KR20100088687A - 관절 질환 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 실질적으로 염증, 또는 발열을 야기하지 않는 정도로 엔도톡신 레벨을 저하시킨 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 관절 질환 치료용 조성물을 제공한다. 이에 따라, 연골을 기계적 자극으로부터 보호하는 효과, 마모나 염증에 의한 연골의 변성 변화를 억제하는 효과, 연골 손상부를 수복시키는 효과, 관절 조직의 염증이나 동통을 억제하는 효과, 활막 조직의 변성을 억제하는 효과, 및 골연골 파괴를 억제하는 효과를 함께 갖는 관절 질환 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

Description

관절 질환 치료용 조성물 {COMPOSITION FOR TREATMENT OF JOINT DISEASE}

본 발명은 수의용 등을 포함하는, 관절 질환 치료용 조성물 등에 관한 것이다.

예를 들면, 관절 연골은 유리 연골로서, 소수의 세포, 콜라겐성의 세포외 매트릭스, 풍부한 프로테오글리칸 및 물로 이루어진다. 뼈의 경우, 혈관이나 신경 네트워크가 존재하고, 자기 수복능을 갖기 때문에, 골절되었을 때에도 충분히 골절 부분이 수복되는 경우가 많다. 그러나, 관절 연골에는 혈관 및 신경 네트워크가 존재하지 않는다. 이 때문에, 자기 수복능이 거의 없어, 특히 큰 연골 결손부가 형성되었을 경우, 연골 결손부는 충분하게는 수복되지 않는다. 수복되는 부분이라 하더라도, 유리 연골과 역학적 특성이 다른 섬유 연골이 형성된다. 이 때문에, 연골 결손이 형성되면, 관절통 및 관절 기능의 상실이 초래되어, 종종 변형성 관절증으로 발전한다. 또한, 가령이나 관절의 혹사에 의해 관절 연골의 표면의 마모가 시작된 변형성 관절증의 초기 단계로부터 병상이 진행된 결과로서, 광범위한 영역에서의 연골 결손에 이를 수도 있다.

변형성 관절증(osteoarthritis; OA)은 가령이나 관절의 혹사에 의해 관절 연골이 마모 감소하는 퇴행성 질환인데, 마모라는 역학적 원인뿐만 아니라 활막 세포나 연골 세포에 의한 염증성 사이토카인의 생산, 염증성 사이토카인에 의한 통증 유발 물질이나 단백질 분해 효소의 유도 등의 국소 염증 반응이 관절 파괴에 관여하고 있는 것으로 알려져 있다. 즉, 관절 연골의 마모(기계적 손상)에 따라 관절 조직 내에서 염증 반응이 야기되고, 염증 반응에 의한 자기 파괴적 연골 손상이 진행되어 관절 기능이 저하됨으로써 기계적 손상이 더욱 진행되는 악순환에 의해 병태가 악화된다. 변형성 관절증의 치료는 환부의 동통이나 염증 제거에 주안이 두어져, 해외에서는 비스테로이드성 항염증제의 투여가 주류이다. 그러나, 고연령자에서는 신기능이 저하될 수도 있어, 비스테로이드성 항염증제의 연속적인 경구 투여는 안전성 측면에서 곤란한 경우도 있다. 연골 관절액의 성분 중 하나인 히알루론산을 제제화한 제품은 관절강 내에 투여함으로써 관절의 윤활 기능을 개선하면서, 동통 억제 작용도 갖기 때문에, 변형성 관절증에서의 관절 기능 개선제로서 많이 사용되고 있다. 그러나, 연골 및 그의 주위 조직의 변성이 진행된 중증의 변형성 관절증에서는 최종적으로는 인공 관절로의 치환을 행하는 것 이외에 방법이 없어, 조직 변성의 진행을 억제하고, 나아가 개선하는 등의 새로운 치료약의 개발이 요망되고 있는 질환 중 하나이다(문헌 1).

류마티스 관절염(rheumatoid arthritis; RA)는 아직 그의 발증 메카니즘은 해명되지 않았으나, 활막의 염증·이상 증식과, 활성화 T 세포에 의한 과잉의 면역 응답이 관여하고 있어, 그 결과 관절 조직의 파괴가 진행되는 것으로 여겨지고 있다. 관절 조직의 변성을 수반한다는 점에서는 OA와 유사한 증상을 보이지만, RA는 자기 면역 질환의 일종으로 여겨지고 있어 양자의 병태는 상이하다. 최근 들어, 염증성 사이토카인인 TNF-α를 타겟으로 한 생물학적 제제가 RA 치료제로서 이용되게 되었다. 이들 제제는 항 TNF-α 항체나 TNF 수용체를 유효 성분으로 하고, TNF-α의 기능을 저해함으로써, 관절 파괴의 방지에 기여하는 것으로 생각되고 있다. 한편, 전신성으로 TNF-α의 기능을 저해하기 때문에, 폐렴, 결핵 등의 감염증을 비롯한 중증의 부작용도 임상상 문제가 되고 있다. 관절 조직의 변성의 진행을 억제할 수 있으면서, 안정성이 높은 새로운 치료약이 필요하게 되었다.

알긴산은 갈조류에 많이 존재하는 고분자 다당류로서, D-만누론산(M)과 L-글루론산(G)의 2종의 우론산이 직쇄상으로 중합한 중합체이다. 알긴산은 용액 상태에서는 점성을 나타냄과 동시에, 2가 이상의 양이온 존재하에서는 겔화한다는 성질을 갖기 때문에, 증점제나 겔화제로서 식품, 화장품, 의약 제제의 기제 등에 널리 사용되고 있다. 겔화한다는 성질을 활용하여, 세포를 현탁한 알긴산 용액을 칼슘 이온 용액에 적하함으로써 세포를 포매한 비드를 제작하는 등의 기술에도 이용되어 왔다. 이러한 비드에 연골 세포 등을 포매하고, 연골 손상부에 이식하는 시도가 이루어지고 있다. 문헌 2에는 알긴산은 연골 손상부에 어떠한 불리한 영향도 주지 않는 캐리어로서 사용을 할 수 있고, 알긴산 자체는 어떠한 치료 효과도 갖지 않는 것으로 고찰되어 있다. 또한, 문헌 3에는 알긴산나트륨 용액에 연골 세포를 현탁하고, 토끼 연골 결손부에 주입한 후, 표면을 CaCl₂ 용액으로 경화시킨 이식물에서 정상적인 연골 조직이 형성되었으나, 세포를 함유시키지 않고 알긴산만을 연골 결손부에 적용한 경우에는 섬유 연골이 형성된 것이 개시되어 있다. 문헌 4에서는 가용성 알긴산염과 불용성 알긴산염/겔을 혼합한 자기 겔화성 알긴산 조성물에, 연골 세포를 함유시켜 연골 결손부에 주입하는 경화성 조성물이 개시되어 있다.

이와 같이, 알긴산은 연골 세포 등의 담체로서 사용할 수 있는 바이오 중합체인 것은 알려지고 있고, 그의 겔화능을 활용하여, 세포와 함께 연골 결손부에 주입하여 경화시키는 이식 담체로서의 사용이 시도되어 왔다. 그러나, 세포를 함유하지 않는 알긴산 조성물의 치료 효과는 알려져 있지 않고, 경화성이 아닌 알긴산 조성물을 관절 질환에 적용하는 시도는 이루어지지 않았다.

(특허 문헌 1) 국제 공개 제2006/044342호 공보

(비특허 문헌 1) Harumoto Yamada et al., "Drug therapy for osteoarthritis", Clin. Rheumatol., Vol. 18, 2006: pp. 298-306 (비특허 문헌 2) Cay M. Mierisch et al., "Transforming Growth Factor-β in Calcium Alginate Beads for the Treatment of Articular Cartilage Defects in the Rabbit", The Journal of Arthroscopic and Related Surgery, Vol. 18, No. 8 (October), 2002: pp. 892-900 (비특허 문헌 3)E. Fragonas et al., "Articular Cartilage Repair in Rabbits by Using Suspensions of Allogenic Chondrocytes in Alginate", Biomaterials, Vol. 21, 2000: pp. 795-801

변형성 관절증의 치료약에는 연골을 마모로부터 보호하는 효과, 마모나 염증에 의한 연골의 변성 변화를 억제하는 효과, 연골 손상부를 수복시키는 효과, 염증이나 동통을 억제하는 효과 등, 복합적인 효과를 함께 가질 것이 요구된다. 관절에서의 염증을 억제하고, 동통을 억제할 수 있는 약제가 얻어지면, 어깨관절 주위염의 치료나, 만성 류마티스 관절염에서의 관절통의 억제에도 응용 가능해진다.

류마티스 관절염의 치료약에는 활막 세포의 이상 증식의 억제, 과잉의 면역 반응에 따른 골연골 조직의 파괴 억제와 같은 치료 효과를 가짐과 동시에, 부작용이 적고 안전성이 높은 성질이 요구되고 있다. RA는 자기 면역 질환이라는 성질상, 치료 효과를 얻고자 하면 면역 억제적인 부작용을 피하는 것이 곤란한 것이 현실이다. RA에 사용 가능한 의약품 중에서 비교적 안정성이 높은 것으로서 히알루론산 제제가 알려져 있지만, 히알루론산의 관절내 주입은 RA에서의 동통 억제를 목적으로 사용되고 있어, RA의 치료제로는 간주되지 않는다. 즉, RA에 대한 치료 효과와 높은 안전성을 양립하는 새로운 약제의 제공이 과제로 되어 있다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 행하였다. 그리고, 실질적으로 염증, 또는 발열을 야기하지 않는 정도로까지 엔도톡신 레벨을 저하시킨 알긴산의 1가 금속염을 함유하는 조성물을 관절 내에 주입 투여함으로써, 실험적 변형성 관절증 모델에서 연골 변성 변화를 억제하고, 연골을 보호하는 효과가 얻어짐을 발견하였다. 또한, 실험적 관절염 동통 모델에서, 동 조성물에 관절염에 의한 동통을 억제하는 효과가 있음을 발견하였다. 또한, 실험적 류마티스 관절염 모델에서, 동 조성물에 활막 조직의 변성을 억제하고, 골연골 조직의 파괴·변성을 억제하는 효과가 있음을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.

변형성 관절증에 있어서, 관절액의 주성분인 히알루론산 이외의 물질로, 이러한 연골 조직으로의 복합적인 효과를 갖는 것이 실증된 것은 처음이다. 해조 유래의 중합체로서, 동물의 체내에는 원래 존재하지 않는 알긴산이 이러한 효과를 갖고 있는 것은 놀랄만한 일이었다.

류마티스 관절염은 자기 면역 질환의 일종으로서, 변형성 관절증과는 병태가 상이하다. 류마티스 관절염에 있어서, 관절 조직의 변성·파괴의 진행을 억제하는 「질환 변형약(disease modifying drug)」으로서의 기능을 갖는 약제는 항 TNFα 항체나 메토트렉세이트와 같은 전신성에 작용하는 면역 조절제가 주이다. 알긴산과 유사한 다당류인 히알루론산은 변형성 관절증의 치료제이지만, 류마티스 관절염에서는 관절 동통의 대증요법에 이용되고 있을 뿐이다. 따라서, 알긴산에 있어서 변형성 관절증에서 치료 효과가 얻어졌다 하더라도, 류마티스 관절염에 있어서 치료 효과를 갖는지의 여부는 예측 곤란하였다. 알긴산과 같은, 식품이나 의약품 기제로서 범용되고 있는 안정성이 높은 천연 유래의 다당류 중합체가, 관절내 투여에 의해 류마티스 관절염의 질환 변형약으로서 기능하는 것은 놀랄만한 것이었다.

즉, 본 발명은 관절 질환 환자의 관절 내에 주입 투여함으로써, 치료 효과를 얻을 수 있는 조성물을 제공한다.

(1-1) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하고, 관절 내에 주입 투여하는, 관절 질환 치료용 조성물.

(1-2) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고, 관절 내에 주입 투여하는, 연골 변성 변화 억제용 조성물.

(1-3) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고, 관절 내에 주입 투여하는, 연골 보호용 조성물.

(1-4) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고, 관절 내에 주입 투여하는, 연골 수복용 조성물.

(1-5) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고, 관절 내에 주입 투여하는, 관절 동통 억제용 조성물.

(1-6) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고, 관절 내에 주입 투여하는, 관절 염증 억제용 조성물.

(1-7) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고, 관절 내에 주입 투여하는, 관절 기능 개선용 조성물.

(1-8) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고, 관절 내에 주입 투여하는, 변형성 관절증 치료용 조성물.

(1-9) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고, 관절 내에 주입 투여하는, 어깨관절 주위염 치료용 조성물.

(1-10) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고, 관절 내에 주입 투여하는, 류마티스 관절염에서의 관절 동통 억제용 조성물.

(1-11) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고, 관절 내에 주입 투여하는, 류마티스 관절염 치료용 조성물.

(1-12) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고, 관절 내에 주입 투여하는, 류마티스 관절염에서의 활막 조직 변성 억제용 조성물.

(1-13) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고, 관절 내에 주입 투여하는, 류마티스 관절염에서의 관절 파괴 억제용 조성물.

(1-14) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고, 관절 질환에 관련된 병태를 완화, 개선 또는 치유하는 효과를 갖는, 관절내 주입용 조성물.

(1-15) 상기의, 관절 질환에 관련된 병태를 완화, 개선 또는 치유하는 효과가, 연골 변성 변화의 억제, 연골의 보호, 연골의 수복, 관절 동통의 억제, 관절 염증의 억제, 관절 기능의 개선, 활막 조직 변성의 억제, 골연골 파괴의 억제 및 관절 파괴의 억제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인, (1-14)에 기재된 조성물.

(1-16) 상기 알긴산의 1가 금속염이 알긴산나트륨인, 상기 (1-1) 내지 (1-15) 중 어느 하나에 기재된 조성물.

(1-17) 상기 알긴산나트륨은 겔 여과 크로마토그래피에서의 중량 평균 분자량이 50만 이상인 알긴산나트륨인, 상기 (1-16)에 기재된 조성물.

(1-18) 세포(예를 들면, 연골 조직 재생을 위한 세포)를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는, 상기 (1-1) 내지 (1-17) 중 어느 하나에 기재된 조성물.

(1-19) 알긴산의 1가 금속염의 경화제를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는, 상기 (1-1) 내지 (1-18) 중 어느 하나에 기재된 조성물.

(1-20) 겔 여과 크로마토그래피에서의 중량 평균 분자량이 50만 이상인 저엔도톡신 알긴산나트륨을 유효 성분으로서 함유하고, 세포를 함유하지 않으며, 비경화성인 것을 특징으로 하는, 관절 내에 주입 투여하는, 류마티스 관절염 치료용 조성물.

또한, 본 발명은 관절 질환 및 그에 관련된 병태의 치료 방법을 제공한다.

(2-1) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는, 관절 질환 치료 방법.

(2-2) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는, 연골 변성 변화 억제 방법.

(2-3) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는, 연골 보호 방법.

(2-4) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는, 연골 수복 방법.

(2-5) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는, 관절 동통 억제 방법.

(2-6) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는, 관절 염증 억제 방법.

(2-7) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는, 관절 기능 개선 방법.

(2-8) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는, 변형성 관절증 치료 방법.

(2-9) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는, 어깨관절 주위염 치료 방법.

(2-10) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는, 류마티스 관절염에서의 관절 동통 억제 방법.

(2-11) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는, 류마티스 관절염 치료 방법.

(2-12) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는, 류마티스 관절염에서의 활막 조직 변성 억제 방법.

(2-13) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는, 류마티스 관절염에서의 관절 파괴 억제 방법.

(2-14) 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는, 관절 질환에 관련된 병태를 완화, 개선 또는 치유하는 방법.

(2-15) 상기의, 관절 질환에 관련된 병태를 완화, 개선 또는 치유하는 효과가, 연골 변성 변화의 억제, 연골의 보호, 연골의 수복, 관절 동통의 억제, 관절 염증의 억제, 관절 기능의 개선, 활막 조직 변성의 억제, 골연골 파괴의 억제 및 관절 파괴의 억제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인, (2-14)에 기재된 방법.

(2-16) 상기 알긴산의 1가 금속염이 알긴산나트륨인, 상기 (2-1) 내지 (2-15) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(2-17) 상기 알긴산나트륨은 겔 여과 크로마토그래피에서의 중량 평균 분자량이 50만 이상인 알긴산나트륨인, 상기 (2-16)에 기재된 방법.

(2-18) 상기 조성물이, 세포(예를 들면, 연골 조직 재생을 위한 세포)를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는, 상기 (2-1) 내지 (2-17) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(2-19) 상기 조성물이, 알긴산의 1가 금속염의 경화제를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는, 상기 (2-1) 내지 (2-18) 중 어느 하나에 기재된 방법.

(2-20) 겔 여과 크로마토그래피에서의 중량 평균 분자량이 50만 이상인 저엔도톡신 알긴산나트륨을 유효 성분으로서 함유하고, 세포를 함유하지 않으며, 비경화성인 것을 특징으로 하는 조성물을 관절 내에 주입 투여하는, 류마티스 관절염 치료 방법.

본 발명의 관절 질환 치료용 조성물은 액체 상태로 관절 내에 주입함으로써, 관절 질환 및 관절 질환에 관련된 병태의 진행을 억제하고, 증상을 완화 또는 치유할 수 있다. 본 발명의 하나의 양태의 조성물은 연골의 기계적 손상에 대하여 수복·보호·변성 억제 효과를 발휘함과 동시에, 관절 조직에서의 염증 반응 및 동통을 억제한다. 또한, 자기 면역 반응에 따른 활막 조직의 변성을 억제하고, 골연골 파괴를 억제하고, 관절 파괴에 대하여 치료 효과를 발휘한다. 이들의 복합적 효과를 통해 관절 질환에서의 관절 기능의 개선에 기여한다. 특히, 변형성 관절증의 치료, 어깨관절 주위염의 치료, 류마티스 관절염에서의 관절통의 완화, 류마티스 관절염의 치료에 유용하다.

도 1은 실시예 1의 토끼 연골 수복 모델에서의 전체 관찰의 스코어 기준을 나타내는 도면이다.
도 2는 실시예 1의 토끼 연골 수복 모델에서의 염색의 스코어 기준을 나타내는 도면이다.
도 3은 실시예 1의 토끼 연골 수복 모델에서의, A) 대조군(empty)의 조직 염색 사진이다. (A)는 4주 후, (B)는 12주 후를 나타낸다. 좌측부터 순서대로 H-E 염색, 사프라닌 O 염색, 타입 I 콜라겐, 타입 II 콜라겐 면역 염색의 결과이다.
도 4는 실시예 1의 토끼 연골 수복 모델에서의, C) 식품 등급 알긴산+세포 존재군의 염색 사진이다. (A)는 4주 후, (B)는 12주 후, 염색 방법에 대해서는 도 3과 마찬가지이다.
도 5는 실시예 1의 토끼 연골 수복 모델에서의, D) 정제 알긴산군(세포 부재)의 염색 사진이다. (A)는 4주 후, (B)는 12주 후, 염색 방법에 관해서는 도 3과 마찬가지이다.
도 6은 실시예 1의 토끼 연골 수복 모델에서의, E) 정제 알긴산+세포 존재군의 염색 사진이다. (A)는 4주 후, (B)는 12주 후, 염색 방법에 대해서는 도 3과 마찬가지이다.
도 7은 실시예 1의 토끼 연골 수복 모델에서의 전체 관찰 및 염색의 스코어 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 실시예 1의 토끼 연골 수복 모델에서의, 정제 알긴산군인 D)군, E)군에 대한 기계적 강도 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 실시예 3의 토끼 변형성 관절증 모델에서의 무릎 관절의 외관을 나타내는 사진이다.
도 10은 실시예 3의 토끼 변형성 관절증 모델에서의 무릎 관절 조직의 염색 사진이다.
도 11은 실시예 4의 토끼 변형성 관절증 모델에서의 무릎 관절에 대하여, 인디아 잉크(India ink) 염색 후의 외관을 나타내는 사진이다. 도면 중, 동그라미로 둘러싸인 부분은 인디아 잉크에 의해 착색된 연골 손상부와 정상 연골의 경계를 나타내고 있다. A) 대조군, B) 1％ 히알루론산나트륨 투여군, C) 2％ 알긴산나트륨 투여군(분자량 40만), D) 2％ 알긴산나트륨 투여군(분자량 100만), E) 2％ 알긴산나트륨 투여군(분자량 170만)이다. 또한, 사진은 복수 표본 중의 일례이다.
도 12는 실시예 4의 토끼 변형성 관절증 모델에서의, 인디아 잉크 염색에 의한 무릎 관절의 육안적 소견을 스코어화한 결과이다. NS, HA, AL40, AL100 및 AL170은 각각 A) 내지 E)(도 11과 동일)에 대응한다. 등급 1은 인디아 잉크에 의한 염색 및 무흠집의 표면(no uptake of India ink, indicating intact surface)을 나타낸다. 등급 2는 인디아 잉크에 의한 국소적인 염색 및 표면에 가벼운 손상이 있는 것(minimal focal uptake of India ink, mild surface irregularity)를 나타낸다. 등급 3은 인디아 잉크에 의한 크고 선명한 염색 및 명백한 피브릴화(evident large focal dark patches of India ink, overt fibrillation)를 나타낸다. 등급 4a는 2 mm 미만의 연골 손상(erosion of cartilage< 2 mm)을 나타낸다. 등급 4b는 2 mm 내지 5 mm의 연골 손상(erosion of cartilage 2-5 mm)을 나타낸다. 등급 4c는 5 mm를 초과하는 연골 손상(erosion of cartilage> 5 mm)을 나타낸다.
도 13은 실시예 4의 토끼 변형성 관절증 모델에서의, 무릎 관절 조직의 사프라닌-O 염색 사진이다. A) 내지 E)는 도 11과 동일함． 또한, 사진은 복수 표본 중의 일례이다.
도 14는 실시예 4의 토끼 변형성 관절증 모델에서의, 병리 조직 종합 평가를 스코어화한 결과이다. NS, HA, AL40, AL100 및 AL170은 각각 A) 내지 E)(도 11과 동일)에 대응한다.
도 15는 실시예 6의 래트 실험적 관절염 동통 모델에서의, 보행 상태 스코어의 경시적 변화를 나타내는 도면이다. A) 대조군(NS), B) 1％ 히알루론산나트륨 투여군(1％ HA), C) 2％ 알긴산나트륨 투여군(분자량 100만)(2％ AL100), D) 1％ 알긴산나트륨 투여군(분자량 170만)(1％ AL170), E) 2％ 알긴산나트륨 투여군(분자량 170만)(2％ AL170)이다. *: p<0.05 vs NS.
도 16은 실시예 7의 토끼 견건판 단열(斷裂) 모델에서의 상완골 골두부의 표본 사진이다. 검정 화살표는 연골 손상부를 나타낸다. 대조군은 생리 식염수 투여군, 알기네이트는 알긴산 투여군을 나타낸다.
도 17은 실시예 8의 토끼 변형성 관절증 모델의 무릎 관절 표본의 마찰 계수를 나타내는 그래프이다. 종축은 마찰 계수를 나타낸다. 대조군(정상)은 정상 관절, HA(OA)는 히알루론산을 투여한 OA 관절, AL100(OA)은 알긴산 투여한 OA 관절을 나타낸다.
도 18은 실시예 9의 래트·콜라겐 유발 관절염 모델에서의, 항원 감작 후의 관절염 발증 정도의 시간 추이를 나타내는 그래프이다. 종축은 관절염 스코어, 횡축은 항원 감작 후의 일수를 나타낸다. A) 대조군, B) 1％ 히알루론산나트륨 투여군, C) 2％ 알긴산나트륨 투여군(분자량 100만), D) 1％ 알긴산나트륨 투여군(분자량 170만), E) 2％ 알긴산나트륨 투여군(분자량 170만)이다.
도 19는 실시예 9의 래트·콜라겐 유발 관절염 모델에서의, 무릎 관절의 활막 조직의 조직학적 평가를 스코어화한 결과이다. A 내지 E는 도 18과 동일함． *: p< 0.05 vs 대조군.
도 20은 실시예 9의 래트·콜라겐 유발 관절염 모델에서의, 무릎 관절의 슬개골의 조직학적 평가를 스코어화한 결과이다. A 내지 E는 도 18과 동일함. *: p< 0.05 vs 대조군.
도 21은 실시예 9의 래트·콜라겐 유발 관절염 모델에서의, 무릎 관절의 대퇴골 외측과의 조직학적 평가를 스코어화한 결과이다. A 내지 E는 도 18과 동일함． *: p< 0.05 vs 대조군.

이하, 본 발명을 상세히 설명하지만, 이하의 실시 형태는 본 발명을 설명하기 위한 예시로, 본 발명은 그의 요지를 일탈하지 않는 한 다양한 형태로 실시할 수 있다.

1. 개요

「연골」은 관절, 흉곽벽, 추간판, 반월판, 또는 후두, 기도, 귀 등의 관상 구조에서 볼 수 있고, 유리 연골, 탄성 연골, 섬유 연골의 3종으로 분류할 수 있다. 예를 들면, 관절 연골은 유리 연골로서, 연골 세포, 콜라겐성의 세포외 매트릭스, 프로테오글리칸 및 물로 이루어지고, 혈관이 분포되어 있지 않다. 유리 연골은 타입 II 콜라겐이 풍부하고, 항타입 II 콜라겐 항체에 의해 염색되는 점, 프로테오글리칸를 염색하는 사프라닌-O 염색으로 적색으로 염색되는 점 등의 특징을 갖는다. 「연골 손상」이란, 가령이나 외상, 기타 다양한 요인에 의해 연골이 장해를 받고 있는 상태를 말하며, 예를 들면 어떠한 요인으로, 연골의 독특한 점탄성(하중이 걸리면 천천히 수축하고, 하중이 제거되면 천천히 원래대로 돌아감)이 저하되어, 가동성을 유지하면서 하중을 지지하는 데에 지장을 초래하는 등, 연골의 기능이 저하된 상태를 포함한다. 변형성 관절증, 류마티스 관절염 등의 질환에서도 연골 손상이 보인다.

본 발명에 있어서, 「관절 질환」이란, 연골, 연골 조직 및/또는 관절 조직(활막, 관절포, 연골 하골 등)이 기계적 자극이나 염증 반응에 의해 상해됨으로써 생기는 질환을 말한다. 「관절 질환 치료」란, 기계적 자극이나 염증 반응에 의해 상해된 조직의 각종 병태를 완화, 개선, 및/또는 치유하는 것을 말한다. 예를 들면, 변형성 관절증에서는 관절 연골의 마모, 연골 조직의 변성, 활막의 염증, 염증에 따른 동통 등의 병태가 복합적으로 발생한다. 한편, 어깨관절 주위염에서는 활막이나 관절포의 염증과 그에 따른 동통이 주이며, 연골의 마모나 변성은 보이지 않을 수도 있다. 류마티스 관절염은 아직도 그의 발증 메카니즘은 해명되지 않았지만, 자기면역 반응에 의한 염증성 사이토카인에 의해 활막 조직이나 연골 조직이 파괴되는 것으로 생각되고 있다. 이와 같이, 관절 질환은 복합적인 병태를 나타내는 질환으로서, 그의 치료약은 연골을 마모로부터 보호하는 효과, 마모나 염증에 의한 연골의 변성 변화를 억제하는 효과, 연골 손상부를 수복시키는 효과, 염증이나 동통을 억제하는 효과, 활막 조직의 변성을 억제하는 효과, 골연골 파괴를 억제하는 효과 등, 복합적인 효과를 함께 가질 것이 요구된다. 본 발명의, 「저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 함유하는 조성물」은 연골을 기계적 자극으로부터 보호하는 효과, 마모나 염증에 의한 연골의 변성 변화를 억제하는 효과, 연골 손상부를 수복시키는 효과, 관절 조직의 염증이나 동통을 억제하는 효과, 활막 조직의 변성을 억제하는 효과 및 골연골 파괴를 억제하는 효과를 함께 갖는다. 이에 따라, 관절 질환의 진행을 억제하고, 증상을 완화, 개선, 및/또는 치유할 수 있다. 특히 변형성 관절증의 치료, 어깨관절 주위염의 치료, 류마티스 관절염에서의 관절통의 완화, 류마티스 관절염의 치료에 유용하다.

또한, 「관절 내에 주입 투여한다」란, 유동성을 갖는 액상의 조성물을 관절강 내, 활액포 내, 건초 내 등에 주입하는 것을 말한다. 변형성 관절증 및 류마티스 관절염의 치료에 이용하는 경우에는 조성물을 관절강 내에 주입하여 적용하는 것이 바람직하다. 또한, 변형성 관절증 및 류마티스 관절염은 무릎, 어깨, 다리 가랑이, 허리, 발목, 손목, 손가락 등의 몸의 각 관절에 발생할 수 있지만, 본 발명의 조성물은 어느 관절에든 적용할 수 있다.

2. 알긴산의 1가 금속염

본 발명의 관절 질환 치료용 조성물에 함유되는 「알긴산의 1가 금속염」은 알긴산의 6위의 카르복실산의 수소 원자를, Na⁺나 K⁺ 등의 1가 금속 이온과 이온 교환함으로써 만들어지는 수용성의 염이다. 알긴산의 1가 금속염으로서는, 구체적으로는 알긴산나트륨, 알긴산칼륨 등을 들 수 있지만, 특히 시판품에 의해 입수 가능한 알긴산나트륨이 바람직하다.

본 발명에 이용하는 「알긴산」은 생분해성의 고분자 다당류로서, D-만누론산(M)과 L-글루론산(G)의 2종의 우론산이 직쇄상으로 중합한 중합체이다. 보다 구체적으로는, D-만누론산의 단독 중합체 분획(MM 분획), L-글루론산의 단독 중합체 분획(GG 분획), 및 D-만누론산과 L-글루론산이 랜덤하게 배열한 분획(MG 분획)이 임의로 결합한 블록 공중합체이다. 알긴산의 D-만누론산과 L-글루론산의 구성비(M/G비)는 주로 해조 등의 유래가 되는 생물의 종류에 따라 다르고, 또한 그 생물의 생육 장소나 계절에 의한 영향을 받아, M/G비가 약 0.4인 고 G형으로부터 M/G비가 약 5인 고 M형까지 광범위하게 걸쳐 있다.

알긴산의 1가 금속염은 고분자 다당류로, 분자량을 정확하게 정하는 것은 곤란하지만, 일반적으로 중량 평균 분자량으로 1만 내지 1000만, 바람직하게는 5만 내지 300만의 범위이다. 겔 여과 크로마토그래피에서의 중량 평균 분자량이 약 100만 및 약 170만인 알긴산나트륨은 분자량이 약 40만인 알긴산나트륨에 비하여 연골 변성 변화 억제 효과, 연골 보호 효과, 연골 수복 효과, 및 관절 동통 억제 효과가 우수하였다. 통상, 고분자 다당류의 분자량을 겔 여과 크로마토그래피에 의해 산출하는 경우, 10 내지 20％의 측정 오차가 생길 수 있다. 예를 들면, 40만이면 32 내지 48만, 50만이면 40 내지 60만, 100만이면 80 내지 120만 정도의 범위에서 값의 변동이 생길 수 있다. 따라서, 알긴산의 1가 금속염에 대하여, 관절 질환에 대한 효과가 특히 우수한 바람직한 중량 평균 분자량 범위는 적어도 50만 이상, 보다 바람직하게는 65만 이상, 더욱 바람직하게는 80만 이상이다. 너무 분자량이 큰 것은 제조가 곤란함과 동시에, 수용액으로 할 때에 점도가 너무 높아지거나, 용해성이 저하되는 등의 문제가 생기기 때문에, 중량 평균 분자량이 500만 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 300만 이하이다.

일반적으로 천연물 유래의 고분자 물질은 단일 분자량을 갖는 것이 아니라, 다양한 분자량을 갖는 분자의 집합체이기 때문에, 어느 일정 폭을 갖는 분자량 분포로서 측정된다. 대표적인 측정 방법은 겔 여과 크로마토그래피이다. 겔 여과 크로마토그래피에 의해 얻어지는 분자량 분포의 대표적인 정보로서는 중량 평균 분자량(Mw), 수 평균 분자량(Mn), 분산비(Mw/Mn)를 들 수 있다.

분자량이 큰 고분자의 평균 분자량으로의 기여를 중시한 것이 중량 평균 분자량이며, 하기 수학식으로 표시된다.

수 평균 분자량은 고분자의 총 중량을 고분자의 총수로 나누어 산출된다.

여기서, W는 고분자의 총 중량, Wi는 i번째의 고분자의 중량, Mi는 i번째의 용출 시간에서의 분자량, Ni는 분자량 Mi의 개수, Hi는 i번째의 용출 시간에서의 높이이다.

연골 손상부에서의 연골 재생 효과(특히 유리 연골 재생 효과), 관절 질환 치료에서의 연골 수복 효과, 연골 변성 변화 억제 효과, 및/또는 연골 보호 효과는 분자량이 큰 분자종의 기여가 크다고 생각되기 때문에, 분자량의 지표로서는 중량 평균 분자량을 이용하면 좋다.

천연물 유래의 고분자 물질의 분자량 측정에서는 측정 방법에 따라 값에 차이가 생길 수 있다고 알려져 있다(히알루론산의 예: Chikako YOMOTA et al., Bull. Natl. Health Sci., Vol.117, pp.135-139(1999), Chikako YOMOTA et al., Bull. Natl. Health Sci., Vol.121, pp.30-33(2003)). 알긴산염의 분자량 측정에 대해서는 고유 점도(intrinsic viscosity)로부터 산출하는 방법, SEC-MALLS(Size Exclusion Chromatography with Multiple Angle Laser Light Scattering Detection)에 의해 산출하는 방법이 기재된 문헌이 있다(ASTM F2064-00(2006), ASTM International 발행). 또한, 상기 문헌에서는 크기 배제 크로마토그래피(=겔 여과 크로마토그래피)에 의해 분자량을 측정함에 있어서는 플루란을 표준 물질로서 이용한 교정 곡선에 의해 산출하는 것 만으로는 불충분하다며, 다각도 광산란 검출기(MALLS)를 병용하는 것(=SEC-MALLS에 의한 측정)을 장려하고 있다. 또한, SEC-MALLS에 의한 분자량을, 알긴산염의 카탈로그 상의 규격치로 이용하고 있는 예도 있다(FMC 바이오폴리머사(Biopolymer), 프로노바(PRONOVA^TM) 알긴산나트륨 카탈로그(Sodium alginates catalog)).

본 발명자들은 분자량이 상이한 알긴산나트륨에 대하여 OA 모델 등에서 치료 효과에 차이가 있음을 발견하였고, 이들 알긴산에 대하여 겔 여과 크로마토그래피에 의한 분자량 측정과, SEC-MALLS에 의한 분자량 측정을 행하였다. 그 결과, 겔 여과 크로마토그래피에 의한 분자량 쪽이, 알긴산염의 점도나 치료 효과와의 관련성이 높음을 알 수 있었다. 즉, 관절 질환 치료용 조성물에 이용하는 알긴산염의, 바람직한 분자량 범위를 특정하는 파라미터로서는, 일반적으로 장려되고 있는 SEC-MALLS에 의한 측정보다, 겔 여과 크로마토그래피에 의한 분자량이 적합함을 새롭게 발견하였다. 따라서, 본 명세서 중에서 알긴산염의 분자량을 특정하는 경우에는 특별히 언급이 없는 한 겔 여과 크로마토그래피에 의해 산출되는 중량 평균 분자량이다.

겔 여과 크로마토그래피의 바람직한 조건은 실시예에 준한다. 대표적인 조건으로서는 플루란을 표준 물질로 한 교정 곡선을 이용하는 것을 들 수 있다. 표준 물질로서 이용하는 플루란의 분자량으로서는 적어도 160만, 78.8만, 40.4만, 21.2만 및 11.2만의 것을 표준 물질로서 이용하는 것이 바람직하다. 그 밖에, 용리액(200 mM 질산나트륨 용액), 컬럼 조건 등을 특정할 수 있다. 컬럼 조건으로서는, 폴리메타크릴레이트 수지계 충전제를 이용하고, 배제 한계 분자량 1000만 이상의 컬럼을 적어도 1개 이용하는 것이 바람직하다. 대표적인 컬럼은 TSKgel GMPWx1(직경 7.8 mm×300 mm)(도소 가부시끼가이샤 제조)이다.

알긴산의 1가 금속염은 갈조류로부터 추출되었을 당초에는 분자량이 크고, 점도가 높았으나, 열에 의한 건조, 동결 건조, 정제 등의 과정에서 분자량이 작아지고, 점도는 낮아진다. 따라서, 제조의 각 공정에서 적절한 온도 관리를 함으로써, 분자량이 상이한 알긴산의 1가 금속염을 제조할 수 있다. 제조의 각 공정에서의 온도가 낮아지도록 관리함으로써 분자량이 큰 알긴산의 1가 금속염이 얻어지고, 온도가 높아질수록 분자량이 작은 알긴산의 1가 금속염이 얻어진다. 또한, 원료로 하는 갈조류를 적절히 선택하거나, 또는 제조 공정에서 분자량에 의한 분획을 행하는 등의 수법에 의해서도, 분자량이 상이한 알긴산의 1가 금속염을 제조할 수 있다. 또한, 각 수법으로 제조한 알긴산의 1가 금속염에 대하여, 분자량 또는 점도를 측정한 후, 상이한 분자량 또는 점도를 갖는 다른 로트의 알긴산의 1가 금속염과 혼합함으로써, 목적으로 하는 분자량을 갖는 알긴산의 1가 금속염으로 하는 것도 가능하다.

본 발명에 이용하는 알긴산은 천연 유래 또는 합성물일 수 있지만, 천연 유래인 것이 바람직하다. 천연 유래의 알긴산으로서는, 예를 들면 갈조류로부터 추출되는 것을 들 수 있다. 알긴산을 함유하는 갈조류는 전세계 연안 지역에 무성하지만, 실제로 알긴산 원료로 사용할 수 있는 해조는 한정되어 있고, 남미의 레소니아, 북미의 마크로시스티스, 유럽의 라미나리아나 아스코필룸, 호주의 더빌리아 등이 대표적인 것이다. 알긴산의 원료가 되는 갈조류로서는, 예를 들면 레소니아(Lessonia)속, 마크로시스티스(Macrocystis)속, 라미나리아(Laminaria)속(다시마속), 아스코필룸(Ascophyllum)속, 더빌리아(Durvillea)속, 대황(Eisenia)속, 감태(Ecklonia)속 등을 들 수 있다.

3. 저엔도톡신 처리

본 발명의 관절 질환 치료용 조성물에 함유되는 알긴산의 1가 금속염은 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염이다. 저엔도톡신이란, 실질적으로 염증 또는 발열을 야기하지 않는 정도로까지 엔도톡신 레벨을 저하시킨 것이다. 즉, 저엔도톡신 처리에 제공된 것이다. 놀랍게도 저엔도톡신 처리함으로써, 조성물을 연골 손상부에 적용했을 때에, 연골 재생 작용을 보다 높일 수 있을 뿐만 아니라, 연골 하골의 재생이 촉진되어, 환부의 기계적 강도를 높일 수도 있음을 알 수 있었다. 즉, 본 발명의 조성물에 있어서 저엔도톡신 알긴산을 이용함으로써, 주위 연골에서의 변성이나 염증 반응이 적어, 생체 친화성이 높은 조성물로 할 수 있다.

저엔도톡신 처리는 공지된 방법 또는 그에 준하는 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 히알루론산나트륨을 정제하는 스가 등의 방법(예를 들면, 일본 특허 공개 (평)9-324001호 공보 등 참조), β1,3-글루칸을 정제하는 요시다 등의 방법(예를 들면, 일본 특허 공개 (평)8-269102호 공보 등 참조), 알기네이트, 젤란 검 등의 생체 고분자염을 정제하는 윌리엄 등의 방법(예를 들면, 일본 특허 공표 2002-530440호 공보 등 참조), 다당류를 정제하는 제임스 등의 방법(예를 들면, 국제공개 제93/13136호 공보 등 참조), 루이스 등의 방법(예를 들면, 미국 특허 제5589591호 명세서 등 참조), 알기네이트를 정제하는 허만 프랭크 등의 방법(예를 들면, Appl. Microbiol. Biotechnol. (1994), 40: 638-643 등 참조) 등 또는 이들에 준하는 방법에 의해 실시할 수 있다. 본 발명의 저엔도톡신 처리는 이들로 한정되지 않고, 세정, 필터(엔도톡신 제거 필터나 대전한 필터 등)에 의한 여과, 한외 여과, 컬럼(엔도톡신 흡착 친화성 컬럼, 겔 여과 컬럼, 이온 교환 수지에 의한 컬럼 등)을 이용한 정제, 소수성 물질, 수지 또는 활성탄 등으로의 흡착, 유기 용매 처리(유기 용매에 의한 추출, 유기 용제 첨가에 의한 석출·침강 등), 계면활성제 처리(예를 들면, 일본 특허 공개 제2005-036036호 공보 등 참조) 등 공지된 방법에 의해, 또는 이들을 적절히 조합하여 실시할 수 있다. 이들 처리 공정에, 원심 분리 등 공지된 방법을 적절히 조합할 수도 있다. 알긴산의 종류에 맞춰 적절히 선택하는 것이 바람직하다.

엔도톡신 레벨은 공지된 방법으로 확인할 수 있고, 예를 들면 리물루스 시약(LAL)에 의한 방법, 엔도스페시(등록상표) ES-24S 세트(세이가가꾸 고교 가부시끼가이샤)를 이용하는 방법 등에 의해 측정할 수 있다. 본 발명의 조성물에 함유되는 알긴산의 엔도톡신의 처리 방법은 특별히 한정되지 않지만, 그 결과로서, 알긴산의 1가 금속염의 엔도톡신 함유량이, 리물루스 시약(LAL)에 의한 엔도톡신 측정을 행한 경우에, 500 엔도톡신 단위(EU)/g 이하인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 100 EU/g 이하, 특히 바람직하게는 50 EU/g 이하, 특히 30 EU/g 이하이다. 저엔도톡신 처리된 알긴산나트륨은, 예를 들면 씨 매트릭스(Sea Matrix)(멸균)((주) 키미카 (주) 모치다 인터내셔날), 프로노바^TM UP LVG (FMC) 등 시판품에 의해 입수 가능하다.

4. 알긴산의 1가 금속염의 용액의 제조

본 발명의 관절 질환 치료용 조성물은 알긴산의 1가 금속염의 용액을 이용하여 제조할 수 있다. 알긴산의 1가 금속염의 용액은 공지된 방법 또는 그에 준하는 방법에 의해 제조할 수 있다. 즉, 본 발명에서 사용되는 알긴산의 1가 금속염은 상술한 갈조류를 이용하여, 산법, 칼슘법 등 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 이들 갈조류로부터 탄산나트륨 수용액 등의 알칼리 수용액을 이용하여 추출한 후, 산(예를 들면, 염산, 황산 등)을 첨가함으로써 알긴산을 얻을 수 있고, 알긴산의 이온 교환에 의해 알긴산의 염을 얻을 수 있다. 상술한 바와 같이 저엔도톡신 처리를 행한다. 알긴산의 염의 용매는 생체에 적용 가능한 용매이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 정제수, 증류수, 이온 교환수, 밀리 Q물, 생리 식염수, 인산 완충 생리 식염수(PBS) 등을 들 수 있다. 이들은 멸균된 것이 바람직하고, 저엔도톡신 처리된 것이 바람직하다. 예를 들면, 밀리 Q물을 여과 멸균하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물을 얻기 위한 조작은 모두 엔도톡신 레벨, 및 세균 레벨이 낮은 환경 하에서 행하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 조작은 클린 벤치에서 멸균 기구를 사용하여 행하는 것이 바람직하고, 사용하는 기구를 시판되는 엔도톡신 제거제로 처리할 수 있다.

바람직한 엔도톡신 레벨을 나타낼 때까지 정제한 알긴산의 1가의 염을 이용하여 상기한 바와 같이 조성물을 제작한 경우에는, 조성물의 엔도톡신 함유량은 통상적으로 500 EU/g 이하이고, 더욱 바람직하게는 300 EU/g 이하, 특히 바람직하게는 150 EU/g 이하이다.

5. 관절 질환 치료용 조성물의 점도

본 발명의 관절 질환 치료용 조성물을 관절 내에 주입하는 경우의 점도는 관절 질환의 치료 효과가 얻어지면 특별히 한정은 되지 않지만, 바람직하게는 100 mPa·s 내지 20000 mPa·s이다. 예를 들면, 상기 용매 등을 이용하여 적절한 점도로 제조할 수 있다. 이러한 점도 범위이면, 시린지 등으로 관절 내에 주입할 수 있다. 바람직하게는 150 mPa·s 내지 15000 mPa·s, 보다 바람직하게는 200 mPa·s 내지 10000 mPa·s, 특히 바람직하게는 250 mPa·s 내지 6000 mPa·s이다. 적절한 점도로 함으로써 관절액의 쿠션으로서의 기능을 보충하는 효과도 이룰 수 있고, 관절액 중에 분산한 상태에서 관절 질환을 치료하는 효과를 발휘하는 것이 가능해진다.

관절 질환 치료용 조성물의 점도는, 예를 들면 알긴산의 1가 금속염의 용액 중의 알긴산 농도, 알긴산의 분자량 등을 제어함으로써 조정할 수 있다.

알긴산의 1가 금속염의 용액의 점도는 용액 중의 알긴산 농도가 높은 경우에 높아지고, 용액 중의 알긴산 농도가 낮은 경우에 낮아진다. 알긴산의 1가 금속염의 용액 중의 바람직한 알긴산 농도는 분자량의 영향을 받기 때문에, 일률적으로는 말할 수 없지만, 대략 0.2％ w/v 내지 5％ w/v 정도이고, 더욱 바람직하게는 0.5％ w/v 내지 3％ w/v 정도이고, 특히 바람직하게는 1％ w/v 내지 2.5％ w/v이다.

낮은 농도의 알긴산의 1가 금속염의 용액에 의해 높은 점도의 조성물을 얻기 위해서는 분자량이 높은 알긴산의 1가 금속염을 선택할 수 있다. 알긴산의 1가 금속염의 용액의 점도는 M/G비에 의해 영향을 받기 때문에, 예를 들면 용액의 점도 등에 따라 바람직한 M/G비를 갖는 알긴산을 적절히 선택할 수 있다. 본 발명에 이용하는 알긴산의 M/G비는 약 0.4 내지 4.0이고, 바람직하게는 약 0.8 내지 3.0, 보다 바람직하게는 약 1.0 내지 1.6이다.

상술한 바와 같이, M/G비가 주로 해조의 종류에 따라 결정되는 점 등에서, 원료로서 이용되는 갈조류의 종류는 알긴산의 1가 금속염의 용액의 점도에 영향을 미친다. 본 발명에서 사용되는 알긴산으로서는, 바람직하게는 레소니아속, 마크로시스티스속, 라미나리아속, 아스코필룸속, 더빌리아속의 갈조 유래이며, 보다 바람직하게는 레소니아속의 갈조 유래이고, 특히 바람직하게는 레소니아 니그레센즈(Lessonia nigrescens) 유래이다.

6. 알긴산의 1가 금속염 함유 관절 질환 치료용 조성물의 제제화 및 적용

본 발명의 관절 질환 치료용 조성물은 인간 또는 인간 이외의 생물, 예를 들면 소, 원숭이, 새, 고양이, 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터, 돼지, 개, 토끼, 양, 말 등의 비인간 포유동물의 관절 내에 주입 투여하여, 관절 질환의 치료를 행하기 위해 이용된다.

본 발명의 관절 질환 치료용 조성물의 형태는 유동성이 있는 액체상, 즉 용액상이다. 본 발명에 있어서 「유동성을 갖는다」란, 그의 형태를 부정형으로 변화시키는 성질을 갖는 것을 의미한다. 바람직하게는, 예를 들면 조성물을 시린지 등에 봉입하고, 환부로 주입할 수 있는 것과 같은 유동성을 갖는 것이 바람직하다. 용액상인 본 발명의 조성물은 시린지, 겔용 피펫, 전용 주사기 등으로 관절 내에 용이하게 적용할 수 있다.

본 발명의 관절 질환 치료용 조성물은 변형성 관절증, 어깨관절 주위염, 류마티스 관절염 등의 관절 질환에 있어서, 연골의 수복 효과, 연골 변성 변화의 억제 효과, 연골 보호 효과, 관절 조직의 염증을 억제하는 효과, 관절 조직의 염증에 의한 동통을 억제하는 효과, 활막 조직 변성의 억제 효과, 및/또는 골연골 파괴 억제 효과를 가지며, 관절 질환의 치료 효과를 발휘한다. 이들의 복합적인 효과를 통해 관절 기능을 개선하고, 관절 파괴를 억제한다.

본 발명의 관절 질환 치료용 조성물의 양태 중 하나는, 변형성 관절증 치료용 조성물이다. 변형성 관절증과 같이 연골 손상이 관절 연골의 광범위에 걸쳐 있는 경우, 또는 분명한 연골 결손은 생기지 않지만, 연골 표면의 평활함이 흐트러져 변성 변화가 시작되고 있는 것과 같은, 비교적 초기의 변형성 관절증에 자주 보이는 타입의 연골 손상을 치료하고자 하는 경우에는, 본 발명의 조성물을 관절강 내에 주입하여, 관절액 내에 미치도록 적용하는 것이 바람직하다. 알긴산의 1가 금속염이 연골 손상부에 접촉함으로써, 연골 손상부에서의 관절의 수복을 촉진하고, 염증이나 마모에 의한 연골의 변성 변화를 억제하여, 연골을 보호한다. 또한, 유효 성분인 알긴산의 1가 금속염이 관절액 내에 미침으로써, 활막 조직을 포함한 주변 조직의 염증 반응을 억제하고, 동통을 억제하는 효과를 발휘한다. 동시에, 관절액 내에 알긴산의 1가 금속염이 존재함으로써, 쿠션 및 윤활유로서의 관절액의 기능을 보충하는 역할을 한다.

본 발명의 관절 질환 치료용 조성물의 다른 양태 중 하나는, 어깨관절 주위염 치료용 조성물이다. 어깨관절 주위염에서는 활막이나 관절포의 염증과 이에 따른 동통이 주이며, 연골의 마모나 변성은 보이지 않을 수도 있다. 알긴산의 1가 금속염은 활막 조직을 포함한 주변 조직의 염증 반응을 억제하고, 동통을 억제하는 효과를 발휘하기 때문에, 본 발명의 조성물을 어깨 관절강 내, 견봉하 활액포 내, 또는 상완이두근 장두건 건초내 등에 투여함으로써, 어깨관절 주위염을 치료할 수 있다.

본 발명의 관절 질환 치료용 조성물의 다른 양태 중 하나는, 관절 동통 억제용 조성물이다. 관절 동통은 상술한 바와 같은 변형성 관절증, 어깨관절 주위염 등 외에 류마티스 관절염에 있어서 종종 문제가 된다. 본 발명의 바람직한 양태의 하나는 류마티스 관절염에서의 관절 동통의 치료용 조성물이고, 특히 바람직하게는 만성 류마티스 관절염에서의 무릎 관절 동통 억제용 조성물이다. 류마티스 관절염은 아직도 그의 발증 메카니즘은 해명되지 않았지만, 자기 면역 반응에 의한 염증성 사이토카인에 의해 활막 조직이나 연골 조직이 파괴되는 것으로 생각되고 있다. 알긴산의 1가 금속염은 활막 조직을 포함한 주변 조직의 염증 반응을 억제하고, 동통을 억제하는 효과를 발휘하기 때문에, 본 발명의 조성물을, 류마티스 관절염을 앓고 있는 관절 내에 투여함으로써, 염증 반응과 그에 따른 동통을 억제할 수 있다.

본 발명의 관절 질환 치료 조성물의 다른 양태 중 하나는, 류마티스 관절염 치료용 조성물이다. 본 발명의 조성물은 자기면역 반응에 따른 활막 조직의 변성을 억제하고, 골연골 파괴를 억제한다. 또한, 자기면역 반응에 의해 관절 조직에 변성이 생기면, 관절 본래의 매끄러운 움직임을 할 수 없게 되어, 연골에 변형성 관절증과 동일한 기계적 손상이 가해지게 된다. 본 발명의 조성물은 이러한 연골 손상부에서의 관절의 수복을 촉진하여, 염증이나 마모에 의한 연골의 변성 변화를 억제하고, 연골을 보호한다. 본 발명의 조성물은 이러한 복합적인 효과를 통해 류마티스 관절염에서의 관절 파괴를 억제하고, 치료 효과를 발휘한다.

본 발명의 관절 질환 치료 조성물의 다른 양태 중 하나는, 관절 질환에 따른 각종 병태를 완화, 개선, 및/또는 치유하는 조성물이다. 관절 질환에서는 연골, 연골 조직 및/또는 관절 조직(활막, 관절포, 연골하골 등)이 기계적 자극이나 염증 반응에 의해 상해되어, 관절 연골의 마모, 기계적 자극이나 염증 반응에 의한 연골 조직의 변성 변화, 활막 등 관절 조직의 염증, 염증에 따른 관절 동통, 활막 조직의 변성, 골연골 조직의 파괴 등의 병태가 복합적으로 발생한다. 본 발명의 조성물은 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하고, 연골을 기계적 자극으로부터 보호하는 효과, 마모나 염증에 의한 연골의 변성 변화를 억제하는 효과, 연골 손상부를 수복시키는 효과, 관절 조직의 염증이나 동통을 억제하는 효과, 활막 조직의 변성을 억제하는 효과, 및 골연골 파괴를 억제하는 효과를 더불어 갖는다. 이에 따라, 관절 질환의 진행을 억제하여, 증상을 완화, 개선, 및/또는 치유할 수 있다. 또한, 본 발명의 관절 질환 치료 조성물은 이들 병태의 완화, 개선, 및/또는 치유를 통해 관절 기능을 개선하는 효과를 갖는다. 관절 기능의 개선이란, 관절 가동 영역의 개선, 일상 생활 동작의 개선 등을 의미한다.

본 발명의 관절 질환 치료용 조성물을 관절 내에 적용하는 경우에는, 투여량은 투여 대상이 되는 관절의 관절액 등의 양에 따라 적절히 결정하면 좋고, 특별히 한정되지 않지만, 인간 무릎 관절이나 어깨관절에 투여하는 경우에는 통상 1 내지 5 mL, 보다 바람직하게는 2 내지 3 mL이다. 또한, 투여는, 예를 들면 1주일마다 연속 5회 연속적으로 행하고, 그 후 2 내지 4주일에 1회를 계속하는 방법을 취할 수 있다. 특별히 여기에 한정되는 것은 아니며, 증상과 효과에 따라 적절히 증감 가능하다. 예를 들면, 2주에 1회, 1개월에 1회, 2개월에 1회, 3개월에 1회, 또는 6개월에 1회의 투여를 적절히 계속하는 방법도 취할 수 있다. 알긴산은 동물의 체내에 원래 존재하지 않는 물질이기 때문에, 동물은 알긴산을 특이적으로 분해하는 효소를 보유하고 있지 않다. 알긴산은 동물 체내에서는 통상의 가수분해에 의해 서서히 분해되지만, 히알루론산 등의 중합체에 비해 체내의 분해가 완만하여, 관절 내에 투여했을 경우, 장기간의 효과 지속을 기대할 수 있다.

본 발명의 관절 질환 치료용 조성물은 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 한다. 본 발명자들은 알긴산을 생체의 관절 내에 투여한 경우에, 알긴산 자체가 연골 조직 및 관절 조직으로의 치료 효과를 발휘하는 것을 처음으로 발견하였다. 알긴산의 1가 금속염이란, 바람직하게는 알긴산나트륨이고, 더욱 바람직하게는 겔 여과 크로마토그래피에서의 중량 평균 분자량이 50만 이상인 알긴산나트륨이다. 유효 성분으로서 함유한다란, 알긴산이 환부에 적용되었을 때에, 연골 조직 및 관절 조직으로의 치료 효과를 발휘할 수 있는 양으로 함유될 수 있고, 적어도 조성물 전체의 0.1％ w/v 이상인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 0.5％ w/v 이상, 특히 바람직하게는 1 내지 3％ w/v이다.

본 발명의 연골 재생용 또는 연골 질환 치료용 조성물에는, 필요에 따라 다른 의약 활성 성분이나, 관용의 안정화제, 유화제, 삼투압 조정제, 완충제, 등장화제, 보존제, 무통화제, 착색제 등 통상적으로 의약에 이용되는 성분을 본 발명의 조성물에 함유시킬 수도 있다.

또한, 본 발명의 일 양태에서는 본 발명의 조성물은 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염 이외에, 연골 또는 관절 조직에 대하여 약리 작용을 발휘하는 성분을 포함하지 않는다. 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염만을 유효 성분으로서 함유하는 조성물에서도 충분한 관절 질환 치료 효과를 발휘할 수 있다.

예를 들면, 시술의 수법이 간편하고, 생체에 대해서도 연골 세포, 골막 채취, 골수 채취 등의 과도한 부담을 주지 않고, 생체 유래나 배양 공정 유래의 바이러스 등의 감염 위험을 경감시키기 위해서는 세포를 함유하지 않는 조성물로 하는 것이 바람직하다. 세포란, 구체적으로는 연골 조직 재생을 위한 세포로서, 예를 들면 골수 간엽계 줄기 세포, 골수 간엽계 간질 세포, 연골 전구 세포, 연골 세포, 활막 세포, 혈구계 줄기 세포, ES 세포 등의 세포를 들 수 있다. 본 발명의 관절 질환 치료용 조성물은 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로 하는 조성물로서, 알긴산 자체에 관절 질환의 치료 효과가 있음을 발견한 데에 기초하고 있다. 바람직한 치료용 조성물의 예는, 겔 여과 크로마토그래피에서의 중량 평균 분자량이 50만 이상인, 저엔도톡신 알긴산나트륨을 유효 성분으로서 함유하고, 세포를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는, 관절 내에 주입 투여하는, 관절 질환 치료용 조성물로서, 종래 이용되고 있는 히알루론산 제제보다 우수한 치료 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명의 관절 질환 치료용 조성물은 알긴산의 1가 금속염에 대한 경화제를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 알긴산의 1가 금속염에 대한 경화제란, 알긴산의 1가 금속염과 용액 중에서 공존시키면, 알긴산을 경화시키거나 또는 겔화시키는 성분을 말하며, Ca^{2 +}, Mg^{2 +}, Ba^{2 +}, Sr^{2 +} 등의 2가 이상의 금속 이온 화합물, 분자 내에 2 내지 4개의 아미노기를 갖는 가교성 시약 등을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, CaCl₂, MgCl₂, CaSO₄, BaCl₂, 글루콘산칼슘, 알긴산칼슘염 등을 들 수 있다. 이들 성분을 알긴산이 경화/겔화하는 정도까지 함유하면, 알긴산의 겔화에 의해 시린지 등으로의 주입이 곤란해지거나, 관절 내에서 알긴산이 다량으로 고화함으로써 관절의 기능을 방해하는 등의 문제가 생길 수 있다. 경화성의 조성물은 연골 결손부 등의 구멍에 충전하여 이용하는 데에는 적합하다. 한편, 본 발명의 조성물과 같이, 관절 내에 미치게 하여, 변형성 관절증이나 류마티스 관절염의 관절 조직 전체로 복합적인 치료 효과를 발휘시키기 위해서는 조성물 자체는 비경화성인 것이 바람직하다. 일반적인 약제 용해액에는 극히 미량의 2가 금속 이온 등이 포함될 수도 있지만, 알긴산의 1가 금속염의 경화/겔화를 의도한 첨가가 아닌 한, 여기서 말하는 경화제에는 해당하지 않는다. 본 발명의 조성물의 바람직한 양태 중 하나는, 알긴산의 1가 금속염의 경화제를, 알긴산이 경화/겔화하는 정도로까지 함유하지 않는 조성물이다. 환원하면, 본 발명의 조성물의 바람직한 양태의 하나는 비경화성 조성물이다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 관절 질환 치료용 조성물을 이용하는, 관절 질환의 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 관절 질환의 치료 방법은 상기 본 발명의 관절 질환 치료용 조성물을 관절 내에 투여함으로써, 관절 질환의 진행을 억제하여, 증상을 완화, 개선, 및/또는 치유한다. 상기 본 발명의 관절 질환 치료용 조성물을 관절 내에 투여함으로써, 연골 변성 변화의 억제, 연골의 보호, 연골의 수복, 관절 동통의 억제, 관절 염증의 억제, 활막 조직 변성의 억제, 및 골연골 파괴의 억제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효과를 발휘, 관절 질환의 진행을 억제하여, 증상을 완화, 개선, 및/또는 치유한다. 이들의 복합적인 효과를 통해 관절 기능을 개선하고, 관절 파괴를 억제한다.

본 발명의 관절 질환 치료용 조성물을 관절 내에 적용하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 시린지, 겔용 피펫, 전용 충전기 등으로 관절 내에 직접 주입하도록 할 수 있다. 관절 내에 주입하여 적용하는 경우, 18G 내지 27G의 바늘을 사용하는 것이 바람직하다. 「관절 내에 주입 투여한다」란, 유동성을 갖는 액상의 조성물을 관절강 내, 활액포 내, 건초 내 등에 주입하는 것을 말한다. 변형성 관절증 및 류마티스 관절염의 치료에 이용하는 경우에는 조성물을 관절강 내에 주입하여 적용하는 것이 바람직하다. 또한, 변형성 관절증 및 류마티스 관절염은 무릎, 어깨, 다리 가랑이, 허리, 발목, 손목, 손가락 등의 몸의 각 관절에 발생할 수 있지만, 본 발명의 조성물은 어느 관절에든 적용할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물을 투여하기 전에, 또는 동시에, 또는 후에 스트렙토마이신, 페니실린, 토브라마이신, 아미카신, 겐타마이신, 네오마이신, 및 암포테리신 B 등의 항생 물질, 아스피린, 비스테로이드성 해열 진통제(NSAIDs), 아세트아미노펜 등의 항염증약, 스테로이드제 등의 병용약을 투여하도록 할 수도 있다. 이들 약제는 본 발명의 조성물에 혼입하여 사용할 수 있다.

7. 관절 질환 치료용 키트

또한, 본 발명은 관절 질환 치료용 키트를 제공한다. 키트에는 상기 본 발명의 관절 질환 치료용 조성물, 시린지, 겔용 피펫, 전용 충전기, 취급 설명서 등을 포함할 수도 있다. 키트로서 바람직한 구체예로서는, 일체 성형되고, 격벽에 의해 구획된 2개의 방으로 이루어지는 시린지의 1실에 알긴산의 1가 금속염을 봉입하고, 다른 쪽 방에 용해액으로서의 생리 식염액을 포함하는 용액을 봉입하고, 양쪽 방의 격벽을 사용시 용이하게 개통할 수 있도록 구성하여, 사용시 양자를 혼합·용해시켜 이용할 수 있는 키트로 한다. 다른 예로서는, 알긴산의 1가 금속염 용액을 프리필드 시린지에 봉입하여, 사용시에 조제 조작없이 그대로 투여할 수 있는 키트로 한다. 또한, 키트에는 스트렙토마이신, 페니실린, 토브라마이신, 아미카신, 겐타마이신, 네오마이신, 및 암포테리신 B 등의 항생 물질, 아스피린, 비스테로이드성 해열 진통제(NSAIDs), 아세트아미노펜 등의 항염증약, 스테로이드제 등의 병용약을 포함시킬 수도 있다.

본 키트를 이용함으로써, 관절 질환 치료를 원활히 행할 수 있다.

또한, 본 명세서에 있어서 인용한 모든 간행물, 예를 들면 선행기술문헌 및 공개공보, 특허공보 그 밖의 특허문헌은 그 전체가 본 명세서에서 참조로서 도입된다. 또한, 본 명세서는 일본 특허출원인 특원 제2007-277005호 및 국제특허출원인 PCT/JP2008/52999의 개시 내용을 포함한다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

토끼 연골 수복 모델

(1) 이식 세포의 제조

이식 세포로 하기 위해, 골수 간엽계 간질 세포(BMSC: Bone marrow mesenchymal stromal cell)를 단리하여 배양하였다. BMSC에는 골수 간엽계 줄기 세포 외에도 혈구계 세포 등도 포함된다. 4개월령의 일본 흰토끼의 경골로부터 골수 10 mL를 채취하고, Ca·Mg 부재 PBS(Gibco BRL Lab.)로 2회 세정한 후, DMEM-high glucose(DMEM-HG, Sigma Chemical, St.Louis, MO)에 현탁시켰다. 혈액 덩어리를 공경 70 ㎛의 셀 스트레이너(Falcon Co., Ltd.)에 의해 제거하였다. 세포를, DMEM-HG, 10％ 소 태아 혈청(FBS, Gibco, Life Technology, Grand Island, NY), 1％ 항생 물질(Penicillin-Streptomycin-Fungizone 100X concentrated, Cambrex Biosciences, Walkersville, MD)의 배양 배지 중, 100 mm의 배양 접시에서 37℃, 5％ CO₂, 가습하에서 배양하였다. 배양 배지를 3일 마다 교환하고, 접착성이 없는 세포를 제거하였다. 접착성이 있는 세포를 10 내지 14일간 단층 배양한 후, 트립신·EDTA(10 mM)(Sigma, UK)로 벗겨내어 계수하고, 3일 마다 계대하였다.

(2) 방법

(시술)

암컷 일본 흰토끼 40마리(체중 2.6 내지 2.9 kg)를 이소플루란·O₂ 가스와 펜토바르비탈 정맥 주사(0.05 mg/kg)에 의해 마취하고, 항생 물질(Penicillin G, Meiji-Seika, Japan)의 근육 주사 후, 다리 털을 깍았다. 앞 중앙부를 2 cm 절개하고, 방내측 슬개 접근법에 의해 과간부에 도달하였다. 파워 드릴(Rexon, Japan)을 사용하여, 대퇴골 도르래의 골연골 결손(직경 5 mm, 깊이 2 mm)을 제조하였다. 무릎을 생리 식염수로 적시고, 결손부에 출혈이 없는 것을 확인하고, 결손부를 건조시켰다.

본 실시예에서는 이하의 5군으로 나누어 실험을 행하였다.

A) 대조군(empty),

B) 식품 등급 알긴산군(세포 부재),

C) 식품 등급 알긴산+세포 존재(2.5×10⁷개/mL)군,

D) 정제 알긴산군(세포 부재),

E) 정제 알긴산+세포 존재(2.5×10⁷개/mL)군

A)의 대조군은 결손부에 아무것도 적용하지 않은 것이다. 또한, B)의 식품 등급 알긴산군(세포 부재)은 2％ w/v의 식품 등급의 알긴산나트륨 용액을 결손부에 적용한 것, D)의 정제 알긴산군(세포 부재)은 2％ w/v의 정제 알긴산나트륨 용액을 결손부에 적용한 것이다. 식품 등급의 알긴산은 와코 준야꾸 고교(주), 알긴산나트륨 500(번호 199-09961)을 이용하고, 정제 알긴산은 (주) 키미카 (주) 모치다 인터내셔날, 씨 매트릭스(멸균)(제조번호 B5Y01)를 이용하였다. 또한, C) 식품 등급 알긴산+세포 존재군, E) 정제 알긴산+세포 존재군은, (1)에서 얻어진 세포를 2％ w/v의 식품 등급의 알긴산나트륨 용액 또는 2％ w/v의 정제 알긴산나트륨 용액에 현탁시키고, 관절 연골의 결손부에 적용한 것이다. 시판되는 LAL 어세이 키트(Limulus Color KY Test Wako, Wako, Japan)에 의해 엔도톡신 레벨을 측정한 바, 정제 알긴산나트륨에서는 5.76 EU(엔도톡신 단위)/g, 식품 등급 알긴산나트륨에서는 75950 EU/g으로서, 정제 알긴산나트륨의 엔도톡신 레벨은 식품 등급의 알긴산나트륨에 비해 매우 낮았다. 즉, 정제 알긴산나트륨은 저엔도톡신 처리된 것이었다. 또한, 정제 알긴산나트륨의 중금속 함량은 20 ppm 이하이고, 황산납은 0.98％ 이하, 비소는 2 ppm 이하였다.

알긴산나트륨 용액의 농도를 2％ w/v로 한 것은 점도를 시술에 적합한 5000 mPa·s 내지 6000 mPa·s로 할 수 있기 때문이다. 결손부가 위를 향하는 자세로 토끼를 고정하고, 겔용 피펫을 이용하여 각 조성물을 결손부에 적용하였다.

B) 내지 E)의 각 군 모두 알긴산나트륨 용액의 점도가 적절하였기 때문에, 관절액으로 인해 흐르기 쉬운 조건에도 불구하고, 알긴산나트륨 용액이 결손부로부터 흐르는 일은 없었다. 그 후, 이식편의 표면에 100 mM의 CaCl₂ 용액 약 0.5 ml를 27G 바늘의 주사기로 10초간 천천히 계속 적용시켰다. 이식편의 표면층은 즉시 겔화하여, 이식 세포가 환부로부터 떨어지는 일은 없었다. 생리 식염수로 CaCl₂ 용액을 세정하였다. 추가적인 고정은 필요 없었고, 시술 후 환부를 봉합하였다. 토끼는 자유롭게 움직일 수 있었다.

피검체 토끼에게, 시술 후 4주 후 또는 12주 후에 과량의 펜토바르비탈을 정맥 주사하여 안락사시켰다. 그리고, 그의 대퇴 말단부를 동력 톱으로 절제하였다.

(전체 관찰)

육안으로 외관 전체를 관찰하여 스코어화하였다. 스코어화는 가브리엘 G.(Gabriele G.) 등의 방법(Biomaterial, 21(2000), 2561-2574)을 참고로 도 1의 기준에 의해 득점화하였다.

(염색)

그 후, 피검체를 파라포름알데히드로 고정하고, 탈회, 파라핀 고정하였다. 결손부 중앙으로부터 5 μm 부분을 사프라닌 O, H-E 염색, 항타입 I 콜라겐, 항타입 II 콜라겐 면역 염색을 실시하였다. 새롭게 형성한 연골 조직을 평가하기 위해, 도 2에 기재한 스코어링 시스템을 사용하여 현미경으로 평가하였다. 스코어링은 독립적인 블라인드된 관찰자가 행하였다.

(기계적 강도 측정)

환부의 기계적 강도를 압입 테스트에 의해 측정하였다. 대퇴골 무릎 관절을 위를 향하게 하여 견고하게 클램프 고정하였다. 실험은 실온에서 행하였다. 압입자(indentator)를 자동으로 재생 연골의 중심을 향하여 움직이게 하고, 부하(N)에 대한 이동(mm)을 기록하였다. 신생된 조직의 두께는 조직 절편으로부터 계측하였다. 부하-변형 곡선의 직선 부분으로부터 영 계수(Young's modulus)를 얻었다.

(3) 결과

염색 결과를 도 3 내지 6에 나타내었다.

H-E 염색, 사프라닌 O 염색, 항 타입 II 콜라겐 면역 염색의 결과, E)의 정제 알긴산+세포 존재군(도 6)에 있어서, 4주 후의 빠른 단계부터, 다른 군과 비교하여 가장 우수한 유리 연골, 타입 II 콜라겐의 형성이 확인되었다. 12주에는 약 80％의 연골 재생이 보였다. H-E 염색 결과로부터, 연골 하골의 형성도 매우 양호함을 알 수 있다. 사프라닌 O 염색에서는 프로테오글리칸의 형성이 보였고, 세포외 매트릭스의 형성도 확인할 수 있다. 한편, H-E 염색, 항타입 I 콜라겐 면역 염색에 따르면, 섬유 연골의 형성은 거의 보이지 않았다.

D)의 정제 알긴산군(세포 부재)(도 5)은, C)의 식품 등급 알긴산+세포 존재군(도 4)과 비교하여 유리 연골, 타입 II 콜라겐, 연골하골의 형성 모두 양호하였다. 세포를 포매하지 않는 D)군에 있어서, 유리 연골 세포에 의한 연골 재생이 얻어진 것은 놀랄만한 결과였다. 또한, 세포를 포매하지 않는 D)군이, 세포를 포매한 C)군과 비교하여 연골 손상의 재생 능력이 우수한 것은 예상 밖의 결과였다.

한편, 결손부에 아무것도 적용하지 않은 A) 대조군(도 3)은 연골 세포, 타입 II 콜라겐의 신생은 거의 보이지 않았다.

육안으로 외관 전체를 관찰하여 스코어화한 평가 결과(Macro), 및 상기 염색에 의한 관찰을 스코어화한 평가 결과(Histological)를 도 7에 나타내었다.

12주에서의, Macro와 Histological의 결과를 합한 종합 스코어(total score)는 E) 정제 알긴산+세포 존재군 22.71점, D) 정제 알긴산군(세포 부재) 19.57점, C) 식품 등급 알긴산+세포 존재군 14.75점, B) 식품 등급 알긴산군(세포 부재) 10.25점, A) 대조군(empty) 8.43점으로, E) 정제 알긴산+세포 존재군이 가장 우수하였고, 이어서 D) 정제 알긴산군(세포 부재), C) 식품 등급 알긴산+세포 존재군의 순이었다. 세포를 포매하지 않는 D)군이, 세포를 포매하는 C)군과 비교하여 종합 스코어(total score)에서 우수하였고, 연골 손상의 재생 능력이 우수한 것은 전혀 예상 밖의 결과였다.

육안에 의한 외관 전체의 평가(Macro-total), 염색에 의한 평가(Histological-total) 모두 스코어화 결과는 모두 상기와 마찬가지로 E) 정제 알긴산+세포 존재군이 가장 우수하였고, 이어서 D) 정제 알긴산군(세포 부재)의 순이었다.

Macro의 평가 항목을 보면, 정제 알긴산을 이용한 D)군 및 E)군은, 식품 등급 알긴산을 이용한 B)군, C)군과 비교하여 단부 융합(신생 세포, 원래의 연골에 대한 것)((Edge Integration (new tissue relative to native cartilage)), 연골 표면의 매끄러움(Smoothness of cartilage surface), 연골 표면, 충전도(Cartilage surface, degree of filling), 연골의 색, 신생 연골의 불투명함, 투명성(color of cartilage, opacity or translucency of the neocartilage)의 모든 항목에서 우수하였다.

Histological의 평가 항목을 보면, 정제 알긴산을 이용한 D)군 및 E)군은, 특히 지배적인 조직의 성질(Nature of predominant tissue), 표면의 질서(surface regularity), 구조적인 완전성, 균질성(Structural integrity, homogeneity), 두께(Thickness), 주위 연골로의 결합(Bonding to adjacent cartilage), 주위 연골에서의 변성 변화(degenerative changes in adjacent cartilage), 염증 반응(Inflammatory response)의 항목에 있어서, 식품 등급 알긴산을 이용한 B)군, C)군을 상회하는 높은 스코어였다.

이상으로부터, D)군, E)군은 유리 연골, 타입 II 콜라겐, 연골 하골의 형성 등, 연골 손상에서의 연골 세포, 연골 조직의 형성이 매우 양호하였다. 섬유 연골의 형성은 거의 보이지 않았다.

정제 알긴산은 신생한 조직의 호스트 조직으로의 융합성이 좋고, 주위 연골에서의 변성이나 염증 반응이 적어, 생체 친화성이 높음을 알 수 있다.

정제 알긴산군 D)군, E)군에 대한 기계적 강도 측정 결과를 도 8에 나타내었다.

정제 알긴산군에 대한 기계적 강도 측정 결과, 정상적인 연골 조직의 영 계수 10에 대하여 E) 정제 알긴산+세포 존재군은 8로, 거의 손상이 없는 정상적인 상태로까지 강도의 회복이 보였다. 이 점에서, 세포를 포매한 본 발명의 조성물은 기계적 강도가 우수하여 강도가 있는 유리 연골이 재생되었고, 연골 하골의 형성도 양호한 것이 뒷받침되었다.

정제 알길산나트륨의 분자량 분포 측정

(1) 방법

정제 알긴산나트륨의 분자량 분포 측정을 이하의 조건으로 겔 여과 크로마토그래피(Gel Filtlation Chromatography)에 의해 행하였다.

컬럼: TSKgel GMPWx1 2개＋TSKgel G2500PWx1 1개(도소 가부시끼가이샤 제조)

(직경 7.8 mm×300 mm×3개)

컬럼 온도: 40℃

용리액: 200 mM 질산나트륨 수용액

시료 농도: 0.05％

유속: 1.0 mL/분

주입량: 200 μL

검출기: RI(시차 굴절계)

표준 물질: 플루란, 글루코오스(분자량 160만, 78.8만, 40.4만, 21.2만, 11.2만, 4.73만, 2.28만, 1.18만, 5900, 180)

(2) 결과

(3) 고찰

실시예 1의 토끼 연골 수복 모델에서 사용한 정제 알긴산나트륨의 중량 평균 분자량은 상기 방법에 의한 측정에서는 170만이었다. 실시예 1에 나타낸 바와 같이, 해당 알긴산은 세포 존재, 부재 둘 다에서 토끼 연골 수복 모델에 있어서 유리 연골 재생 효과가 보였다. 한편, 문헌 3에서는 저엔도톡신 알긴산(FMC 바이오폴리머사, 프로노바^TM LVG, 현 프로노바^TM UP LVG)을 이용하여 동일한 실험을 행하고 있는데, 세포를 함유시키지 않고 알긴산만을 연골 결손부에 적용한 경우에는 섬유 연골이 형성되는 것이 개시되어 있다. 또한, 프로노바^TM LVG를 멸균한 제품이 프로노바^TM SLG20이고, 그의 중량 평균 분자량은 상기 방법에 의한 측정에서는 44만이었다. 씨 매트릭스^TR과 프로노바^TM은 저엔도톡신 알긴산이라는 점에서는 공통되지만, 양자의 알긴산은 분자량 면에서 차이가 있고, 이 차이가 연골 재생 효과의 차이로 이어지고 있는 것으로 생각된다. 점도는 알긴산의 농도에 의해 조절이 가능하지만, 상이한 농도의 알긴산겔(0.5 내지 4％)에 연골 세포를 포매하여 마우스 피하에 이식하고, 연골 형성을 확인한 실험에 있어서, 알긴산의 농도는 연골 형성 효과에 영향을 미치지 않았다는 보고도 있다(Keith T. Paige et al., "De Novo Cartilage Generation Using Calcium Alginate-Chondrocyte Constructs", Plastic and Reconstructive Surgery, Vol. 97: 1996, p.168-178). 따라서, 씨 매트릭스^TR과 프로노바^TM의 양 알긴산의 연골 재생 효과의 차이는 분자량에 기인하는 것으로 생각된다. 즉, 저엔도톡신 알긴산을 이용함으로써, 주위 연골에서의 변성이나 염증 반응이 적고, 생체 친화성이 높은 조성물로 할 수 있지만, 이에 더하여 고분자량의 알긴산으로 함으로써, 세포를 포매하지 않는 경우에 있어서도 유리 연골을 재생할 수 있는, 연골 재생 효과가 매우 우수한 연골 재생용 또는 치료용 조성물로 할 수 있음을 알 수 있었다. 분자량으로서는, 중량 평균 분자량으로 적어도 50만 이상, 바람직하게는 65만 이상의 저엔도톡신 알긴산이 연골 재생에 유용하고, 보다 바람직하게는 100 내지 200만, 특히 150 내지 200만 정도의 분자량의 것이 바람직함을 알 수 있었다.

토끼 변형성 관절증 모델( 전십자인대 ( ACL ) 절제 모델)

(1) 방법

암컷 일본 흰토끼(Japanese white rabbit; 체중 2.6 내지 2.9 kg)를 이용하여 양 무릎 관절에 대하여 비뇽 E.(Vignon E.) 등의 방법에 준하여 OA 모델을 제조하였다(Vignon E., Bejui J., Mathieu P., Hartmann JD, Ville G., Evreux JC, et al., Histological cartilage changes in a rabbit model of osteoarthritis, J Rheumatol., 1987; 14 (Spec No): 104-6). 이하의 4군에 대해서 각 3 마리(6 무릎)를 준비하였다.

A) 대조군(생리 식염수 투여),

B) 1％ 히알루론산나트륨 용액 투여군(분자량 약 90만, 점도 약 2300 mPa·s),

C) 1％ 정제 알긴산나트륨 용액 투여군(분자량 약 170만, 점도 약 500 mPa·s),

D) 2％ 정제 알긴산나트륨 용액 투여군(분자량 약 170만, 점도 약 5000 mPa·s).

B) 내지 D)의 용액은 생리 식염수로 제조하였다. C) 내지 D)의 정제 알긴산나트륨은 실시예 1에서 이용하고 있는 정제 알긴산나트륨((주) 키미카 (주) 모치다 인터내셔날, 씨 매트릭스(멸균), 제조 번호 B5Y01)과 동일하다.

전십자인대 절제 수술 후, 4주째, 5주째, 6주째, 7주째, 8주째에, 상기 A) 내지 D)의 각 용액을 관절강 내에 투여하였다(주 1회, 총 5회 투여). 투여는 27G 바늘을 이용하여 슬개골건을 관통시켜 1회당 0.3 mL/무릎을 주입하였다. 9주째에 토끼를 안락사시켜 무릎 관절 조직 표본을 취득하였다. 감염, 이물질 반응 등의 염증은 모든 무릎에서 보이지 않았다.

(2) 결과

(전체 관찰)

육안으로 무릎 관절(대퇴골 및 경골의 무릎 관절 연골) 외관 전체를 관찰하였다. 결과를 도 9에 나타내었다. A군(생리 식염수 투여)에서는 육안적으로 연골 결손, 골극(骨棘) 등의 변형성 관절증의 소견을 많이 보였다. 다른 군에서는 A군과 비교하여 연골 손상의 정도(크기, 깊이)가 가벼웠다. 육안적 소견을 스코어화하더라도 동일한 결과였다.

(염색)

무릎 관절 조직 표본을 파라포름알데히드로 고정하고, 탈회, 파라핀 고정하였다. 사프라닌-O 염색에 의해 조직학적 평가를 행하였다. 결과를 도 10에 나타내었다. 각 도면의 상부는 대퇴골측 연골이고, 하부는 경골측 연골이며, 연골 변성의 변화는 양측 연골에 있어서 판정한다. A군(생리 식염수 투여)에서는 연골 기질의 염색성의 저하, 연골 표면의 조도를 보였다. B군(1％ 히알루론산나트륨 용액 투여)에서는 연골 표면은 A군보다 평활하기는 하나, 염색성의 저하를 보였다. C군(1％ 정제 알긴산나트륨 용액 투여) 및 D군(2％ 정제 알긴산나트륨 용액 투여)에서는 연골 표면은 평활하였고, A군 및 B군과 비교하여 염색성의 저하는 경도였다. 또한, 연골 표면에 알긴산이 잔존해 있었다.

이상으로부터, 알긴산나트륨의 관절내 주사는 ACL 절제 OA 모델에 있어서, 연골 변성을 억제하고, 연골을 보호하는 작용을 나타내었다. 변형성 관절증의 치료약으로서 이용되고 있는 1％ 히알루론산나트륨 용액 투여와 동등 또는 그 이상의 효과가 보였다. 또한, 알긴산나트륨이 연골 표면에 부착되어 있었던 점에서, 알긴산나트륨은 관절 연골과 친화성을 나타내고, 연골 표면을 피복·보호하고 있는 것이 확인되었다.

토끼 변형성 관절증 모델( 전십자인대 ( ACL ) 절제 모델)에서의 분자량이 상이한 알긴산의 치료 효과 평가

(1) 방법

암컷 일본 백색 집토끼(Japanese white rabbit; 체중 2.6 내지 2.9 kg)를 이용하여 양 무릎 관절에 대하여 비뇽 E. 등의 방법에 준하여 OA 모델을 제조하였다(Vignon E., Bejui J., Mathieu P., Hartmann JD, Ville G., Evreux JC, et al., Histological cartilage changes in a rabbit model of osteoarthritis, J Rheumatol., 1987; 14 (Spec No): 104-6). 이하의 5군에 대하여 각 5마리(10 무릎)를 준비하였다.

A) 대조군(생리 식염수 투여),

B) 1％ 히알루론산나트륨 용액 투여군(ARTZ(등록상표), 가켄 세이야꾸(주), 분자량 약 90만, 점도 약 2300 mPa·s),

C) 2％ 정제 알긴산나트륨 용액 투여군(프로노바^TM SLM₂₀, FMC 바이오폴리머사, 분자량 약 40만),

D) 2％ 정제 알긴산나트륨 용액 투여군((주) 키미카 제조, 멸균, 분자량 약 100만),

E) 2％ 정제 알긴산나트륨 용액 투여군(씨 매트릭스(멸균), (주) 키미카 제조, 분자량 약 170만)

C) 내지 E)의 용액은 생리 식염수로 제조하였다.

전십자인대 절제 수술 후, 4주째, 5주째, 6주째, 7주째, 8주째에 상기 A) 내지 E)의 각 용액을 관절강 내에 투여하였다(주 1회, 총 5회 투여). 투여는 27G 바늘을 이용하여 슬개건을 관통시켜 1회당 0.3 mL/무릎을 주입하였다. 9주째에 토끼를 안락사시키고, 무릎 관절 조직 표본을 취득하였다. 감염, 이물질 반응 등의 염증 반응은 모든 무릎에서 보이지 않았다.

(2) 결과

(전체 관찰)

육안으로 무릎 관절(대퇴골 및 경골의 무릎 관절 연골) 외관 전체를 관찰하였다. 연골 표면의 손상 정도를 평가하는 데에는 시미즈 쵸지(Choji SHIMIZU) 등의 방법에 준하여 인디아 잉크로 염색하여 스코어화를 행하였다(J Rheumatol., Vol. 25, pp.1813-1819, 1998). 육안적 소견을 도 11에 나타내었다. 인디아 잉크의 염색으로는 연골 손상부와 정상 연골의 경계가 착색된다. A군(생리 식염수 투여)에서는 육안적으로 깊고 광범한 연골 결손, 골극 등의 변형성 관절증의 소견을 많이 보였다. 다른 군에서는 A군과 비교하여 연골 손상의 정도(크기, 깊이)가 가벼웠다. 육안적 소견을 스코어화한 결과를 도 12에 나타내었다. 무릎 관절에 관해서, 대퇴골 내측과(Medial Femoral Condyle: MFC), 경골 내측과(Medial Tibial Plateau: MTP), 대퇴골 외측과(Lateral Femoral Condyle: LFC), 경골 외측과(Lateral Tibial Plateau: LTP)의 4개소의 관찰을 행하였다. 어느 부위에서든 B 내지 E군은 A군과 비교하여 연골 손상의 정도가 가벼웠다. 또한, 연골 손상의 정도는 B군 및 C군에 비하여 D군 및 E군에서 경도인 경향이 보였다. 알긴산의 분자량의 차이에 따라, 연골 변성 변화 억제 효과·연골 보호 효과·연골 수복 효과에 차이가 있다고 생각되었다.

(프로테오글리칸 염색)

무릎 관절 조직 표본을 파라포름알데히드로 고정하고, 탈회, 파라핀 고정하였다. 사프라닌-O 염색에 의해 조직학적 평가를 행하였다. 결과를 도 13에 나타내었다. 각 도면의 상부는 대퇴골측 연골이고, 하부는 경골측 연골이며, 연골 변성의 변화는 양측 연골에 있어서 판정한다. A군(생리 식염수 투여)에서는 연골 기질의 염색성의 저하, 연골 표면의 거칠음을 보였다. B군(1％ 히알루론산나트륨 용액 투여)에서는 연골 표면은 A군보다 평활하기는 하지만, 염색성의 저하를 보였다. 알긴산나트륨 용액 투여군(C 내지 E군)에서는 연골 표면은 평활하였고, A군 및 B군에 비해 염색성의 저하는 경도였다. 또한, 연골 표면에 알긴산이 부착되어 있었다.

(병리 조직 종합 평가)

육안적 관찰, 염색에 의한 관찰의 종합적인 평가로서, 기쿠치 도시유키(Toshiyuki KIKUCHI) 등의 방법에 준한 스코어화를 행하여 투여 약물의 효과를 평가하였다(Osteoarthritis and Cartilage, Vol. 4, pp. 99-110, 1996). 대퇴골 내측과에 대하여 이하의 8 항목에 대하여 각 4 단계로 평가하고, 합계점을 변형성 관절증 병변 스코어로 하였다.

(1) 연골 표층의 소실, (2) 연골 미란, (3) 섬유화·균열, (4) 가염색성 프로테오글리칸의 소실, (5) 연골 세포의 배열의 흐트러짐, (6) 연골 세포의 소실, (7) 연골 하골의 소실, (8) 연골 세포 클러스터의 형성.

유의차 검정은 군간은 ANOVA를 행하였고, 그 후 각 군간의 비교는 post hoc test에서 p<0.05를 유의한 것으로 하였다.

결과를 도 14에 나타내었다. B 내지 E군은 A군에 대하여 변형성 관절증 병변 스코어가 유의하게 낮았다. 또한, 고분자량 알긴산 투여군(D군, E군)에서는 히알루론산 투여군(B군)보다 우수한 효과가 보였지만, 저분자량 알긴산 투여군(C군)은 히알루론산 투여군과 동등 정도였다.

이상으로부터, 알긴산나트륨의 관절내 주사는 ACL 절제 OA 모델에 있어서, 연골 변성 변화를 억제하고, 연골을 보호하는 작용을 나타내었다. 변형성 관절증의 치료약으로서 이용되고 있는 1％ 히알루론산나트륨 용액 투여와 동등 또는 그 이상의 효과가 보였다. 특히, 고분자량 알긴산은 히알루론산보다 우수한 치료 효과를 나타내었다. 또한, 3종의 알긴산은 점도 면에서의 차이도 존재하지만, 히알루론산보다 점도가 낮은 알긴산에서도 히알루론산과 동등 이상의 효과가 보이고 있는 점에서, 치료 효과의 차이는 점도에 의한 것이 아닌, 물질의 차이 및 분자량의 차이에 의한 것이라 생각된다.

이번 ACL 절제 OA 모델에서는 ACL 절제 후 4주째부터 약물의 투여를 개시하였다. 따라서, 약물 투여군에서 보인 변형성 관절증 병변 스코어의 저하는 연골 변성 변화의 억제, 연골 보호에 의한, 병변 진행의 억제 효과에 더하여, 이미 발생한 손상에 대한 연골 수복 작용이 합쳐진 결과라 생각된다. 본 실험의 참고로 한, 상술한 기쿠치 도시유키 등의 논문에서는 ACL 절제 후 4주째에는 생리 식염수 투여군에서는 OA 스코어가 20 내지 25에 달하는 것으로 되어 있다. 본 실험에서는 ACL 절제 후 4주째부터 약제의 투여를 개시하고 있으므로, OA 스코어가 20 내지 25 정도인 상태부터 약제 투여를 개시한 결과, 약제의 효과에 의해 연골의 상태가 개선되어 OA 스코어가 저하되었을 가능성을 생각할 수 있다. 또한, 본 평가 시스템에서는 정상 관절의 스코어는 8이 되기 때문에, E군(분자량 170만의 알긴산)에서의 OA 평균 스코어(11.3)는 정상 관절에 가까운 매우 양호한 스코어라 할 수 있다.

알긴산의 분자량 측정 수법의 검토

천연물 유래의 고분자 물질의 분자량 측정에서는 측정 방법에 따라 값에 차이가 생길 수 있다고 알려져 있다. ASTM F2064-00(ASTM International 발행(2006); 미국 재료 시험 협회(American Society for Testing and Materials)는 공업 재료 규격 및 시험법 규격의 국제 표준화·규격 설정 기관임)에서는 SEC-MALLS(Size Exclusion Chromatography with Multiple Angle Laser Light Scattering Detection)에 의한 측정이 장려되고 있다. 따라서, 실시예 4에서 이용한 알긴산나트륨에 대하여, SEC-MALLS와 실시예 2에 기재된 겔 여과 크로마토그래피에 의한 측정법을 비교하였다. 또한, SEC-MALLS는 겔 여과 크로마토그래피에 다각도 광산란 검출기(MALLS)를 병용한 측정법이다.

(1) 방법

겔 여과 크로마토그래피에 의한 측정은 실시예 2와 동일한 방법으로 행하였다. SEC-MALLS에 의한 측정은 이하의 조건으로 행하였다.

다각도 광산란 검출기: 야트 테크놀로지(Wyatt Technology)사 제조의 DAWN HELEOS

컬럼: Shodex SB-806M 2개(쇼와 덴꼬 가부시끼가이샤 제조)

용리액: 200 mM 질산나트륨 수용액

유속: 1.0 mL/분

(2) 결과

AL170, AL100, AL40은 실시예 4에서 이용한 정제(저엔도톡신) 알긴산나트륨과 동일하다.

AL170: (주) 키미카 (주) 모치다 인터내셔날, 씨 매트릭스(멸균), 1％ 점도 약 500 mPa·s

AL100: (주) 키미카 제조, 멸균, 1％ 점도 약 100 mPa·s

AL4O: FMC 바이오폴리머사, 프로노바^TM SLM₂₀, 1％ 점도 약 30 mPa·s

(3) 고찰

표 2에 나타낸 바와 같이, 3종의 알긴산염은 SEC-MALLS에서의 분자량은 차이가 있다고는 명확하게는 말할 수 없는 범위의 차이밖에 보이지 않고, 겔 여과 크로마토그래피에 의한 측정 결과와는 큰 차이가 있었다. 실시예 4에 나타낸 바와 같이, 사용한 시료 간에는 약리 효과에 있어서 명확한 차이가 있었던 점에서, 겔 여과 크로마토그래피에 의한 분자량 쪽이, SEC-MALLS에 의한 분자량보다 알긴산염의 치료 효과와의 관련성이 높아 관절 질환 치료용 조성물에 이용하는 알긴산염의, 바람직한 분자량 범위를 특정하는 파라미터로서는 겔 여과 크로마토그래피에 의한 분자량이 적합함을 알 수 있었다.

래트의 실험적 관절염 동통에 대한 알긴산의 효과

(1) 방법

래트의 무릎 관절 내에 요산나트륨의 침상 결정(MSU)을 주입하여 유발시킨 관절염에서는 동통 때문에 보행 이상을 보인다. 이하라 시즈히코(Shizuhiko IHARA) 등의 방법(Folia Pharmacol. Japon, Vol. 100, pp. 359-365 (1992))에 준하여, MSU 투여 래트 실험적 관절염 동통 모델을 제조하여, 알긴산나트륨의 관절내 투여 효과를 검토하였다.

Cr1: CD계 수컷 래트를 5주령으로 구입하여 1주일 순화 후 실험에 제공하였다. 마취하에서 래트의 오른쪽 무릎 관절 내에 5.0％ MSU 생리 식염액 현탁액을 0.05 mL 주입하고, 2, 4, 6 및 24시간 후에 보행 상태를 관찰하였다. 보행 상태는 정상 보행(0점), 가벼운 파행(1점), 중등도의 파행(2점), 발끝으로 선 보행(3점) 및 세발 보행(4점)의 5단계의 스코어로 평가하였다. 이하의 5군에 대하여 각 10마리를 준비하였다.

A) 대조군(생리 식염수 투여),

B) 1％ 히알루론산나트륨 용액 투여군(ARTZ(등록상표), 가켄 세이야꾸(주), 분자량 약 90만),

C) 2％ 정제 알긴산나트륨 용액 투여군((주) 키미카 제조, 멸균, 분자량 약 100만),

D) 1％ 정제 알긴산나트륨 용액 투여군(씨 매트릭스(멸균), (주) 키미카 제조, 분자량 약 170만),

E) 2％ 정제 알긴산나트륨 용액 투여군(씨 매트릭스(멸균), (주) 키미카 제조, 분자량 약 170만)

각 용액 50 μL를, MSU 주입 1시간 전에 동일 관절 부위에 투여하였다.

(2) 결과 및 고찰

보행 상태 스코어의 경시적 변화를 도 15에 나타내었다. 1％ 히알루론산나트륨 용액 투여군(B군) 및 2％ 알긴산나트륨 용액 투여군(C군, E군)의 보행 상태 스코어는 대조군(A군)에 비하여 유의하게 낮아, 동통 억제 효과가 보였다. 분자량 약 170만의 알긴산나트륨에서의 1％ 용액과 2％ 용액의 비교에서는 농도 의존적인 동통 억제 효과가 보였다(D군, E군). 또한, 분자량 100만과 170만의 2％ 알긴산나트륨 용액에서는 점도가 각각 약 300 mPa·s 및 약 5000 mPa·s로 상이하지만, 동등한 동통 억제 효과를 나타내었다.

MSU는 관절 내에서, 활막 세포나 호중구에 직접 또는 간접적으로 작용하여, 사이토카인 등의 생산을 통해 관절염을 발증시키는 것으로 생각되고 있다(상기 이하라 시즈히코 등의 논문). 즉, MSU에 의해 염증 반응이 유발되어 그 결과로서 동통을 야기한다. 알긴산나트륨 용액은 상기 모델에 있어서 동통 억제 효과를 나타내었고, 변형성 관절증 치료약 및 만성 류마티스 관절염에서의 관절통 억제약으로서 이용되고 있는 히알루론산나트륨과 동등한 효과가 보였다. 알긴산의 1가 금속염은 염증 및 동통을 억제하는 효과를 갖는 것이 확인되었고, 변형성 관절증, 어깨관절 주위염 등의 치료약으로서 유용하며, 류마티스 관절염에서의 관절 동통으로의 적용도 가능하다고 생각되었다.

또한, 분자량 43만의 알긴산나트륨((주) 키미카 제조, 멸균)에서는 분자량 100만의 알긴산나트륨보다 동통 억제 효과가 약한 경향이 보였다. 알긴산의 분자량의 차이에 따라 동통 억제 효과에 차이가 있는 것으로 생각되었다.

토끼 견건판 단열 모델에서의 알긴산 관절내 투여 효과

(1) 견건판 단열 모델의 제조

일본 백색 집토끼를 이용하여 견건판 단열 모델을 제작하였다. 염산 케타민을 사용한 전신 마취 하에, 양 어깨관절의 털을 깍은 후, 멸균 조작으로 어깨관절을 후방 접근법으로 전개하였다. 견갑척추 근육(Omovertebral muscle)을 잘라내고, 양측 극하근건과 그의 상완골두측의 건부착부에 10×7 mm의 결손부를 제조하였다. 오른쪽 어깨관절 내에 2％ 정제 알긴산나트륨 용액(씨 매트릭스(멸균), (주) 키미카 제조, 분자량 약 170만) 0.3 mL를 주입하였다. 왼쪽 어깨관절 내에는 대조군으로서 생리 식염수(오츠카 세이야꾸) 0.3 mL를 동일한 기법으로 주입하였다. 수술 후, 양측 상지의 고정은 행하지 않고 사육 케이지 안에서 자유롭게 운동시켰다. 수술 후, 주 1회로 5주일 동안(총 5회) 오른쪽 어깨로의 알긴산 용액 투여, 왼쪽 어깨로의 생리 식염수 투여를 계속한 후에, 펜토바르비탈의 대량 정맥내 투여에 의해 안락사시켜 어깨관절 조직 표본을 취득하였다.

(2) 결과

육안으로 상완골 골두부를 관찰한 바, 대조군에서는 건단열부를 따른 부위에 고도한 연골 결손이 보였으나, 알긴산 투여군에서는 분명한 연골 손상은 보이지 않았다(도 16). 알긴산나트륨은 연골 보호 효과를 나타내고, 연골 손상의 발생 및 진전을 억제하였다.

토끼 변형성 관절증 모델( 전십자인대 ( ACL ) 절제 모델)의 무릎 관절 마찰계수의 측정

(1) 방법

실시예 4와 동일한 방법으로 토끼 OA 모델을 제작하여, 1％ 히알루론산나트륨 용액(ARTZ(등록상표), 가켄 세이야꾸(주), 분자량 약 90만, 점도 약 2300 mPa·s)를 투여한 OA 무릎 관절 표본(n=4)과, 2％ 정제 알긴산나트륨 용액((주) 키미카 제조, 멸균, 분자량 약 100만)을 투여한 OA 무릎 관절 표본(n=4)을 취득하고, 다나카 E.(Tanaka E.) 등의 방법(J Dent Res. 2004 May; 83(5): 404-7)에 준하여 무릎 관절 마찰계수를 측정하였다. 각 약제의 투여는 실시예 4와 동일하게 행하였고, 전십자인대 절제 수술 후 9주째에 토끼를 안락사시켜 무릎 관절 표본을 취득하였다. 측정은 무릎 굴곡각 30도, 하중 1.8 kg, 측정 시간 120초로 각 표본마다 5회 행하였다. 대조군은 정상 관절(n=1)로 하였다.

(2) 결과

알긴산을 투여한 OA 무릎 관절 표본에서는 히알루론산을 투여한 OA 무릎 관절 표본보다 유의하게 낮은 마찰 계수를 나타내었다(도 17). 본래, 정상 관절의 마찰 계수는 낮은 수치를 나타내지만, OA의 병태가 진행되면 마찰 계수가 증가하고, 마찰 계수의 증가가 더욱 조직의 파괴를 촉진한다. 알긴산을 투여한 OA 무릎 관절 표본에 있어서 마찰 계수가 낮은 것은 OA의 병태가 경도였고, 조직이 양호한 상태로 유지되고 있음을 반영하고 있는 것으로 생각되었다. 즉, 실시예 4에서의 육안적 소견 및 조직학적 평가에서 관찰된 조직 상태가, 무릎 관절 마찰 계수에 반영되어 있는 것으로 생각되었다.

래트 ·콜라겐 유발 관절염에 대한 알길산 관절내 투여의 효과

콜라겐 유발 관절염 모델(CIA)은 병태가 인간의 류마티스 관절염(RA)와 많이 유사하여, 류마티스 관절염의 모델로서 많이 이용되고 있다. 래트·콜라겐 유발 관절염 모델을 제작하여 알긴산나트륨의 관절내 투여 효과를 검토하였다.

(1) 모델 동물의 제조

10 주령의 DA/Slc(SPF) 수컷 래트를 구입하여 1주일 순화 후 실험에 제공하였다. 소 II형 콜라겐(콜라겐 기술 연구회)을 0.01 mol/L 아세트산 수용액에 1.5 mg/mL가 되도록 용해시키고, 등량의 프로인트 불완전 보조제(Freund's incomplete adjuvant; Difco)를 이용하여 유탁액을 제작하였다. 이 유탁액을 래트의 등부 피내 4 내지 6개소에 총 0.4 mL(콜라겐량: 300 μg) 투여(감작)하여 관절염을 유발하였다.

(2) 피검 물질의 투여

이하의 5군에 대하여 각 10마리를 준비하였다.

A) 대조군(생리 식염액 투여)

B) 1％ 히알루론산나트륨 용액 투여군(ARTZ(등록상표), 가켄 세이야꾸(주), 분자량 약 90만)

C) 2％ 정제 알긴산나트륨 용액 투여군((주) 키미카 제조, 멸균, 분자량 약 100만)

D) 1％ 정제 알긴산나트륨 용액 투여군(씨 매트릭스(멸균), (주) 키미카 제조, 분자량 약 170만)

E) 2％ 정제 알긴산나트륨 용액 투여군(씨 매트릭스(멸균), (주) 키미카 제조, 분자량 약 170만)

각 투여 물질의 투여액량은 모두 0.05 mL/래트로 하였고, 1 mL 주사통 및 26G 주사 바늘을 이용하여 동물의 왼쪽 뒷다리 무릎 관절강 내에 투여하였다. 투여 횟수는 1일 1회, 감작 후 0(콜라겐 투여일), 5, 10, 15, 20일의 5회 투여하였다.

(3) 관절염 발증의 육안적 관찰

감작 후 매일, 하기에 나타낸 기준에 의해 왼쪽 뒷다리부를 육안적으로 관찰하여, 관절염 발증의 유무 및 그 정도를 평가하였다.

스코어 0: 정상

스코어 1: 홍조가 관찰됨.

스코어 2: 발가락에서 홍조와 가벼운 부종이 관찰됨.

스코어 3: 발가락부터 발 전체에 걸쳐 부종

스코어 4: 심한 부종이 관찰됨.

스코어 5: 관절 변형이 관찰됨.

결과를 도 18에 나타내었다. 대조군에서는 관절염의 급격한 발증이 감작 후 14일부터 보였고, 관절염의 정도는 25일까지 증강하였다. 감작 후 25일째까지 모든 군에서 동등한 발증도가 얻어졌지만, 히알루론산 투여군(B군) 및 알긴산나트륨 용액 투여군(C, D, E군)에서는 대조군에 비하여 발증이 지연되는 경향이 보였다. 지연 정도는 히알루론산 투여군(B군)보다 알긴산나트륨 용액 투여군(C, D, E군)에서 강하게 보였다. 피검 물질은 관절에서의 염증을 억제하고 있을 가능성이 생각되었다.

(4) 병리조직학적 평가

감작 후 25일에 동물을 안락사시키고, 왼쪽 뒷다리 무릎 관절 조직을 적출하여 포르말린액으로 고정하고, 10％ EDTA 수용액으로 탈회 후, 파라핀 고정하였다. 헤마톡실린 에오신 염색 및 사프라닌 O 염색을 행하여 조직학적 평가를 행하였다. 콜라겐 관절염의 평가 항목 및 평가 기준에 따라 각 항목을 변화없음(평점 0), 경미(평점 1), 경도(평점 2), 중등도(평점 3), 고도(평점 4)의 5단계로 평가하였다. 활막에 대하여, 염증 세포 침윤, 활막 세포 증생, 육아 조직 형성, 섬유화를 관찰하여 평점화한 결과를 도 19에 나타내었다. 슬개골에 대하여 관절 연골 표면으로의 판누스 형성(활막 증생을 포함함), 관절 연골의 파괴(변성, 섬유화를 포함함), 뼈의 파괴(흡수), 사프라닌 O 염색성 저하(프로테오글리칸의 감소)를 관찰하여 평점화한 결과를 도 20에 나타내었다. 골극 형성(반응성 유골(osteoid) 형성, 골막성 골 신생)의 관찰은 가장 골극이 형성되기 쉬운 대퇴골 외측과를 대상으로 하였다. 결과를 도 21에 나타내었다. 유의차 검정은 맨-휘트니(Mann-Whitney)의 U 검정에 의해 행하였다.

활막에 있어서, 알긴산나트륨 용액 투여군(C, D, E군)은 대조군에 비하여 유의한 활막 세포 증생 억제 효과, 육아 조직 형성 억제 효과, 및 섬유화 억제 효과를 나타내었다. 또한, 고분자량의 알긴산 쪽이 보다 강한 효과를 나타내었다.

슬개골에 있어서, 알긴산나트륨 용액 투여군(C, D, E군)은 판누스 형성, 관절 연골의 파괴, 및 뼈의 파괴 항목에 있어서 억제 경향을 보였다.

대퇴골 외측과에 있어서, 알긴산나트륨 용액 투여군(C, D, E군)은 골극 형성의 억제 경향을 나타내었다. 또한, 고분자량의 알긴산 쪽이 보다 강한 효과를 나타내었다.

류마티스 관절염의 발증에는 활막의 염증·이상 증식과, 활성화 T 세포에 의한 과잉의 면역 응답이 관여하고 있어, 그 결과 관절 조직의 파괴가 진행되는 것으로 여겨지고 있다. 알긴산나트륨 용액은 콜라겐 유발 관절염 모델 동물에 있어서, 관절내 투여에 의해 활막 조직의 변성을 강력히 억제하였다. 또한, 골 및 연골의 파괴·변성에 대해서도 억제 경향을 보였다. 류마티스 관절염에서의 관절통의 치료에 이용되고 있는 히알루론산나트륨 용액과 비교하여, 우수한 조직 변성 억제 효과가 보였다. 알긴산염 용액의 관절내 주입에 의해, 조직 병변 진행의 억제 및 개선과 같은, 류마티스 관절염의 치료 효과를 얻을 수 있는 것으로 생각되었다.

본 발명의 관절 질환 치료용 조성물은 액체 상태에서 관절 내에 주입함으로써, 연골의 수복 효과, 연골 변성 변화의 억제 효과, 연골 보호 효과, 관절 조직의 염증을 억제하는 효과, 및/또는 관절 조직의 염증에 의한 동통을 억제하는 효과, 활막 조직의 변성 억제 효과, 및/또는 골연골 파괴 억제 효과를 갖고, 관절 질환의 치료 효과를 발휘한다. 특히, 변형성 관절증의 치료, 어깨관절 주위염의 치료, 류마티스 관절염에서의 관절통의 완화, 류마티스 관절염의 치료에 유용하다.

Claims (6)

1. 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하며, 관절 내에 주입 투여하는, 류마티스 관절염 치료용 조성물.
2. 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하며, 관절 내에 주입 투여하는, 류마티스 관절염에서의 활막 조직 변성 억제용 조성물.
3. 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하며, 관절 내에 주입 투여하는, 류마티스 관절염에서의 관절 파괴 억제용 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 알긴산의 1가 금속염의 경화제를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저엔도톡신 알긴산의 1가 금속염은 겔 여과 크로마토그래피에서의 중량 평균 분자량이 50만 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.

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