Inc., 뉴저지주, 클리프톤 소재)에서 사전혼합하였다. 24 시간 혼합 후, 균질한 히드로겔을 제조하였다. 이 시점에, 12 그램의 DBM을 부가하였다. 이 공정 종료시, 조성물이 퍼티(HA/DBM 도우 조성물)를 형성하지는 않았으나, 모든 DMB이 혼입되지 않는 불균일한 혼합물로 보였다.

방법 2:

12 그램의 DBM 및 2.4 그램의 HA를 12 시간 동안 분말로서 고속 진탕기(Turbula T2F)에서 사전혼합하여 균질한 분말 믹스를 제조하였다. 이 시점에, 21.4 mL의 액체 성분, PBS을 부가하고 용기를 추가 24시간 동안 고속 진탕기로 돌려보냈다. 공정 종료시, 라텍스 고무에 대한 최소 접착성과 우수한 응집성을 갖는 균질한 퍼티(HATJBM 도우 조성물)가 얻어졌다.

실시예 1에서 사용된 HA/DBM 퍼티의 조성
HA MW	HA	DBM	PBS	총합
1.2 MDa	2.4 그램	12 그램	21.4 그램	35.8 그램

실시예 1의 퍼티 중 HA와 DBM 및 조성물 중 HA의 계산 농도
[HA]^* w/w	[DBM] w/w	[PBS] w/w
6.7%	33.5%	59.8%
* 퍼티(HA+DBM+PBS)에서의 농도

실시예 1, 방법 1에서, 퍼티는 먼저 HA를 PBS에 용해시킨 후 퍼티가 형성되도록 DBM에 혼합시켜 제조되었다. 결과는 불균질한 펴티가 형성된 것으로 나타났다. DBM의 일부가 퍼티로 혼입되지 않았을 수 있다. 또한, DBM의 일부가 PBS로 습윤되지 않았다. 이는 아마도 HA와 DBM 간에 발생한 경쟁적인 물 흡수때문인 듯 하다. 실시예 1, 방법 2에서, 퍼티는 먼저 HA 및 DBM 분말을 균일하게 분산시킨 후, PBS를 부가하여 제조되었다. 이 결과 균일한, 응집성의 가단가능한 퍼티가 얻어졌다.

실시예 2

재료:

히알루론산 염(HA) 분말을 Genzyme Corporation의 스트렙토코커스 주우에피더미커스 발효물로부터 정제하였다: MW=1.2 MDa, 물리적 형태(미분). HA 분말을 Genzyme Corporation의 스트렙토코커스 주우에피더미커스 발효물로부터 정제한 후 감마선 조사하여 분자량을 500 kDa의 물리적 형태(미분)로 감소시켰다(Miller, R. & Shieldlin, A. US 특허 제6,383,344호). 탈회 골기질은 Tissue Banks International(TBI)(캘리포니아주, 산 라파엘 소재)에서 받았다.

방법: 12 그램의 DBM 및 2 그램의 HA 분자량 1.2 MDa 및 1 그램의 HA 분자량 500 kDa을 12 시간 동안 분말로서 고속 진탕기(Turbula T2F)에서 사전혼합하여 균질한 분말 믹스를 만들었다. 이 시점에, 21.4 mL의 액체 성분 PBS를 부가하고 용기를 추기 24시간 동안 고속 진탕기로 다시보냈다. 공정 종료시, 라텍스 글로브에 대한 접착성이 최소이고 응집성이 우수한 퍼티(HA/DBM 도우 조성물)가 얻어졌다.

실시예 2에서 사용된 HA/DBM 퍼티의 조성
HA MW = 0.5 MDa	HA MW = 1.2 MDa	DBM	PBS	총합
1 그램	2 그램	12 그램	21.4 그램	36.4 그램

실시예 2의 퍼티 중 HA와 DBM 및 조성물 중 HA의 계산 농도
[HA]^** w/w	[DBM] w/w	[PBS] w/w
8.24%	33%	58.76%
** 퍼티(HA+DBM+PBS)에서의 농도

실시예 2에서는, 조성물 중 14% HA를 이용하여 라텍스 글로브에 대한 접착성이 최소이고 응집성은 우수한 퍼티가 얻어졌다. 또한, 이 조성물은 2종의 HA 분자량, 0.5 및 1.2 MDa HA를 사용하였다. 2가지 분자량의 HA 성분을 혼합하여 유동성 조작이 가능해졌다.

실시예 3

재료:

히알루론산 염(HA) 분말을 Genzyme Corporation의 스트렙토코커스 주우에피더미커스 발효물로부터 정제하였다: MW=1.2 MDa, 물리적 형태(미분). HA 분말을 Genzyme Corporation의 스트렙토코커스 주우에피더미커스 발효물로부터 정제한 후 감마선 조사하여 분자량을 500 kDa의 물리적 형태(미분)로 감소시켰다(Miller, R. & Shieldlin, A. U.S. 특허 제6,383,344호). 탈회 골기질은 Tissue Banks International(TBI)(캘리포니아주, 산 라파엘 소재)에서 받았다.

방법:

9 그램의 DBM, 1.9 그램의 HA 분자량 1.2 MDa 및 0.85 그램의 HA 분자량500 kDa을 12 시간 동안 분말로서 고속 진탕기(Turbula T2F)에서 사전혼합하여 균질한 분말 믹스를 만들었다. 0.9 그램(1.4 mL)의 혼합 분말을 웨이트 보트에 넣고 1.5 그램의 PBS를 부가하였다. 부가 이후, 분말과 PBS는 균질한 퍼티가 얻어질때까지(30초) 스파츌라를 사용해 혼합하였다.

실시예 3에서 사용된 HA/DBM 분말의 조성
HA MW = 0.5 MDa	HA MW = 1.2 MDa	DBM	[HA] w/w	[DBM] w/w
0.85 그램	1.9 그램	9 그램	23%	77%

실시예 3에서 사용된 HA/DBM 퍼티의 조성
HA	DBM	PBS	[HA] w/w	[DBM] w/w
0.21 그램	0.69 그램	15 그램	8.75%	29%

실시예 3에서, HA/DBM 믹스 중 23% HA를 사용하여 응집성이 우수하고 라텍스 글로브에 대한 접착성이 최소인 퍼티를 얻었다. 분말을 혼합한 후, 원하는 유동성을 갖는 페이스트를 얻기 위해 필요에 따라 PBS를 부가하였다. 또한, 이 조성물에서는 2종의 HA 분자량, 0.5 및 1.2 MDa HA를 사용하였다. 2가지 분자량의 HA 성분을 혼합하여 유동성 조작이 가능하였다.

실시예 4: 허용되는 퍼티에 대한 압출력 및 압출력의 측정

HA/DBM의 기계적 특성을 특징규명하기 위한 추가 테스트를 진행하였다. 퍼티의 특성을 규명하기 위해 인스트론 시린지 압출력 테스트를 사용한다. 이 테스트에서는, 일정한 속도로, 직경이 8.6 mm인 3 mL 시린지와 15 게이지 1-1/2 바늘을 통하여 물질을 미는데 요구되는 힘을 측정한다. 이러한 압출력은 평탄역에 도달할때까지 0.5 mm/sec의 속도로 압축 동안 측정되었다(도 1 참조). 5종의 HA/DBM 제형을 측정하였고 DBX™(시판되는 DBM; Synthes, 펜실베니아주 소재)와 비교하였다.

도 1:

실시예 5: HA - DBM 플러그 제형의 흡수성

HA-DBM 퍼티는 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조하거나 또는 루어-락 시린지 커넥터가 있는 2개 시린지에서 액체 성분 PBS와 HA-DBM 분말을 수동으로 혼합하여 제조하였다. 균질한 퍼티를 원하는 치수의 Teflon 몰드에 충전시켰다. 성형된 퍼티를 몰드 내에서 -8O℃에서 4시간 동안 냉동시킨 후 밤새 동결건조하였다. 얻어진 HA-DBM 건조 플러그를 Teflon 몰드로부터 분리하였다.

스캐폴드로 골수를 유입시키는 플러그의 능력을 최적화하기 위해, 다양한 플러그 제형의 흡수성을 이하의 방법으로 테스트하였다.

방법: 1 cc 시린지 양 말단을 절단하고, 105∼149 ㎛ 폴리프로필렌 메쉬를 시린지의 한쪽 말단에 부착하였다. 한 HA-DBM 플러그를 각 시린지에 위치시키고 플러그의 초기 높이를 기록하였다. 시린지를 15 mL 코니칼 튜브에 넣고 단지 시린지의 아래쪽 말단(필터가 부착된 말단)을 덮기 위해 PBS 중 염료를 상기 튜브에 넣었다. 샘플을 37℃에 두었다. 각 플러그로의 염료 이동을 7일의 기간 동안 기록하였다. 플러그로 100% 염료가 흡수될 때까지의 시간을 이용해 다양한 제형에 대한 흡수율을 비교하였다.

제형 [DBM]	제형 [HA], HA MW	100% 흡수까지 시간
97%	3%, 450 kDa	< 30 분
94%	6%, 450 kDa	4-5 시간
88%	12%, 450 kDa	> 24 시간

이 데이타로부터, 느린 흡수율은 고분자량 HA 및/또는 고농도의 HA가 원인인 것으로 보인다.

실시예 6: HA - DBM 플러그 제형의 팽창

생체 내에서 DBM의 최대 농도를 유지시키기 위해, 팽창이 최소인 플러그가 바람직하다. 팽창율을 측정하기 위해, 상이한 플러그 제형을 하기 방법으로 테스트하였다.

방법: 1 cc 시린지의 양 말단을 절단하고 시린지의 한쪽 말단에 5 ㎛ 폴리프로필렌 메쉬를 접착시켰다. 한 HA-DBM 플러그를 각 시린지에 넣고 플러그의 초기 높이를 기록하였다. 시린지를 15 mL 코니칼 튜브에 넣고 PB를 튜브 및 시린지 내부에 넣었다. 샘플을 37℃에 두었다. 각 플러그의 높이를 72시간 동안 기록하였다. 플러그의 높이 차이를 사용하여 팽창율을 계산하였다.

이 데이타로부터, 팽창율 증가는 고분자량 HA가 원인인 것으로 보인다. HA의 농도가 HA-DBM 플러그의 팽창에 또한 영향을 줄 수 있다.

실시예 7: HA / DBM 플러그 제형의 관절경 전달 평가

취급조작 동안 보전성을 유지하는 플러그의 능력을 이하의 방법으로 테스트하였다.

방법: 합성, 연계 슬관절을 사용하여 관절경 전달 조건을 모의하였다. 표준 관절경 장비를 사용해 무릎에 접근 포트를 생성시키고 관절낭에서 시술과정을 시각화하였다. 표준 유체 관리 장치를 사용하여 관절낭에서의 유속을 제어하고 필요에 따라 관절낭을 팽창시켰다. 골연골 결함을 내측 및 대퇴 관절부 상에 생성시켰다. HA/DBM 플러그를 튜브 및 플런저 디바이스에 충전시켰다. 다바이스의 말단부를 캐뉼라를 통해 관절 공간에 도입시키고 결함부에 정렬시켰다. 이 시점에, 일정한 유체 흐름을 개시하고 플런저를 전진시켜서 골연골 결함부에 HA/DBM 플러그를 이식하였다. 플러그는 이식 동안과 그 이후(5∼60분) 유체 흐름 조건 하에서 보전성 및 체류성을 평가하였다.

테스트 결과(표 10), HA 농도는 6%이고 분자량은 200,000 달톤인 플러그 제형은 일정한 흐름 하에서 적용부위를 이탈한 것으로 나타났다. 대조적으로, HA 농도가 6% 이상이고 분자량은 450,000 달톤 이상인 플러그는 일정한 유체 흐름 하에서 적용 부위에 성공적으로 체류하였다.

진입	제형 [DBM]	제형 [HA], HA MW	관절경 전달 결과
A	94%	6% 200 kDa	실패 - 이식물이 부위에서 이탈
B	94%	6% 450 kDa	통과 - 이식물이 부위에 체류
C	88%	12% 450 kDa	통과 - 이식물이 부위에 체류
D	79%	21% 1.6 MDa	통과 - 이식물이 부위에 체류

도 2: 관절경 평가

2A. 진입 A는 적용부에서 이탈함. 2B. 진입 B는 적용부에 성공적으로 체류함

실시예 8: HA / DBM 플러그 제형의 일축 압축 테스트

방법:

인스트론 기계적 테스트 장치를 사용하여 건조 HA/DBM 플러그의 일축 압축성을 측정하였다. 각 테스트 시작 시, 플러그는 1 mm/분의 속도로 1N까지 사전하중이 가해졌다. 사전하중이 가해진 후, 표 11에 기술된 플러그를 13%의 압축 변형률이 얻어질 때까지 1 mm/분의 속도로 압축하였다. 압축 응력(10% 변형률에서) 및 계수(5 내지 10% 변형률)에 대한 값은 응력-변형률 그래프로부터 계산하였다.

도 3: 12% HA(45OkDa) + 88% DBM의 일축 압축 테스트

표본	높이 (mm)	직경 (mm)	압축 응력 (10%) (MPa)	계수 (자동) (MPa)	계수 (5-10%) (MPa)
1	9.49	4.76	1.57	32.81	11.19
2	9.61	4.74	1.64	30.78	12.37
3	9.87	4.75	1.69	26.50	13.51
평균	9.66	4.75	1.63	30.03	12.36
표준 편차	0.19	0.01	0.06	3.22	1.16

표본 1-3은 적절한 압축 응력을 나타내었다. 이들 결과는 12% HA(450 kDa) + 88% DBM을 포함하는 3개의 개별 플러그의 테스트를 기초로 한다. 이 제형은 표 10의 진입 C에 도시한 바와 같이 관절경 평가를 통과하였다.

본 명세서에 개시된 모든 특징들은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 특징들은 동일하거나, 균등하거나 또는 유사한 목적을 제공하는 다른 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 명백하게 언급하지 않으면, 개시된 각 특징은 오직 포괄적인 일련의 균등하거나 또는 유사한 특징의 예이다.

본원에 개시된 것 이외에도, 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명을 통해 당분야의 숙련가에게 자명하다. 이러한 변형은 또한 첨부된 청구항의 범주에 포함시키고자 한다.

Claims

약 25 중량%∼약 40 중량%의 탈회 골기질, 약 3.5 중량%∼약 25 중량%의 히알루론산 염, 및 약 40 중량%∼약 72 중량%의 생물학적으로 적합한 액체를 포함하는 형성성(formable) 조성물.
제1항에 있어서, 히알루론산 염은 히알루론산의 나트륨 염, 칼륨 염 또는 칼슘 염인 형성성 조성물.
제1항에 있어서, 생물학적으로 적합한 액체는 PBS, 물, 염수 또는 LRS인 형성성 조성물.
제1항에 있어서, 생물학적으로 적합한 액체는 PBS인 형성성 조성물.
제1항에 있어서, 유동성 개질제를 더 포함하는 것인 형성성 조성물.
제5항에 있어서, 유동성 개질제는 글리세롤 또는 카르복시메틸 셀룰로스인 형성성 조성물.
제1항에 있어서, 약 25 중량%∼약 35 중량%의 탈회 골기질을 포함하는 것인 형성성 조성물.
제1항에 있어서, 약 6 중량%∼약 15 중량%의 히알루론산 염을 포함하는 것인 형성성 조성물.
제1항에 있어서, 약 6 중량%∼약 9 중량%의 히알루론산 염을 포함하는 것인 형성성 조성물.
제1항에 있어서, 히알루론산 염은 평균 분자량이 약 500,000 달톤 이상인 형성성 조성물.
제1항에 있어서, 2종 이상의 히알루론산 염의 혼합물을 포함하는 것인 형성성 조성물.
제11항에 있어서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염 및 제2 평균 분자량의 히알루론산 염을 포함하는, 2종의 히알루론산 염의 혼합물을 포함하는 것인 형성성 조성물.
제12항에 있어서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 0.05∼1.0 밀리온 달톤인 형성성 조성물.
제12항에 있어서, 제2 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 1.0∼5.0 밀리온 달톤인 형성성 조성물.
제12항에 있어서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염 대 제2 평균 분자량의 히알루론산 염의 평균 분자량 비율은 1:5∼5:1 범위인 형성성 조성물.
제12항에 있어서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염과 제2 평균 분자량의 히알루론산 염 간 평균 분자량 차이는 약 0.5 밀리온 달톤 이상인 형성성 조성물.
제1항에 있어서, 인스트론 시린지 압출력(ISEF) 테스트를 가할 시, 압출력이 약 12.0 뉴톤 내지 약 30.0 뉴톤으로 나타나는 것을 더욱 특징으로 하는 것인 형성성 조성물.
제17항에 있어서, 압출력은 약 18.0 뉴톤∼약 26.0 뉴톤인 형성성 조성물.
제17항에 있어서, 압출력은 직경이 8.6 mm인 3 mL 시린지 및 15 게이지 1∼1/1 바늘로 측정되는 것인 형성성 조성물.
제1항에 있어서, 약학적 활성 성분을 더 포함하는 것인 형성성 조성물.
제20항에 있어서, 약학적 활성 성분은 골 형성능 단백질, 조직 성장 인자, 인슐린 성장 인자, 항산화제, 항생제, 또는 성장 인자의 조합인 형성성 조성물.
제20항에 있어서, 약학적 활성 성분은 BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, TGF-β, IGF-1, 아스코르베이트, 피루베이트, BHT, 젠타마이신, 반코마이신, TGF-β와 BMP-2의 조합, 및 TGF-β와 IGF-1의 조합에서 선택되는 것인 형성성 조성물.
제20항에 있어서, 약학적 활성 성분은 히알루론산 염과 접합된 것인 형성성 조성물.
피험체에서 연골을 복구시키는 방법으로서, 조성물의 유효량을 연골 조직의 결함부에서 피험체에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 조성물은 탈회 골기질 및 히알루론산 염을 포함하는 것인 복구 방법.
제24항에 있어서, 히알루론산 염은 히알루론산의 나트륨 염, 칼륨 염 또는 칼슘 염인 복구 방법.
제24항에 있어서, 조성물은 생물학적으로 적합한 액체를 더 포함하는 것인 복구 방법.
제26항에 있어서, 생물학적으로 적합한 액체는 PBS, 물, 염수 또는 LRS인 복구 방법.
제26항에 있어서, 생물학적으로 적합한 액체는 PBS인 복구 방법.
제26항에 있어서, 생물학적으로 적합한 액체는 물인 복구 방법.
제24항에 있어서, 조성물은 유동성 개질제를 더 포함하는 것인 복구 방법.
제30항에 있어서, 유동성 개질제는 글리세롤 또는 카르복시메틸 셀룰로스인 복구 방법.
제24항에 있어서, 조성물은 약 25 중량%∼약 40 중량%의 탈회 골기질을 포함하는, 형성성 조성물인 복구 방법.
제32항에 있어서, 조성물은 적어도 약 3.5 중량%∼약 25 중량%의 히알루론산 염을 포함하는 것인 복구 방법.
제32항에 있어서, 조성물은 약 6 중량%∼약 15 중량%의 히알루론산 염을 포함하는 것인 복구 방법.
제32항에 있어서, 조성물은 약 6 중량%∼약 9 중량%의 히알루론산 염을 포함하는 것인 복구 방법.
제32항에 있어서, 조성물은 약 40 중량%∼약 72 중량%의 생물학적으로 적합한 액체를 포함하는 것인 복구 방법.
제24항에 있어서, 조성물은 약 60 중량%∼약 92 중량%의 탈회 골기질을 포함하는, 건조 블렌드 조성물인 복구 방법.
제37항에 있어서, 조성물은 적어도 약 3.5 중량%∼약 38 중량%의 히알루론산 염을 포함하는 것인 복구 방법.
제37항에 있어서, 조성물은 약 3 중량%∼약 10 중량%의 생물학적으로 적합한 액체를 포함하는 것인 복구 방법.
제24항에 있어서, 조성물은 약 25 중량%∼약 88 중량%의 탈회 골기질을 포함하는, 플러그인 복구 방법.
제40항에 있어서, 조성물은 적어도 약 3.5 중량%∼약 38 중량%의 히알루론산 염을 포함하는 것인 복구 방법.
제40항에 있어서, 조성물은 약 3 중량%∼약 20 중량%의 생물학적으로 적합한 액체를 더 포함하는 것인 복구 방법.
제40항에 있어서, 조성물은 약 5 중량%∼약 10 중량%의 생물학적으로 적합한 액체를 더 포함하는 것인 복구 방법.
제24항에 있어서, 조성물은 2종 이상의 히알루론산 염의 혼합물을 포함하는 것인 복구 방법.
제44항에 있어서, 조성물은 제1 평균 분자량의 히알루론산 염 및 제2 평균 분자량의 히알루론산 염을 포함하는, 2종의 히알루론산 염의 혼합물을 포함하는 것인 복구 방법.
제45항에 있어서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 0.05∼1.0 밀리온 달톤인 복구 방법.
제45항에 있어서, 제2 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 1.0∼5.0 밀리온 달톤인 복구 방법.
제45항에 있어서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염 대 제2 평균 분자량의 히알루론산 염의 평균 분자량 비율은 1:5∼5:1 범위인 복구 방법.
제45항에 있어서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염과 제2 평균 분자량의 히알루론산 염 간 평균 분자량 차이는 약 0.5 밀리온 달톤 이상인 복구 방법.
제24항에 있어서, 조성물은 약학적 활성 성분을 더 포함하는 것인 복구 방법.
제50항에 있어서, 약학적 활성 성분은 골 형성능 단백질, 조직 성장 인자, 인슐린 성장 인자, 항산화제, 항생제 또는 성장 인자의 조합인 복구 방법.
제50항에 있어서, 약학적 활성 성분은 BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, TGF-β, IGF-1, 아스코르베이트, 피루베이트, BHT, 젠타마이신, 반코마이신, TGF-β와 BMP-2의 조합, 및 TGF-β와 IGF-1의 조합에서 선택되는 것인 복구 방법.
제50항에 있어서, 약학적 활성 성분은 히알루론산 염과 접합된 것인 복구 방법.
약 25 중량%∼약 40 중량%의 탈회 골기질, 약 3.5 중량%∼약 25 중량%의 히알루론산 염, 및 약 40 중량%∼약 72 중량%의 생물학적으로 적합한 액체를 포함하는 형성성 조성물의 제조 방법으로서, 고체 성분을 혼합한 후, 액체 성분을 부가하는 것을 포함하는 것인 제조 방법.
제54항에 있어서, 고체 성분은 탈회 골기질 및 히알루론산 염을 포함하는 것인 제조 방법.
제54항에 있어서, 히알루론산 염은 히알루론산의 나트륨 염, 칼륨 염 또는 칼슘 염인 제조 방법.
제54항에 있어서, 액체 성분은 생물학적으로 적합한 액체인 제조 방법.
제57항에 있어서, 생물학적으로 적합한 액체는 PBS, 물, 염수 또는 LRS인 제조 방법.
제57항에 있어서, 생물학적으로 적합한 액체는 물인 제조 방법.
제54항에 있어서, 액체 성분은 의도하는 사용 전에 부가되는 것인 제조 방법.
제54항에 있어서, 조성물은 유동성 개질제를 더 포함하는 것인 제조 방법.
제61항에 있어서, 유동성 개질제는 글리세롤 또는 카르복시메틸 셀룰로스인 제조 방법.
제54항에 있어서, 히알루론산 염은 평균 분자량이 약 200,000 달톤 이상인 제조 방법.
제54항에 있어서, 조성물은 2종 이상의 히알루론산 염의 혼합물을 포함하는 것인 제조 방법.
제64항에 있어서, 조성물은 제1 평균 분자량의 히알루론산 염 및 제2 평균 분자량의 히알루론산 염을 포함하는, 2종의 히알루론산 염의 혼합물을 포함하는 것인 제조 방법.
제65항에 있어서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 0.05∼1.0 밀리온 달톤인 제조 방법.
제65항에 있어서, 제2 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 1.0∼5.0 밀리온 달톤인 제조 방법.
제65항에 있어서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염 대 제2 평균 분자량의 히알루론산 염의 평균 분자량 비율은 1:5∼5:1 범위인 제조 방법.
제65항에 있어서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염과 제2 평균 분자량의 히알루론산 염 간 평균 분자량 차이는 약 0.5 밀리온 달톤 이상인 제조 방법.
제54항에 있어서, 조성물은 약학적 활성 성분을 더 포함하는 것인 제조 방법.
제70항에 있어서, 약학적 활성 성분은 골 형성능 단백질, 조직 성장 인자, 인슐린 성장 인자, 항산화제, 항생제 또는 성장 인자의 조합인 제조 방법.
제70항에 있어서, 약학적 활성 성분은 BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, TGF-β, IGF-1, 아스코르베이트, 피루베이트, BHT, 젠타마이신, 반코마이신, TGF-β와 BMP-2의 조합, 및 TGF-β와 IGF-1의 조합에서 선택되는 것인 제조 방법.
제70항에 있어서, 약학적 활성 성분은 히알루론산 염과 접합된 것인 제조 방법.
제70항에 있어서, 약학적 활성 성분은 탈회 골기질 및 히알루론산 염과 혼합되는 것인 제조 방법.
제70항에 있어서, 약학적 활성 성분은 액체 성분과 혼합되는 것인 제조 방법.
약 60 중량%∼약 92 중량%의 탈회 골기질, 약 3.5 중량%∼약 38 중량%의 히알루론산 염, 및 약 3 중량%∼약 10 중량%의 생물학적으로 적합한 액체를 포함하는 건조 블렌드 조성물.
제76항에 있어서, 히알루론산 염은 히알루론산의 나트륨 염, 칼륨 염 또는 칼슘 염인 건조 블렌드 조성물.
제76항에 있어서, 히알루론산 염은 평균 분자량이 약 200,000 달톤 이상인 건조 블렌드 조성물.
제76항에 있어서, 2종 이상의 히알루론산 염의 혼합물을 포함하는 것인 건조 블렌드 조성물.
제76항에 있어서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염 및 제2 평균 분자량의 히알루론산 염의, 2종의 히알루론산 염의 혼합물을 포함하는 것인 건조 블렌드 조성물.
제80항에 있어서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 0.05∼1.0 밀리온 달톤인 건조 블렌드 조성물.
제80항에 있어서, 제2 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 1.0∼5.0 밀리온 달톤인 건조 블렌드 조성물.
제76항에 있어서, 약학적 활성 성분을 더 포함하는 것인 건조 블렌드 조성물.
제83항에 있어서, 약학적 활성 성분은 골 형성능 단백질, 조직 성장 인자, 인슐린 성장 인자, 항산화제, 항생제 또는 성장 인자의 조합인 건조 블렌드 조성물.
제83항에 있어서, 약학적 활성 성분은 BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, TGF-β, IGF-1, 아스코르베이트, 피루베이트, BHT, 젠타마이신, 반코마이신, TGF-β와 BMP-2의 조합, 및 TGF-β와 IGF-1의 조합에서 선택되는 것인 건조 블렌드 조성물.
제83항에 있어서, 약학적 활성 성분은 히알루론산 염과 접합된 것인 건조 블렌드 조성물.
약 25 중량%∼약 88 중량%의 탈회 골기질 및 약 3.5 중량%∼약 38 중량%의 히알루론산 염 및 약 3 중량%∼약 20 중량%의 생물학적으로 적합한 액체를 포함하는 플러그.
제87항에 있어서, 생물학적으로 적합한 액체는 약 5∼10 중량%인 플러그.
제87항에 있어서, 생물학적으로 적합한 액체는 물인 플러그.
제87항에 있어서, 분말이 가소제를 더 포함하는 것인 플러그.
제90항에 있어서, 가소제는 글리세롤 또는 PEG인 플러그.
제87항에 있어서, 히알루론산 염은 히알루론산 염의 나트륨 염, 칼륨 염 또는 칼슘 염인 플러그.
제87항에 있어서, 약 6 중량% 이상의 히알루론산 염을 포함하는 것인 플러그.
제87항에 있어서, 약 6 중량%∼약 24 중량%의 히알루론산 염을 포함하는 것인 플러그.
제87항에 있어서, 약 6 중량%∼약 18 중량%의 히알루론산 염을 포함하는 것인 플러그.
제87항에 있어서, 히알루론산 염은 평균 분자량이 약 200,000 달톤 이상인 플러그.
제87항에 있어서, 2종 이상의 히알루론산 염의 혼합물을 포함하는 것인 플러그.
제97항에 있어서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염 및 제2 평균 분자량의 히알루론산 염을 포함하는, 2종의 히알루론산염의 혼합물을 포함하는 것인 플러그.
제98항에 있어서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 0.05∼1.0 밀리온 달톤인 플러그.
제98항에 있어서, 제2 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 1.0∼5.0 밀리온 달톤인 플러그.
제98항에 있어서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염 대 제2 평균 분자량의 히알루론산 염의 평균 분자량 비율은 1:5∼5:1 범위인 플러그.
제98항에 있어서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염과 제2 평균 분자량의 히알루론산 염 간 평균 분자량 차이는 약 0.5 밀리온 달톤 이상인 플러그.
제87항에 있어서, 분말이 약학적 활성 성분을 더 포함하는 것인 플러그.
제103항에 있어서, 약학적 활성 성분은 골 형성능 단백질, 조직 성장 인자, 인슐린 성장 인자, 항산화제, 항생제 또는 성장 인자의 조합인 플러그.
제103항에 있어서, 약학적 활성 성분은 BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, TGF-β, IGF-1, 아스코르베이트, 피루베이트, BHT, 젠타마이신, 반코마이신, TGF-β와 BMP-2의 조합, 및 TGF-β와 IGF-1의 조합에서 선택되는 것인 플러그.
제103항에 있어서, 약학적 활성 성분은 히알루론산 염과 접합된 것인 플러그.
제87항에 있어서, 일축 압축 응력이 약 1.55 MPa 이상으로 나타나는 것을 특징으로 하는 것인 플러그.
a) 탈회 골기질 및 히알루론산 염의 분말을 제공하는 단계,
b) 분말을 혼합하는 단계,
c) 액체 성분을 부가하여 퍼티 유사 물질을 형성시키는 단계,
d) 퍼티를 몰드에 위치시키는 단계, 및
e) 성형된 퍼티를 건조하여 플러그를 형성시키는 단계
를 포함하는 플러그의 형성 방법.
제108항에 있어서, 히알루론산 염은 히알루론산 염의 나트륨 염, 칼륨 염 또는 칼슘 염인 형성 방법.
제108항에 있어서, 플러그는 약 20 중량% 이하의 생물학적으로 적합한 액체를 포함하는 것인 형성 방법.
제110항에 있어서, 플러그는 약 10 중량% 이하의 생물학적으로 적합한 액체를 포함하는 것인 형성 방법.
제110항에 있어서, 생물학적으로 적합한 액체는 물인 형성 방법.
제108항에 있어서, 분말이 가소제를 더 포함하는 것인 형성 방법.
제113항에 있어서, 가소제는 글리세롤 또는 PEG인 형성 방법.
제108항에 있어서, 플러그는 약 6 중량% 이상의 히알루론산 염을 포함하는 것인 형성 방법.
제108항에 있어서, 플러그는 약 6 중량%∼약 24 중량%의 히알루론산 염을 포함하는 것인 형성 방법.
제108항에 있어서, 플러그는 약 6 중량%∼약 18 중량%의 히알루론산 염을 포함하는 것인 형성 방법.
제108항에 있어서, 히알루론산 염은 평균 분자량이 약 200,000 달톤 이상인 형성 방법.
제108항에 있어서, 플러그는 2종 이상의 히알루론산 염의 혼합물을 포함하는 것인 형성 방법.
제119항에 있어서, 조성물이 제1 평균 분자량의 히알루론산 염 및 제2 평균 분자량의 히알루론산 염을 포함하는, 2종의 히알루론산 염의 혼합물을 포함하는 것인 형성 방법.
제120항에 있어서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 0.05∼1.0 밀리온 달톤인 형성 방법.
제120항에 있어서, 제2 평균 분자량의 히알루론산 염은 약 1.0∼5.0 밀리온 달톤인 형성 방법.
제120항에 있어서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염 대 제2 평균 분자량의 히알루론산 염의 평균 분자량 비율은 1:5∼5:1 범위인 형성 방법.
제120항에 있어서, 제1 평균 분자량의 히알루론산 염과 제2 평균 분자량의 히알루론산 염 간 평균 분자량 차이는 약 0.5 밀리온 달톤 이상인 형성 방법.
제108항에 있어서, 분말이 약학적 활성 성분을 더 포함하는 것인 형성 방법.
제125항에 있어서, 약학적 활성 성분은 골 형성능 단백질, 조직 성장 인자, 인슐린 성장 인자, 항산화제, 항생제 또는 성장 인자의 조합인 형성 방법.
제125항에 있어서, 약학적 활성 성분은 BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, TGF-β, IGF-1, 아스코르베이트, 피루베이트, BHT, 젠타마이신, 반코마이신, TGF-β와 BMP-2의 조합, 및 TGF-β와 IGF-1의 조합에서 선택되는 것인 형성 방법.
제125항에 있어서, 약학적 활성 성분은 히알루론산 염과 접합된 것인 형성 방법.
제108항에 있어서, 건조는 동결건조, 공기 건조, 또는 오븐 또는 진공 건조인 형성 방법.
제108항에 있어서, 플러그는 약 3∼20 중량%의 수분 함량을 얻도록 더 조건화되는 것인 형성 방법.
제130항에 있어서, 수분 함량은 약 5 중량%∼약 10 중량%인 형성 방법.