JPH07116240A

JPH07116240A - 骨形成材料

Info

Publication number: JPH07116240A
Application number: JP5287407A
Authority: JP
Inventors: Toshiya Ogawa; 俊也小川; Toru Natsume; 徹夏目; Takayuki Matsumoto; 貴之松本; Shunichiro Iemura; 俊一郎家村; Yasumare Satou; 靖希佐藤; Tamotsu Shigehisa; 保重久; Minoru Haneda; 實羽田
Original assignee: Nippon Meat Packers Inc
Current assignee: NH Foods Ltd
Priority date: 1993-10-23
Filing date: 1993-10-23
Publication date: 1995-05-09

Abstract

(57)【要約】【目的】外科、整形外科、歯科領域などにおける骨損
傷治療などに用いられ、異所性に骨形成を誘導し得る骨
形成材料を提供することを目的とする。【構成】本発明の骨形成材料は、骨形成因子と特定の
型のコラーゲンを含有することからなる。本発明の骨形
成材料は、担体として用いるコラーゲンの型により特異
的な骨形成挙動を示し、軟骨から骨までいずれの形態の
骨でも形成することができる。従って、本発明の骨形成
材料によれば、患部に適した骨形成を行うことができる
という効果を奏する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は骨形成材料に関し、より
詳細には、外科、整形外科、歯科領域などで用いられ、
生体内において異所性に骨形成を誘導し得る骨形成材料
に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、外傷や骨腫瘍切除などによる
骨欠損の修復には、患者自身の骨を用いた自家骨移植が
行われているが、自家骨の採取には限界があり、また骨
採取と移植の２回の手術を行わねばならず、患者に大き
な負担をかけることとなる。そのため、骨の主成分であ
るヒドロキシアパタイトなどの素材を用いた人工材料が
汎用されている。一般に、生体内における骨は骨形成と
骨吸収を繰り返して維持されているが、上記の人工材料
は、生体内の骨と異なり、骨形成誘導能を持たない問題
がある。そこで、近年に見出された、骨形成誘導能を有
する骨形成因子(bone morphogenetic protein)を用いて
治療することが検討されている。骨形成因子は、一連の
骨形成過程において、未分化間葉系細胞を軟骨細胞に導
き、一旦軟骨を作った後、さらにそこに骨芽細胞を集め
（又は分化させて）骨組織を形成するという一連の軟骨
性骨化の過程を自動的に進行させる蛋白質であり、骨形
態形成蛋白、骨形成蛋白などと称されることもある。骨
形成因子は、Uristら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8
1, 371, 1984)が、ウシ骨の塩酸脱灰後の不溶性成分を
ラットの皮下に移植して骨形成を行って以来、多数の研
究者により研究され、精製が試みられており、近年、そ
の遺伝子がクローン化され、部分的にアミノ酸構造が明
らかにされている(Science, 242, 1528,1988; Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 85, 9484, 1988など参照)。

【０００３】上記の骨形成因子を生体に移植して骨形成
を行うに際しては、骨形成を促進すると共に生体内にお
ける骨形成因子の拡散を防止しするために、担体（マト
リックス）が用いられる。担体としてはＩ型コラーゲン
が汎用されており、既に骨形成因子とコラーゲンの複合
体を用いることが提案されている(例えば、特開昭６２
−１６４２１号公報、特開昭６３−６５８７２号公報、
特開平１−２６５９６８号公報、特開平２−１８２２６
０号公報など参照)。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】骨には軟骨といわゆる
骨があり、骨の種類・部位によってそれらの分布比率が
異なるので、骨形成を誘導させようとする骨の種類や部
位によって、軟骨と骨の分布比率を変えたり、調節する
必要がある。しかし、従来の骨形成組成物（材料）にお
いては、かかる点について検討されておらず、骨の種類
や部位に適合させて骨形成を行うことは知られていなか
った。本発明は上記従来技術の問題を解消するためにな
されたもので、本発明の目的は、骨形成を誘導させよう
とする骨の種類や部位によって、軟骨と骨の分布比率を
変えたり、調節することが可能な骨形成材料を提供する
ことにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、骨形成材料としての諸条件を満足し
且つ骨の種類や部位に適合させて骨形成を行うことを鋭
意研究した結果、骨形成因子による骨形成挙動が、担体
であるコラーゲンのタイプにより異なることを見出して
本発明を完成した。すなわち、本発明の骨形成材料は、
骨形成因子と、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV
型コラーゲン及びＶ型コラーゲンから選ばれた少なくと
も一種のコラーゲンを含有することからなる。なお、コ
ラーゲンとしては抗原性が低い点からアテロコラーゲン
を用いるのが好ましく、また本発明の骨形成材料は、ヒ
アルロン酸などのグリコサミノグリカンを含有していて
もよい。

【０００６】上記の構成からなる本発明において、骨形
成因子は、生体内で異所性骨形成を誘導できる蛋白であ
ればいずれのものであってもよく、例えば、いわゆるＢ
ＭＰ１〜７、ＯＩＦ(Osteroinductive factor)などの骨
形成因子の他、骨形成因子様蛋白などが包含され、既に
多くの物質が知られており、例えば、前掲の文献、J.Bi
ol. Chem., 264, 13377, 1989、特表平２−５００２４
１号公報、特表平３−５０５０９８号公報、特表平４−
５０２３３６号公報、特表平４−５０５１５１号公報、
特開平５−８４０８１号公報、特開平５−８５９３９号
公報などに詳述されている。

【０００７】かかる骨形成因子（以下、ＢＭＰという）
の調製の一例を示すと、ウシ骨などの原料骨を粉砕した
後、０．５Ｎ程度の塩酸水で脱灰し、エーテルなどの溶
媒で脱脂し、抽出液（例えば、グアニジン塩酸塩水溶
液、尿素水溶液など）で抽出する。この際、ＢＭＰの変
性を防止するため、蛋白分解酵素阻害剤を添加してもよ
い。抽出液を分離した後、限外濾過などの手段により、
分子量10,000〜100,000の画分を回収する。回収された
画分は、ついで、透析により精製して不純蛋白を除去
し、水不溶性画分を回収し、凍結乾燥などの手段で乾燥
することにより、部分精製粉末としてＢＭＰを得ること
ができる。なお、ＢＭＰは、出発原料として、骨肉腫
（例えば、Dunn骨肉腫など）を用いても得ることがで
き、さらに上記の文献・公報に記載されているように、
遺伝子工学的方法により調製されたものであってもよ
い。

【０００８】また、本発明において、コラーゲンとして
は、II型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲ
ン及びＶ型コラーゲンから選ばれた少なくとも一種のコ
ラーゲンが用いられ、２種以上を組み合わせて使用して
もよい。さらに、本発明においては、上記のコラーゲン
と共に、Ｉ型をはじめとする他の型のコラーゲンを組み
合わせて使用してもよく、骨形成部位における軟骨と骨
の発現様式の変更・調整が容易になる。これらのコラー
ゲンの由来は特に限定されず、一般に哺乳動物（例え
ば、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ネズミなど）の皮
膚、骨、軟骨、腱、臓器などから、慣用の方法で得るこ
とができる。上記のコラーゲンとしては、コラーゲン分
子中の抗原性の強いテロペプチド部分を酵素（例えば、
ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、プ
ロナーゼ等）処理やアルカリ処理により除去し、抗原性
を低減したアテロコラーゲンが好適に用いられる。

【０００９】本発明の骨形成材料は、固形状の形態で移
植用材料としてもよく、また液状の形態で注入用材料と
してもよく、さらに人工骨などの表面加工剤としても使
用できる。上記の注入用材料の形態においては、切開す
ることなしに骨形成材料を患部に注入することができる
ので、患者の負担を軽減することができる。固形状の材
料は、例えば、ＢＭＰとコラーゲンを酸性水溶液に溶解
した後、中和し、凍結乾燥することにより得ることがで
き、必要に応じて、ペレット状、棒状、粒状などの適当
な形状に成型して用いるのが好ましい。凍結乾燥は常法
に準じて行うことができる。また、固形状の材料として
は、粒状（粒径100〜2000μ）のコラーゲンにＢＭＰを
担持した形態であってもよく、かかる材料は、コラーゲ
ン粒子にＢＭＰの溶液をスプレーしたり、ＢＭＰの溶液
にコラーゲン粒子を浸漬することにより調製することが
できる。液状の材料は、例えば、ＢＭＰとコラーゲンを
酸性水溶液に溶解した後、中和して調製することができ
る。この中和に際して、溶液からＢＭＰ及びコラーゲン
が析出し、水性懸濁液となることがあるが、かかる懸濁
液状であっても骨形成作用には影響がない。また、本発
明の骨形成材料を人工骨などの表面加工剤として使用す
る場合には、人工骨などに上記の液状材料を塗布又はス
プレーした後、乾燥すればよい。

【００１０】本発明の骨形成材料においては、ＢＭＰ１
ｍｇに対してコラーゲンを０．１〜１００ｍｇ程度、好
ましくは０．５〜５０ｍｇ程度、より好ましくは１〜１
０ｍｇ程度含有していることが好ましい。なお、これら
の量は、ＢＭＰの純度により適宜変更することができ
る。また、液状の材料に調製する場合には、液１ｍｌに
対して、ＢＭＰ及びコラーゲンの合計量が１〜２００ｍ
ｇ程度、好ましくは５〜１００ｍｇ程度となるように調
整するのが好ましい。なお、本発明の骨形成材料は、ヒ
アルロン酸などのグリコサミノグリカンを含有していて
もよく、これを添加することにより、骨形成時期を調節
（促進又は遅延）を行うことができる。材料中における
上記のヒアルロン酸などのグリコサミノグリカン含量
は、ＢＭＰ１ｍｇに対してグリコサミノグリカンを０．
１〜１０ｍｇ程度、好ましくは０．５〜５ｍｇ程度、よ
り好ましくは１〜２ｍｇ程度含有していることが好まし
い。

【００１１】本発明の骨形成材料は、通常、骨形成させ
ようとする部位に移植又は注入することにより使用さ
れ、例えば、骨折、骨腫瘍切除などによる骨損傷の治
療、歯周疾患の治療、骨粗鬆症の治療などに用いられ
る。特に、後記実施例に示されるように、本発明の骨形
成材料はコラーゲンの型により特異的な骨形成挙動を示
し、例えば、Ｖ型コラーゲンを用いた材料は軟骨を形成
し、II型又はIII型コラーゲンを用いた材料は骨の形成
を促進する。従って、関節、肋骨などのような軟骨を必
要とする部位についてはＶ型コラーゲンを用いた骨形成
材料を、骨を必要とする部位にはII型又はIII型コラー
ゲンを用いた骨形成材料を用いるなど、担体であるコラ
ーゲンを適宜変更・組み合わせることにより、患部に適
した骨形成を行うことができる。

【００１２】本発明の骨形成材料の使用量は、治療目
的、治療すべき部位や治療個所の形態、投与方法、患者
の年齢、性別、健康状態などにより、適宜調整される。
また、本発明の骨形成材料は、安定化剤、保存剤などの
製剤上の慣用の助剤を含有していてもよく、さらに各種
成長因子、走化剤、抗生物質、抗炎症剤などのような適
当な生理活性物質を含有していてもよい。

【００１３】

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものでは
ない。

【００１４】実施例１１．方法下記の方法で、ＢＭＰを調製した。牛中足骨を粉砕後、０．５ＮＨＣｌで脱灰した。エー
テルにて脱脂後、４Ｍグアニジン塩酸で抽出したものを
限外濾過で分子量１０，０００〜１００，０００画分を
回収した。透析後、水に不溶性画分を回収し、凍結乾燥
したものを部分精製ＢＭＰとして、以下の実験に用い
た。

【００１５】骨形成材料の調製下記の群からなる骨形成材料を調整した。Ｉ群：牛中足骨由来Ｉ型コラーゲン（１０ｍｇ）＋部分
精製ＢＭＰ（５ｍｇ）ＩＩ群：豚大腿骨軟骨由来II型コラーゲン（１０ｍｇ）
＋部分精製ＢＭＰ（５ｍｇ）ＩＩＩ群：豚皮由来III型コラーゲン（１０ｍｇ）＋部
分精製ＢＭＰ（５ｍｇ）ＩＶ群：牛レンズ包由来ＩＶ型コラーゲン（１０ｍｇ）
＋部分精製ＢＭＰ（５ｍｇ）Ｖ群：豚胎盤由来Ｖ型コラーゲン（１０ｍｇ）＋部分精
製ＢＭＰ（５ｍｇ）調製方法は、コラーゲンの塩酸溶液（ｐＨ３．０）に、
部分精製ＢＭＰ（０．１％トリフルオロ酢酸溶液）を添
加し、０．１Ｎ水酸化ナトリウムで中和した後、凍結乾
燥し、７ｍｍ×７ｍｍ×１ｍｍに押し固め、ＢＭＰペレ
ットとした。

【００１６】生体内移植上記で得られたＢＭＰペレットを、４週令の雄ＳＤラッ
トの胸部皮下に埋植し、誘導された組織を１〜４週間の
間、継時的に取り出し骨誘導の程度を比較した。一方、
対照群としてＩ型コラーゲン（１５ｍｇ）のみを押し固
めたペレットを用いた。

【００１７】２．結果上記のＩ〜Ｖ群の材料を用いて、異所性に形成させた骨
組織について、下記の試験を行った。その結果を示す。生化学的項目 (1)異所性に形成させた骨組織の重量の測定骨組織の重量の経時変化を図１に示す。なお、図１にお
いて、Ｃｏｌ．はコラーゲンを意味する（以下、同
様）。図１に示されるように、Ｖ型コラーゲンを担体と
するときに大きな骨が形成されていた。

【００１８】(2)異所性に形成させた骨組織のカルシウ
ム量及び含有率の測定カルシウム沈着量は、形成された骨組織をマッフル炉で
８００℃にて灰化後、６Ｎ塩酸で灰分を溶解し、和光純
薬工業社製カルシウム測定用キット「カルシウムＣ−テ
ストワコー」を用いて測定した。カルシウム沈着量の経
時変化を図２に示す。図２に示されるように、II型コラ
ーゲンを担体とするとき、早期からカルシウムの沈着が
起り、またカルシウム量も大きいことが認められた。次
に、カルシウム含有量の経時変化を図３に示す。図３に
示されるように、II型コラーゲンを担体とするとき、早
期からカルシウム含有量の高い骨が形成され、一方、Ｖ
型コラーゲンを担体とするときにはカルシウム含有量の
低い骨が形成されている。

【００１９】(3)アルカリ性ホスファターゼ活性の測定アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）活性は、形成され
た骨組織を０．１Ｍ炭酸緩衝液にてホモジナイズした
後、３０００ｒｐｍ×３０分遠心分離を行い、その上清
を和光純薬工業社製アルカリ性ホスファターゼ測定用キ
ット「アルカリ性ホスファＢ−テストワコー」を用いて
測定した。その結果を図４に示す。図４に示されるよう
に、II型コラーゲンを担体とするとき、早期から高いＡ
ＬＰ活性が認められる。

【００２０】組織学的観察組織学的観察として脱灰組織をパラフィン包埋した後、
５μｍの切片を作成し、ＨＥ染色（形態観察）及びアル
シアンブルー染色（多糖類、主にグリコサミノグリカン
の分布を観察し、染色部位は軟骨の存在を示す）をおこ
なった。また、非脱灰組織を樹脂（ＪＢ−４）包埋した
後、４μｍの切片を作成し、フォン・コッサ染色（カル
シウム沈着の分布を観察）及びＡＬＰ染色（ＡＬＰの分
布の観察）を行った。

【００２１】(1)異所性に形成させた骨組織の軟Ｘ線写
真形成された骨組織の軟Ｘ線写真を図５に示す。図５に示
されるように、II型コラーゲンを担体とするとき、早期
からカルシウムの沈着が認められ、一方、Ｖ型コラーゲ
ンを担体とするときにはカルシウムの沈着が少ない。

【００２２】(2)異所性に形成させた骨組織の骨と軟骨
の分布組織学的所見に基づき、形成された骨組織の骨と軟骨の
分布を模式的に示したのが、図６である。図６に示され
るように、II型コラーゲンを担体とするとき、早期から
骨の形成が認められ、一方、Ｖ型コラーゲンを担体とす
るときには軟骨の形成は早いがそのまま経過することが
認められる。

【００２３】(3)組織学的観察異所性に形成させた骨組織の特徴を表１に示す。

【００２４】

【表１】

【００２５】以上の結果に示されるように、誘導された
骨組織は、担体として用いたコラーゲンの型により骨誘
導の過程に顕著な差が認められた。特にＩＩ群において
組織学的にも実際のカルシウムの沈着量の測定において
も他の群に比べて骨の誘導が早く、それに対し、ＩＩＩ
群は骨の誘導が他の群に比べて遅い上に、軟骨の誘導が
ほとんど見られず、直接骨が誘導されているように見受
けられた。また、Ｖ群においては軟骨の誘導が早い時期
から起り、カルシウムの沈着は他の型に比べて少なく、
４週目の組織でも軟骨が骨に置き変わっていなかった。

【００２６】実施例２実施例１におけるＩ群（Ｉ型コラーゲン＋部分精製ＢＭ
Ｐ）及びＩＩ群（ＩＩ型コラーゲン＋部分精製ＢＭＰ）
に、それぞれヒアルロン酸ナトリウム（鶏冠由来）５ｍ
ｇを添加し、実施例１と同様にしてペレット状骨形成材
料を調製した。次いで、実施例１と同様にして、４週令
の雄ＳＤラットの胸部皮下に埋植し、誘導された組織を
１〜４週間の間、継時的に取り出し骨誘導の程度を、カ
ルシウム量の経時変化で比較した。その結果を図１３に
示す。図１３において、ＨＡはヒアルロン酸ナトリウム
を意味する。図１３に示されるように、ヒアルロン酸ナ
トリウムを添加していない群に比べて、早い骨化が認め
られた。

【００２７】

【発明の効果】本発明の骨形成材料は、担体として用い
るコラーゲンの型により特異的な骨形成挙動を示し、軟
骨から骨までいずれの形態の骨でも形成することができ
る。従って、従来の骨形成材料のような画一的な骨形成
と異なり、患部に適した骨形成を行うことができるとい
う効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【図１】異所性に形成された骨組織の重量の経時変化を
示す図である。

【図２】異所性に形成された骨組織のカルシウム量の経
時変化を示す図である。

【図３】異所性に形成された骨組織のカルシウム含有量
の経時変化を示す図である。

【図４】異所性に形成された骨組織のＡＬＰ活性の経時
変化を示す図である。

【図５】異所性に形成された骨組織の軟Ｘ線写真であ
る。

【図６】異所性に形成された骨組織についての組織学的
所見に基づく、骨及び軟骨の分布を示す模式図である。

【図７】実施例１のＩ群の材料を移植した後の生物組織
の状態（生物の形態）を示す写真である。

【図８】実施例１のＩＩ群の材料を移植した後の生物組
織の状態（生物の形態）を示す写真である。

【図９】実施例１のＩＩＩ群の材料を移植した後の生物
組織の状態（生物の形態）を示す写真である。

【図１０】実施例１のＩＩＩ群の材料を移植した後の生
物組織の状態（生物の形態）を示す写真（アルシアンブ
ルー染色）である。

【図１１】実施例１のＶ群の材料を移植した後の生物組
織の状態（生物の形態）を示す写真である。

【図１２】実施例１のＶ群の材料を移植した後の生物組
織の状態（生物の形態）を示す写真（アルシアンブルー
染色）である。

【図１３】実施例２の骨形成材料を用いて異所性に形成
された骨組織のカルシウム量の経時変化を示す図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者家村俊一郎茨城県つくば市緑ケ原３丁目３番日本ハム株式会社中央研究所内 (72)発明者佐藤靖希茨城県つくば市緑ケ原３丁目３番日本ハム株式会社中央研究所内 (72)発明者重久保茨城県つくば市緑ケ原３丁目３番日本ハム株式会社中央研究所内 (72)発明者羽田實茨城県つくば市緑ケ原３丁目３番日本ハム株式会社中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】骨形成因子と、II型コラーゲン、II
I型コラーゲン、IV型コラーゲン及びＶ型コラーゲンか
ら選ばれた少なくとも一種のコラーゲンを含有すること
を特徴とする骨形成材料。
【請求項２】コラーゲンがアテロコラーゲンであ
る請求項１記載の骨形成材料。
【請求項３】グリコサミノグリカンを含有する請
求項１又は２記載の骨形成材料。