JP2005036036A - エンドトキシン除去方法 - Google Patents
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- 0 CCOC(C(*=C[C@@]1NCc2ccccc2C1)C(C=C(C1(CC2)OCC(*)(*)CO1)N2C1=O)=C1C#N)=O Chemical compound CCOC(C(*=C[C@@]1NCc2ccccc2C1)C(C=C(C1(CC2)OCC(*)(*)CO1)N2C1=O)=C1C#N)=O 0.000 description 1
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Abstract
【課題】エンドトキシンを含む多糖類からのエンドトキシン除去方法を提供する。
【解決手段】エンドトキシンを含む多糖類を、酸のアルカリ金属塩の存在下、界面活性剤で処理することを特徴とするエンドトキシン除去方法。
【選択図】 なし
【解決手段】エンドトキシンを含む多糖類を、酸のアルカリ金属塩の存在下、界面活性剤で処理することを特徴とするエンドトキシン除去方法。
【選択図】 なし
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、エンドトキシンを含む多糖類からのエンドトキシン除去方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
エンドトキシンは、発熱、ショックの原因物質であり、注射薬、輸液など非経口医薬品の製造過程でエンドトキシンの混入が判明した場合は、安全性確保のため、除去が必須である。
蛋白質からエンドトキシンを除去する方法は種々報告されており、界面活性剤でエンドトキシンを抽出し、界面活性剤相を分液後、水相から蛋白質を回収する二相抽出法も有力な方法の一つとなっている(非特許文献1)。一方、多糖類からエンドトキシンを除去する方法としては、二相抽出法が一例報告されているのみである(非特許文献2)。この方法は、エンドトキシンを含む多糖類の水溶液を界面活性剤(Triton X−114)で抽出を2回繰返し、エンドトキシン含量を3000 EU/mgから30 EU/mgまで減少させるものである。しかし、除去効果は十分でなく、抽出操作を2回以上繰返しても30 EU/mg以下に減少させ得ない。
上述の如く、既存の二相抽出法を用いて多糖類からエンドトキシンを除く場合、除去効果が十分でなく、従って、より実用性の高い二相抽出法の開発が望まれていた。
【0003】
【非特許文献1】
F. B. Anspachら, Journal of Biotechnology 76巻 97頁 2000年
【非特許文献2】
O. Adamら, Analytical Biochemistry 225巻 321頁 1995年
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、非経口医薬品の原薬等に用いられる多糖類からエンドトキシンを効率的に除去する方法を提供することである。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の通りである。
1. エンドトキシンを含む多糖類を、酸のアルカリ金属塩の存在下、界面活性剤で処理することを特徴とするエンドトキシン除去方法。
2. 塩基性条件下で実施することを特徴とする1.記載のエンドトキシン除去方法。
3. 酸のアルカリ金属塩の酸の種類が1種類である1.又は2.記載のエンドトキシン除去方法。
4. 多糖類それ自身が酸のアルカリ金属塩である3.記載のエンドトキシン除去方法。
5.界面活性剤が非イオン界面活性剤である4.記載のエンドトキシン除去方法。
6.一般式[II]
【0006】
〔式中、R1及びR2は低級アルキル基、Eはエステル残基、Xはハロゲン原子を表す。〕
で示される化合物と一般式[III]
【0007】
[式中、Bocはベンジルオキシカルボニル基を表す。]
で示される化合物とを反応させて一般式[IV]
【0008】
[式中、記号は前記と同一意味を有する。]
で示される化合物とした後保護基を除去して一般式[V]
【0009】
[式中、記号は前記と同一意味を有する。]
で示される化合物又はその塩を得、次いで一般式[VI]
【0010】
[式中、X1はハロゲン原子を表す。]
で示される化合物と反応させて一般式[VII]
【0011】
[式中、記号は前記と同一意味を有する。]
で示される化合物を得、さらに一般式[VIII]
X2−CH2CH3
[式中、X2はハロゲン原子を表す。]
で示される化合物と反応させ、得られる一般式[IX]
【0012】
[式中、記号は前記と同一意味を有する。]
で示されるS型2−置換ヒドロキシ−2−インドリジニル酪酸エステル誘導体のシアノ基を還元後アルカノイル化して、一般式〔X〕
【0013】
〔式中、R3は低級アルカノイル基を表し、他の記号は前記と同一意味を有する。〕
で示されるS型2−置換ヒドロキシ−2−(6−置換アミノメチルインドリジニル)酪酸エステル誘導体とした後、これをニトロソ化反応及び転移反応に付して、一般式〔XI〕
【0014】
〔式中、記号は前記と同一意味を有する。〕
で示されるS型2−置換ヒドロキシ−2−(6−置換ヒドロキシメチルインドリジニル)酪酸エステル誘導体とし、該化合物を分子内閉環後または分子内閉環と同時に、アセタールをケトンに変換して一般式〔XII〕
【0015】
〔式中、記号は前記と同一意味を有する。〕
で示されるS型4−置換ヒドロキシピラノインドリジン誘導体とし、さらに、一般式〔XIII〕
【0016】
〔式中、R5〜R9は水素原子又は保護基を有していてもよい置換基を表す。〕
で示されるo−アシルアニリン化合物とを反応させて、一般式〔XIV〕
【0017】
〔式中、記号は前記と同一意味を有する。〕
で示される20位水酸基が置換されたカンプトテシン化合物を得、この化合物を、20位水酸基の置換基除去反応に付して一般式〔I〕
【0018】
〔式中、記号は前記と同一意味を有する。〕
で示されるカンプトテシン誘導体とし、さらに、アミノ酸またはペプチドと反応させ、得られた化合物のアミノ酸が保護されている場合はその保護基を除去したのち、カルボキシル基を有する多糖類と反応させ、所望により、酸のアルカリ金属塩の存在下、界面活性剤で処理してエンドトキシン除去することを特徴とする化合物[I]とカルボキシル基を有する多糖類とがアミノ酸またはペプチドを介して結合してなるカンプトテシン誘導体またはその薬理的に許容しうる塩の製法。
7.界面活性剤添加時には冷却し、その後加温することを特徴とする1.〜5.記載のエンドトキシン除去方法。
8.水の存在下で行うことを特徴とする1.〜5.及び7.記載のエンドトキシン除去方法。
【0019】
【発明の実施の形態】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【0020】
エンドトキシンを含む多糖類水溶液を、酸のアルカリ金属塩の存在下、必要に応じpH調整した後、界面活性剤で処理し、エンドトキシンを含む界面活性剤相と多糖類を含む水相の二相に分液させ、さらに所望により、多糖類を含む水相から残存する界面活性剤を限外ろ過(UF)膜で除去し、多糖類を含む水相を濃縮、凍結乾燥等で水分を除くことにより、エンドトキシンが除去された多糖類が効率よく得られる。
エンドトキシンを含む多糖類における多糖類の具体例としては、デキストラン、プルラン、マンノグルカン、キチン、キトサン、マンナン等の中性多糖類、ヒアルロン酸、ペクチン酸、アルギン酸、コンドロイチン、ヘパリン等の酸性多糖類、上記中性多糖類にカルボキシメチル基を導入した化合物(即ち多糖類置換酢酸)、上記中性多糖類をポリアルコール化したのちにカルボキシルメチル基を導入した化合物(即ち、カルボキシメチル基を有する多糖ポリアルコール)等があげられる。
中性多糖類にカルボキシメチル基を導入した化合物(即ち多糖類置換酢酸)の例としては、WO94/19376に開示されている物質を、中性多糖類をポリアルコール化したのちにカルボキシルメチル基を導入した化合物(即ち、カルボキシメチル基を有する多糖ポリアルコール)の例としては、WO97/46260に開示されている物質を、それぞれあげることができる。
また、中性多糖類にカルボキシメチル基を導入した化合物(即ち多糖類置換酢酸)に、さらに薬物等が結合した化合物の例としては、式:
【0021】
(式中、CM・Dextran・Naは、カルボキシメチルデキストラン・ナトリウム塩を表す。以下、同様。)
で示される化合物など特開平10−72467号及び特開平10−95802号に開示されている物質や、中性多糖類をポリアルコール化したのちにカルボキシルメチル基を導入した化合物(即ち、カルボキシメチル基を有する多糖ポリアルコール)に、さらに薬物等が結合した化合物、即ち、式:
【0022】
で示される化合物等があげられる。
酸のアルカリ金属塩の具体例としては、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム等の炭酸アルカリ金属塩、四ほう酸ナトリウム(Na2B4O7)等のほう酸アルカリ金属塩、りん酸三ナトリウム(Na3PO4)、トリポリりん酸ナトリウム(Na5P3O10)、二りん酸ナトリウム(Na4P2O7)、ヘキサメタりん酸ナトリウム(Na6P6O18)、りん酸水素二ナトリウム(Na2HPO4)、りん酸二水素カリウム(KH2PO4)等のりん酸アルカリ金属塩、けい酸ナトリウム(Na2SiO3、Na6Si2O7、Na2Si3O7)等のけい酸アルカリ金属塩、硫酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム等の硫酸アルカリ金属塩、塩化ナトリウム等の塩酸アルカリ金属塩酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等の有機酸アルカリ金属塩などがあげられる。
界面活性剤としては、水相と界面活性剤相との二相に分離し得る界面活性剤であればよいが、好ましくは、非イオン界面活性剤を好適に用いることができ、具体例としては、例えばTriton X−114、Triton X−100などがあげられる。
pH調整に用いる塩基としては、水酸化ナトリウム等の水酸化アルカリ金属を好適に用いることができる。
【0023】
本発明における温度は、界面活性剤添加時には、冷却下、例えば0〜10℃が好ましい。また、エンドトキシンを含む界面活性剤相と多糖類を含む水相の二相に分液させる際には、加温下、とりわけ40〜50℃が好ましい。
【0024】
なお、多糖類の製造方法としては、上記WO94/19376、WO97/46260、特開平10−72467号及び特開平10−95802号記載の方法に加え、さらに特開平10−182646号記載の方法があげられるが、その他に、化合物[II]と化合物[III]を反応させて化合物[IV]とした後、保護基を除去して化合物[V]を得、次いで化合物[VI]と反応させて化合物[VII]を得、さらに化合物[VIII]と反応させ、得られる化合物[IX]を以下、特開平10−182646号及び特開平10−72467号記載の方法に従って製造することもできる。
化合物[II]と化合物[III]との反応は、炭酸カリウム等の塩基の存在下、ジメチルホルムアミド等の適当な溶媒中で実施することができる。
化合物[IV]の保護基の除去は、テトラヒドロフランやエタノール等の適当な溶媒中、塩化水素等の酸で処理することにより実施することができる。
化合物[V]又はその塩と化合物[VI]との反応は、炭酸水素ナトリウム等の塩基の存在下、酢酸エチルや水等の適当な溶媒中で実施することができる。化合物[V]の塩としては、例えば、塩酸塩などの酸付加塩を好適に用いることができる。
化合物[VII]と化合物[VIII]との反応は、t−ブトキシカリウム等の塩基の存在下、ジメチルアセトアミド、トルエン、水等の適当な溶媒中で実施することができる。
化合物[IX]から化合物[I]への工程は、特開平10−182646号記載の方法に従って実施することができ、化合物[I]とアミノ酸又はペプチドとの反応及び引き続くカルボキシル基を有する多糖類との反応は、特開平10−72467号記載の方法に従って実施することができる。
R1及びR2としてはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、イソブチル基等の低級アルキル基をあげることができ、X、X1及びX2のハロゲン原子としては塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等をあげることができる。Eとしては慣用のエステル残基をいずれも使用することができ、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、イソブチル基等の低級アルキル基があげられる。R3の低級アルカノイルとしては、アセチル、プロピオニル等、炭素数2〜7の直鎖または分岐鎖のアルカノイルをあげることができる。
R5〜R9としては、従来既知のカンプトテシン誘導体(例えば、特開平5−222048号、同1−279891号、同6−228141号、同6−87746号、特表平4−503505号、同5−502017号記載の化合物)、欧州公開特許No.757049及び欧州公開特許No.781781に含まれるカンプトテシン誘導体における置換基の組み合わせがあげられ、例えば、(a)R5〜R9のうち、隣接する2つが互いに結合して炭素数2〜6個の直鎖又は分岐鎖アルキレン基を形成しているか、又は、2つとも水素原子であり、R5〜R9のうち残りの1つが−Qq−Alkp−R10であり、他の2つが水素原子、置換もしくは非置換低級アルキル基又はハロゲン原子であるか、あるいは、(b)R5〜R9のうち、隣接する2つが互いに結合して炭素数2〜6個の直鎖又は分岐鎖アルキレン基を形成し、そのアルキレン基のいずれかの炭素原子に−Qq−Alkp−R10が置換しており、R5〜R9の残りの3つが水素原子、置換もしくは非置換低級アルキル基又はハロゲン原子であり、(a)及び(b)におけるアルキレン基中の1つ又は2つのメチレン基は−O−、−S−又は−NH−で置き換えられていてもよく、Qは−O−又は−NH−、Alkは酸素原子が介在していることもある炭素数1〜6個の直鎖又は分岐鎖アルキレン基、R10は保護されたアミノ基、保護された低級アルキルアミノ基、保護されたピペラジノ基、保護された水酸基、p及びqは共に0又は1であるか、pが1、qが0であるものがあげられる。化合物[I]とカルボキシル基を有する多糖類との結合に際して介在させるべきアミノ酸としては、天然アミノ酸および合成アミノ酸(D−アミノ酸、L−アミノ酸、これらの混合物を含む)のいずれも含み、また中性アミノ酸、塩基性アミノ酸および酸性アミノ酸のいずれであってもよい。さらにα−アミノ酸に限らず、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、ε−アミノ酸等も含まれる。具体例としては、グリシン、α−アラニン、β−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジン、トリプトファン、プロリン、オキシプロリン、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸等が挙げられる。
【0025】
またペプチドとしては、上記アミノ酸から導かれるペプチドのほか、鎖中の一部にアミノ酸以外の化合物を含む場合も包含する。例えば、コハク酸のようなジカルボン酸、エチレンジアミンの様なジアミンあるいはエチレングリコールの様なジオールがペプチド鎖の中にまたは末端に存在していてもよい。また、ペプチド鎖の結合方向は、多糖類のカルボキシル基にN末端から酸アミド結合によって結合しているのが通常であるが、ペプチド鎖中に塩基性アミノ酸(例えば、リジン)が存在する場合にはそのε−アミノ基を多糖類のカルボキシル基と結合させ、α−アミノ基をペプチド鎖のC末端と結合させることによってペプチド鎖の結合方向を逆転させてもよい。このようなペプチドは2以上のアミノ酸がペプチド結合したもの、すなわちペプチド鎖2以上のものであって、好ましくは、ペプチド鎖2〜5のものである。その具体的なペプチド鎖の例としては、例えば、−Gly−Gly−LまたはD−Phe−Gly−、−LまたはD−Phe−Gly−、−LまたはD−Tyr−Gly−、−LまたはD−Leu−Gly−、−Gly−Gly−、−Gly−Gly−Gly−、−Gly−Gly−Gly−Gly−または−Gly−Gly−Gly−Gly−Gly−および鎖中にこの配列を含むペプチド鎖が挙げられる(ここで、これらペプチドおよびこれら配列を含むペプチド鎖のN末端側が多糖類のカルボキシル基に導入される)。これらペプチドのうち、−Gly−Gly−LまたはD−Phe−Gly−、−Gly−Gly−、−Gly−Gly−Gly−、−Gly−Gly−Gly−Gly−、−Gly−Gly−Gly−Gly−Gly−、−LまたはD−Phe−Gly−および−LまたはD−Leu−Gly−であるものがより好ましい。また、これらのうち、−Gly−Gly−L−Phe−Gly、−Gly−Gly−、−Gly−Gly−Gly−、−Gly−Gly−Gly−Gly−、−LまたはD−Phe−Gly−がとりわけ好ましい。
【0026】
本明細書において、低級アルキルとは、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル等、炭素数1〜6の直鎖または分岐鎖のアルキルを意味し、好ましくは炭素数1〜4のものを意味する。低級アルカノイルとは、例えば、アセチル、プロピオニル等、炭素数2〜7の直鎖または分岐鎖のアルカノイルを意味し、好ましくは炭素数2〜5のものを意味する。低級アルコキシカルボニルとは、例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル等、炭素数2〜7の直鎖または分岐鎖のアルコキシカルボニルを意味し、好ましくは炭素数2〜5のものを意味する。低級アルケニルとは、例えば、ビニル、アリル、イソプロペニル等、炭素数2〜7の直鎖または分岐鎖のアルケニルを意味し、好ましくは炭素数2〜4のものを意味する。低級アルケニルオキシカルボニルとは、例えば、ビニルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、イソプロペニルオキシカルボニル等、炭素数2〜7の直鎖または分岐鎖のアルケニルオキシカルボニルを意味し、好ましくは炭素数2〜4のものを意味する。低級アルキニルとは、エチニル、2−プロピニル等、炭素数2〜7の直鎖または分岐鎖のアルキニルを意味し、好ましくは炭素数2〜4のものを意味する。低級アルキニルオキシカルボニルとは、エチニルオキシカルボニル、2−プロピニルオキシカルボニル等、炭素数2〜7の直鎖または分岐鎖のアルキニルオキシカルボニルを意味し、好ましくは炭素数2〜4のものを意味する。また、t−ブトキシは1,1−ジメチルエトキシを意味する。
【0027】
【実施例】
以下、本発明を実施例により説明する。
実施例1
デキストラン 3.2g、蒸留水152 mL、2000 EU/mLのエンドトキシン水溶液8 mL、KH2PO4 354 mg、Na2HPO4 554 mgを混合溶解させる。Triton X−114、1.6 mLを加え、5℃ 以下で5 min 攪拌後、40〜45℃で5 min 攪拌する。同温度を維持しながら遠心機で二相に分離し、上相の水相のみを抜き出す(エンドトキシン含量 <0.0015 EU/mg)。この水相に蒸留水150 mLを加え、UF膜ろ過装置 (分画分子量5kDa)で処理してTriton X−114を除去後、凍結乾燥してエンドトキシンが除去されたデキストラン2.27g(エンドトキシン含量 0.015 EU/mg、水分2.1%、Triton X−114含量 < 0.05%)を得る。なお、二相抽出前のエンドトキシン含量は 6.0 EU/mgであった。
実施例2
実施例1の酸のアルカリ金属塩であるKH2PO4 及びNa2HPO4に代えて、下記表1記載の酸のアルカリ金属塩を用いて適宜pH調整して同様に処理して、下記表1記載の結果を得た。
〔表1:エンドトキシン除去効果まとめ〕1 )
【0028】
1)二相抽出1回実施後の水相のエンドトキシン含量;単位:EU/mg
2)NaOHでpH9に調整
3)比濁法により測定。その他はゲル化法により測定
実施例3
後記製造例1で得られた化合物(Na含量3 %)100.0 gを蒸留水2 Lに溶解させ、溶液の一部をサンプリングしてエンドトキシン含量 を測定する(6.95EU/mg)。 1N NaOH 水溶液でpHを9.5に調整する。Triton X−114 20 mLを加え、5℃以下で5 分攪拌後、40〜45℃で5分攪拌する。同温度を維持しながら遠心機で二相に分離し、上相の水相のみを抜き出す(水相のエンドトキシン含量 <0.042 EU/mg)。この水相に蒸留水8 Lを加え、UF膜ろ過装置(分画分子量 50 KDa)で処理してTriton X−114を除去後、エバポレータで約1Lまで濃縮する。濃縮液をエタノールに加え、この混液に食塩水を滴下して結晶を析出させ、攪拌、静置後、上澄みを除く。含水エタノ−ル、エタノ−ル、アセトンで順次、攪拌、静置、上澄みの除去操作を繰返す。最終の沈殿物をろ取し、アセトンで洗浄する。30 ℃で減圧乾燥後、凍結乾燥してエンドトキシンが除去された化合物 84g(エンドトキシン含量 <0.031 EU/mg、 Triton X−114含量 <0.01 %)を得る。
380 nmのUV吸収により、薬物活性残基、10−(3’−アミノプロピルオキシ)−7−エチル−(20S)−カンプトテシンの含量は4.81 %であり、二相抽出操作前の含量は5.03 %であった。ゲル透過カラムクロマトグラフィ−(GPC)による分析の結果、平均分子量は、136,000、多分散度Mw/Mnは1.30であり、二相抽出操作前の平均分子量は133,000、多分散度Mw/Mnは、1.28であった。
実施例4
後記製造例2で得られた化合物 51 mg、蒸留水4.87 mL、2000 EU/mLのエンドトキシン水溶液0.13 mLを混合溶解させ、0.05N NaOH水溶液を加えてpHを9.5に調整する。実験例3と同様の処理後、凍結乾燥して32 mgのエンドトキシンが除去された化合物を得る(エンドトキシン含量 <0.015 EU/mg)。二相抽出前のエンドトキシン含量は、3.6 EU/mgであった。
製造例1
【0029】
CM−Dextran−Na−7−エチル−10−[3’−(グリシル−グリシル−グリシルアミノ)プロピルオキシ]−(20S)−カンプトテシンの製造:
(1)エチル 2−クロロ−2−[6−シアノー1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロー7−インドリジニル]アセテート (230g,0.60 mol)と(3R)−N−(tert−ブトキシカルボニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリンカルボン酸 (184.1g,0.65 mol)のジメチルホルムアミド(1.15 L)溶液に、炭酸カリウム(58.5g, 0.42 mol)を加え、40〜50℃で約2時間撹拌した。反応終了後、接種し、水(345 ml)を45〜50℃、10分で滴下し晶析させた。水(2 L)を同温で加えて1時間撹拌後、室温まで冷却し、さらに1時間撹拌した。析出晶をろ取し、水 (1.2 L)で洗浄した。得られた結晶を50℃で16時間送風乾燥し、エチル 2−[(3R)−N−(tert−ブトキシカルボニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリンカルボニルオキシ]−2−[6−シアノー1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロー7−インドリジニル]アセテート(361g, Y=96 % )を得た。
融点:165−168℃
(2)エチル 2−[[(3R)−N−(tert−ブトキシカルボニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル]カルボニルオキシ]−2−[6−シアノー1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロー7−インドリジニル]アセテート(350.0g, 0.56 mol)、テトラヒドロフラン(0.88 L)、エタノール(0.59 L)の混合物に、塩化水素(45.2g,1.24 mol)のエタノール(0.28 L)溶液を38〜40℃で加えた。同温で2時間攪拌後、接種し、同温で22時間撹拌した。5〜15℃まで冷却し、さらに1時間、同温で攪拌した。析出晶をろ取し、エタノール(〜0.7 L)でpH4以上になるまで洗浄した。得られた結晶を50℃で16時間送風乾燥し、粗体、255gを得た。この粗体250gを、炭酸水素ナトリウム(41.4g, 0.49 mol)、水(1 L)、酢酸エチル(1 L)の混合物に加えて溶解させた。分液後、有機層を10% 食塩水(0.5 L)、20% 食塩水(0.5 L)で順次洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過後、酢酸エチル(250 ml)で洗浄した。ろ液に接種後、塩化水素(16.4g, 0.45 mol)のエタノール(0.5 L)溶液を30分かけて20〜30℃で滴下した。同温で30分撹拌後、5〜15℃に冷却し、1時間撹拌した。析出晶をろ取し、エタノール(〜0.5 L)でpH4以上になるまで洗浄した。得られた結晶を50℃で16時間送風乾燥し、エチル 2−[[(3R)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル]カルボニルオキシ]−2−[6−シアノー1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロー7−インドリジニル]アセテート塩酸塩(188g, Y=59 %, 水2.4%含有)を得た。
MS(m/z):522(M+1)+
(3)4−ビフェニリルスルホニルクロリド(75.3g, 0.30 mol)、酢酸エチル(0.7 L)、水(1.05 L)、炭酸水素ナトリウム(58.0g, 0.69 mol)の順に仕込み、溶解後、エチル 2−[[(3R)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル]カルボニルオキシ]−2−[6−シアノー1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロー7−インドリジニル]アセテート塩酸塩(175.0g, 0.31 mol)を加えた。28〜30℃で6時間攪拌後、5〜15℃に冷却し、さらに1時間撹拌した。析出晶をろ取し、冷却した酢酸エチル(350 ml)で洗浄した。得られた結晶を50℃で16時間送風乾燥しエチル 2−[[(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル]カルボニルオキシ]−2−[6−シアノー1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロー7−インドリジニル]アセテート(179g、Y=78 %、酢酸エチル1.8 %含有)を得た。
MS(m/z):738(M+1)+
(4)ジメチルアセトアミド(275 ml)、トルエン(275 ml)、エチル 2−[[(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル]カルボニルオキシ]−2−[6−シアノー1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロー7−インドリジニル]アセテート(55.0g, 0.075 mol))及び水(27.5 ml)の混合物に、t−ブトキシカリウム(10.0 g, 0.089 mol)を15℃以下で加えた。25〜30℃で1時間撹拌後、ヨウ化エチル(116.5 g, 0.75 mol)を滴下し、25℃で一夜撹拌した。20℃以下に冷却し、酢酸エチル(220 ml)を加えた後、濃塩酸(2.0 g)と水(220 ml)の混液を滴下した。塩化ナトリウム(5.5 g)を加え、撹拌後、分液した。水層を酢酸エチルで(220 ml1回及び110 ml1回)逆抽出した。有機層を合せてチオ硫酸ナトリウム・5水和物(16.5 g)の水(220 ml)溶液、水(220 ml)、食塩(55.0 g)の水(220 ml)溶液で順次洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過後、酢酸エチル(55 ml)で洗浄し、ろ液を減圧濃縮した。濃縮残渣にクロロホルム(165 ml)に溶かし、シリカゲル及び活性炭を加え撹拌、ろ過、クロロホルム(165 ml)で洗浄した。ろ液を減圧濃縮し、クロロホルム(550 ml3回)、アセトン(550 ml3回)で順次置換濃縮した。最終残渣の半量を採り、アセトン(103 ml)と水(34ml)を加え、加温、溶解した。接種し、25℃で20時間、次いで10℃で5時間、撹拌した。析出晶をろ取し、アセトン(39 ml)と水(19 ml)の混液で洗浄した。得られた結晶を50℃で送風乾燥し、(2S)−2−[[(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル]カルボニルオキシ]−2−[6−シアノー1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロー7−インドリジニル]酪酸エチルエステル(21.2g、Y=69 %,アセトン7.1% 含有)を得た。
MS(m/z):766(M+1)+
(5)(2S)−2−〔〔(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル〕カルボニルオキシ〕−2−〔6−シアノ−1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロ−7−インドリジニル〕酪酸エチルエステル23.71g及びラネーニッケル(W−4)49gを無水酢酸−酢酸混液(460ml−190ml)に溶解し、水素雰囲気下50〜60℃にて撹拌した。反応終了後触媒をろ去し、ろ液を減圧濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒;クロロホルム:メタノール=100:1〜70:1〜60:1)にて精製することにより、(2S)−2−〔〔(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル〕カルボニルオキシ〕−2−〔6−〔(アセチルアミノ)メチル〕−1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロ−7−インドリジニル〕酪酸エチルエステル22.10gを淡黄色粉末として得た。
MS(m/z):812(MH+)
(6)(2S)−2−〔〔(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル〕カルボニルオキシ〕−2−〔6−〔(アセチルアミノ)メチル〕−1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロ−7−インドリジニル〕酪酸エチルエステル30.16gを無水酢酸−酢酸混液(450ml−150ml)に溶解し、氷冷下亜硝酸ナトリウム13.18gを加え、氷浴上にて4時間撹拌した。反応混合物をクロロホルム1.5lに注ぎ、不溶物をろ過した。ろ液を減圧乾固し、残渣を酢酸エチル900mlと混合し、60℃にて13時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル700mlにて希釈し、水及び食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムにて乾燥後、炭末処理した。溶媒を減圧留去後、酢酸エチル−ヘキサンより結晶化することにより、(2S)−2−〔〔(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル〕カルボニルオキシ〕−2−〔6−アセトキシメチル−1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロ−7−インドリジニル〕酪酸エチルエステル16.77gを無色プリズム晶として得た。
MS(m/z):813(MH+)
(7)(2S)−2−〔〔(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル〕カルボニルオキシ〕−2−〔6−アセトキシメチル−1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロ−7−インドリジニル〕酪酸エチルエステル1.457gを80%トリフルオロ酢酸水溶液15mlに氷冷下溶解し、反応混合物を室温2日撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、残渣をクロロホルムで抽出後、抽出液を水洗し、硫酸マグネシウムにて乾燥した。抽出液から溶媒を減圧留去することにより、(4S)−7,8−ジヒドロ−4−エチル−4−〔〔(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル〕カルボニルオキシ〕−1H−ピラノ〔3,4−f〕インドリジン−3,6,10(4H)−トリオン1.145gを無色の泡状物として得た。
MS(m/z):639(MH+)
(8)(4S)−7,8−ジヒドロ−4−エチル−4−〔〔(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル〕カルボニルオキシ〕−1H−ピラノ〔3,4−f〕インドリジン−3,6,10(4H)−トリオン1.145g及び1−[5’−(3’’−(tert−ブトキシカルボニルアミノプロピルオキシ)−2’−アミノフェニル)−プロパン−1−オン867mgを酢酸15mlに溶解し、60℃で47時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒;クロロホルム:酢酸エチル=2:1〜1:1)で精製後、酢酸エチル−ヘキサンにて再結晶することにより、(20S)−7−エチル−10−〔3−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)プロピルオキシ〕−20−O−〔〔(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル〕カルボニル〕カンプトテシン1.11gを無色結晶として得た。
MS(m/z):925(MH+)
(9)(20S)−7−エチル−10−〔3−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)プロピルオキシ〕−20−O−〔〔(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル〕カルボニル〕カンプトテシン991mgを水−メタノール(6−30ml)混液に溶解し、氷冷下、水酸化リチウム・一水和物180mgを加え、室温で22時間撹拌後、50℃にて4時間加熱撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、クロロホルム20ml及び酢酸4mlを加え、室温にて19時間撹拌する。反応混合物をクロロホルム、水で希釈し、クロロホルム層を、水及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧濃縮することにより、(20S)−7−エチル−10−〔3−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)プロピルオキシ〕カンプトテシンを得た。
(10)得られた(20S)−7−エチル−10−〔3−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)プロピルオキシ〕カンプトテシンを水−エタノール(5ml+15ml)混液に溶解し、6.6N塩酸−エタノール5mlを加え、室温で23時間撹拌した。反応混合物を減圧乾固し、酢酸エチル及び水に溶かした。酢酸エチル層から更に水で抽出し、全水層を減圧乾固して得られた残渣をイソプロパノール−水から結晶化することにより、(20S)−7−エチル−10−(3−アミノプロピルオキシ)カンプトテシン塩酸塩240mgを淡黄色針状晶として得た。
MS(m/z):450(〔M−Cl〕+)
(11)(20S)−7−エチル−10−(3−アミノプロピルオキシ)カンプトテシン塩酸塩500mgをアセトニトリル25mlに溶解し、t−ブトキシカルボニル−グリシル−グリシル−グリシン345mg、N−メチルモルホリン121mg、N−ヒドロキシベンゾトリアゾール161mgおよび1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩228mgを順次加え、一夜攪拌した。析出した生成物を濾取した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製して、淡黄色泡状粉末を得た。ノルマルプロパノールから再結晶し、無色結晶の7−エチル−10−[3’−(t−ブトキシカルボニル−グリシル−グリシル−グリシルアミノ)プロピルオキシ]−(20S)−カンプトテシンを663mg得た。融点:157−159℃
(12)7−エチル−10−[3’−(t−ブトキシカルボニル−グリシル−グリシル−グリシルアミノ)プロピルオキシ]−(20S)−カンプトテシン3.86gを精製水64mlに乳濁させ、6N塩酸水溶液32mlを加え、室温にて攪拌しながら2時間反応後、溶媒を濃縮し、ノルマルプロパノールを加え、粉末を析出させる。粉末を濾取したのち、ノルマルプロパノール水より再結晶すると、黄色結晶の7−エチル−10−[3’−(グリシル−グリシル−グリシルアミノ)プロピルオキシ]−(20S)−カンプトテシン塩酸塩を2.56g得た。
(13)CM−デキストラン・ナトリウム塩(CM化度=0.44、エンドトキシン値=5.93EU/mg)(600 g)を精製水(24 L)に溶かし、0.2N 塩酸でpH 6とした後、7−エチル−10−[3’−(グリシル−グリシル−グリシルアミノ)プロピルオキシ]−(20S)−カンプトテシン塩酸塩(50.4g、0.0767 mol)の精製水(0.6 L)溶液を加えた。この液に1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩(600g, 2.07 mol)の精製水(4.8 L)溶液を、0.2N 塩酸でpH 5.0〜6.5に調整しながら14〜15℃で、約1時間で滴下した。同温で一夜攪拌した後、精製水(60 L)で希釈し、UF膜を用いてpH4.5以下で脱塩する。脱塩液を10% 水酸化ナトリウム水溶液でpH 8に調整し、陽イオン交換樹脂(MSC−1 Na型)に通した後、溶出液を再度、UF膜で脱塩処理を行った。脱塩処理液をUF膜、RO膜、減圧留去(ロ−タリ−エバポレ−タ−)で順次濃縮(7 L)し、ろ過後、10%水酸化ナトリウム水溶液でpH 4とした。この液をエタノ−ル(36L)に加え、攪拌下、3M 食塩水(240 ml)を滴下し、一夜、室温で攪拌した。攪拌を停止し、デカンテ−ションにより上澄み液を除き、90%含水エタノ−ル(30 L)を加えて10分間攪拌、デカンテ−ションにより上澄み液を除いた。この操作をエタノ−ル(60 L)、アセトン(30L、2回)を用いて繰り返した後、最終の沈殿をアセトン(6 L)を用いて、ろ取した。得られた結晶をロ−タリ−エバポレ−タ−で減圧乾燥後、精製水に溶かし、凍結乾燥することにより、597gのCM−Dextran−Na−7−エチル−10−[3’−(グリシル−グリシル−グリシルアミノ)プロピルオキシ]−(20S)−カンプトテシンを得た。本品のエンドトキシン値は、6.95EU/mgであった。
製造例2
カルボキシメチルデキストランポリアルコール−(1S,9S)−1−(グリシルグリシルーL−フェニルアラニルグリシルアミノ)−9−エチル−5−フルオロ−2,3−ジヒドロ−9−ヒドロキシ−4−メチル−1H,12H−ベンゾ[de]ピラノ[3‘,4’:6,7]インドリジノ[1,2−b]キノリン−10,13(9H,15H)−ジオンの製造:
(1)(1S,9S)−1−アミノ−9−エチル−5−フルオロ−2,3−ジヒドロ−9−ヒドロキシ−4−メチル−1H,12H−ベンゾ[de]ピラノ[3‘,4’:6,7]インドリジノ[1,2−b]キノリン−10,13(9H,15H)−ジオン塩酸塩 (167mg; 0.354mmol), t−ブトキシカルボニル−グリシル−グリシル−L−フェニルアラニル−グリシン (463mg; 1.06mmol) 及び 1−ヒドロキシベンゾトリアゾール・一水和物(HOBT) (143mg; 1.06mmol) のジメチルホルムアミド(DMF)溶液 (10ml) に1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド(EDC)塩酸塩 (270mg; 1.42mmol), トリエチルアミン (148μl; 1.06mmol) 及び 4−ジメチルアミノピリジン(DMAP) (5mg; 0.04mmol)を加える。 反応混合物を室温で15時間かくはんし、溶媒を減圧留去する。 残査をクロロホルムに溶解し、該溶液を洗浄、乾燥後、溶媒を減圧留去する。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶媒;クロロホルム:メタノール=50:1〜10:1)で精製して、(1S,9S)−1−(t−ブトキシカルボニルグリシルグリシルーL−フェニルアラニルグリシルアミノ)−9−エチル−5−フルオロ−2,3−ジヒドロ−9−ヒドロキシ−4−メチル−1H,12H−ベンゾ[de]ピラノ[3‘,4’:6,7]インドリジノ[1,2−b]キノリン−10,13(9H,15H)−ジオン(228mg, Y=75%) を淡黄色固体として得る IR(Nujol) ; 3290, 1710, 1655 cm−1. ESI−MS ; 854 (M+H).
(2)(1S,9S)−1−(t−ブトキシカルボニルグリシルグリシルーL−フェニルアラニルグリシルアミノ)−9−エチル−5−フルオロ−2,3−ジヒドロ−9−ヒドロキシ−4−メチル−1H,12H−ベンゾ[de]ピラノ[3‘,4’:6,7]インドリジノ[1,2−b]キノリン−10,13(9H,15H)−ジオン(220mg; 0.258mmol)のジオキサン溶液 (4ml)に氷浴中かくはん下に4N塩化水素―ジオキサン溶液 (6ml) を加える。 混合物を室温で16時間かくはんする。反応混合物にジエチルエーテル (30ml)を加え、室温で1時間かくはんする。析出物をろ取し、乾燥して、(1S,9S)−1−(グリシルグリシルーL−フェニルアラニルグリシルアミノ)−9−エチル−5−フルオロ−2,3−ジヒドロ−9−ヒドロキシ−4−メチル−1H,12H−ベンゾ[de]ピラノ[3‘,4’:6,7]インドリジノ[1,2−b]キノリン−10,13(9H,15H)−ジオン (176mg, Y=86%)を黄色粉末として得る。 IR (Nujol); 3250, 1745, 1660, 1605, 1535 cm−1. ESI−MS; 754 (M+H).
(3)3リットル3つ首丸底フラスコに酢酸緩衝液(0.1M, pH5.5)(1000 ml)を加える。 デキストラン T−500TM (10.0 g, Amersham Pharmacia Biotech AB)を室温で少量づつ30分間かけて緩衝液に加える。かくはんを、透明な液が得られるまで(約30分)行い、その後水浴中で5℃(内温)まで冷却する。
1リットルフラスコに、過ヨウ素酸ナトリウム(33.0g)及び水(1000ml)を加え、室温でかくはんし、その後5℃に冷却する。
上記デキストラン溶液に5℃にて上記過ヨウ素酸ナトリウム溶液をかくはんしながら加え、反応温度を5日間5℃に保つとともに暗所に保存する。過剰の過ヨウ素酸ナトリウムを除去するため、エチレングリコール(10ml)加え、さらに5℃で2時間かくはんする。反応混合物を3℃に冷却し、8M水酸化ナトリウム水溶液を6℃以下となるように調節しながら滴下する(反応混合物のpHが9以上となる)。反応混合物に水素化ホウ素ナトリウム(14g)をかくはんしながら少量づつ加え、5℃で終夜かくはんする。過剰の水素化ホウ素ナトリウムを除去するために、かくはん下、3〜6℃で、酢酸を加えて反応混合物のpHを5.5以下に調節し、さらに2時間かくはんする。反応混合物を8M水酸化ナトリウム水溶液でpH7.8前後に調節する。反応混合物を水に対して透析(SpectoraTM/ Por 3 membrane, Molecule weight cutoff <3500) した後、凍結乾燥して、デキストランポリアルコール(8.34g)を無定形粉末として得る。
(4)500ml3つ首丸底フラスコに水(155ml)を加え、さらにデキストランポリアルコール(5.18g)を室温でかくはんしながら10分間かけて加える。かくはんは、透明溶液が得られるまで(10〜30分間)行う。水酸化ナトリウム (pellet, 97.0%, 21.8g)を少量づつデキストランポリアルコール溶液にかくはんしながら加える。その際、内温は、氷浴を用いて30〜40℃に保つ。 反応フラスコを水浴に浸して30℃でかくはんする。クロロ酢酸(31.1 g)を少量づつ反応混合物にかくはんしながら30〜40℃で加える。添加完了後、水浴中で30℃でかくはんを20時間続ける。反応混合物を氷浴中に冷却し、かくはんしながら酢酸を加えて中性とする(pHを9以下とする)。水(160ml)を加え、溶液を水に対して透析 (SpectoraTM/ Por3 membrane, Molecule weight cutoff <3500)し、凍結乾燥してカルボキシメチルデキストランポリアルコール(6.53g)を無定形粉末として得る。
(5)100ml1つ首丸底フラスコに水(40ml)を加え、さらにカルボキシメチルデキストランポリアルコール(1.0g)を室温でかくはんしながら5分間かけて加える。かくはんを透明な溶液が得られるまで(30分間)続ける。さらに、(1S,9S)−1−(グリシルグリシルーL−フェニルアラニルグリシルアミノ)−9−エチル−5−フルオロ−2,3−ジヒドロ−9−ヒドロキシ−4−メチル−1H,12H−ベンゾ[de]ピラノ[3‘,4’:6,7]インドリジノ[1,2−b]キノリン−10,13(9H,15H)−ジオンのジメチルホルムアミド溶液(100 mg in 10 ml)をかくはんしながら加え、ついでジメチルホルムアミド15mlを加え、さらに10分間かくはんする。2−エトキシー1−エトキシカルボニルー1,2−ジヒドロキノリン(EEDQ)のジメチルホルムアミド溶液(1.0 g in 10 ml) を室温でかくはんしながら滴下しさらに18時間かくはんする。反応混合物を3度水ろ過 (SpectoraTM/ Por 3 membrane, Molecule weight cutoff <3500) し、さらに陽イオン交換カラム(BioRad AGTM MP−50 カラム、 Na type, 30 ml)を通してで精製する。主要な画分を水に対して透析 (SpectoraTM/ Por 3 membrane, Molecule weight cutoff <3500)し、凍結乾燥して粗生成物を得る。粗生成物をアセトンで粉末化後、ろ取、乾燥して目的物(904mg)を淡黄色粉末として得る。
【0030】
【発明の効果】
本発明によれば、エンドトキシンを含む多糖類からエンドトキシンを効率的に除去することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、エンドトキシンを含む多糖類からのエンドトキシン除去方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
エンドトキシンは、発熱、ショックの原因物質であり、注射薬、輸液など非経口医薬品の製造過程でエンドトキシンの混入が判明した場合は、安全性確保のため、除去が必須である。
蛋白質からエンドトキシンを除去する方法は種々報告されており、界面活性剤でエンドトキシンを抽出し、界面活性剤相を分液後、水相から蛋白質を回収する二相抽出法も有力な方法の一つとなっている(非特許文献1)。一方、多糖類からエンドトキシンを除去する方法としては、二相抽出法が一例報告されているのみである(非特許文献2)。この方法は、エンドトキシンを含む多糖類の水溶液を界面活性剤(Triton X−114)で抽出を2回繰返し、エンドトキシン含量を3000 EU/mgから30 EU/mgまで減少させるものである。しかし、除去効果は十分でなく、抽出操作を2回以上繰返しても30 EU/mg以下に減少させ得ない。
上述の如く、既存の二相抽出法を用いて多糖類からエンドトキシンを除く場合、除去効果が十分でなく、従って、より実用性の高い二相抽出法の開発が望まれていた。
【0003】
【非特許文献1】
F. B. Anspachら, Journal of Biotechnology 76巻 97頁 2000年
【非特許文献2】
O. Adamら, Analytical Biochemistry 225巻 321頁 1995年
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、非経口医薬品の原薬等に用いられる多糖類からエンドトキシンを効率的に除去する方法を提供することである。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の通りである。
1. エンドトキシンを含む多糖類を、酸のアルカリ金属塩の存在下、界面活性剤で処理することを特徴とするエンドトキシン除去方法。
2. 塩基性条件下で実施することを特徴とする1.記載のエンドトキシン除去方法。
3. 酸のアルカリ金属塩の酸の種類が1種類である1.又は2.記載のエンドトキシン除去方法。
4. 多糖類それ自身が酸のアルカリ金属塩である3.記載のエンドトキシン除去方法。
5.界面活性剤が非イオン界面活性剤である4.記載のエンドトキシン除去方法。
6.一般式[II]
【0006】
〔式中、R1及びR2は低級アルキル基、Eはエステル残基、Xはハロゲン原子を表す。〕
で示される化合物と一般式[III]
【0007】
[式中、Bocはベンジルオキシカルボニル基を表す。]
で示される化合物とを反応させて一般式[IV]
【0008】
[式中、記号は前記と同一意味を有する。]
で示される化合物とした後保護基を除去して一般式[V]
【0009】
[式中、記号は前記と同一意味を有する。]
で示される化合物又はその塩を得、次いで一般式[VI]
【0010】
[式中、X1はハロゲン原子を表す。]
で示される化合物と反応させて一般式[VII]
【0011】
[式中、記号は前記と同一意味を有する。]
で示される化合物を得、さらに一般式[VIII]
X2−CH2CH3
[式中、X2はハロゲン原子を表す。]
で示される化合物と反応させ、得られる一般式[IX]
【0012】
[式中、記号は前記と同一意味を有する。]
で示されるS型2−置換ヒドロキシ−2−インドリジニル酪酸エステル誘導体のシアノ基を還元後アルカノイル化して、一般式〔X〕
【0013】
〔式中、R3は低級アルカノイル基を表し、他の記号は前記と同一意味を有する。〕
で示されるS型2−置換ヒドロキシ−2−(6−置換アミノメチルインドリジニル)酪酸エステル誘導体とした後、これをニトロソ化反応及び転移反応に付して、一般式〔XI〕
【0014】
〔式中、記号は前記と同一意味を有する。〕
で示されるS型2−置換ヒドロキシ−2−(6−置換ヒドロキシメチルインドリジニル)酪酸エステル誘導体とし、該化合物を分子内閉環後または分子内閉環と同時に、アセタールをケトンに変換して一般式〔XII〕
【0015】
〔式中、記号は前記と同一意味を有する。〕
で示されるS型4−置換ヒドロキシピラノインドリジン誘導体とし、さらに、一般式〔XIII〕
【0016】
〔式中、R5〜R9は水素原子又は保護基を有していてもよい置換基を表す。〕
で示されるo−アシルアニリン化合物とを反応させて、一般式〔XIV〕
【0017】
〔式中、記号は前記と同一意味を有する。〕
で示される20位水酸基が置換されたカンプトテシン化合物を得、この化合物を、20位水酸基の置換基除去反応に付して一般式〔I〕
【0018】
〔式中、記号は前記と同一意味を有する。〕
で示されるカンプトテシン誘導体とし、さらに、アミノ酸またはペプチドと反応させ、得られた化合物のアミノ酸が保護されている場合はその保護基を除去したのち、カルボキシル基を有する多糖類と反応させ、所望により、酸のアルカリ金属塩の存在下、界面活性剤で処理してエンドトキシン除去することを特徴とする化合物[I]とカルボキシル基を有する多糖類とがアミノ酸またはペプチドを介して結合してなるカンプトテシン誘導体またはその薬理的に許容しうる塩の製法。
7.界面活性剤添加時には冷却し、その後加温することを特徴とする1.〜5.記載のエンドトキシン除去方法。
8.水の存在下で行うことを特徴とする1.〜5.及び7.記載のエンドトキシン除去方法。
【0019】
【発明の実施の形態】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【0020】
エンドトキシンを含む多糖類水溶液を、酸のアルカリ金属塩の存在下、必要に応じpH調整した後、界面活性剤で処理し、エンドトキシンを含む界面活性剤相と多糖類を含む水相の二相に分液させ、さらに所望により、多糖類を含む水相から残存する界面活性剤を限外ろ過(UF)膜で除去し、多糖類を含む水相を濃縮、凍結乾燥等で水分を除くことにより、エンドトキシンが除去された多糖類が効率よく得られる。
エンドトキシンを含む多糖類における多糖類の具体例としては、デキストラン、プルラン、マンノグルカン、キチン、キトサン、マンナン等の中性多糖類、ヒアルロン酸、ペクチン酸、アルギン酸、コンドロイチン、ヘパリン等の酸性多糖類、上記中性多糖類にカルボキシメチル基を導入した化合物(即ち多糖類置換酢酸)、上記中性多糖類をポリアルコール化したのちにカルボキシルメチル基を導入した化合物(即ち、カルボキシメチル基を有する多糖ポリアルコール)等があげられる。
中性多糖類にカルボキシメチル基を導入した化合物(即ち多糖類置換酢酸)の例としては、WO94/19376に開示されている物質を、中性多糖類をポリアルコール化したのちにカルボキシルメチル基を導入した化合物(即ち、カルボキシメチル基を有する多糖ポリアルコール)の例としては、WO97/46260に開示されている物質を、それぞれあげることができる。
また、中性多糖類にカルボキシメチル基を導入した化合物(即ち多糖類置換酢酸)に、さらに薬物等が結合した化合物の例としては、式:
【0021】
(式中、CM・Dextran・Naは、カルボキシメチルデキストラン・ナトリウム塩を表す。以下、同様。)
で示される化合物など特開平10−72467号及び特開平10−95802号に開示されている物質や、中性多糖類をポリアルコール化したのちにカルボキシルメチル基を導入した化合物(即ち、カルボキシメチル基を有する多糖ポリアルコール)に、さらに薬物等が結合した化合物、即ち、式:
【0022】
で示される化合物等があげられる。
酸のアルカリ金属塩の具体例としては、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウム等の炭酸アルカリ金属塩、四ほう酸ナトリウム(Na2B4O7)等のほう酸アルカリ金属塩、りん酸三ナトリウム(Na3PO4)、トリポリりん酸ナトリウム(Na5P3O10)、二りん酸ナトリウム(Na4P2O7)、ヘキサメタりん酸ナトリウム(Na6P6O18)、りん酸水素二ナトリウム(Na2HPO4)、りん酸二水素カリウム(KH2PO4)等のりん酸アルカリ金属塩、けい酸ナトリウム(Na2SiO3、Na6Si2O7、Na2Si3O7)等のけい酸アルカリ金属塩、硫酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム等の硫酸アルカリ金属塩、塩化ナトリウム等の塩酸アルカリ金属塩酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等の有機酸アルカリ金属塩などがあげられる。
界面活性剤としては、水相と界面活性剤相との二相に分離し得る界面活性剤であればよいが、好ましくは、非イオン界面活性剤を好適に用いることができ、具体例としては、例えばTriton X−114、Triton X−100などがあげられる。
pH調整に用いる塩基としては、水酸化ナトリウム等の水酸化アルカリ金属を好適に用いることができる。
【0023】
本発明における温度は、界面活性剤添加時には、冷却下、例えば0〜10℃が好ましい。また、エンドトキシンを含む界面活性剤相と多糖類を含む水相の二相に分液させる際には、加温下、とりわけ40〜50℃が好ましい。
【0024】
なお、多糖類の製造方法としては、上記WO94/19376、WO97/46260、特開平10−72467号及び特開平10−95802号記載の方法に加え、さらに特開平10−182646号記載の方法があげられるが、その他に、化合物[II]と化合物[III]を反応させて化合物[IV]とした後、保護基を除去して化合物[V]を得、次いで化合物[VI]と反応させて化合物[VII]を得、さらに化合物[VIII]と反応させ、得られる化合物[IX]を以下、特開平10−182646号及び特開平10−72467号記載の方法に従って製造することもできる。
化合物[II]と化合物[III]との反応は、炭酸カリウム等の塩基の存在下、ジメチルホルムアミド等の適当な溶媒中で実施することができる。
化合物[IV]の保護基の除去は、テトラヒドロフランやエタノール等の適当な溶媒中、塩化水素等の酸で処理することにより実施することができる。
化合物[V]又はその塩と化合物[VI]との反応は、炭酸水素ナトリウム等の塩基の存在下、酢酸エチルや水等の適当な溶媒中で実施することができる。化合物[V]の塩としては、例えば、塩酸塩などの酸付加塩を好適に用いることができる。
化合物[VII]と化合物[VIII]との反応は、t−ブトキシカリウム等の塩基の存在下、ジメチルアセトアミド、トルエン、水等の適当な溶媒中で実施することができる。
化合物[IX]から化合物[I]への工程は、特開平10−182646号記載の方法に従って実施することができ、化合物[I]とアミノ酸又はペプチドとの反応及び引き続くカルボキシル基を有する多糖類との反応は、特開平10−72467号記載の方法に従って実施することができる。
R1及びR2としてはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、イソブチル基等の低級アルキル基をあげることができ、X、X1及びX2のハロゲン原子としては塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等をあげることができる。Eとしては慣用のエステル残基をいずれも使用することができ、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、イソブチル基等の低級アルキル基があげられる。R3の低級アルカノイルとしては、アセチル、プロピオニル等、炭素数2〜7の直鎖または分岐鎖のアルカノイルをあげることができる。
R5〜R9としては、従来既知のカンプトテシン誘導体(例えば、特開平5−222048号、同1−279891号、同6−228141号、同6−87746号、特表平4−503505号、同5−502017号記載の化合物)、欧州公開特許No.757049及び欧州公開特許No.781781に含まれるカンプトテシン誘導体における置換基の組み合わせがあげられ、例えば、(a)R5〜R9のうち、隣接する2つが互いに結合して炭素数2〜6個の直鎖又は分岐鎖アルキレン基を形成しているか、又は、2つとも水素原子であり、R5〜R9のうち残りの1つが−Qq−Alkp−R10であり、他の2つが水素原子、置換もしくは非置換低級アルキル基又はハロゲン原子であるか、あるいは、(b)R5〜R9のうち、隣接する2つが互いに結合して炭素数2〜6個の直鎖又は分岐鎖アルキレン基を形成し、そのアルキレン基のいずれかの炭素原子に−Qq−Alkp−R10が置換しており、R5〜R9の残りの3つが水素原子、置換もしくは非置換低級アルキル基又はハロゲン原子であり、(a)及び(b)におけるアルキレン基中の1つ又は2つのメチレン基は−O−、−S−又は−NH−で置き換えられていてもよく、Qは−O−又は−NH−、Alkは酸素原子が介在していることもある炭素数1〜6個の直鎖又は分岐鎖アルキレン基、R10は保護されたアミノ基、保護された低級アルキルアミノ基、保護されたピペラジノ基、保護された水酸基、p及びqは共に0又は1であるか、pが1、qが0であるものがあげられる。化合物[I]とカルボキシル基を有する多糖類との結合に際して介在させるべきアミノ酸としては、天然アミノ酸および合成アミノ酸(D−アミノ酸、L−アミノ酸、これらの混合物を含む)のいずれも含み、また中性アミノ酸、塩基性アミノ酸および酸性アミノ酸のいずれであってもよい。さらにα−アミノ酸に限らず、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、ε−アミノ酸等も含まれる。具体例としては、グリシン、α−アラニン、β−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジン、トリプトファン、プロリン、オキシプロリン、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロン酸等が挙げられる。
【0025】
またペプチドとしては、上記アミノ酸から導かれるペプチドのほか、鎖中の一部にアミノ酸以外の化合物を含む場合も包含する。例えば、コハク酸のようなジカルボン酸、エチレンジアミンの様なジアミンあるいはエチレングリコールの様なジオールがペプチド鎖の中にまたは末端に存在していてもよい。また、ペプチド鎖の結合方向は、多糖類のカルボキシル基にN末端から酸アミド結合によって結合しているのが通常であるが、ペプチド鎖中に塩基性アミノ酸(例えば、リジン)が存在する場合にはそのε−アミノ基を多糖類のカルボキシル基と結合させ、α−アミノ基をペプチド鎖のC末端と結合させることによってペプチド鎖の結合方向を逆転させてもよい。このようなペプチドは2以上のアミノ酸がペプチド結合したもの、すなわちペプチド鎖2以上のものであって、好ましくは、ペプチド鎖2〜5のものである。その具体的なペプチド鎖の例としては、例えば、−Gly−Gly−LまたはD−Phe−Gly−、−LまたはD−Phe−Gly−、−LまたはD−Tyr−Gly−、−LまたはD−Leu−Gly−、−Gly−Gly−、−Gly−Gly−Gly−、−Gly−Gly−Gly−Gly−または−Gly−Gly−Gly−Gly−Gly−および鎖中にこの配列を含むペプチド鎖が挙げられる(ここで、これらペプチドおよびこれら配列を含むペプチド鎖のN末端側が多糖類のカルボキシル基に導入される)。これらペプチドのうち、−Gly−Gly−LまたはD−Phe−Gly−、−Gly−Gly−、−Gly−Gly−Gly−、−Gly−Gly−Gly−Gly−、−Gly−Gly−Gly−Gly−Gly−、−LまたはD−Phe−Gly−および−LまたはD−Leu−Gly−であるものがより好ましい。また、これらのうち、−Gly−Gly−L−Phe−Gly、−Gly−Gly−、−Gly−Gly−Gly−、−Gly−Gly−Gly−Gly−、−LまたはD−Phe−Gly−がとりわけ好ましい。
【0026】
本明細書において、低級アルキルとは、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル等、炭素数1〜6の直鎖または分岐鎖のアルキルを意味し、好ましくは炭素数1〜4のものを意味する。低級アルカノイルとは、例えば、アセチル、プロピオニル等、炭素数2〜7の直鎖または分岐鎖のアルカノイルを意味し、好ましくは炭素数2〜5のものを意味する。低級アルコキシカルボニルとは、例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル等、炭素数2〜7の直鎖または分岐鎖のアルコキシカルボニルを意味し、好ましくは炭素数2〜5のものを意味する。低級アルケニルとは、例えば、ビニル、アリル、イソプロペニル等、炭素数2〜7の直鎖または分岐鎖のアルケニルを意味し、好ましくは炭素数2〜4のものを意味する。低級アルケニルオキシカルボニルとは、例えば、ビニルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、イソプロペニルオキシカルボニル等、炭素数2〜7の直鎖または分岐鎖のアルケニルオキシカルボニルを意味し、好ましくは炭素数2〜4のものを意味する。低級アルキニルとは、エチニル、2−プロピニル等、炭素数2〜7の直鎖または分岐鎖のアルキニルを意味し、好ましくは炭素数2〜4のものを意味する。低級アルキニルオキシカルボニルとは、エチニルオキシカルボニル、2−プロピニルオキシカルボニル等、炭素数2〜7の直鎖または分岐鎖のアルキニルオキシカルボニルを意味し、好ましくは炭素数2〜4のものを意味する。また、t−ブトキシは1,1−ジメチルエトキシを意味する。
【0027】
【実施例】
以下、本発明を実施例により説明する。
実施例1
デキストラン 3.2g、蒸留水152 mL、2000 EU/mLのエンドトキシン水溶液8 mL、KH2PO4 354 mg、Na2HPO4 554 mgを混合溶解させる。Triton X−114、1.6 mLを加え、5℃ 以下で5 min 攪拌後、40〜45℃で5 min 攪拌する。同温度を維持しながら遠心機で二相に分離し、上相の水相のみを抜き出す(エンドトキシン含量 <0.0015 EU/mg)。この水相に蒸留水150 mLを加え、UF膜ろ過装置 (分画分子量5kDa)で処理してTriton X−114を除去後、凍結乾燥してエンドトキシンが除去されたデキストラン2.27g(エンドトキシン含量 0.015 EU/mg、水分2.1%、Triton X−114含量 < 0.05%)を得る。なお、二相抽出前のエンドトキシン含量は 6.0 EU/mgであった。
実施例2
実施例1の酸のアルカリ金属塩であるKH2PO4 及びNa2HPO4に代えて、下記表1記載の酸のアルカリ金属塩を用いて適宜pH調整して同様に処理して、下記表1記載の結果を得た。
〔表1:エンドトキシン除去効果まとめ〕1 )
【0028】
1)二相抽出1回実施後の水相のエンドトキシン含量;単位:EU/mg
2)NaOHでpH9に調整
3)比濁法により測定。その他はゲル化法により測定
実施例3
後記製造例1で得られた化合物(Na含量3 %)100.0 gを蒸留水2 Lに溶解させ、溶液の一部をサンプリングしてエンドトキシン含量 を測定する(6.95EU/mg)。 1N NaOH 水溶液でpHを9.5に調整する。Triton X−114 20 mLを加え、5℃以下で5 分攪拌後、40〜45℃で5分攪拌する。同温度を維持しながら遠心機で二相に分離し、上相の水相のみを抜き出す(水相のエンドトキシン含量 <0.042 EU/mg)。この水相に蒸留水8 Lを加え、UF膜ろ過装置(分画分子量 50 KDa)で処理してTriton X−114を除去後、エバポレータで約1Lまで濃縮する。濃縮液をエタノールに加え、この混液に食塩水を滴下して結晶を析出させ、攪拌、静置後、上澄みを除く。含水エタノ−ル、エタノ−ル、アセトンで順次、攪拌、静置、上澄みの除去操作を繰返す。最終の沈殿物をろ取し、アセトンで洗浄する。30 ℃で減圧乾燥後、凍結乾燥してエンドトキシンが除去された化合物 84g(エンドトキシン含量 <0.031 EU/mg、 Triton X−114含量 <0.01 %)を得る。
380 nmのUV吸収により、薬物活性残基、10−(3’−アミノプロピルオキシ)−7−エチル−(20S)−カンプトテシンの含量は4.81 %であり、二相抽出操作前の含量は5.03 %であった。ゲル透過カラムクロマトグラフィ−(GPC)による分析の結果、平均分子量は、136,000、多分散度Mw/Mnは1.30であり、二相抽出操作前の平均分子量は133,000、多分散度Mw/Mnは、1.28であった。
実施例4
後記製造例2で得られた化合物 51 mg、蒸留水4.87 mL、2000 EU/mLのエンドトキシン水溶液0.13 mLを混合溶解させ、0.05N NaOH水溶液を加えてpHを9.5に調整する。実験例3と同様の処理後、凍結乾燥して32 mgのエンドトキシンが除去された化合物を得る(エンドトキシン含量 <0.015 EU/mg)。二相抽出前のエンドトキシン含量は、3.6 EU/mgであった。
製造例1
【0029】
CM−Dextran−Na−7−エチル−10−[3’−(グリシル−グリシル−グリシルアミノ)プロピルオキシ]−(20S)−カンプトテシンの製造:
(1)エチル 2−クロロ−2−[6−シアノー1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロー7−インドリジニル]アセテート (230g,0.60 mol)と(3R)−N−(tert−ブトキシカルボニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリンカルボン酸 (184.1g,0.65 mol)のジメチルホルムアミド(1.15 L)溶液に、炭酸カリウム(58.5g, 0.42 mol)を加え、40〜50℃で約2時間撹拌した。反応終了後、接種し、水(345 ml)を45〜50℃、10分で滴下し晶析させた。水(2 L)を同温で加えて1時間撹拌後、室温まで冷却し、さらに1時間撹拌した。析出晶をろ取し、水 (1.2 L)で洗浄した。得られた結晶を50℃で16時間送風乾燥し、エチル 2−[(3R)−N−(tert−ブトキシカルボニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリンカルボニルオキシ]−2−[6−シアノー1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロー7−インドリジニル]アセテート(361g, Y=96 % )を得た。
融点:165−168℃
(2)エチル 2−[[(3R)−N−(tert−ブトキシカルボニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル]カルボニルオキシ]−2−[6−シアノー1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロー7−インドリジニル]アセテート(350.0g, 0.56 mol)、テトラヒドロフラン(0.88 L)、エタノール(0.59 L)の混合物に、塩化水素(45.2g,1.24 mol)のエタノール(0.28 L)溶液を38〜40℃で加えた。同温で2時間攪拌後、接種し、同温で22時間撹拌した。5〜15℃まで冷却し、さらに1時間、同温で攪拌した。析出晶をろ取し、エタノール(〜0.7 L)でpH4以上になるまで洗浄した。得られた結晶を50℃で16時間送風乾燥し、粗体、255gを得た。この粗体250gを、炭酸水素ナトリウム(41.4g, 0.49 mol)、水(1 L)、酢酸エチル(1 L)の混合物に加えて溶解させた。分液後、有機層を10% 食塩水(0.5 L)、20% 食塩水(0.5 L)で順次洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過後、酢酸エチル(250 ml)で洗浄した。ろ液に接種後、塩化水素(16.4g, 0.45 mol)のエタノール(0.5 L)溶液を30分かけて20〜30℃で滴下した。同温で30分撹拌後、5〜15℃に冷却し、1時間撹拌した。析出晶をろ取し、エタノール(〜0.5 L)でpH4以上になるまで洗浄した。得られた結晶を50℃で16時間送風乾燥し、エチル 2−[[(3R)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル]カルボニルオキシ]−2−[6−シアノー1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロー7−インドリジニル]アセテート塩酸塩(188g, Y=59 %, 水2.4%含有)を得た。
MS(m/z):522(M+1)+
(3)4−ビフェニリルスルホニルクロリド(75.3g, 0.30 mol)、酢酸エチル(0.7 L)、水(1.05 L)、炭酸水素ナトリウム(58.0g, 0.69 mol)の順に仕込み、溶解後、エチル 2−[[(3R)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル]カルボニルオキシ]−2−[6−シアノー1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロー7−インドリジニル]アセテート塩酸塩(175.0g, 0.31 mol)を加えた。28〜30℃で6時間攪拌後、5〜15℃に冷却し、さらに1時間撹拌した。析出晶をろ取し、冷却した酢酸エチル(350 ml)で洗浄した。得られた結晶を50℃で16時間送風乾燥しエチル 2−[[(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル]カルボニルオキシ]−2−[6−シアノー1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロー7−インドリジニル]アセテート(179g、Y=78 %、酢酸エチル1.8 %含有)を得た。
MS(m/z):738(M+1)+
(4)ジメチルアセトアミド(275 ml)、トルエン(275 ml)、エチル 2−[[(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル]カルボニルオキシ]−2−[6−シアノー1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロー7−インドリジニル]アセテート(55.0g, 0.075 mol))及び水(27.5 ml)の混合物に、t−ブトキシカリウム(10.0 g, 0.089 mol)を15℃以下で加えた。25〜30℃で1時間撹拌後、ヨウ化エチル(116.5 g, 0.75 mol)を滴下し、25℃で一夜撹拌した。20℃以下に冷却し、酢酸エチル(220 ml)を加えた後、濃塩酸(2.0 g)と水(220 ml)の混液を滴下した。塩化ナトリウム(5.5 g)を加え、撹拌後、分液した。水層を酢酸エチルで(220 ml1回及び110 ml1回)逆抽出した。有機層を合せてチオ硫酸ナトリウム・5水和物(16.5 g)の水(220 ml)溶液、水(220 ml)、食塩(55.0 g)の水(220 ml)溶液で順次洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過後、酢酸エチル(55 ml)で洗浄し、ろ液を減圧濃縮した。濃縮残渣にクロロホルム(165 ml)に溶かし、シリカゲル及び活性炭を加え撹拌、ろ過、クロロホルム(165 ml)で洗浄した。ろ液を減圧濃縮し、クロロホルム(550 ml3回)、アセトン(550 ml3回)で順次置換濃縮した。最終残渣の半量を採り、アセトン(103 ml)と水(34ml)を加え、加温、溶解した。接種し、25℃で20時間、次いで10℃で5時間、撹拌した。析出晶をろ取し、アセトン(39 ml)と水(19 ml)の混液で洗浄した。得られた結晶を50℃で送風乾燥し、(2S)−2−[[(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル]カルボニルオキシ]−2−[6−シアノー1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロー7−インドリジニル]酪酸エチルエステル(21.2g、Y=69 %,アセトン7.1% 含有)を得た。
MS(m/z):766(M+1)+
(5)(2S)−2−〔〔(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル〕カルボニルオキシ〕−2−〔6−シアノ−1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロ−7−インドリジニル〕酪酸エチルエステル23.71g及びラネーニッケル(W−4)49gを無水酢酸−酢酸混液(460ml−190ml)に溶解し、水素雰囲気下50〜60℃にて撹拌した。反応終了後触媒をろ去し、ろ液を減圧濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒;クロロホルム:メタノール=100:1〜70:1〜60:1)にて精製することにより、(2S)−2−〔〔(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル〕カルボニルオキシ〕−2−〔6−〔(アセチルアミノ)メチル〕−1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロ−7−インドリジニル〕酪酸エチルエステル22.10gを淡黄色粉末として得た。
MS(m/z):812(MH+)
(6)(2S)−2−〔〔(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル〕カルボニルオキシ〕−2−〔6−〔(アセチルアミノ)メチル〕−1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロ−7−インドリジニル〕酪酸エチルエステル30.16gを無水酢酸−酢酸混液(450ml−150ml)に溶解し、氷冷下亜硝酸ナトリウム13.18gを加え、氷浴上にて4時間撹拌した。反応混合物をクロロホルム1.5lに注ぎ、不溶物をろ過した。ろ液を減圧乾固し、残渣を酢酸エチル900mlと混合し、60℃にて13時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル700mlにて希釈し、水及び食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムにて乾燥後、炭末処理した。溶媒を減圧留去後、酢酸エチル−ヘキサンより結晶化することにより、(2S)−2−〔〔(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル〕カルボニルオキシ〕−2−〔6−アセトキシメチル−1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロ−7−インドリジニル〕酪酸エチルエステル16.77gを無色プリズム晶として得た。
MS(m/z):813(MH+)
(7)(2S)−2−〔〔(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル〕カルボニルオキシ〕−2−〔6−アセトキシメチル−1,1−(2,2−ジメチルトリメチレンジオキシ)−5−オキソ−1,2,3,5−テトラヒドロ−7−インドリジニル〕酪酸エチルエステル1.457gを80%トリフルオロ酢酸水溶液15mlに氷冷下溶解し、反応混合物を室温2日撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、残渣をクロロホルムで抽出後、抽出液を水洗し、硫酸マグネシウムにて乾燥した。抽出液から溶媒を減圧留去することにより、(4S)−7,8−ジヒドロ−4−エチル−4−〔〔(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル〕カルボニルオキシ〕−1H−ピラノ〔3,4−f〕インドリジン−3,6,10(4H)−トリオン1.145gを無色の泡状物として得た。
MS(m/z):639(MH+)
(8)(4S)−7,8−ジヒドロ−4−エチル−4−〔〔(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル〕カルボニルオキシ〕−1H−ピラノ〔3,4−f〕インドリジン−3,6,10(4H)−トリオン1.145g及び1−[5’−(3’’−(tert−ブトキシカルボニルアミノプロピルオキシ)−2’−アミノフェニル)−プロパン−1−オン867mgを酢酸15mlに溶解し、60℃で47時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒;クロロホルム:酢酸エチル=2:1〜1:1)で精製後、酢酸エチル−ヘキサンにて再結晶することにより、(20S)−7−エチル−10−〔3−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)プロピルオキシ〕−20−O−〔〔(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル〕カルボニル〕カンプトテシン1.11gを無色結晶として得た。
MS(m/z):925(MH+)
(9)(20S)−7−エチル−10−〔3−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)プロピルオキシ〕−20−O−〔〔(3R)−N−(4−ビフェニリルスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロ−3−イソキノリル〕カルボニル〕カンプトテシン991mgを水−メタノール(6−30ml)混液に溶解し、氷冷下、水酸化リチウム・一水和物180mgを加え、室温で22時間撹拌後、50℃にて4時間加熱撹拌した。反応混合物を減圧濃縮し、クロロホルム20ml及び酢酸4mlを加え、室温にて19時間撹拌する。反応混合物をクロロホルム、水で希釈し、クロロホルム層を、水及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧濃縮することにより、(20S)−7−エチル−10−〔3−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)プロピルオキシ〕カンプトテシンを得た。
(10)得られた(20S)−7−エチル−10−〔3−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)プロピルオキシ〕カンプトテシンを水−エタノール(5ml+15ml)混液に溶解し、6.6N塩酸−エタノール5mlを加え、室温で23時間撹拌した。反応混合物を減圧乾固し、酢酸エチル及び水に溶かした。酢酸エチル層から更に水で抽出し、全水層を減圧乾固して得られた残渣をイソプロパノール−水から結晶化することにより、(20S)−7−エチル−10−(3−アミノプロピルオキシ)カンプトテシン塩酸塩240mgを淡黄色針状晶として得た。
MS(m/z):450(〔M−Cl〕+)
(11)(20S)−7−エチル−10−(3−アミノプロピルオキシ)カンプトテシン塩酸塩500mgをアセトニトリル25mlに溶解し、t−ブトキシカルボニル−グリシル−グリシル−グリシン345mg、N−メチルモルホリン121mg、N−ヒドロキシベンゾトリアゾール161mgおよび1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩228mgを順次加え、一夜攪拌した。析出した生成物を濾取した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製して、淡黄色泡状粉末を得た。ノルマルプロパノールから再結晶し、無色結晶の7−エチル−10−[3’−(t−ブトキシカルボニル−グリシル−グリシル−グリシルアミノ)プロピルオキシ]−(20S)−カンプトテシンを663mg得た。融点:157−159℃
(12)7−エチル−10−[3’−(t−ブトキシカルボニル−グリシル−グリシル−グリシルアミノ)プロピルオキシ]−(20S)−カンプトテシン3.86gを精製水64mlに乳濁させ、6N塩酸水溶液32mlを加え、室温にて攪拌しながら2時間反応後、溶媒を濃縮し、ノルマルプロパノールを加え、粉末を析出させる。粉末を濾取したのち、ノルマルプロパノール水より再結晶すると、黄色結晶の7−エチル−10−[3’−(グリシル−グリシル−グリシルアミノ)プロピルオキシ]−(20S)−カンプトテシン塩酸塩を2.56g得た。
(13)CM−デキストラン・ナトリウム塩(CM化度=0.44、エンドトキシン値=5.93EU/mg)(600 g)を精製水(24 L)に溶かし、0.2N 塩酸でpH 6とした後、7−エチル−10−[3’−(グリシル−グリシル−グリシルアミノ)プロピルオキシ]−(20S)−カンプトテシン塩酸塩(50.4g、0.0767 mol)の精製水(0.6 L)溶液を加えた。この液に1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩(600g, 2.07 mol)の精製水(4.8 L)溶液を、0.2N 塩酸でpH 5.0〜6.5に調整しながら14〜15℃で、約1時間で滴下した。同温で一夜攪拌した後、精製水(60 L)で希釈し、UF膜を用いてpH4.5以下で脱塩する。脱塩液を10% 水酸化ナトリウム水溶液でpH 8に調整し、陽イオン交換樹脂(MSC−1 Na型)に通した後、溶出液を再度、UF膜で脱塩処理を行った。脱塩処理液をUF膜、RO膜、減圧留去(ロ−タリ−エバポレ−タ−)で順次濃縮(7 L)し、ろ過後、10%水酸化ナトリウム水溶液でpH 4とした。この液をエタノ−ル(36L)に加え、攪拌下、3M 食塩水(240 ml)を滴下し、一夜、室温で攪拌した。攪拌を停止し、デカンテ−ションにより上澄み液を除き、90%含水エタノ−ル(30 L)を加えて10分間攪拌、デカンテ−ションにより上澄み液を除いた。この操作をエタノ−ル(60 L)、アセトン(30L、2回)を用いて繰り返した後、最終の沈殿をアセトン(6 L)を用いて、ろ取した。得られた結晶をロ−タリ−エバポレ−タ−で減圧乾燥後、精製水に溶かし、凍結乾燥することにより、597gのCM−Dextran−Na−7−エチル−10−[3’−(グリシル−グリシル−グリシルアミノ)プロピルオキシ]−(20S)−カンプトテシンを得た。本品のエンドトキシン値は、6.95EU/mgであった。
製造例2
カルボキシメチルデキストランポリアルコール−(1S,9S)−1−(グリシルグリシルーL−フェニルアラニルグリシルアミノ)−9−エチル−5−フルオロ−2,3−ジヒドロ−9−ヒドロキシ−4−メチル−1H,12H−ベンゾ[de]ピラノ[3‘,4’:6,7]インドリジノ[1,2−b]キノリン−10,13(9H,15H)−ジオンの製造:
(1)(1S,9S)−1−アミノ−9−エチル−5−フルオロ−2,3−ジヒドロ−9−ヒドロキシ−4−メチル−1H,12H−ベンゾ[de]ピラノ[3‘,4’:6,7]インドリジノ[1,2−b]キノリン−10,13(9H,15H)−ジオン塩酸塩 (167mg; 0.354mmol), t−ブトキシカルボニル−グリシル−グリシル−L−フェニルアラニル−グリシン (463mg; 1.06mmol) 及び 1−ヒドロキシベンゾトリアゾール・一水和物(HOBT) (143mg; 1.06mmol) のジメチルホルムアミド(DMF)溶液 (10ml) に1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド(EDC)塩酸塩 (270mg; 1.42mmol), トリエチルアミン (148μl; 1.06mmol) 及び 4−ジメチルアミノピリジン(DMAP) (5mg; 0.04mmol)を加える。 反応混合物を室温で15時間かくはんし、溶媒を減圧留去する。 残査をクロロホルムに溶解し、該溶液を洗浄、乾燥後、溶媒を減圧留去する。残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶媒;クロロホルム:メタノール=50:1〜10:1)で精製して、(1S,9S)−1−(t−ブトキシカルボニルグリシルグリシルーL−フェニルアラニルグリシルアミノ)−9−エチル−5−フルオロ−2,3−ジヒドロ−9−ヒドロキシ−4−メチル−1H,12H−ベンゾ[de]ピラノ[3‘,4’:6,7]インドリジノ[1,2−b]キノリン−10,13(9H,15H)−ジオン(228mg, Y=75%) を淡黄色固体として得る IR(Nujol) ; 3290, 1710, 1655 cm−1. ESI−MS ; 854 (M+H).
(2)(1S,9S)−1−(t−ブトキシカルボニルグリシルグリシルーL−フェニルアラニルグリシルアミノ)−9−エチル−5−フルオロ−2,3−ジヒドロ−9−ヒドロキシ−4−メチル−1H,12H−ベンゾ[de]ピラノ[3‘,4’:6,7]インドリジノ[1,2−b]キノリン−10,13(9H,15H)−ジオン(220mg; 0.258mmol)のジオキサン溶液 (4ml)に氷浴中かくはん下に4N塩化水素―ジオキサン溶液 (6ml) を加える。 混合物を室温で16時間かくはんする。反応混合物にジエチルエーテル (30ml)を加え、室温で1時間かくはんする。析出物をろ取し、乾燥して、(1S,9S)−1−(グリシルグリシルーL−フェニルアラニルグリシルアミノ)−9−エチル−5−フルオロ−2,3−ジヒドロ−9−ヒドロキシ−4−メチル−1H,12H−ベンゾ[de]ピラノ[3‘,4’:6,7]インドリジノ[1,2−b]キノリン−10,13(9H,15H)−ジオン (176mg, Y=86%)を黄色粉末として得る。 IR (Nujol); 3250, 1745, 1660, 1605, 1535 cm−1. ESI−MS; 754 (M+H).
(3)3リットル3つ首丸底フラスコに酢酸緩衝液(0.1M, pH5.5)(1000 ml)を加える。 デキストラン T−500TM (10.0 g, Amersham Pharmacia Biotech AB)を室温で少量づつ30分間かけて緩衝液に加える。かくはんを、透明な液が得られるまで(約30分)行い、その後水浴中で5℃(内温)まで冷却する。
1リットルフラスコに、過ヨウ素酸ナトリウム(33.0g)及び水(1000ml)を加え、室温でかくはんし、その後5℃に冷却する。
上記デキストラン溶液に5℃にて上記過ヨウ素酸ナトリウム溶液をかくはんしながら加え、反応温度を5日間5℃に保つとともに暗所に保存する。過剰の過ヨウ素酸ナトリウムを除去するため、エチレングリコール(10ml)加え、さらに5℃で2時間かくはんする。反応混合物を3℃に冷却し、8M水酸化ナトリウム水溶液を6℃以下となるように調節しながら滴下する(反応混合物のpHが9以上となる)。反応混合物に水素化ホウ素ナトリウム(14g)をかくはんしながら少量づつ加え、5℃で終夜かくはんする。過剰の水素化ホウ素ナトリウムを除去するために、かくはん下、3〜6℃で、酢酸を加えて反応混合物のpHを5.5以下に調節し、さらに2時間かくはんする。反応混合物を8M水酸化ナトリウム水溶液でpH7.8前後に調節する。反応混合物を水に対して透析(SpectoraTM/ Por 3 membrane, Molecule weight cutoff <3500) した後、凍結乾燥して、デキストランポリアルコール(8.34g)を無定形粉末として得る。
(4)500ml3つ首丸底フラスコに水(155ml)を加え、さらにデキストランポリアルコール(5.18g)を室温でかくはんしながら10分間かけて加える。かくはんは、透明溶液が得られるまで(10〜30分間)行う。水酸化ナトリウム (pellet, 97.0%, 21.8g)を少量づつデキストランポリアルコール溶液にかくはんしながら加える。その際、内温は、氷浴を用いて30〜40℃に保つ。 反応フラスコを水浴に浸して30℃でかくはんする。クロロ酢酸(31.1 g)を少量づつ反応混合物にかくはんしながら30〜40℃で加える。添加完了後、水浴中で30℃でかくはんを20時間続ける。反応混合物を氷浴中に冷却し、かくはんしながら酢酸を加えて中性とする(pHを9以下とする)。水(160ml)を加え、溶液を水に対して透析 (SpectoraTM/ Por3 membrane, Molecule weight cutoff <3500)し、凍結乾燥してカルボキシメチルデキストランポリアルコール(6.53g)を無定形粉末として得る。
(5)100ml1つ首丸底フラスコに水(40ml)を加え、さらにカルボキシメチルデキストランポリアルコール(1.0g)を室温でかくはんしながら5分間かけて加える。かくはんを透明な溶液が得られるまで(30分間)続ける。さらに、(1S,9S)−1−(グリシルグリシルーL−フェニルアラニルグリシルアミノ)−9−エチル−5−フルオロ−2,3−ジヒドロ−9−ヒドロキシ−4−メチル−1H,12H−ベンゾ[de]ピラノ[3‘,4’:6,7]インドリジノ[1,2−b]キノリン−10,13(9H,15H)−ジオンのジメチルホルムアミド溶液(100 mg in 10 ml)をかくはんしながら加え、ついでジメチルホルムアミド15mlを加え、さらに10分間かくはんする。2−エトキシー1−エトキシカルボニルー1,2−ジヒドロキノリン(EEDQ)のジメチルホルムアミド溶液(1.0 g in 10 ml) を室温でかくはんしながら滴下しさらに18時間かくはんする。反応混合物を3度水ろ過 (SpectoraTM/ Por 3 membrane, Molecule weight cutoff <3500) し、さらに陽イオン交換カラム(BioRad AGTM MP−50 カラム、 Na type, 30 ml)を通してで精製する。主要な画分を水に対して透析 (SpectoraTM/ Por 3 membrane, Molecule weight cutoff <3500)し、凍結乾燥して粗生成物を得る。粗生成物をアセトンで粉末化後、ろ取、乾燥して目的物(904mg)を淡黄色粉末として得る。
【0030】
【発明の効果】
本発明によれば、エンドトキシンを含む多糖類からエンドトキシンを効率的に除去することができる。
Claims (6)
- エンドトキシンを含む多糖類を、酸のアルカリ金属塩の存在下、界面活性剤で処理することを特徴とするエンドトキシン除去方法。
- 塩基性条件下で実施することを特徴とする請求項1記載のエンドトキシン除去方法。
- 酸のアルカリ金属塩の酸の種類が1種類である請求項1又は2記載のエンドトキシン除去方法。
- 多糖類それ自身が酸のアルカリ金属塩である請求項3記載のエンドトキシン除去方法。
- 界面活性剤が非イオン界面活性剤である請求項4記載のエンドトキシン除去方法。
- 一般式[II]
〔式中、R1及びR2は低級アルキル基、Eはエステル残基、Xはハロゲン原子を表す。〕
で示される化合物と一般式[III]
[式中、Bocはベンジルオキシカルボニル基を表す。]
で示される化合物とを反応させて一般式[IV]
[式中、記号は前記と同一意味を有する。]
で示される化合物とした後保護基を除去して一般式[V]
[式中、記号は前記と同一意味を有する。]
で示される化合物又はその塩を得、次いで一般式[VI]
[式中、X1はハロゲン原子を表す。]
で示される化合物と反応させて一般式[VII]
[式中、記号は前記と同一意味を有する。]
で示される化合物を得、さらに一般式[VIII]
X2−CH2CH3
[式中、X2はハロゲン原子を表す。]
で示される化合物と反応させ、得られる一般式[IX]
[式中、記号は前記と同一意味を有する。]
で示されるS型2−置換ヒドロキシ−2−インドリジニル酪酸エステル誘導体のシアノ基を還元後アルカノイル化して、一般式〔X〕
〔式中、R3は低級アルカノイル基を表し、他の記号は前記と同一意味を有する。〕
で示されるS型2−置換ヒドロキシ−2−(6−置換アミノメチルインドリジニル)酪酸エステル誘導体とした後、これをニトロソ化反応及び転移反応に付して、一般式〔XI〕
〔式中、記号は前記と同一意味を有する。〕
で示されるS型2−置換ヒドロキシ−2−(6−置換ヒドロキシメチルインドリジニル)酪酸エステル誘導体とし、該化合物を分子内閉環後または分子内閉環と同時に、アセタールをケトンに変換して一般式〔XII〕
〔式中、記号は前記と同一意味を有する。〕
で示されるS型4−置換ヒドロキシピラノインドリジン誘導体とし、さらに、一般式〔XIII〕
〔式中、R5〜R9は水素原子又は保護基を有していてもよい置換基を表す。〕
で示されるo−アシルアニリン化合物とを反応させて、一般式〔XIV〕
〔式中、記号は前記と同一意味を有する。〕
で示される20位水酸基が置換されたカンプトテシン化合物を得、この化合物を、20位水酸基の置換基除去反応に付して一般式〔I〕
〔式中、記号は前記と同一意味を有する。〕
で示されるカンプトテシン誘導体とし、さらに、アミノ酸またはペプチドと反応させ、得られた化合物のアミノ酸が保護されている場合はその保護基を除去したのち、カルボキシル基を有する多糖類と反応させ、所望により、酸のアルカリ金属塩の存在下、界面活性剤で処理してエンドトキシン除去することを特徴とする化合物[I]とカルボキシル基を有する多糖類とがアミノ酸またはペプチドを介して結合してなるカンプトテシン誘導体またはその薬理的に許容しうる塩の製法。
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