BRPI0818719B1 - composição para o tratamento de doença articular - Google Patents

Description

(54) Título: COMPOSIÇÃO PARA O TRATAMENTO DE DOENÇA ARTICULAR (51) Int.CI.: A61L 27/00; A61K 31/734; A61K 35/28; A61P 19/02 (30) Prioridade Unionista: 21/02/2008 JP PCT/JP2008/052999, 24/10/2007 JP 2007/277005 (73) Titular(es): MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO, LTD. NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION HOKKAIDO UNIVERSITY (72) Inventor(es): NORIMASA IWASAKI; AKIO MINAMI; YASUHIKO KASAHARA; TATSUYA IGARASHI; DAISUKE KAWAMURA; NOBUO OHZAWA; MARIKO IMAI (85) Data do Início da Fase Nacional: 22/04/2010

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COMPOSIÇÃO PARA O TRATAMENTO DE DOENÇA ARTICULAR

Campo técnico

A presente invenção relaciona-se a uma composição para o tratamento de uma doença articular, incluindo aplicações veterinárias.

Fundamento da invenção

Por exemplo, a cartilagem articular é um cartucho de hialina que é composto de um pequeno número de células, matriz extracelular colagenosa, abundantes proteoglicanos e água. No caso de osso, uma vez que as redes vascular e neural estão presentes e o osso tem a capacidade de se auto-reparar, mesmo se ocorrer uma fratura, a fratura é frequentemente totalmente reparada. No entanto, a cartilagem articular é desprovida de redes vascular e neural. Consequentemente, ela não tem potencial para autoreparação, e no caso da formação de defeitos de cartilagem grande em particular, o defeito da cartilagem não é adequadamente reparado. Mesmo naquelas porções que são reparadas, é formada cartilagem fibrosa que tem diferentes propriedades mecânicas que a cartilagem de hialina. Consequentemente, quando é formado um defeito da cartilagem, a dor articular e a perda de função frequentemente progridem até a osteoartrite. Em adição, um defeito da cartilagem pode atingir uma ampla escala como um resultado de sintomas que progridem dos estágios iniciais de osteoartrite que inicia com um desgaste da superfície da cartilagem articular devido ao envelhecimento ou excessivo uso da articulação.

Embora a osteoartrite (OA) seja uma doença degenerativa em que a cartilagem articular está desgastada

2/78 devido ao envelhecimento e excessivo uso da articulação, além da causa mecânica de desgaste, respostas inflamatórias locais, como a produção de citocinas inflamatórias por células sinoviais e condrócitos e a indução de substâncias algésicas e proteases por citocinas inflamatórias, também acredita-se que estejam envolvidas na destruição articular. Ou seja, acompanhando o desgaste da cartilagem articular (dano mecânico) , é induzida uma resposta inflamatória no tecido articular, dano autodestrutivo e o dano cartilaginoso progride devido a essa resposta inflamatória e dano mecânico também progride devido à função articular diminuída, assim resultando em um ciclo vicioso que também exacerba a doença. O tratamento de osteoartrite é focado primariamente na remoção da dor e inflamação na área afetada, e é comumente tratada no exterior com a administração de fármacos antiinflamatórios não esteróides. Entretanto, uma vez que a função renal pode ser deprimida em pacientes mais idosos, a administração oral contínua de fármacos antiinflamatórios não esteróides pode ser difícil do ponto de vista de segurança. Produtos que incorporam ácido hialurônico, que é um componente do fluido sinovial da cartilagem, melhoram a função de lubrificação de articulações ao serem administrados em uma articulação, e uma vez que esses produtos também têm ação analgésica, eles são amplamente usados como agentes de melhoria da função articular para osteoartrite. No entanto, em casos severos de osteoartrite associada à degeneração avançada da cartilagem e tecido circundante, não há outra escolha a não ser substituir a articulação com uma articulação artificial, assim tornando essa uma das doenças para as

3/78 terapêuticas para quais há uma necessidade de desenvolver uma nova droga terapêutica que iniba e finalmente melhore o avanço da degeneração tecidual (Referência 1).

Embora o mecanismo de ocorrência de artrite reumatóide (AR) não seja totalmente entendido, foi relatado que envolve inflamação e crescimento anormal da membrana sinovial e uma excessiva resposta imune mediada por células t ativadas, resultando em destruição progressiva do tecido articulação. Embora a AR demonstre sintomas que lembram OA com relação a serem associados à degeneração do tecido articulação, AR é um tipo de doença autoimune, e tem uma diferente patologia daquela de OA. Recentemente, preparações biológicas foram usadas como drogas

AR direcionadas em uma citocina inflamatória na forma de TNF-α. Essas preparações têm como ingredientes ativos anticorpos anti-TNF-α ou receptores de TNF, e acredita-se que contribuam para a prevenção de destruição da articulação por inibição da função de TNF-a. Por outro lado, uma vez que essas preparações inibem a função de TNF-α sistemicamente, sérios efeitos adversos, que incluem doenças infecciosas como pneumonia e tuberculose, apresentam problemas clinicamente. Portanto, há uma necessidade por uma nova droga terapêutica que seja altamente segura e capaz de inibir a progressão de degeneração de tecido articular.

Ácido algínico é um polissacarídeo de alto peso molecular presente em grandes quantidades em algas marrons que é um polímero obtido por polimerização de modo linear de dois tipos de ácido urônico na forma de ácido Dmanurônico (M) e ácido L-glurônico (G) . Além de exibir

4/78 viscosidade quando em solução, uma vez que o ácido algínico também tem a propriedade de gelação na presença de um cátion que tem uma valência de 2 ou mais, ele é amplamente usado como um espessante ou agente de gelação em alimentos, cosméticos e materiais de base de preparações farmacêuticas. Tem sido usada uma tecnologia que utiliza essa propriedade de gelação do ácido algínico pela qual glóbulos incrustados com células são produzidos por colocação de uma solução de ácido algínico com células suspensas nela em uma solução de íon cálcio. Foram feitas tentativas de incrustar condrócitos e outros em tais glóbulos, seguido por transplante para lesões de dano à cartilagem. A Referência 2 fornece uma discussão que indica que o ácido algínico pode ser usado como um veículo sem ter quaisquer efeitos não vantajosos seja quais forem sobre as lesões de dano à cartilagem, e que o ácido algínico por si não tem qualquer efeito terapêutico. Além disso, a referência 3 revela que, embora o tecido normal da cartilagem tenha sido formado em um enxerto após a suspensão de condrócitos em uma solução de alginato de sódio, a injeção em um defeito da cartilagem de coelho e cura da superfície com solução de CaCl₂, é formada cartilagem fibrosa no caso de aplicação apenas de ácido algínico ao defeito da cartilagem sem conter células nela.

A Referência 4 revela uma composição de ácido algínico curável, e auto-gelação, que compreende uma mistura de um sal solúvel de ácido algínico e um sal insolúvel de ácido algínico/gel, que contém condrócitos e é injetada em um defeito da cartilagem.

Desse modo, o ácido algínico é conhecido por ser um

5/78 biopolímero capaz de ser usado como um veículo de condrócitos e outros, e tem sido usado como um carreador de transplante que é injetado em um defeito da cartilagem junto com células e então curado tomando-se vantagem de sua capacidade de gelação. No entanto, os efeitos terapêuticos de uma composição de ácido algínico que não contém células são desconhecidos, e a aplicação de uma composição de ácido algínico de não cura a doença articular ainda deve ser tentada.

[REFERÊNCIAS]

1. Harumoto Yamada e cols., Drug therapy for osteoarthritis, Clin. Rheumatol. , Vol. 18, 2006: pp. 298306

2. Cay M. Mierisch e cols., Transforming Growth Factor-b in Calcium Alginato Beads for the Treatment of Articular Cartilage Deffects in the Rabbit, The Journal of Arthroscopic and Related Surgery, Vol. 18, No. 8 (October), 2002: pp. 892-900

3. E. Fragonas e cols., Articular Reparação da cartilagem in Rabbits by Using Suspensions of Allogenic Condrocytes in Alginato, Biomaterials, Vol. 21, 2000: pp.

795-801

4. Publicação Internacional WO 2006/044342

Revelação da invenção

Drogas terapêuticas para osteoartrite são necessárias para fornecer efeitos abrangentes, que incluem efeitos que protegem a cartilagem do desgaste, efeitos que inibem as alterações degenerativas em cartilagem causadas por desgaste e inflamação, efeitos que reparam a lesão de dano à cartilagem, e efeitos que suprimem a inflamação e dor. Se

6/78 um fármaco capaz de inibir inflamação e suprimir a dor nas articulações foi capaz de ser obtido, ele pode ser aplicado ao tratamento de capsulite adesiva do ombro e supressão da dor articular em artrite reumatóide crônica.

São necessárias drogas terapêuticas para artrite reumatóide que tenham efeitos terapêuticos como inibição de proliferação anormal de células sinoviais e inibição de destruição de tecido osteocondral que acompanha uma excessiva resposta imune embora sendo ainda bastante seguro com poucos efeitos adversos. Uma vez que a AR é uma doença autoimune, é difícil evitar efeitos adversos imunossupressores quando da tentativa de obter efeitos terapêuticos. Embora as preparações de ácido hialurônico sejam conhecidas por terem comparativamente um alto grau de segurança entre os fármacos capazes de serem usados para AR, a injeção intra-articular de ácido hialurônico é usada para o objetivo de suprimir a dor em AR, e não é considerado como sendo um agente terapêutico para AR. Ou seja, o problema é fornecer um novo fármaco capaz de realizar tanto efeitos terapêuticos para RA quanto um alto grau de segurança.

Os inventores da presente invenção conduziram estudos extensivos para solucionar os problemas acima-mencionados. Foi constatado que por injeção intra-articular de uma composição que contém um sal de metal monovalente de ácido algínico em que o nível de endotoxina foi diminuído a um grau de modo a substancialmente não causar inflamação ou febre, alterações degenerativas da cartilagem são inibidas e são obtidos efeitos que protegem a cartilagem em um modelo experimental de osteoartrite. Além disso, foi

7/78 constatado que essa composição tem o efeito de suprimir a dor em um modelo experimental de dor de artrite. Além disso, também foi constatado que essa composição tem o efeito de inibição da destruição e degeneração do tecido osteocondral e inibição da degeneração do tecido sinovial em um modelo experimental de artrite reumatóide, assim levando ao término da presente invenção.

Esse é o primeiro caso em que uma substância diferente de ácido hialurônico, que é um componente principal do fluido sinovial, demonstrou ter efeitos de composto sobre o tecido cartilaginoso da mesma maneira em osteoartrite. Foi surpreendente descobrir que o ácido algínico, que é um polímero que se origina em algas e não está inerentemente presente em animais, tem efeitos como esses.

A artrite reumatóide é um tipo de doença autoimune e tem uma patologia diferente da osteoartrite. Na artrite reumatóide, fármacos que possuem a função de um fármaco de modificação da doença que inibem a degeneração e destruição do tecido articular consistem primariamente em imunomoduladores que agem sistemicamente a maneira de anticorpos anti-TNFa e metotrexato. Embora o ácido hialurônico, que é um polissacarídeo similar ao ácido algínico, seja um agente terapêutico para osteoartrite, ele é apenas usado em terapia sintomática para dor articular em artrite reumatóide. Assim, embora os efeitos terapêuticos tenham sido obtidos para osteoartrite com ácido algínico, foi difícil prever se ele tem ou não efeitos terapêuticos na artrite reumatóide. Foi, portanto, surpreendente descobrir que um polímero polissacarídeo altamente seguro e de ocorrência natural como o ácido algínico, comumente

8/78 usado em alimentos e bases farmacêuticas, funciona como um fármaco modificador de doença de artrite reumatóide por injeção intra-articular.

Particularmente, a presente invenção fornece uma composição que permite a obtenção de efeitos terapêuticos por injeção em uma articulação de um paciente que tem uma doença articular.

(1-1) Uma composição, que é usada para tratamento de uma doença articular e que é injetada em uma articulação, que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido alginico de baixa endotoxina.

(1-2) Uma composição, que é usada para inibição de alterações degenerativas da cartilagem e que é injetada em uma articulação, que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido alginico de baixa endotoxina.

(1-3) Uma composição, que é usada para proteção da cartilagem e que é injetada em uma articulação, que contêm como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido alginico de baixa endotoxina.

(1-4) Uma composição, que é usada para reparação da cartilagem e que é injetada em uma articulação, que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido alginico de baixa endotoxina.

(1-5) Uma composição, que é usada para supressão da dor articular e que é injetada em uma articulação, que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido alginico de baixa endotoxina.

(1-6) Uma composição, que é usada para inibição de inflamação da articulação e que é injetada em uma

9/78 articulação, que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.

(1-7) Uma composição, que é usada para melhoria da função articular e que é injetada em uma articulação, que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.

(1-8) Uma composição, que é usada para tratamento de osteoartrite e que é injetada em uma articulação, que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.

(1-9) Uma composição, que é usada para tratamento de capsulite adesiva do ombro e que é injetada em uma articulação, que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.

(1-10) Uma composição, que é usada para supressão da dor articular associada à artrite reumatóide e que é injetada em uma articulação, que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.

(1-11) Uma composição para o tratamento de artrite reumatóide, que é injetada em uma articulação, que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.

(1-12) Uma composição para inibição da degeneração de tecido sinovial em artrite reumatóide, que é injetada em uma articulação, que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.

10/78 (1-13) Uma composição for inibição da destruição de articulação em artrite reumatóide, que é injetada em uma articulação, que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.

(1-14) Uma composição para injeção intra-articular que tem o efeito de alívio ou cura de sintomas associados à doença articular, que contém como um ingrediente ativo dessa, um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.

(1-15) Uma composição descrita em (1-14) acima, em que o efeito de alívio, melhoria ou cura dos sintomas associados à doença articular é pelo menos um efeito selecionado do grupo que consiste em inibição de alterações degenerativas da cartilagem, proteção da cartilagem, reparação da cartilagem, supressão da dor articular, inibição de inflamação da articulação, melhoria da função articular, inibição da degeneração de tecido sinovial, inibição de destruição osteocondral e inibição da destruição de articulação.

(1-16) Uma composição descrita em qualquer um de (1-1) a (1-15) acima, em que o sal de metal monovalente de ácido algínico é alginato de sódio.

(1-17) Uma composição descrita em (1-16) acima, em que o alginato de sódio é alginato de sódio que tem uma média de peso de peso molecular de 500.000 ou mais como determinado por cromatografia de filtração a gel.

(1-18) Uma composição descrita em qualquer um de (1-1) a (1-17) acima, que não contém células (por exemplo, células para regeneração de tecido cartilaginoso).

11/78 (1-19) Uma composição descrita em qualquer um de (1-1) a (1-18) acima, que não contém um agente de cura de um sal de metal monovalente de ácido algínico.

(1-20) Uma composição para o tratamento de artrite reumatóide, que é injetada em uma articulação, que contém como um ingrediente ativo dessa um alginato de sódio de baixa endotoxina que tem uma média de peso de peso molecular de 500.000 ou mais como determinado por cromatografia de filtração a gel, em que a composição não contém células e é não curável.

Além disso, a presente invenção fornece um método de tratamento para doença articular e sintomas associados a ela.

(2-1) Um método de tratamento de uma doença articular que compreende: a injeção em uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.

(2-2) Um método de inibição de alterações degenerativas da cartilagem que compreende: injeção em uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.

(2-3) um método de proteção da cartilagem que compreende: injeção em uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.

(2-4) um método de reparação da cartilagem que compreende: injeção em uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal

12/78 monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.

(2-5) Um método de supressão da dor articular que compreende: injeção em uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.

(2-6) Um método de inibição de inflamação da articulação que compreende: injeção em uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.

(2-7) Um método de melhoria da função articular que compreende: injeção em uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.

(2-8) Um método de tratamento de osteoartrite que compreende: injeção em uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.

(2-9) Um método de tratamento de capsulite adesiva do ombro que compreende: injeção em uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.

(2-10) Um método de supressão da dor articular associada à artrite reumatóide que compreende: injeção em uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.

(2-11) Um método de tratamento de artrite reumatóide

0 que compreende: injeção em uma articulação de uma

13/78 composição que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.

(2-12) Um método de inibição de degeneração do tecido sinovial em artrite reumatóide que compreende: injeção em uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.

(2-13) Um método de inibição da destruição de articulação em artrite reumatóide que compreende: injeção em uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.

(2-14) Um método de alívio, melhoria ou cura de sintomas associados à doença articular que compreende: injeção em uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.

(2-15) O método descrito em (2-14) acima, em que o efeito de alívio, melhoria ou cura de sintomas associados à doença articular é pelo menos um efeito selecionado do grupo que consiste em inibição de alterações degenerativas da cartilagem, proteção da cartilagem, reparação da cartilagem, supressão da dor articular, inibição de inflamação da articulação, melhoria da função articular, inibição da degeneração de tecido sinovial, inibição de destruição osteocondral e inibição da destruição de articulação.

(2-16) O método descrito em qualquer um de (2-1) a (215) acima, em que o sal de metal monovalente de ácido

14/78 algínico é alginato de sódio.

(2-17) O método descrito em (2-16) acima, em que o alginato de sódio é alginato de sódio que tem uma média de peso de peso molecular de 500.000 ou mais como determinado por cromatografia de filtração a gel.

(2-18) O método descrito em qualquer um de (2-1) a (217) acima, em que a composição não contém células (como células para regeneração do tecido cartilaginoso).

(2-19) O método descrito em qualquer um de (2-1) a (218) acima, em que a composição não contém a agente de cura de um sal de metal monovalente de ácido algínico.

(2-20) Um método de tratamento de artrite reumatóide que compreende: injeção em uma articulação de uma composição que contém como um ingrediente ativo dessa um alginato de sódio de baixa endotoxina que tem uma média de peso de peso molecular de 500.000 ou mais como determinado por cromatografia de filtração a gel, em que a composição não contém células e é não curável.

A composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção é capaz de inibir a progressão de doença articular e sintomas associados à doença articular, e alívio ou cure de sintomas dessa por injeção em uma articulação em um estado líquido. Um aspecto da composição da presente invenção demonstra efeitos inibidores reparadores, protetores e de degeneração sobre o dano mecânico da cartilagem enquanto também inibe as reações inflamatórias e dor no tecido articular. Além disso, a composição demonstra efeitos terapêuticos para destruição articular por inibição da degeneração de tecido sinovial que acompanha uma resposta autoimune e inibição de

15/78 destruição osteocondral. A composição contribui para a melhoria da função articular na doença articular através desses efeitos combinados. Em particular, a composição é útil no tratamento de osteoartrite, tratamento de capsulite adesiva do ombro, alívio de dor articular em artrite reumatóide, e tratamento de artrite reumatóide.

Breve descrição dos desenhos

FIG. 1 é um gráfico que mostra os critérios para pontuação das observações gerais em um modelo de reparação da cartilagem de coelho do Exemplo 1.

FIG. 2 é um gráfico que mostra os critérios para pontuação dos resultados de coloração em um modelo de reparação da cartilagem de coelho do Exemplo 1.

FIG. 3 mostra fotografias de coloração do tecido de um grupo de controle (A) (vazio) em um modelo de reparação da cartilagem de coelho do Exemplo 1. FIG. 3A mostra os resultados depois de 4 semanas enquanto a FIG. 3B mostra os resultados depois de 12 semanas. Os resultados são mostrados para, movendo da esquerda para a direita, coloração H-E, coloração de Safranina-0 e imunocoloração de colágeno tipo I e colágeno tipo II.

FIG. 4 mostra fotografias de coloração do tecido de um alginato de grau alimentar + células grupo (C) em um modelo de reparação da cartilagem de coelho do Exemplo 1. A FIG. 4A mostra os resultados depois de 4 semanas enquanto a FIG. 4B mostra os resultados depois de 12 semanas. Os métodos de coloração são os mesmos que aqueles da FIG. 3.

FIG. 5 mostra fotografias de coloração do tecido de um grupo de alginato purificado (sem células) (D) em um modelo de reparação da cartilagem de coelho do Exemplo 1. A FIG.

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5Α mostra os resultados depois de 4 semanas enquanto a FIG. 5B mostra os resultados depois de 12 semanas. Os métodos de coloração são os mesmos que aqueles da FIG. 3.

FIG. 6 mostra fotografias de coloração do tecido de um 5 grupo de alginato purificado + células (E) em um modelo de reparação da cartilagem de coelho do Exemplo 1. FIG. 6A mostra os resultados depois de 4 semanas enquanto a FIG. 6B mostra os resultados depois de 12 semanas. Os métodos de coloração são os mesmos que aqueles da FIG. 3.

FIG. 7 mostra os resultados de pontuação das observações gerais e coloração em um modelo de reparação da cartilagem de coelho do Exemplo 1.

FIG. 8 é um gráfico que mostra os resultados de edição da resistência mecânica para alginato purificado grupos (D) e (E) em um modelo de reparação da cartilagem de coelho do Exemplo 1.

FIG. 9 mostra fotografias da aparência das articulações do joelho em um modelo de osteoartrite de coelho do Exemplo 3.

FIG. 10 mostra fotografias de coloração de tecido articular do joelho em um modelo de osteoartrite de coelho do Exemplo 3.

FIG. 11 mostra fotografias da aparência das articulações do joelho em um modelo de osteoartrite de coelho do Exemplo 4 depois da coloração com tinta da índia. Nas fotografias, as áreas circundadas indicam limites entre lesões de dano à cartilagem coradas com tinta da índia e cartilagem normal. A) grupo de controle; B) grupo de dose de 1% hialuronato de sódio; C) grupo de dose de alginato de sódio 2% (peso molecular: 400.000); D) grupo de dose de

17/78 alginato de sódio 2% (peso molecular: 1.000.000); E) grupo de dose de alginato de sódio 2% (peso molecular: 1.700.000). Além disso, as fotografias mostram exemplos de várias amostras.

FIG. 12 mostra os resultados de pontuação de achados macroscópicos das articulações do joelho coradas com tinta da índia em um modelo de osteoartrite de coelho do Exemplo 4. NS, HA, AL40, AL100 e AL170, respectivamente, correspondem a (A) a (E) (mesmo que a FIG. 11) . Grau 1 indica uma superfície danificada não corada com tinta da índia (nenhuma captação da tinta da índia, que indica superfície intacta). Grau 2 indica coloração focal com tinta da índia e leve dano à superfície (captação focal mínima de tinta da índia, leve irregularidade da superfície). Grau 3 indica coloração grande, bem definida com tinta da índia e óbvia fibrilação (evidentes manchas focais grandes escuras de tinta da índia, fibrilação observável). Grau 4a indica erosão da cartilagem de menos que 2 mm (erosão da cartilagem <2 mm) . Grau 4b indica erosão da cartilagem de 2 a 5 mm (erosão da cartilagem 2-5 mm) . Grau 4c indica erosão da cartilagem maior que 5 mm (erosão da cartilagem >5 mm).

FIG. 13 mostra fotografias de coloração de tecido articular do joelho com Safranina-0 em um modelo de osteoartrite de coelho do Exemplo 4. A) a E) são o mesmo que na FIG. 11. Além disso, as fotografias mostram exemplos de várias amostras.

FIG. 14 mostra os resultados de pontuação de avaliações histopatológicas gerais em um modelo de osteoartrite de coelho do Exemplo 4. NS, HA, AL4 0, AL100 e

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AL170, respectivamente, correspondem a (A) a (E) (mesmo que a FIG. 11).

FIG. 15 mostra alterações com base em tempo em pontuações de marcha em um modelo de dor de artrite experimental de rato do Exemplo 6. A) grupo de controle (NS) ; B) grupo de dose de 1% hialuronato de sódio (1% HA) ; C) grupo de dose de alginato de sódio 2% (peso molecular: 1.000.000) (2% AL100) ; D) grupo de dose de alginato de sódio 1% (peso molecular: 1.700.000) (1% AL170) ; E) grupo de dose de alginato de sódio 2% (peso molecular: 1.700.000) (2% AL170). *: p<0,05 vs. NS.

FIG. 16 mostra uma fotografia de cabeças do úmero em um modelo de ruptura do manguito de coelho do Exemplo 7. a seta preta indica lesões de dano à cartilagem. Controle indica um grupo de dose de solução salina fisiológica, enquanto Alginato indica um grupo de dose de ácido algínico.

FIG. 17 é um gráfico que mostra coeficientes de fricção de amostras de articulação do joelho de um modelo de osteoartrite de coelho do Exemplo 8. Coeficientes de fricção são organizados em um eixo vertical. Controle (normal) indica uma articulação normal, HA(OA) indica uma articulação com OA administrada com ácido hialurônico, e AL100(OA) indica uma articulação com OA administrada com ácido algínico.

FIG. 18 é um gráfico que mostra alterações baseadas em tempo no grau de artrite após sensibilização com antígeno em um modelo de artrite induzida por colãgeno de rato do Exemplo 9. As pontuações de artrite são organizadas no eixo vertical, enquanto o número de dias após a sensibilização

19/78 com antígeno é organizado no eixo horizontal. A) indica um grupo de controle, B) um grupo de dose de 1% hialuronato de sódio, C) um grupo de dose de alginato de sódio 2% (peso molecular: 1.000.000), D) um grupo de dose de alginato de sódio 1% (peso molecular: 1.700.000) e E) um grupo de dose de alginato de sódio 2% (peso molecular: 1.700.000).

FIG. 19 mostra os resultados de classificação de avaliações histológicas do tecido sinovial da articulação do joelho em um modelo de artrite induzida por colãgeno de rato do Exemplo 9. A até E representam os mesmos grupos que na FIG. 18. *: p<0,05 vs. controle

FIG. 20 mostra os resultados de classificação de avaliações histológicas das patelas da articulação do joelho em um modelo de artrite induzida por colãgeno de rato do FIG. 9. A até E representam os mesmos grupos como na FIG. 18. *: p<0,05 vs. controle

FIG. 21 mostra os resultados de classificação de avaliações histológicas do côndilo femoral lateral da articulação do joelho em um modelo de artrite induzida por colãgeno de rato do Exemplo 9. A até E representam os mesmos grupos como na FIG. 18. *: p<0,05 vs. controle Melhor modo de realizar a invenção

Embora a seguir seja apresentada uma explicação detalhada da presente invenção, as seguintes modalidades são exemplos para explicar a presente invenção, e a presente invenção pode ser realizada de várias formas sem desviar do propósito desta.

1. Introdução

Cartilagem é encontrada em articulações; parede torácica; discos intervertebrais; menisco; estruturas

20/78 tubulares como garganta, trato respiratório e orelhas e assim por diante, e é classificada em três tipos que consistem em cartilagem de hialina, cartilagem elástica e cartilagem fibrosa. Por exemplo, a cartilagem articular é classificada como cartilagem de hialina, é composta de condrócitos, matriz extracelular colagenosa, proteoglicano e água, e é livre de intervenção vascular. A cartilagem de hialina é rica em colágeno tipo II, e é corada por anticorpos de colágeno tipo II. Ela também é caracterizada por ser corada em vermelho por corante safranina-0 usado para corar proteoglicano. Um dano à cartilagem refere-se a um estado em que uma cartilagem foi danificada devido ao envelhecimento, trauma ou outros fatores, e inclui um estado em que a função da cartilagem diminuiu, como uma diminuição na viscoelasticidade característica da cartilagem (que permite que a cartilagem se comprima lentamente quando submetida a uma carga e então retorne lentamente a seu estado original quando a carga é removida) assim prejudicando a capacidade de uma cartilagem de suportar uma carga enquanto mantém a mobilidade. O dano à cartilagem também pode ser observado em uma doença como osteoartrite e artrite reumatóide.

Na presente invenção, doença articular refere-se a uma doença que ocorre devido a um dano à cartilagem, tecido cartilaginoso e/ou tecido articular (como a membrana sinovial, articular cápsula ou osso subcondral) por irritação mecânica ou resposta inflamatória. Tratamento de doença articular refere-se ao alívio, melhoria e/ou cura de vários sintomas de tecido que foi danificado por irritação mecânica ou resposta inflamatória. Por exemplo,

21/78 no caso de osteoartrite, há ocorrência composta de sintomas como desgaste da cartilagem articular, degeneração do tecido cartilaginoso, inflamação da membrana sinovial ou dor associada à inflamação. Por outro lado, nos casos de capsulite adesiva do ombro, os sintomas consistem primariamente em inflamação da membrana sinovial e cápsula articular bem como dor associada a ela, enquanto o desgaste da cartilagem e degeneração podem não ser observados. Embora o mecanismo de ocorrência de artrite reumatóide não seja totalmente compreendido, acredita-se que o tecido sinovial e tecido cartilaginoso sejam destruídos por citocinas inflamatórias que resultam de uma resposta autoimune. Desse modo, a doença articular é uma doença que se apresenta com sintomas compostos, e são necessários fármacos para o tratamento dessa que tenham efeitos compostos, incluindo proteção da cartilagem do desgaste, inibição de alterações degenerativas em cartilagem devido ao desgaste ou inflamação, reparação de lesões de dano à cartilagem, inibição de inflamação e dor, inibição da degeneração de tecido sinovial, e inibição da destruição osteocondral. A composição que contém um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina da presente invenção tem os efeitos de proteção da cartilagem de irritação mecânica, inibição de alterações degenerativas em cartilagem causada por desgaste ou inflamação, reparação de lesões de dano à cartilagem, inibição de inflamação e dor de tecido articular, inibição da degeneração de tecido sinovial, e inibição de destruição osteocondral. Consequentemente, a composição é capaz de inibir o progressão da doença articular, e alívio, melhoria e/ou

22/78 cura de sintomas. Em particular, a composição é útil para o tratamento de osteoartrite, tratamento de capsulite adesiva do ombro, alívio dor articular associada à artrite reumatóide e tratamento de artrite reumatóide.

Além disso, injeção em uma articulação refere-se a injeção de uma composição líquida que tem fluidez em, por exemplo, uma cavidade articular, bolsa sinovial ou peritônio. No caso de uso para tratar osteoartrite e artrite reumatóide, a composição é preferivelmente injetada em uma cavidade articular. Além disso, embora a osteoartrite e artrite reumatóide possam ocorrer em várias articulações do corpo, incluindo aquelas dos joelhos, ombros, quadris, coluna inferior, tornozelos, punhos e dedos, a composição da presente invenção pode ser aplicada a qualquer uma dessas articulações.

2. Sal de metal monovalente de ácido algínico

O sal de metal monovalente de ácido algínico contido na composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção é um sal hidrossolúvel formado por troca iônica entre um átomo de hidrogênio de ácido carboxílico na posição 6 de ácido algínico e um íon de metal monovalente como Na⁺ ou K⁺. Embora exemplos específicos de sais de metal monovalente de ácido algínico incluam alginato de sódio e alginato de potássio, alginato de sódio que pode ser adquirido como um produto comercialmente disponível é particularmente preferido.

O ácido algínico usado na presente invenção é um polissacarídeo biodegradável, de alto peso molecular que é um polímero obtido por polimerização linear de dois tipos de ácidos urônicos na forma de ácido D-manurônico (M) e

23/78 ácido L-glurônico (G) . Mais especificamente, o ácido algínico é um copolímero em bloco em que uma fração de homopolímero de ácido D-manurônico (fração MM) , fração de homopolímero de ácido L-glurônico (fração GG) e fração em que o ácido D-manurônico e ácido L-glurônico são aleatoriamente arranjados (fração MG) são ligados arbitrariamente. A proporção composta do ácido D-manurônico para o ácido L-glurônico do ácido algínico (proporção M/G) varia principalmente de acordo com o tipo de algas ou outro organismo que serve como a origem desse, é afetada pelo habitat e estação daquele organismo, e se estende por uma

ampla faixa	de um	tipo de	alto	G que	tem uma proporção	M/G
de cerca de	0,4 a	um tipo	de alto M	que tem uma proporção
M/G de cerca	de 5 .
Um sal	de metal monovalente de	ácido algínico é	um
polissacarídeo, e	embora	se j a	é difícil de determinar	de

modo preciso o peso molecular, ele geralmente tem uma média de peso de peso molecular de 10.000 a 10.000.000 e preferivelmente 50.000 a 3.000.000. O alginato de sódio que tem uma média de peso de peso molecular de cerca de 1.000.000 e 1.700.000 como determinado por cromatografia de filtração a gel demonstrou efeitos inibidores superiores de alteração degenerativa da cartilagem, efeitos protetores da cartilagem, efeitos de reparação da cartilagem e efeitos inibidores de dor articular quando comparado com alginato de sódio que tem um peso molecular de cerca de 400.000. No caso de cálculo do peso molecular de um polissacarídeo por cromatografia de filtração a gel, há normalmente o potencial para medição de erro de 10 a 20%. Por exemplo, um peso molecular de 400.000 pode flutuar na faixa de 320.000

24/78 a 480.000, a peso molecular de 500.000 pode flutuar na faixa de 400.000 a 600.000, e um peso molecular de 1.000.000 pode flutuar na faixa de 800.000 a 1.200.000. Portanto, a faixa de peso médio preferido de peso molecular de um sal de metal monovalente de ácido algínico para o qual os efeitos sobre a doença articular são particularmente superiores é de pelo menos 500.000 ou mais, mais preferivelmente 650.000 ou mais, e ainda mais preferivelmente 800.000 ou mais. Além da produção difícil, uma vez que ocorrem problemas como viscosidade sendo excessivamente alta quando da preparação de uma solução aquosa ou diminuição da solubilidade se o peso molecular for excessivamente alto, o peso médio de peso molecular é preferivelmente 5.000.000 ou menos e mais preferivelmente

3.000.000 ou menos.

Uma vez que substâncias de alto peso molecular derivadas de uma origem natural tipicamente não têm um único peso molecular, mas consistem em um agregado de moléculas que têm vários pesos moleculares, o peso molecular é medido na forma de uma distribuição de peso molecular que tem uma cerca faixa. Uma técnica de medição típica é cromatografia de filtração a gel. Exemplos típicos de informação obtida a partir da distribuição de peso molecular como determinado por cromatografia de filtração a gel incluem média de peso de peso molecular (Mw), número médio de peso molecular (Mn)e proporção de variância (Mw/Mn).

A média de peso de peso molecular enfatiza a contribuição do peso molecular médio de polímeros que têm um grande peso molecular, e é representada com a seguinte

25/78 fórmula:

Mw = Z(WiMÍ)/W = Σ (HiMi)/ Σ (Hi)

Número médio de peso molecular é calculado por divisão do peso total de polímeros pelo número total de polímeros.

Mn = W/ΣΝϊ = Σ (MiNi)/ ΣΝί = Σ (Hi)/ Σ (Hi/Mi)

Aqui, W representa o peso total de todos os polímeros, Wi representa o peso do ith polímero, Mi representa peso molecular em um tempo de eluição ith, Ni representa o número de pesos moleculares, Mi, e Hi representa o peso no tempo de eluição ith.

Uma vez que os efeitos de regeneração da cartilagem (e particularmente efeitos de regeneração de cartilagem de hialina) em lesões de dano à cartilagem, efeitos de reparação da cartilagem, efeitos inibição de alterações degenerativas da cartilagem e/ou efeitos protetores da cartilagem no tratamento de uma doença articular são considerados como sendo amplamente contribuídos pelas espécies moleculares que têm altos pesos moleculares, média de peso de peso molecular pode ser usada como um indicador de peso molecular.

Diferenças nos valores de acordo com o método medição são conhecidas por ocorrer na medição de pesos moleculares de substâncias com alto peso molecular derivadas de uma origem natural (exemplo de ácido hialurônico: Chikako Yomota e cols., Bull. Natl. Health Sei., Vol. 117, pp. 135139 (1999), Chikako Yomota e cols., Bull. Natl. Health

Sei., Vol. 121, pp. 30-33 (2003)). Métodos para a medição de peso molecular de alginato descritos na literatura incluem um método em que o peso molecular é calculado a partir de viscosidade intrínseca, e um método em que o peso

26/78 molecular é calculado por Cromatografia de exclusão por tamanho com detecção de dispersão de luz de laser de ângulo múltiplo (SEC-MALLS) (ASTM F2064-00 (2006), publicado por ASTM International). Além disso, é também descrito na literatura que na medição de peso molecular por cromatografia de exclusão por tamanho (cromatografia de fíltração a gel) , o cálculo a partir de uma curva de calibragem com o uso de pululana para a substância padrão é insuficiente, e é recomendado que a medição do peso molecular seja usada em combinação com detector de dispersão de luz de laser de ângulo múltiplo (MALLS) (ou seja, medição por SEC-MALLS) . Além disso, há também exemplos do uso de pesos moleculares determinados por SECMALLS sendo usados como especificações de catálogo de alginatos (FMC Biopolymer Inc., PRONOVA™ catálogo de Alginato de sódios).

Os inventores da presente invenção descobriram que há diferenças nos efeitos terapêuticos de alginato de sódio que tem diferentes pesos moleculares em um modelo de OA, e mediram os pesos moleculares desses alginatos por cromatografia de fíltração a gel e SEC-MALLS. Consequentemente, os pesos moleculares determinados por cromatografia de fíltração a gel foram determinados para demonstrar uma maior correlação com viscosidade e efeitos terapêuticos dos alginatos. Ou seja, foi recentemente constatado que em vez do método de SEC-MALLS geralmente recomendado, o peso molecular determinado por cromatografia de fíltração a gel ê mais adequados como um parâmetro para a especificação da faixa preferida de peso molecular de alginatos usados em uma composição para o tratamento de uma

27/78 doença articular. Assim, no caso de especificação do peso molecular de um alginato na presente especificação, aquele peso molecular é a média de peso de peso molecular como calculado por cromatografia de filtração a gel a menos que especificamente determinado em contrário.

As condições preferidas para cromatografia de filtração a gel são como indicado nos exemplos. Uma condição típica consiste no uso de uma curva de calibragem com o uso de pululana para a substância padrão. Pululana que tem um peso molecular de pelo menos 1.600.000, 788.000, 404.000, 212.000 e 112.000 são preferivelmente usados para a pululana usada para a substância padrão. Em adição, o eluado (200 mM solução de nitrato de sódio), condições de coluna e outros também podem ser especificados. As condições de coluna consistem preferivelmente no uso de preenchimento com base em resina de polimetacrilato e no uso de pelo menos uma coluna que tenha um valor de corte de peso molecular de 10.000.000 ou mais. Um exemplo típico de uma coluna é TSKgel GMPWxl (diâmetro: 7,8 mm x 300 mm) (Tosoh Corp.).

Embora um sal de metal monovalente de ácido algínico tenha um grande peso molecular e alta viscosidade quando inicialmente isolado de algas marrons, o peso molecular diminui a viscosidade diminui durante a duração de experimento de secagem por calor, liofilização, purificação e outros. Portanto, os sais de metal monovalente de ácido algínico que têm diferentes pesos moleculares podem ser produzidos por controle adequado da temperatura em cada etapa de produção. Sais de metal monovalente de ácido algínico que têm um alto peso molecular são obtidos por

28/78 controle da temperatura em cada etapa de produção para ser um tanto baixa, enquanto os sais de metal monovalente de ácido algínico que têm um baixo peso molecular são obtidos por controle da temperatura em cada etapa de produção para ser um tanto alta. Além disso, os sais de metal monovalente de ácido algínico que têm diferentes pesos moleculares também podem ser produzidos por uma técnica como seleção adequada das algas marrons usadas para o material bruto, ou fracionamento de acordo com peso molecular no processo de produção. Ademais, um sal de metal monovalente de ácido algínico que tem um peso molecular alvo também pode ser obtido por mistura de um sal de metal monovalente de ácido algínico produzido de acordo com vários processos de produção com um diferente lote de sal de metal monovalente de ácido algínico que tem um diferente peso molecular ou viscosidade depois de ter medido o peso molecular ou viscosidade desse.

Embora o ácido algínico usado na presente invenção possa ser de uma origem natural ou sintética, ele é preferivelmente derivado de uma origem natural. Exemplos de ácidos algínicos de ocorrência natural incluem aqueles extraídos de algas marrons. Embora as algas marrons que contêm o ácido algínico sejam encontradas principalmente nas costas do mar por todo o mundo, as algas que podem ser realmente usadas como materiais brutos de ácido algínico são limitadas, com exemplos típicos dessa incluindo espécies Lessonia encontradas na América do Sul, espécies Macrocystis encontradas na América do Norte, espécies Laminaria e Ascophyllum encontradas na Europa, e espécies Durvillea encontradas na Austrália. Exemplos de algas

29/78 marrons que servem como materiais brutos de ácido algínico incluem Lessonia species, Macrocystis species, Laminaria species, Ascophyllum species, Durvillea species, Eisenia species e Ecklonia species.

3. Tratamento de redução de endotoxina

O sal de metal monovalente de ácido algínico contido na composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção é um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina. Baixa endotoxina refere-se àquela em que o nível de endotoxina foi substancialmente diminuído a uma extensão que não induz inflamação ou febre. Ou seja, o sal de metal monovalente de ácido algínico foi submetido a tratamento de redução de endotoxina. Descobriuse de modo surpreendente quando se submete a esse tratamento de redução de endotoxina, além de ser capaz de aumentar a ação regenerativa da cartilagem da composição quando aplicada a uma lesão de dano à cartilagem, a regeneração de osso subcondral pode ser promovida e a resistência mecânica da área afetada pode ser aumentada. Ou seja, pelo uso de ácido algínico de baixa endotoxina na composição da presente invenção, pode ser obtida uma composição que tem alta bioafinidade, e que não induz a degeneração e respostas inflamatórias na cartilagem circundante.

O tratamento de redução de endotoxina pode ser realizado por um método conhecido ou um método de acordo com ele. Por exemplo, esse tratamento pode ser realizado pelo método de Suga e cols. que envolve a purificação de hialuronato de sódio (veja, por exemplo, Pedido de Patente Japonesa Laid-open No. H9-324001), o método de Yoshida e

30/78 cols. que envolve a purificação de pi,3-glucano (veja, por exemplo, Pedido de Patente Japonesa Laid-open No. H8269102), o método de William e cols. que envolve a purificação de um biopolímero como alginato ou goma gelana (veja, por exemplo, Tradução Japonesa Publicada No. 2002530440 de Publicação Internacional PCT), o método de James e cols. que envolve a purificação de polissacarídeo (veja, por exemplo, Publicação Internacional No. 93/13136 panfleto), o método de Lewis e cols. (veja, por exemplo,

Patente US No. 5.589.591), o método de Hermanfranck e cols. que envolve a purificação de alginato (veja, por exemplo, Appl. Microbiol. Biotechnol. (1994), 40:638-643) ou um método de acordo com esses. O tratamento de redução de endotoxina da presente invenção não é limitado a isso, mas, ao contrário, pode ser realizado por um método conhecido como limpeza, purificação com o uso de filtração com filtro (filtro de remoção de endotoxina ou filtro de eletrificação), ultrafiltração ou uma coluna (como uma coluna de afinidade de adsorção de endotoxina, coluna de

0 filtração a gel ou gel de troca iônica) , adsorção a uma substância hidrofóbica, resina ou carbono ativado e outros, tratamento com solvente orgânico (como extração com um solvente orgânico ou precipitação ou deposição por adição de solvente orgânico), tratamento com tensoativo (veja, por exemplo, Pedido de Patente Japonesa Laid-open No. 2005036036) ou uma combinação adequadas desses. Um método conhecido como separação centrífuga pode ser adequadamente combinado com essas etapas de tratamento. O tratamento de redução de endotoxina é preferivelmente selecionado adequadamente de acordo com o tipo de ácido algínico.

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O nível de endotoxina pode ser confirmado por um método conhecido, e pode ser medido com o uso de um método conhecido como um método que usa um reagente de limulus (LAL) ou método que usa um conjunto Endospecy (marca registrada) ES-24S (Seikagaku Corp.). Embora não haja limitações particulares sobre o método de tratamento de endotoxina do ácido algínico contido na composição da presente invenção, o teor de endotoxina do sal de metal monovalente de ácido algínico no caso de medição de endotoxina com o uso de um reagente de limulus (LAL) é preferivelmente de 500 unidades de endotoxina (EU)/g ou menos, mais preferivelmente 100 EU/g ou menos, ainda mais preferivelmente 50 EU/g ou menos e particularmente preferivelmente 30 EU/g ou menos como um resultado dessa.

Alginato de sódio que sofreu tratamento de redução de endotoxina pode ser adquirido como produtos comercialmente disponíveis como Sea Matrix (sterilized) (Kimica Corp., Mochida International Ltd.) e Pronova™ UP LVG (FMC).

4. Preparação de solução de sal de metal monovalente de ácido algínico

Uma composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção pode ser preparada pelo uso de uma solução de um sal de metal monovalente de ácido algínico. A solução de um sal de metal monovalente de ácido algínico pode ser preparada por um método conhecido ou método de acordo com esse. Ou seja, o sal de metal monovalente de ácido algínico usado na presente invenção pode ser produzido por um método conhecido como um método de ácido ou método de cálcio que usa as algas marrons previamente descritas. Mais especificamente, depois da

32/78 extração dessas algas marrons com o uso de uma solução aquosa alcalina como solução aquosa de carbonato de sódio, por exemplo, o ácido algínico pode ser obtido por adição de um ácido (como ácido clorídrico ou ácido sulfúrico), e um sal de ácido algínico pode ser obtido por troca iônica do ácido algínico. O tratamento de redução de endotoxina é então realizado como previamente descrito. Não há limitações particulares sobre o solvente do sal de ácido algínico desde que ele seja um solvente que possa ser aplicado in vivo, e exemplos de tais solventes incluem água purificada, água destilada, água de troca iônica, água Milli-Q, solução salina fisiológica e solução salina tamponada por fosfato (PBS). Esses são preferivelmente esterilizados e preferivelmente submetidos a tratamento de redução de endotoxina. Por exemplo, água Milli-Q pode ser usada após esterilização por filtração. Em adição, o procedimento para obtenção da composição da presente invenção é preferivelmente realizado em um ambiente que tenha baixos níveis de endotoxinas e bactérias. Por exemplo, o procedimento é preferivelmente realizado em uma bancada limpa com o uso de aparelho esterilizado, e os aparelhos usados podem ser tratados com agente de remoção de endotoxina comercialmente disponível.

No caso de produção de uma composição como acima descrito com o uso de um sal de metal monovalente de ácido algínico que foi purificado a um nível preferível de endotoxina, o teor de endotoxina da composição é normalmente 5 00 EU/g ou menos, mais preferivelmente 3 00 EU/g ou menos e particularmente preferivelmente 150 EU/g ou menos.

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5. Viscosidade da composição para o tratamento de doença articular

Embora não haja limitações particulares sobre a viscosidade da composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção no caso de injeção dela em uma articulação, efeitos terapêuticos para doença articular são obtidos, ela é preferivelmente de 100 a 20.000 mPa.s. Por exemplo, a composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção pode ser ajustada a uma viscosidade adequada com o uso do solvente acima mencionado. Se a viscosidade está dentro dessa faixa, a composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção pode ser injetada com uma seringa e outros. A viscosidade é preferivelmente 150 a 15.000 mPa.s, mais preferivelmente 200 a 10.000 mPa.s, e particularmente preferivelmente 250 a 6.000 mPa.s. O uso de uma viscosidade adequada torna possível demonstrar o efeito de compensação para a função de amortecimento do fluido sinovial, assim tornando possível demonstrar o efeito de tratamento de uma doença articular sendo disperso no fluido sinovial.

A viscosidade da composição para o tratamento de uma doença articular pode ser ajustada, por exemplo, por controle da concentração de ácido algínico na solução de um sal de metal monovalente de ácido algínico ou controle do peso molecular do ácido algínico.

A viscosidade da solução do sal de metal monovalente de ácido algínico aumenta quando a concentração de ácido algínico na solução é alta e diminui quando a concentração de ácido algínico na solução é baixa. Embora não sendo capaz de ser declarada como um resultado de ser afetada

34/78 pelo peso molecular, a concentração preferida de ácido algínico na solução do íon de metal monovalente de ácido algínico é de 0,2 a 5% p/v, mais preferivelmente 0,5 a 3% p/v e particularmente preferivelmente 1 a 2,5% p/v.

Um sal de metal monovalente de ácido algínico que tem um alto peso molecular pode ser selecionado para obter uma composição que tem alta viscosidade a partir da solução de um sal de metal monovalente de ácido algínico que tem baixa concentração. Uma vez que a viscosidade da solução de um sal de metal monovalente de ácido algínico é afetada pela proporção M/G, pode ser adequadamente selecionado um ácido algínico que tenha uma proporção M/G mais preferível para a viscosidade da solução e outros. A proporção M/G de ácido algínico usado na presente invenção é cerca de 0,4 a 4,0, preferivelmente cerca de 0,8 a 3,0 e, mais preferivelmente, cerca de 1,0 a 1,6.

Como previamente descrito, uma vez que a proporção M/G é determinada primariamente pelo tipo de alga, o tipo de algas marrons usado para o material bruto tem um efeito sobre a viscosidade da solução do sal de metal monovalente de ácido algínico. O ácido algínico usado na presente invenção é preferivelmente derivado de algas marrons dos gêneros Lessonia, Macrocystis, Laminaria, Ascophyllum e Durvillea, mais preferivelmente derivado de algas marrons do gênero Lessonia, e particularmente preferivelmente algas marrons de Lessonia nigrescens.

6. Formulação e aplicação de uma composição para o tratamento de doença articular que contém um sal de metal monovalente de ácido algínico

Uma composição para o tratamento de uma doença

35/78 articular da presente invenção é usada para tratar uma doença articular por injeção em uma articulação de um mamífero humano ou não humano como uma vaca, macaco, pássaro, gato, camundongo, rato, porquinho da índia, hamster, porco, cão, coelho, carneiro ou cavalo.

A forma da composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção é um líquido fluido, ou seja, uma solução. Na presente invenção, a frase que tem fluidez refere-se a ter a propriedade que faz a forma dessa se modificar a uma forma amorfa. Por exemplo, a composição preferivelmente tem fluidez de modo que ela seja capaz de ser injetada em uma área afetada. A composição da presente invenção na forma de uma solução pode ser facilmente aplicada a uma articulação com uma seringa, pipeta de gel ou seringa para objetivo especial.

Uma composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção demonstra efeitos terapêuticos sobre a doença articular em doenças articulares como osteoartrite, capsulite adesiva do ombro e artrite reumatóide por ter efeitos de reparação da cartilagem, efeitos inibidores sobre alterações degenerativas da cartilagem, efeitos protetores da cartilagem, efeitos inibidores sobre inflamação de tecido articular, efeitos inibidores sobre dor atribuída à inflamação do tecido articular, efeitos inibidores sobre degeneração do tecido sinovial e/ou efeitos inibidores sobre destruição osteocondral. A composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção inibe a destruição articular e melhora a função articular através desses efeitos combinados.

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Um aspecto da composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção é uma composição para o tratamento de osteoartrite. No caso do dano à cartilagem se estender sobre uma área ampla de cartilagem articular no modo de osteoartrite, ou quando desejável para tratar um tipo de dano à cartilagem frequentemente observado em um estágio comparativamente precoce de osteoartrite de modo que a uniformidade da superfície da cartilagem é perturbada e alterações degenerativas se iniciam embora defeitos da cartilagem bem definidos ainda não tenham ocorrido, a composição da presente invenção é preferivelmente aplicada por injeção em uma cavidade articular e se dispersa por todo o fluido sinovial. O contato de um sal de metal monovalente de ácido algínico com a lesão de dano à cartilagem promove a reparação da articulação na lesão de dano à cartilagem, inibe alterações degenerativas causadas por inflamação e desgaste, e protege a cartilagem. Além disso, como um resultado da dispersão do ingrediente ativo na forma de um sal de metal monovalente de ácido algínico por todo o fluido sinovial, as respostas inflamatórias do tecido circundante, incluindo tecido sinovial, são inibidas e os efeitos que suprimem a dor são demonstrados. Ao mesmo tempo, a presença de um sal de metal monovalente de ácido algínico no fluido sinovial cumpre o papel de compensação para a função de fluido sinovial ao servir como um amortecedor e lubrificante.

Outro aspecto da composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção é uma composição para o tratamento de capsulite adesiva do ombro (periartrite úmero-escapular). A capsulite adesiva do ombro se apresenta

37/78 primariamente com inflamação da membrana sinovial e cápsula articular ligada à dor associada, e o desgaste da cartilagem e a degeneração podem não ser observados. Uma vez gue um sal de metal monovalente de ácido algínico demonstra os efeitos de inibição de respostas inflamatórias de tecido circundante, incluindo tecido sinovial e supressão da dor, a capsulite adesiva do ombro pode ser tratada por administração de uma composição da presente invenção na cavidade articular do ombro, bolsa subacromial ou bainha do tendão do músculo bíceps.

Outro aspecto da composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção é uma composição para supressão da dor articular. A dor articular é frequentemente um problema em artrite reumatóide em adição à osteoartrite, capsulite adesiva do ombro e outros, como previamente descrito. Um aspecto preferível da presente invenção é uma composição para o tratamento de dor articular associada à artrite reumatóide, e é particularmente preferivelmente uma composição para a supressão de dor articular do joelho associada à artrite reumatóide crônica. Embora o mecanismo de ocorrência de artrite reumatóide não seja ainda totalmente compreendido, o tecido sinovial e o tecido cartilaginoso são destruídos por citocinas inflamatórias que resultam de uma resposta autoimune. Uma vez que um sal de metal monovalente de ácido algínico demonstra efeitos que inibem as respostas inflamatórias do tecido circundante, incluindo o tecido sinovial e suprime a dor, a composição da presente invenção é capaz de inibir respostas inflamatórias e suprimir dor associada a ela pela administração em uma articulação que

38/78 sofre de artrite reumatóide.

Um aspecto da composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção é uma composição para o tratamento de artrite reumatóide. A composição da presente invenção inibe a destruição osteocondral e degeneração de tecido sinovial que acompanha uma resposta autoimune. Em adição, quando a degeneração de tecido articular ocorre devido a uma resposta autoimune, a articulação não é mais capaz de demonstrar seu movimento suave inerente, assim resultando em dano mecânico à cartilagem do mesmo modo que na osteoartrite. A composição da presente invenção promove a reparação articular de danos à cartilagem e protege a cartilagem e inibe alterações degenerativas na cartilagem causadas por inflamação e desgaste. A composição da presente invenção demonstra efeitos terapêuticos por inibição da destruição de articulação em artrite reumatóide através desses efeitos combinados.

Outro aspecto da composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção é uma composição para alivio, melhoria e/ou cura de vários sintomas associados a uma doença articular. Em uma doença articular, a cartilagem, tecido cartilaginoso e/ou tecido articular (como membrana sinovial, cápsula articular ou osso subcondral) são danificados por irritação mecânica ou resposta inflamatória, e ocorrem sintomas compostos como desgaste da cartilagem articular, alterações degenerativas em tecido cartilaginoso devido à irritação mecânica junto com respostas inflamatórias, inflamação da membrana sinovial e de outros tecidos articulares, dor articular

39/78 atribuível à inflamação, degeneráção do tecido sinovial, e destruição osteocondral. Uma vez que a composição da presente invenção contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina, ela tem os efeitos múltiplos de proteção da cartilagem de irritação mecânica, inibição de alterações degenerativas em cartilagem causadas por desgaste e inflamação, reparação de lesões de dano à cartilagem, inibição de inflamação do tecido articular e dor, inibição da degeneráção de tecido sinovial, e inibição de destruição osteocondral. Consequentemente, a composição da presente invenção é capaz de inibir a progressão de uma doença articular, e alívio, melhoria e/ou cura de sintomas. Além disso, a composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção tem o efeito de melhoria da função articular através do alívio, melhoria e/ou cura de sintomas dessa. A melhoria da função articular refere-se a melhoria da escala de movimento da articulação, melhoria do movimento realizado durante a vida diária e outros.

No caso de aplicação da composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção por injeção em uma articulação, a dose é adequadamente determinada de acordo com a quantidade de fluido sinovial da articulação em que a composição será injetada, e embora não haja limitações particulares, no caso de administração a um ser humano na articulação do joelho ou articulação do ombro, a dose é normalmente de 1 a 5 mL e mais preferivelmente 2 a 3 mL. Em adição, o método de administração pode consistir em, por exemplo, administração em cinco administrações consecutivas em intervalos de uma semana, seguida por

40/78 administrações contínuas a cada 2 a 4 semanas. Embora não haja limitações particulares sobre a dose, a dose pode ser adequadamente ajustada de acordo com os sintomas e efeitos. Por exemplo, um método de administração pode ser adotado em que a administração é adequadamente continuada uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses ou uma vez a cada seis meses. Uma vez que o ácido algínico não está inerentemente presente no corpo, os animais não possuem uma enzima capaz de quebrar especificamente o ácido algínico. Embora o ácido algínico seja normalmente gradualmente decomposto por hidrólise no corpo de um animal, já que sua decomposição no corpo é lenta em comparação com polímeros como ácido hialurônico, pode ser esperado que ele sustente efeitos de longa duração no caso de ser administrado em uma articulação.

Uma composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina. Os inventores da presente invenção descobriram pela primeira vez que o ácido algínico em si demonstra efeitos terapêuticos sobre tecido cartilaginoso e tecido articular no caso de administração de ácido algínico em uma articulação do corpo. Um sal de metal monovalente de ácido algínico preferivelmente refere-se ao alginato de sódio, e mais preferivelmente ao alginato de sódio que tem uma média de peso de peso molecular de 500.000 ou mais como determinado por cromatografia de filtração a gel. Conter ácido algínico como um ingrediente ativo significa que o ácido algínico é contido em uma quantidade que permite que

4Τ/Ί3 ele demonstre efeitos terapêuticos sobre tecido cartilaginoso e tecido articular quando aplicado a uma área afetada, e que a quantidade é preferivelmente pelo menos 0,1% p/v ou mais da composição inteira, mais preferivelmente 0,5% p/v ou mais, e particularmente preferivelmente 1 a 3% p/v.

Uma composição para regeneração de cartilagem ou tratamento de uma doença da cartilagem da presente invenção também pode conter outros ingrediente farmaceuticamente ativos e componentes comumente usados em farmácia, como estabilizantes, emulsificantes, agentes de ajuste de pressão osmótica, tampões, agentes isotônicos, conservantes, agentes de alívio da dor ou colorantes comumente usados como necessário.

Além disso, em um aspecto da presente invenção, a composição da presente invenção não contém um componente que demonstra ação farmacológica sobre a cartilagem ou tecido articular outro que não um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina. Uma composição que contém como um ingrediente ativo dessa apenas um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina é também capaz de demonstrar efeitos adequados para o tratamento de uma doença articular.

Por exemplo, é preferível usar uma composição que não contém células para facilitar o procedimento cirúrgico bem como reduzir o risco de infecção por vírus e outros atribuíveis ao corpo ou o processo de cultura sem sobrecarregar de modo excessivo o corpo através de tais procedimentos como coleta de condrócitos, periósteo ou medula óssea. Células referem-se especificamente a células

42/78 para regeneração do tecido cartilaginoso, exemplos dessas incluem células-tronco mesenquimais de medula óssea, células estromais mesenquimais de medula óssea, células precursoras da cartilagem, condrócitos, sinoviócitos, células-tronco eritropoiéticas e células ES. A composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção é uma composição que tem para um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina, e é baseada no achado de que o ácido algínico em si tem efeitos terapêuticos sobre doença articular. Um exemplo preferível de uma composição terapêutica é uma composição livre de células para o tratamento de uma doença articular injetada em uma articulação que contém como um ingrediente ativo dessa alginato de sódio de baixa endotoxina que tem uma média de peso de peso molecular de 500.000 ou mais como determinado por cromatografia de filtração a gel, que é capaz de demonstrar efeitos terapêuticos superiores àqueles de preparações de ácido hialurônico usadas na técnica prévia.

A composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção preferida não contém um agente de cura para o sal de metal monovalente de ácido algínico. Um agente de cura para um sal de metal monovalente de ácido algínico refere-se a um componente que causa cura ou gelação de ácido algínico na presença de um sal de metal monovalente de ácido algínico em solução, exemplos desses incluem compostos divalentes ou de mais íon de metal como Ca²⁺, Mg²⁺, Ba²⁺ ou Sr²⁺, e reagentes de entrecruzamento que têm 2 a 4 grupos amino em uma molécula desse. Exemplos específicos incluem CaCl₂, MgCl₂, CaSO₄ e BaCl₂, gluconato

43/78 difícil

Consequentemente, de cálcio e alginato de cálcio. Quando esses componentes são contidos a um grau que causa cura e/ou gelação de ácido algínico, a injeção com uma seringa e outros torna-se devido à gelação do ácido algínico.

ocorrem problemas como obstrução da função articular devido à solidificação de uma grande quantidade de ácido algínico na articulação. Uma composição curável é adequada para uso por preenchimento em um orifício e assim por diante de um defeito da articulação. Por outro lado, para demonstrar efeitos terapêuticos combinados por todo o tecido articular de osteoartrite ou artrite reumatóide que se estende por toda a articulação como no modo da composição da presente invenção, a composição e si é preferivelmente não curável. Embora solventes típico de fármaco contenham quantidades de traço de íons de metal divalentes, agentes de cura como aqui referidos não são aplicáveis já que eles são adicionados com a intenção de cura e/ou gelação de um sal de metal monovalente de ácido algínico. Um aspecto preferível da composição da presente invenção é uma composição que não contém um agente de cura de um sal de metal monovalente de ácido algínico a um grau que causa cura e/ou gelação de ácido algínico. Em outras palavras, um aspecto preferível da composição da presente invenção é uma composição não curável.

Além disso, a presente invenção fornece um método de tratamento de doença articular que usa a composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção como acima descrito. O método de tratamento de doença articular da presente invenção inibe a progressão da doença

44/78 articular e alivia, melhora e/ou cura os sintomas por administração da composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção em uma articulação. A administração da composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção em uma articulação inibe o progressão da doença articular e alivia, melhora e/ou cura os sintomas por demonstração de pelo menos um dos efeitos selecionados do grupo que consiste em inibição de alterações degenerativas da cartilagem, proteção da cartilagem, reparação da cartilagem, supressão da dor articular, inibição de inflamação da articulação, inibição da degeneração de tecido sinovial e inibição de destruição osteocondral. A função articulação é melhorada e a destruição articular é inibida através desses efeitos combinados.

Não há limitações particulares sobre o método para a aplicação da composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção a uma articulação, e, por exemplo, a composição pode ser injetada diretamente em uma articulação com uma seringa, pipeta de gel ou seringa para objetivo especial. No caos de aplicação por injeção em uma articulação, uma agulha de 18 a 27G é usada preferivelmente. Injeção em uma articulação refere-se à injeção de uma composição líquida que tem fluidez em uma cavidade articular, bolsa ou bainha de tendão e outros. No caso de uso para tratar osteoartrite ou artrite reumatóide, a composição é preferivelmente aplicada por injeção em uma cavidade articular. Além disso, embora a osteoartrite e artrite reumatóide possam ocorrer em várias articulações como articulações do joelho, ombro, quadril, coluna lombar,

45/78 tornozelo, punho ou dedos, a composição da presente invenção pode ser aplicada a qualquer uma dessas articulações.

Em adição, fármacos concomitantes que incluem antibióticos como estreptomicina, penicilina, tobramicina, amicacina, gentamicina, neomicina ou anfotericina B ou fármacos antiinflamatórios como aspirina, fármacos antiinflamatórios não esteróides (NSAIDs) ou acetaminofeno, ou fármacos esteróides também podem ser administrados antes, simultaneamente ou depois da administração da composição da presente invenção. Esses fármacos também podem ser usados por mistura em uma composição da presente invenção.

7. Kit para o tratamento de uma doença articular

Além disso, a presente invenção fornece um kit para o tratamento de uma doença articular. Esse kit pode incluir uma composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção como acima descrito, seringa, gel pipeta, enchimento de objetivo especial, instruções e outros. Um exemplo específico preferido de um kit é aquele em que um sal de metal monovalente de ácido alginico é selado em um compartimento da seringa composta de dois compartimentos integralmente formados divididos por uma partição, e a solução que contém a solução salina fisiológica como uma solução de dissolução é selada no outro compartimento, e é composta de tal modo que a divisão entre os compartimentos pode ser facilmente penetrada no momento do uso para permitir que o conteúdo de ambos os compartimentos seja usado por mistura e dissolução no momento do uso. Outro exemplo de um kit é aquele em que uma solução de sal de

46/78 metal monovalente de ácido algínico é selada em uma seringa preenchida que permite que ela seja administrada diretamente no momento do uso sem necessitar de um procedimento de preparação. Além disso, o kit também pode conter fármacos concomitantes que incluem antibióticos como estreptomicina, penicilina, tobramicina, amicacina, gentamicina, neomicina ou anfotericina B ou fármacos antiinflamatórios como aspirina, fármacos analgésicos antipiréticos não esteróides (NSAIDs) ou acetaminofen, ou fármacos esteróides.

O uso desse kit permite que seja realizada a terapia de doença articular facilmente.

Além disso, todas as publicações citadas na presente especificação, como documentos de técnica prévia, pedidos de patente em aberto, publicações de patente e outros documentos de patente, são incorporados em sua totalidade na presente especificação como referências. Em adição, a presente especificação incorpora o conteúdo das especificações de pedido de patente Japonesa na forma de pedido de patente Japonesa No. 2007-277005 bem como pedido de patente Internacional PCT/JP2008/52999.

Embora seja fornecida a seguir uma explicação detalhada da presente invenção através de exemplos dessa, a presente invenção não é limitada a estes exemplos.

Exemplo 1

Modelo de reparação da cartilagem de coelho (1) Produção de células de transplante

Células estromais mesenquimais de medula óssea (BMSC) foram isoladas e cultivadas para obter células. BMSC incluem células eritropoiéticas e outras além de células47/78 tronco mesenquimais de medula óssea. Dez mL de medula óssea foram coletados da tíbia de coelhos brancos japoneses de quatro meses de idade, seguido por lavagem duas vezes com PBS livre de Ca-Mg (Gibco BRL Lab.) e suspensão em DMEMalta Glicose (DMED-HG, Sigma Chemical, St. Louis, MO) . Os coágulos sanguíneos foram removidos com um filtro de células que tem um diâmetro de poro de 70 mm (Falcon Co., Ltd.). As células foram então incubadas com umidificação a 37°C e 5% C0₂ em uma placa de cultura de 100 mm que contém um meio de cultura que consiste em DMEM-HG, 10% soro bovino fetal (FBS, Gibco, Life Technology, Grand Island, NY) e 1% antibióticos (Penicilina-estreptomicina-Fungizona 100X concentrado, Cambrex Biosciences, Walkersville, MD). O meio de cultura foi substituído a cada três dias e as células não aderentes foram removidas. Depois de cultura de monocamada das células por 10 a 14 dias, as células foram removidas com tripsina-EDTA (10 mM, Sigma, UK) e contadas seguido por subcultura a cada três dias.

(2) Método (Procedimento)

Quarenta fêmeas de coelhos brancos japoneses (peso corporal: 2,6 a 2,9 kg) foram anestesiados com isoflurano em gás O₂ e injeção intravenosa de pentobarbital (0,05 mg/kg) seguida por injeção intramuscular de antibiótico (Penicilina G, Meiji-Seika, Japan) e raspagem das pernas. Uma incisão de 2 cm ântero-medial foi feita na pele e a fenda troclear foi acessada com o uso de uma abordagem parapatelar mediana. Defeitos osteocondrais (diâmetro: 5 mm, profundidade: 2 mm) foram criados na tróclea femoral com o uso de uma furadeira (Rexon, Japan). Os joelhos foram

48/78 então irrigados com solução salina fisiológica, a ausência de sangramento nos defeitos foi confirmada e os defeitos foram deixados para secar.

No presente exemplo, o experimento foi conduzido por 5 divisão dos animais em cinco grupos.

A) grupo de controle (vazio)

B) grupo de alginato de grau alimentar (sem células)

C) alginato de grau alimentar + células (2,5 x 10⁷/mL) grupo

D) grupo de alginato purificado (sem células)

E) alginato purificado + células (2,5 x 10⁷/mL) grupo Os defeitos foram deixados não tratados no grupo de controle (A) . Além disso, 2% p/v de solução de alginato de sódio de grau alimentar foi aplicada aos defeitos no grupo de alginato de grau alimentar (B) (sem células) . 2% p/v de solução de alginato de sódio purificado foi aplicada aos defeitos no grupo de alginato purificado (D) (sem células). Alginato de sódio 500 (n° de série 199-09961) produzido por Wako Pure Chemical Industries, Ltd. foi usado para o alginato de grau alimentar, enquanto Sea Matrix (esterilizado) (n° de série B5Y01) produzido por Kimica Corp., Mochida International Ltd. foi usado para o alginato purificado. Além disso, as células obtidas em (1) foram suspensas em 2% p/v de solução de alginato de sódio de grau alimentar ou 2% p/v de solução de alginato de sódio purificado e aplicado aos defeitos articulares da cartilagem no grupo de alginato de grau alimentar + grupo de células (C) e o alginato purificado + grupo de células (E) , respectivamente. Quando os níveis de endotoxina foram

0 medidos com o uso de um kit de ensaio comercialmente

49/78 disponível LAL (Limulus Color KY Test Wako, Wako, Japan), o nível de endotoxina do alginato de sódio purificado foi de 5,76 EU (unidades de endotoxina)/g e aquele do alginato de sódio de grau alimentar foi de 75.950 EU/g, assim indicando que o nível de endotoxina do alginato de sódio purificado foi bem menor que aquele do alginato de sódio de grau alimentar. Ou seja, o alginato de sódio purificado foi submetido a tratamento de redução de endotoxina. Em adição, o conteúdo de metal pesado do alginato de sódio purificado foi de 20 ppm ou menos, o conteúdo de sulfato de chumbo foi de 0,98% ou menos, e o conteúdo de arsênico foi de 2 ppm ou menos.

A razão para tornar a concentração das soluções alginato de sódio a 2% p/v foi que essa permite que a viscosidade seja ajustada a um nível de 5.000 a 6.000 mPa.s adequada para o procedimento. Os coelhos foram imobilizados com o defeito para cima, e cada composição foi aplicada aos defeitos com o uso de uma pipeta de gel.

Uma vez que a viscosidade da solução de alginato de sódio era adequada nos grupos (B) até (E) , as soluções de alginato de sódio não fluíram para fora dos defeitos apesar das condições que facilitam o fluxo devido ao fluido sinovial. Subsequentemente, aproximadamente 0,5 ml de solução 100 mM CaCl₂ foi lentamente e continuamente aplicado por 10 segundos à superfície do enxerto com o uso de uma seringa de 27G. A camada da superfície do enxerto gelificou imediatamente e as células não deixaram a área afetada. A solução de CaCl₂ foi lavada com solução salina fisiológica. Imobilização adicional não foi necessária e a área afetada foi suturada após o procedimento. Os coelhos

50/78

I foram capazes de se mover livremente.

Os coelhos foram sacrificados por injeção intravenosa de uma dose excessiva de pentobarbital em 4 semanas ou 12 semanas após o procedimento. As extremidades distais dos fêmures foram retiradas com uma serra elétrica.

(Observações gerais)

A aparência geral foi observada macroscopicamente e pontuada. A aparência geral foi pontuada de acordo com os critérios da FIG. 1 com referência ao método de Gabriele, G. e cols. (Biomaterial, 21 (2000), 2561-2574).

(Coloração)

Subsequentemente, as amostras foram fixadas com paraformaldeído, descalcifiçadas e incrustadas em parafina. Secções localizadas a 5 mm do centro do defeito foram coradas com Safranina-O, corante H-E e imunocoradas com anti-colágeno tipo I e anti-colágeno tipo II. O sistema de classificação descrito na FIG. 2 foi usado para avaliar o tecido cartilaginoso recém formado e o tecido foi avaliado microscopicamente. Observadores independentes realizaram a classificação.

(Medição da resistência mecânica)

A resistência mecânica da área afetada foi medida com o uso de um teste de indentação. As amostras foram firmemente fixadas com a articulação femuropatelar para cima, e o teste foi realizado em temperatura ambiente. O indentador foi automaticamente movido na direção do centro da cartilagem regenerada e o deslocamento (mm) foi registrado em relação à carga (N) . E espessura do tecido regenerado foi medida a partir das secções histológicas. Módulo de Young foi então obtido a partir da região linear

51/78 das curvas carga-deslocamento.

(3) Resultados

Os resultados de coloração são mostrados na FIG. 3 a

FIG. 6.

Consequentemente da coloração com H-E, coloração com Safranina-0 e imunocoloração com anti-colágeno tipo II, a formação mais proeminente de cartilagem de hialina e colágeno tipo II em comparação aos outros grupos foi confirmada no grupo de alginato purificado + células E) (FIG. 6) em ume estágio precoce 4 semanas após o procedimento. Mais ou menos 80% da cartilagem foram observados como tendo sido regenerados em 12 semanas depois do procedimento. A formação de osso subcondral foi extremamente favorável com base nos resultados de coloração com H-E. A coloração com Safranina-O revelou a formação de proteoglicano, e a formação de uma matriz extracelular também foi capaz de ser confirmada. Por outro lado, houve quase nenhuma formação de cartilagem fibrosa observada com base nos resultados de coloração com H-E e imunocoloração com anti-colágeno tipo I.

O grupo de alginato purificado (sem células) (D) (FIG.

5) demonstrou formação favorável de cartilagem de hialina, colágeno tipo II e osso subcondral quando comparado com o alginato de grau alimentar + células grupo (C) (FIG. 4). No grupo (D) , em que as células não foram incrustadas, a regeneração da cartilagem foi surpreendentemente obtida por condrócitos de hialina. Em adição, foi constatado também inesperadamente que o grupo (D) em que células não foram incrustadas demonstrou uma capacidade superior de regenerar danos à cartilagem quando comparado com o grupo (C) em que

52/78 as células foram incrustadas.

Por outro lado,	houve	quase nenhuma	neogênese	da
cartilagem e colágeno	tipo	II observada	no grupo	de
controle (A) (FIG. 3) em que	os defeitos foram	. deixados	não
5 tratados.

Os resultados da avaliação obtidos por pontuação macroscópica da aparência geral (Macro) e os resultados da avaliação obtidos por pontuação das observações com base na coloração descrita acima (Histológica) são mostrados na

FIG. 7.

As pontuações totais obtidas por combinação das pontuações Macro e Histológica na semana 12 consistiram em 22,71 para o grupo de alginato purificado + células (E) , 19,57 para o grupo de alginato purificado (sem células) (D), 14,75 para o alginato de grau alimentar + células grupo (C) , 10,25 para o alginato de grau alimentar (sem células) grupo B) , e 8,43 para o grupo de controle (A) (vazio). Assim, o grupo de alginato purificado + células (E) demonstrou a mais alta pontuação seguido pelo grupo de alginato purificado (sem células) D) e e o grupo de alginato de grau alimentar + células C) neste ordem. Foi completamente inesperado que o grupo (D) em que as células não foram incrustadas produziu uma maior pontuação total, e assim demonstra a capacidade superior de regenerar cartilagem em danos à cartilagem, quando comparado ao grupo (C) em que as células foram incrustadas.

Os resultados de pontuação por avaliação macroscópica da aparência geral (Macro total) e avaliação por coloração (Histológica total) foram os mais altos no grupo de alginato purificado + células (E) do mesmo modo como acima

53/78 descrito, e a próxima pontuação mais alta foi observada no grupo de alginato purificado (sem células) (D).

Ao observar os parâmetros da avaliação Macro, os grupos (D) e (E) , em que alginato purificado foi usado, foram superiores para todos os parâmetros de integração de borda (novo tecido em relação à cartilagem nativa), uniformidade da superfície da cartilagem, superfície da cartilagem, grau de preenchimento, e cor da cartilagem, opacidade ou translucidez da neocartilagem quando comparada com os grupos (B) e (C) em que alginato de grau alimentar foi usado.

Ao observar os parâmetros da avaliação histológica, grupos (D) e (E) , em que alginato purificado foi usado, demonstraram maiores pontuações que os grupos (B) e (C), em que alginato de grau alimentar foi usado, para os parâmetros de natureza do tecido predominante, regularidade da superfície, integridade estrutural e homogeneidade, espessura, ligação a cartilagem adjacente, alterações degenerativas em cartilagem adjacente e resposta inflamatória.

Com base nesses achados, os grupos (D) e (E) demonstraram formação de condrócitos e tecido cartilaginoso extremamente favorável em um dano à cartilagem, incluindo a formação de cartilagem de hialina, colágeno tipo II e osso subcondral. Não houve qualquer formação de cartilagem fibrosa observada.

A ligação do tecido regenerado ao tecido do hospedeiro com o uso de alginato purificado foi também favorável, houve pouca degeneração ou inflamação em cartilagem adjacente, e a bioafinidade foi determinada como sendo

54/78 alta.

Os resultados de medição de resistência mecânica para os grupos de alginato purificado (D) e (E) são mostrados na

FIG. 8.

Consequentemente da medição da resistência mecânica para os grupos de alginato purificado, a resistência mecânica no grupo de alginato purificado + células E) foi um módulo de Young de 8 versus módulo de Young de 10 em tecido cartilaginoso normal, assim indicando que a resistência foi recuperada quase ao estado normal, livre de dano. Esse achado também sustenta a reivindicação que a composição da presente invenção incrustada com células tem resistência mecânica superior, e é favorável com relação à regeneração de cartilagem de hialina forte e a formação de osso subcondral.

Exemplo 2

Medição de distribuição de peso molecular de alginato de sódio purificado (1) Método

A distribuição de peso molecular de alginato de sódio purificado foi medida por cromatografia de filtração a gel sob as condições abaixo indicadas.

Coluna: TSKgel GMPWxl, 2 colunas + TSKgel G2500PWxl, 1 coluna (Tosoh Corp.) (diâmetro 7,8 mm x 300 mm x 3 colunas)

Temperatura da coluna: 40°C

Eluado: 200 mM solução aquosa de nitrato de sódio

Concentração da amostra: 0,05%

Taxa de fluxo: 1,0 mL/min

Volume da injeção: 200 mL

Detector: RI (refratômetro diferencial)

55/78

Padrões: Pululana, glicose (pesos moleculares:

1.600.000, 788.000, 404.000, 212.000, 112.000, 47.300,

22.800, 11.800, 5.900, 180) (2) Resultados (Tabela 1)

Amostra da medição	Média numérica do peso molecular Mn	Média de peso de peso molecular Mw	Proporção de vari- ância Mw/Mn	(Referên- cia) Viscosidade de 1% solução aquosa
Alginato de sódio purificado(Kimica Corp., Mochida International Ltd., Sea Matrix™ (esterilizado), n° de série B5Y01)	430.000	1.700.000	4,0	400 a 500 mPa-s
Alginato de sódio purificado (FMC Biopolymer AS, Pronova™ SLG20)	66.000	440,000	6,6	20 a 100 mPa-s

(3) Discussão

A média de peso de peso molecular do alginato de sódio purificado usado no modelo de reparação da cartilagem de coelho do Exemplo 1 foi 1.700.000 como medido com o uso do método acima descrito. Como indicado no Exemplo 1, o alginato de sódio demonstrou efeitos regenerativos da cartilagem de hialina no modelo de reparação da cartilagem

56/78 de coelho com e sem células. Por outro lado, embora um experimento similar tenha sido conduzido com o uso de um ácido algínico de baixa endotoxina (Pronova™ LVG, atualmente Pronova™ UP LVG, FMC Biopolímero Inc.) como descrito na Referência 3, é revelado que a cartilagem fibrosa é formada no caso de aplicação apenas de ácido algínico que não contém células a um defeito da cartilagem. Além disso, a versão esterilizada de Pronova™ LVG é designada como Pronova™ SLG2 0, a média de peso de peso molecular dessa como determinado pelo método acima descrito foi 440.000. Embora Sea Matrix™ e Pronova™ tenham uma característica comum de serem ácidos algínicos de baixa endotoxina, seus ácidos algínicos diferem em termos de peso molecular, e acredita-se que essa diferença leve a diferenças nos efeitos de regeneração da cartilagem. Embora a viscosidade possa ser ajustada pela concentração de ácido algínico, em um experimento em que diferentes concentrações de géis de ácido algínico (0,5 a 4%) foram incrustadas com condrócitos, transplantados abaixo da pele de camundongos e confirmados para a geração de cartilagem, a concentração de ácido algínico foi relatada como não tendo um efeito sobre efeitos de geração de cartilagem (Keith T. Paige e cols., De Novo Cartilage Generation Using Calcium AlginateChondrocyte Constructions, Plastic and Reconstructive Surgery, Vol. 97: 1996, p.168-178). Portanto, a diferença nos efeitos de regeneração da cartilagem entre Sea Matrix™ e Pronova™ é atribuída ao peso molecular. Ou seja, embora o uso de ácido algínico de baixa endotoxina permita a obtenção de uma composição que tem alta bioafinidade com baixos níveis de degeneração e resposta inflamatórias na

57/78 cartilagem circundante, ao usar de ácido algínico que tem um alto peso molecular, foi constatado que pode ser obtida uma composição para regeneração de cartilagem ou composição terapêutica que tenha efeitos regenerativos da cartilagem extremamente superiores que permitem a regeneração da cartilagem mesmo sem células incrustadas nela. Ácido algínico de baixa endotoxina que tem uma média de peso de

peso molecular	de pelo	menos 5 00	. 000	ou mais, e
preferivelmente	650.000 ou	mais, é útil	para	a regeneração
da cartilagem,	e que tem uma média	de	peso de peso
molecular de 1.	000.000 a	2.000.000 é	mais	preferível, e

aquele que tem uma média de peso de peso molecular de cerca de 1.500.000 a 2.000.000 é particularmente preferível.

Exemplo 3

Modelo de osteoartrite de coelho (modelo de ressecção do Ligamento cruciforme anterior (ACL)) (1) Método

Um modelo de OA foi criado em ambas as articulações do joelho de fêmeas de coelhos brancos japoneses (pesos corporais: 2,6 a 2,9 kg) de acordo com o método de Vignon, E. e cols. (Vignon, E., Bejui, J., Mathieu, P., Hartmann, JD, Ville, G. , Evreux, JC, e cols., Histological cartilage changes in a rabbit model of osteoarthritis, J. Rheumatol., 1987:14 (Spec No): 104-6). Três animais cada (6 joelhos) foram distribuídos nos seguintes quatro grupos.

A) grupo de controle (solução salina fisiológica)

B) grupo de dose de solução a 1% hialuronato de sódio (peso molecular: aproximadamente 900.000, viscosidade:

aproximadamente 2.300 mPa.s)

C) grupo de dose de solução a 1% de alginato de sódio

58/78 purificado (peso molecular: aproximadamente 1.700.000, viscosidade: aproximadamente 500 mPa.s)

D) grupo de dose de solução a 2% de alginato de sódio purificado (peso molecular: aproximadamente 1.700.000, viscosidade: aproximadamente 5.000 mPa.s)

As soluções de (B) a (D) foram preparadas com o uso de solução salina fisiológica. O alginato de sódio purificado de (C) e (D) foram o mesmo que o alginato de sódio purificado usado no Exemplo 1 (Kimica Corp., Mochida International Ltd., Sea Matrix (esterilizado), n° de série B5Y01).

Depois da ressecção do ligamento cruciforme anterior, cada uma das soluções (A) até (D) acima foram administradas na cavidade articular nas semanas 4, 5, 6, 7 e 8 (total de 5 administrações dadas uma vez por semana). As soluções foram administradas com o uso de uma agulha 2 7G por penetração no tendão patelar e injeção de 0,3 mL/joelho por administração. Os coelhos foram sacrificados na 9^a semana para adquirir amostras do tecido articular do joelho. Inflamação de infecções, reações de corpo estranho e outros não foram observados em qualquer um dos joelhos.

(2) Resultados (Observações gerais)

A aparência da articulação do joelho inteira (cartilagem articular do joelho do fêmur e tíbia) foi observada macroscopicamente. Os resultados são mostrados na FIG. 9. No grupo A (grupo de dose de solução salina fisiológica), numerosos achados de osteoartrite, incluindo defeitos da cartilagem e osteófitos, foram observados macroscopicamente. O grau de dano à cartilagem (tamanho,

59/78 profundidade) foi mais grupo A. A pontuação resultados similares.

brando nos outros grupos que no dos achados macroscópicos gerou (Coloração)

As amostras de tecido articular do joelho foram fixadas com paraformaldeído, descalcifiçadas e incrustadas em parafina. As amostras foram avaliadas histologicamente por coloração com Safranina-O. Os resultados são mostrados na FIG. 10. As porções superiores de cada figura indicam cartilagem femoral, enquanto as porções inferiores indicam cartilagem tibial, e alterações degenerativas da cartilagem foram avaliadas na cartilagem em ambas as localizações. A coloração diminuída da matriz cartilaginosa e aspereza aumentada da superfície da cartilagem foram observadas no grupo A (grupo de dose de solução salina fisiológica) . No grupo B (grupo de dose de solução a 1% de hialuronato de sódio), embora a superfície da cartilagem fosse mais uniforme que no grupo A, coloração diminuída foi observada. No grupo C (grupo de dose de solução a 1% de alginato de sódio purificado) e grupo D (grupo de dose de solução a 2% de alginato de sódio purificado), a superfície da cartilagem foi mais uniforme e diminuição na coloração foi leve quando comparada com os grupos A e B. Além disso, ácido algínico residual estava presente na superfície da cartilagem.

Com base nos achados acima, a injeção intra-articular de alginato de sódio demonstrou ação que inibiu a degeneração da cartilagem e protegeu a cartilagem em um modelo de OA de ressecção ACL, e foram observados efeitos que eram iguais ou melhores que a administração de solução

60/78 a 1% de hialuronato de sódio usado como um fármaco terapêutico para osteoartrite. Em adição, uma vez que o alginato de sódio aderiu à superfície da cartilagem, foi confirmado que o alginato de sódio demonstra afinidade com a cartilagem articular bem como cobre e protege as superfícies da cartilagem.

Exemplo 4

Avaliação de efeitos terapêuticos de ácido algínico de diferentes pesos molecular em um modelo de osteoartrite de coelho (modelo de ressecção de ligamento cruciforme anterior (ACL)) (1) Método

Um modelo de OA foi criado em ambas as articulações do joelho de fêmeas de coelhos brancos japoneses (pesos corporais: 2,6 a 2,9 kg) de acordo com o método de Vignon, E. e cols. (Vignon, E., Bejui, J. , Mathieu, P., Hartmann, JD, Ville, G., Evreux, JC, e cols., Histological cartilage changes in a rabbit model of osteoarthritis, J. Rheumatol., 1987:14 (Spec No): 104-6). Cinco animais cada (10 joelhos) foram distribuídos nos seguintes cinco grupos.

A) grupo de controle (solução salina fisiológica)

B) grupo de dose de solução a 1% de hialuronato de sódio ARTZ (marca registrada), Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., peso molecular: aproximadamente 900.000, viscosidade: aproximadamente 2.300 mPa.s)

C) grupo de dose de solução a 2% de alginato de sódio purificado (Pronova™ SLM20, FMC Biopolimer Inc., peso molecular: aproximadamente 400.000)

D) grupo de dose de solução a 2% de alginato de sódio purificado (Kimica Corp., esterilizado, peso molecular:

61/78 aproximadamente 1.000.000)

E) grupo de dose de solução a 2% de alginato de sódio purificado (Sea Matrix (esterilizado), Kimica Corp., peso molecular: aproximadamente 1.700.000)

As soluções de (C) a (E) foram preparadas com o uso de solução salina fisiológica.

Depois da ressecção do ligamento cruciforme anterior, cada uma das soluções (A) a (E) acima foram administradas na cavidade articular nas semanas 4, 5, 6, 7 e 8 (total de

5 administrações dadas uma vez por semana) . As soluções foram administradas com o uso de uma agulha 2 7G por penetração no tendão patelar e injeção de 0,3 mL/joelho por administração. Os coelhos foram sacrificados na 9^a semana para adquirir amostras do tecido articular do joelho.

Inflamação de infecções, reações de corpo estranho e outros não foram observados em qualquer um dos joelhos.

(2) Resultados (Observações gerais)

A aparência da articulação do joelho inteira (cartilagem articular do joelho do fêmur e tíbia) foi observada macroscopicamente. Para avaliar o grau de dano à superfície da cartilagem, as amostras foram coradas em tinta da índia de acordo com o método de Choj i Shimizu e cols. e então classificadas (J. Rheumatol. , Vol. 25, pp.

1.813-1.819, 1998). Os achados macroscópicos são mostrados na FIG. 11. Quando da coloração com tinta da índia, os limites entre as lesões de dano à cartilagem e cartilagem normal são coloridos. No grupo A (grupo de dose de solução salina fisiológica), numerosos achados de osteoartrite, incluindo defeitos da cartilagem profundos e de ampla

62/78 escala e osteófitos, foram observados macroscopicamente. O grau de dano à cartilagem (tamanho, profundidade) foi mais brando nos outros grupos que no grupo A. Os resultados de pontuação dos achados macroscópicos são mostrados na FIG.

12. As articulações do joelho foram observadas em quatro locais que consistiam em no Côndilo femoral mediai (MFC), Platô tibial mediai (MTP), côndilo femoral lateral (LFC) e platô tibial lateral (LTP). O grau de dano à cartilagem foi mais leve nos grupos B até E que no grupo A em todos esses locais. Além disso, o grau de dano à cartilagem tendeu a ser mais leve nos grupos D e E que nos grupos B e C. Diferenças nos efeitos inibidores de alteração degenerativa da cartilagem, efeitos protetores da cartilagem e efeitos de reparação da cartilagem estavam presentes devido à diferenças no peso molecular do ácido algínico.

(Coloração de proteoglicano)

As amostras de tecido articular do joelho foram fixadas em paraformaldeído, descalcifiçadas e incrustadas em parafina. As amostras foram avaliadas histologicamente por coloração com safranina-O. Os resultados são mostrados na FIG. 13. As porções superiores de cada figura indicam cartilagem femoral, enquanto as porções inferiores indicam cartilagem tibial, e alterações degenerativas da cartilagem foram avaliadas na cartilagem em ambas as localizações. A coloração diminuída da matriz cartilaginosa e aspereza aumentada da superfície da cartilagem foram observadas no grupo A (grupo de dose de solução salina fisiológica) . No grupo B (grupo de dose de solução a 1% de hialuronato de sódio), embora a superfície da cartilagem fosse mais uniforme que no grupo A, coloração diminuída foi observada.

63/78

Nos grupos de dose de solução de alginato de sódio (grupos C a E) a superfície da cartilagem foi mais uniforme e diminuição na coloração foi leve quando comparada com os grupos A e B. Além disso, ácido alginico residual estava presente na superfície da cartilagem.

(Avaliação histopatológica geral)

Observações macroscópicas e observações por coloração foram extensivamente avaliadas por pontuação de acordo com o método de Toshiyuki Kikuchi e cols. para avaliar os efeitos dos fármacos administrados (Osteoarthritis and Cartilage, Vol. 4, pp. 99-110, 1996). Côndilos femorais mediais foram avaliados a um de quatro níveis para os 8 parâmetros indicados abaixo, e a pontuação total foi usada como um pontuação de lesão por osteoartrite.

(1) perda da superfície da cartilagem, (2) erosão da cartilagem, (3) fibrose e fratura, (4) perda do proteoglicano corável, (5) perturbações no arranjo de condrócitos, (6) perda de condrócitos, (7) perda de osso subcondral, e (8) formação de aglomerados de condrócitos.

ANOVA foi usado para testar a presença de uma diferença significativa entre os grupos, e comparações subsequentes entre cada grupo foram feitas em um nível de significância de p<0,05 com o uso de um teste post hoc.

Os resultados são mostrados na FIG. 14. As pontuações de lesão de osteoartrite foram significativamente menores nos grupos B a E versus grupo A. Além disso, embora efeitos superiores tenham sido observados nos grupos de dose de ácido alginico de alto peso molecular (grupos D e E) quando comparados com o grupo de dose de ácido hialurônico (grupo B) , os efeitos do grupo de dose de ácido alginico de baixo

64/78 peso molecular (grupo (C) foram aproximadamente os mesmos que aqueles do grupo de dose de ácido hialurônico.

Com base nos achados acima, a injeção intra-articular de alginato de sódio demonstrou ação que inibiu alterações degenerativas da cartilagem e protegeu a cartilagem em um modelo de OA de ressecção ACL, e foram observados efeitos que eram iguais ou melhores que a administração de solução a 1% de hialuronato de sódio usado como um fármaco terapêutico para osteoartrite. Em particular, ácido algínico de alto peso molecular demonstrou efeitos terapêuticos superiores ao ácido hialurônico. Além disso, embora os três tipos de ácido algínico fossem diferentes em termos de viscosidade, já que ácido algínico que tem viscosidade menor que aquela do ácido hialurônico demonstra efeitos iguais ou maiores que aqueles de ácido hialurônico, diferenças nos efeitos terapêuticos são atribuíveis a diferenças na substância usada e peso molecular em vez de

diferenças na	viscosidade.
No modelo de AO de	ressecção de	ACL	usado nesse
experimento,	os fármacos	foram administrados	iniciando 4
semanas após	a ressecção	de ACL.	Assim,	acredita-se que
diminuições	nas pontuações de	lesão	de	osteoartrite
observadas nos grupos de	dose de	fármaco	são	o resultado
combinado de	efeitos que	inibem	a progressão de lesões

devido à inibição de alterações degenerativas da cartilagem e proteção da cartilagem, bem como ação de reparação da cartilagem em danos à cartilagem que já ocorreram. De acordo com o trabalho de Toshiyuki Kikuchi acima mencionado citado como uma referência neste experimento, as pontuações de OA são relatadas por atingir 20 a 25 nos grupos de dose

65/78 de solução salina fisiológica. Uma vez que a administração do fármaco foi iniciada na semana 4 após a ressecção de ACL nesse experimento, há a possibilidade de que as pontuações de OA diminuam como um resultado de melhoria do estado da cartilagem devido aos efeitos do fármaco como um resultado do início da administração a partir de um estado em que as pontuações de OA foram cerca de 20 a 25. Além disso, uma vez que a pontuação para articulações normais é de 8 no sistema de avaliação usado nesse experimento, pode-se dizer que a média de pontuação para OA (11,3) no grupo E (ácido algínico que tem um peso molecular de 1.700.000) se aproxima da pontuação para articulações normais e é uma pontuação muito boa.

Exemplo 5

Estudo de métodos de medição de peso molecular de ácido algínico

Diferentes valores são conhecidos por serem obtidos quando da medição do peso molecular de substâncias de alto peso molecular derivadas de uma origem natural dependendo do método de medição. De acordo com ASTM F2064-00 (Publicação Internacional ASTM (2006); the American Society for Testing and Materials is an organization engaged in the International standardization and establishment of specifications of industrial material standards and testing method standards), o uso de SECMALLS (Cromatografia de exclusão por tamanho com detecção de dispersão de luz de laser de ângulo múltiplo) é recomendado para a medição de peso molecular. Assim, foi feita uma comparação entre a medição do peso molecular do alginato de sódio usado no Exemplo 4 por SEC-MALLS e por

66/78 cromatografia de filtração a gel como descrito no Exemplo 2. Além disso, SEC-MALLS combina o uso de um detector de dispersão de luz de laser de ângulo múltiplo (MALLS) com cromatografia de filtração a gel.

(1) Método

As medições por cromatografia de filtração a gel foram realizadas do mesmo modo como no Exemplo 2. As medições por SEC-MALLS foram realizadas sob as mesmas condições indicadas abaixo.

Detector de dispersão de luz de laser de ângulo múltiplo: DAWN HELEOS, Wyatt Technology

Coluna: Shodex SB-806M, 2 colunas (Showa Denko K.K.)

Eluado: 200 mM solução aquosa de nitrato de sódio

Taxa de fluxo: 1,0 mL/min 15 (2) Resultados (Tabela 2)

	AL17 0	AL10 0	AL4 0
Média de peso de peso molecular como determinado por cromatografia de filtração a gel	1.700.000	1.000.000	410.000
Média de peso de peso molecular como determinado por SEC-MALLS	185.000	149.000	128.000
(Referência) Efeitos farmacológicos no Exemplo 4	Muito bons	Muito bons	Muito bons

O mesmo alginato de sódio purificado (de baixa endotoxina) usado no Exemplo 4 é usado para AL170, AL100 e

67/78

AL4 0 .

AL170: Kimica Corp., Mochida International Ltd., Sea Matrix (esterilizado), 1% viscosidade: aproximadamente 500 mPa. s

AL100: Kimica Corp., esterilizado, 1% viscosidade:

aproximadamente 100 mPa.s

AL40: FMC Biopolimer Inc., Pronova™ SLM20, 1% viscosidade: aproximadamente 30 mPa.s (3) Discussão

Como mostrado na Tabela 2, as diferenças nos pesos moleculares de três tipos de alginatos, como determinados por SEC-MALLS, só foram observadas dentro de uma gama que não indicava definitivamente uma diferença entre eles, e aqueles valores diferiam consideravelmente dos resultados de medidas obtidos por cromatografia de filtração a gel. Como mostrado no Exemplo 4, na medida em que havia diferenças bem definidas nos efeitos farmacológicos entre as amostras usadas, verificou-se que os pesos moleculares determinados por cromatografia de filtração a gel demonstram uma correlação maior com os efeitos terapêuticos de alginatos do que com os pesos moleculares determinados por SEC-MALLS, e constatou-se que os pesos moleculares determinados por cromatografia de filtração a gel eram adequados como parâmetros para a especificação de uma gama de pesos moleculares preferíveis de alginatos usados em uma composição para o tratamento de uma doença articular. Exemplo 6

Efeitos do ácido algínico sobre dor de artrite experimental em ratos

0 (1) Método

68/78

Ratos com artrite induzida por injeção intra-articular de cristais em forma de agulha de urato monossódico (MSU) se apresentam com uma marcha anormal em função da dor. Um modelo experimental de dor de artrite em ratos que receberam a administração de MSU foi preparado de acordo com o método de Shizuhiko Ihara, e cols. (Folia Pharmacol. Japon, Vol. 100, pp. 359-365 (1992)) para avaliar os efeitos da administração intra-articular de alginato de sódio.

Machos de ratos Cri:CD foram adquiridos com 5 semanas de idade e usados no experimento após um período de aclimatação de uma semana. 0,05 mL de uma suspensão 5,0% de solução salina fisiológica de MSU foi injetado na articulação do joelho direito dos ratos sob anestesia, seguido por observação da marcha com 2, 4, 6 e 24 horas após a injeção. A marcha foi avaliada por classificação em um a cinco graus que consistem em marcha normal (0 ponto), claudicação leve (1 ponto), claudicação moderada (2 pontos), andando na ponta dos dedos (3 pontos) e andando sobre três patas (4 pontos). Dez animais foram distribuídos em cada um dos cinco grupos indicados abaixo.

A) grupo de controle (grupo de dose de solução salina fisiológica)

B) grupo de dose de solução a 1% de hialuronato de sódio (ARTZ (marca registrada), Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., peso molecular: aproximadamente 900.000)

C) grupo de dose de solução a 2% de alginato de sódio purificado (Kimica Corp., sterilized, peso molecular: aproximadamente 1.000.000)

D) grupo de dose de solução a 1% de alginato de sódio

69/78 purificado (Sea Matrix (sterilized), Kimica Corp., peso molecular: aproximadamente 1.700.000)

E) grupo de dose de solução a 2% de alginato de sódio purificado (Sea Matrix (sterilized), Kimica Corp., peso molecular: aproximadamente 1.700.000)

Cinquenta piL de cada solução foram administrados ano mesmo local de uma articulação uma hora antes da injeção de

MSU.

(2) Resultados e discussão

As alterações baseadas em tempo em classificações da marcha são mostradas na FIG. 15. As classificações da marcha do grupo de dose de solução a 1% de hialuronato de sódio (grupo B) e grupos de dose de solução a 2% de alginato de sódio (grupos C e E) foram significativamente menores do que a do grupo de controle (grupo A) , e foram observados efeitos supressivos da dor. Foram observados efeitos supressivos da dor dose-dependentes em uma comparação das soluções a 1% e 2% contendo alginato de sódio com um peso molecular de cerca de 1.700.00 (grupos D e E). Além disso, as soluções a 2% de alginato de sódio que possuem pesos moleculares de 1.000.000 e 1.700.000 demonstraram efeitos supressivos da dor iguais, apesar de terem viscosidades diferentes de cerca de 300 mPa.s e cerca de 5.000 mPa.s, respectivamente.

Nas articulações, MSU atua direta ou indiretamente sobre as células sinoviais e neutrófilos, e acredita-se que cause artrite por meio da produção de citocinas e semelhantes (publicação mencionada acima por Shizuhiko Ihara, e cols.) . Ou seja, MSU induz dor em consequência da reação inflamatória por ele induzida. A solução de alginato

70/78 de sódio demonstrou efeitos supressivos da dor nesse modelo, e os efeitos observados foram iguais àqueles do hialuronato de sódio, que é usado como um fármaco terapêutico para osteoartrite e como um fármaco supressivo da dor articular para artrite reumatóide crônica. Um sal de metal monovalente de ácido algínico foi confirmado como tendo efeitos que inibem a inflamação e dor, e acredita-se que seja útil como fármaco terapêutico para osteoartrite, capsulite adesiva do ombro e semelhantes, embora também possa ser aplicado à dor articular associada à artrite reumatóide.

Além disso, foi observado que o alginato de sódio com um peso molecular de 430.000 (Kimica Corp., esterilizado) tende a ter efeitos de supressão da dor mais fracos do que o alginato de sódio com um peso molecular de 1.000.000. Acredita-se que essa diferença nos efeitos de supressão da dor seja atribuível à diferença no peso molecular do ácido algínico.

Exemplo 7

Efeitos da administração intra-articular de ácido algínico no modelo de ruptura do manguito rotador de coelho (1) Produção do modelo de ruptura do manguito rotador

Um modelo de ruptura do manguito rotador foi produzido com o uso de coelhos brancos japoneses. Após a tricotomia de ambas as articulações do ombro dos animais sob anestesia geral usando cloridrato de quetamina, as articulações do ombro foram expostas com uma abordagem posterior usando um procedimento estéril. O músculo omovertebral foi então separado para produzir defeitos que medem 10 x 7 mm no tendão do músculo infra-espinhoso e na inserção deste no

71/78 lado da cabeça umeral. 0,3 mL de uma solução purificada a 2% de alginato de sódio (Sea Matrix (esterilizada), Kimica Corp., peso molecular: aproximadamente 1.700.000) foi injetado na articulação do ombro direito. 0,3 mL de solução salina fisiológica (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) foi injetado na articulação do ombro esquerdo usando o mesmo procedimento para uso como um controle. Após o procedimento, permitiu-se que os animais se movimentassem livremente em suas gaiolas, sem imobilização dos membros superiores. Após o procedimento, após administração contínua de solução de alginato no ombro direito e de solução salina fisiológica no ombro esquerdo uma vez por semana por cinco semanas (total de 5 administrações), os animais foram sacrificados por administração de uma grande dose intravenosa de pentobarbital, seguida por aquisição de amostras de tecido articular do ombro.

(2) Resultados

Embora tenham sido observados graves defeitos de cartilagem em locais ao longo do rasgo do manguito rotador no grupo de controle após observação macroscópica da cabeça umeral, não foram observadas lesões cartilaginosas bem definidas no grupo de dose de alginato (FIG. 16). O alginato de sódio demonstrou efeitos protetores da cartilagem e inibiu a ocorrência e a progressão de lesão cartilaginosa.

Exemplo 8

Medição de coeficientes de fricção da articulação do joelho em um modelo de osteoartrite de coelho (modelo de descolamento do ligamento cruciforme anterior (ACL) (1) Método

ΊΙ/ΊΖ

Um modelo de OA em coelho foi criado do mesmo modo que no Exemplo 4, foram adquiridas amostras de articulação do joelho com OA (n=4) , com administração de solução a 1% de hialuronato de sódio (ARTZ (marca registrada), Kaken

Pharmaceutical Co., Ltd., peso molecular: aproximadamente 900.000, viscosidade: aproximadamente 2.300 mPa) e amostras de articulação do joelho com OA (n=4) com administração de solução purificada a 2% de alginato de sódio (Kimica Corp., esterilizada, peso molecular: aproximadamente 1.000.000), e os coeficientes de fricção da articulação do joelho foram medidos de acordo com o método de Tanaka, E. e cols. (U. Dent. Res., Maio de 2004; 83 (5) : 404-7) . A administração de cada fármaco foi realizada do mesmo modo que no Exemplo 4, e os coelhos foram sacrificados na 9^a semana após excisão do ligamento cruciforme anterior para a aquisição de amostras da articulação do joelho. As medidas foram realizada flexionando-se o joelho em um ângulo de 30 graus, com aplicação de uma carga de 1,8 kg por um tempo de medição de 120 segundos, e as medidas foram realizadas cinco vezes em cada amostra. Uma articulação do joelho normal (n=l) foi usada como controle.

(2) Resultados

As articulações do joelho com OA que receberam a administração de ácido algínico demonstraram coeficientes de fricção significativamente menores do que as amostras de articulação do joelho com OA que receberam a administração de ácido hialurônico (FIG. 17) . Embora as articulações normais do joelho demonstrem inerentemente valores baixos para o coeficiente de fricção, à medida que a patologia da

OA progride, o coeficiente de fricção aumenta, e esse

73/78 aumento promove ainda mais a destruição de tecido. Acredita-se que os baixos coeficientes de fricção nas amostras de articulação do joelho com OA que receberam a administração de ácido algínico é ocorram em decorrência do fato de que os sintomas de OA eram leves, e refletiam o fato de que o tecido era mantido em um estado favorável. Ou seja, acredita-se que o estado do tecido observado nos achados macroscópicos e nas avaliações histológicas do Exemplo 4 são tenha refletido nos coeficientes de fricção da articulação do joelho.

Exemplo 9

Efeitos da administração intra-articular de ácido algínico para artrite induzida por colãgeno em ratos

Um modelo de artrite induzida por colãgeno (CIA) é 15 frequentemente usado como modelo de artrite reumatóide, na medida em que a patologia é semelhante àquela da artrite reumatóide humana (RA) . Um modelo de artrite induzida por colãgeno foi criado em ratos a fim de examinar os efeitos da administração intra-articular de alginato de sódio.

(1) Criação do modelo animal

Machos de ratos DA/Slc (SPF) com dez semanas de idade foram adquiridos e usados no experimento após um período de aclimatação de uma semana. Uma emulsão foi preparada por dissolução de colãgeno bovino do tipo II (Collagen

Technology Research Association) em 0,01 mol/L de solução aquosa de ácido acético até uma concentração de 1,5 mg/mL e usando um volume igual de adjuvante incompleto de Freund (Difco) . Um total de 0,4 mL (teor de colãgeno: 300 gg) dessa emulsão foi administrado (sensibilizado) na pele das costas dos ratos (em 4 a 6 localizações) para induzir

Ί4/ΊΖ artrite .

(2) Administração de Substâncias de teste

Dez animais foram distribuídos nos cinco grupos indicados abaixo.

A) grupo de controle (grupo de dose de solução salina fisiológica)

B) grupo de dose de hialuronato de sódio aquoso 1% (ARTZ (marca registrada), Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., peso molecular: aproximadamente 900.000)

C) grupo de dose de alginato de sódio aquoso 2% purificado (Kimica Corp., esterilizado, peso molecular: aproximadamente 1.000.000)

D) grupo de dose de alginato de sódio aquoso 1% purificado (Sea Matrix (esterilizado), Kimica Corp., peso molecular: aproximadamente 1.700.000)

E) grupo de dose de alginato de sódio aquoso 2% purificado (Sea Matrix (esterilizado), Kimica Corp., peso molecular: aproximadamente 1.700.000)

O volume de dose de cada substância administrada foi 20 de 0,05 mL/rato, e as substâncias foram administradas na cavidade articular da articulação do joelho da pata traseira esquerda dos animais usando uma seringa de 1 mL e uma agulha de injeção de 26G. Os animais foram dosados uma vez ao dia em cinco dias que consistem nos dias 0 (dia da administração de colágeno), 5, 10, 15 e 20 após sensibilização.

(3) Observação macroscópica da inflamação da articulação

As patas traseiras esquerdas dos animais foram observadas macroscopicamente diariamente após sensibilização, e a presença e o grau de artrite foram

75/78 avaliados por classificação de acordo com os critérios indicados abaixo.

Classificação 0: Normal Classificação 1: Vermelhidão observada

Classificação 2: Vermelhidão e ligeiro edema observados nos dedos das patas

Classificação 3: Edema que se estende dos dedos das patas até todo o comprimento da para

Classificação 4: Edema grave observado

Classificação 5: Deformação da articulação observada

Os resultados são mostrados na FIG. 18. O surgimento rápido de artrite foi observado, começando 14° dia após a sensibilização no grupo de controle, e o grau de artrite aumentou até o 25° dia. Embora graus similares de surgimento tenham sido observados em todos os grupos por volta do 25° dia após a sensibilização, o surgimento tendia a ser retardado no grupo de dose de ácido hialurônico (grupo B) e nos grupos de dose de alginato de sódio aquoso (grupos C, D e E) , comparados com o grupo de controle. O grau do retardo foi observado mais fortemente nos grupos de dose de alginato de sódio aquoso (grupos C, D e E) do que no grupo de dose de ácido hialurônico (grupo B) . Portanto, a substância de teste considerada como tendo o potencial para inibir a inflamação em articulações.

(4) Avaliações histopatológicas

Os animais foram sacrificados no 25° dia após sensibilização, seguido por excisão de tecido articular do joelho do membro traseiro esquerdo, fixação em formalina, descalcificação com solução aquosa de EDTA 10% e fixação em parafina. As amostras foram coradas com hematoxilina e

76/78 eosina e com safranina-O, seguida por avaliação histológica. Aas amostras foram avaliados por classificação de um a cinco níveis que consistem em: ausência de alterações (classificação: 0) , ligeiras alterações (classificação: 1), ligeiras leves (classificação: 2), ligeiras intermediárias (classificação:3) e ligeiras graves (classificação: 4) de acordo com parâmetros de avaliação e critérios de avaliação de artrite induzida por colágeno. A membrana sinovial foi observada quanto à infiltração de células inflamatórias, hiperplasia de células sinoviais, formação de tecido de granulação e fibrose, e os resultados da classificação desses achados são mostrados na FIG. 19. A patela foi observada quanto à formação de pânus na superfície da cartilagem articular (incluindo hiperplasia sinovial), destruição da cartilagem articular (incluindo degeneração e fibrose), destruição óssea (reabsorção) e coloração diminuída de safranina-O (proteoglicanos reduzidos), e os resultados da classificação desses achados são mostrados na FIG. 20. A observação de formação de osteófitos (formação osteóide reativa e formação de novo osso periósteo) foi pesquisada no côndilo lateral do fêmur, onde é mais fácil a formação de osteófitos. Os resultados são mostrados na FIG. 21. A presença de uma diferença significante foi testada com o teste U de Mann-Whitney.

Na membrana sinovial, os grupos de dose de alginato de sódio aquoso (grupos C, D e E) demonstraram efeitos inibidores da hiperplasia de células sinoviais significativos, efeitos inibidores da formação de tecido de granulação e efeitos inibidores de fibrose em relação ao grupo de controle. Além disso, o ácido algínico dom peso

77/78 molecular elevado demonstrou efeitos mais potentes.

Na patela, os grupos de dose de alginato de sódio aquoso (grupos C, D e E) tenderam a inibir a formação de pânus, destruição da cartilagem articular e destruição óssea.

No lateral côndilo do fêmur, os grupos de dose de alginato de sódio aquoso (grupos C, D e E) tenderam a inibir a formação de osteófitos. Além disso, o ácido algínico com peso molecular elevado demonstrou efeitos mais potentes.

Acredita-se que a inflamação e o crescimento anormal da membrana sinovial e uma resposta imune excessiva mediada por células T ativadas estejam envolvidos no surgimento de artrite reumatóide, e acredita-se que a destruição de tecido articular progrida em consequência desta. A solução aquosa de alginato de sódio inibiu fortemente a degeneração de tecido sinovial por administração intra-articular aos animais do modelo de artrite induzida por colágeno. Além disso, a solução aquosa de alginato também demonstrou uma tendência inibidora contra destruição e degeneração de osso e cartilagem. Também foi observado que a solução aquosa de alginato de sódio demonstra efeitos inibidores da degeneração de tecido superiores àqueles das soluções de hialuronato de sódio usadas para o tratamento de dor articular em artrite reumatóide. Acredita-se que a injeção intra-articular de uma solução de um sal de ácido algínico permita a obtenção de efeitos terapêuticos para artrite reumatóide na forma de inibição da progressão e melhoria de lesões teciduais.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

78/78

Uma composição para o tratamento de uma doença articular da presente invenção possui efeitos de reparação da cartilagem, efeitos que suprimem as alterações degenerativas da cartilagem, efeitos protetores da cartilagem, efeitos que inibem a inflamação do tecido articular, efeitos que suprimem a dor causada por inflamação do tecido articular, efeitos que inibem a degeneração do tecido sinovial e/ou efeitos que inibem a destruição osteocondral, ao ser injetada em uma articulação em estado líquido permitindo, dessa forma, a demonstração de efeitos terapêuticos em uma doença articular. A composição é particularmente útil para o tratamento de osteoartrite, par ao tratamento de capsulite adesiva do ombro, alívio de dor articular associada à artrite reumatóide e tratamento de artrite reumatóide.

Uso de

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Claims (20)

1. REIVINDICAÇÕES um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina caracterizado por ser para a manufatura de uma composição farmacêutica para o tratamento 5 de artrite reumatóide, e em que a composição é adaptada para ser injetada em uma articulação.
2. 2. Uso de um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina caracterizado por ser para a manufatura de uma composição farmacêutica para a inibição

   10 de degeneração de tecido sinovial em artrite reumatóide, e em que a composição é adaptada para ser injetada em uma articulação.
3. 3. Uso de um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina caracterizado por ser para a

   15 manufatura de uma composição farmacêutica para a inibição da destruição articular em artrite reumatóide, e em que a composição é adaptada para ser injetada em uma articulação.
4. 4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a

   20 referida composição não contém células.
5. 5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a referida composição não contém um agente de cura de um sal de metal monovalente de ácido algínico.

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6. 6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina tem uma média de peso de peso molecular de 500.000 ou mais como determinado por cromatografia de

   30 filtração a gel.

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7. 7. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida composição não contém um agente de cura de um sal de metal monovalente de ácido algínico.
8. 8. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina tem uma média de peso de peso molecular de 500.000 ou mais como determinado por cromatografia de filtração a gel.
9. 9. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina tem uma média de peso de peso molecular de 500.000 ou mais como determinado por cromatografia de filtração a gel.
10. 10. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina tem uma média de peso de peso molecular de 500.000 ou mais como determinado por cromatografia de filtração a gel.
11. 11. Composição usada para o tratamento de artrite reumatóide, caracterizada pelo fato de que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.
12. 12. Composição usada para inibição de degeneração de tecido sinovial em artrite reumatóide, caracterizada pelo fato de que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.
13. 13. Composição usada para inibição da destruição de articulação em artrite reumatóide, caracterizada pelo fato de que contém como um ingrediente ativo dessa um sal de

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    V s, metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina.
14. 14. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11, 12 ou 13, caracterizada pelo fato de que a composição não contém células.
15. 15. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11, 12 ou 13, caracterizada pelo fato de que a composição não contém um agente de cura de um sal de metal monovalente de ácido algínico.
16. 16. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11, 12 ou 13, caracterizada pelo fato de que o sal de metal monovalente de ácido algínico de baixa endotoxina tem uma média de peso de peso molecular de 500.000 ou mais como determinado por cromatografia de filtração a gel.
17. 17. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a composição não contém um agente de cura de um sal de metal monovalente de ácido algínico.
18. 18. Composição, de acordo com caracterizada pelo fato de que o sal de ácido algínico de baixa endotoxina de peso molecular de 500.000 ou mais cromatografia de filtração a gel.
19. 19. Composição, de acordo com caracterizada pelo fato de que o sal de ácido algínico de baixa endotoxina de peso molecular de 500.000 ou mais cromatografia de filtração a gel.
20. 20. Composição, de acordo com caracterizada pelo fato de que o sal a reivindicação 14, de metal monovalente tem uma média de peso como determinado por a reivindicação 15, de metal monovalente tem uma média de peso como determinado por a reivindicação 17, de metal monovalente

    4/4 de ácido alginico de baixa endotoxina tem uma média de peso de peso molecular de 500.000 ou mais como determinado por cromatografia de fíltração a gel.

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