WO2018012605A1 - 癒着防止用組成物 - Google Patents

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alginic acid
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monovalent metal
sponge
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大知 伊藤
誠一 太田
典宏 國土
三津子 伊佐次
賢 清水
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持田製薬株式会社
国立大学法人東京大学
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Definitions

  • the present invention relates to an adhesion preventing material, a method for producing the same, and a sponge-like laminate.
  • Adhesion refers to a state where the surfaces of tissues that should be separated from each other are connected or fused with a fibrous tissue. Adhesion occurs when exudate containing fibrin is generated on the surface of the tissue due to trauma or inflammation, and the exudate is organized and the tissue surfaces are connected or fused. Injuries that occur on the surface of tissues during surgery, inflammation caused by the trauma, and inflammation caused by drying of the tissue surface during surgery cause adhesions.
  • Adhesion can sometimes cause infertility, bowel passage problems and chronic pelvic pain.
  • another surgical operation may be required in order to peel off the adhesion that has occurred after the surgical operation.
  • multiple operations are effective for patients with liver cancer recurrence, but the determination of whether or not re-operation is possible, the risk of treatment, the amount of bleeding at the time of surgery, the operation time, etc. It largely depends on the prevention of later adhesions. For these reasons, it is necessary to prevent adhesion, and various measures have been taken to prevent adhesion.
  • Some such means for preventing adhesions are to place a physical barrier between the site of trauma or inflammation and its adjacent tissue to prevent tissue connection or fusion.
  • a physical barrier a sheet-like one is known.
  • the sheet-like material contains a polytetrafluoroethylene (PTFE) film (Prelude (trade name) (WL Gore and Associates, Inc.)), hyaluronic acid (HA) and carboxymethyl cellulose (CMC). Sheet (Seprafilm (trade name) (Genzyme GmbH)), regenerated oxidized cellulose sheet (INTERCEED (trade name) (Johnson & Johnson)) and the like.
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • Prelude trade name
  • HA hyaluronic acid
  • CMC carboxymethyl cellulose
  • Sheet Seprafilm (trade name) (Genzyme GmbH)
  • INTERCEED regenerated oxidized cellulose sheet
  • the PTFE film is not biodegradable and has a problem of remaining in the body.
  • the sheet containing HA and CMC and the regenerated oxidized cellulose sheet are biodegradable, serious adhesion such as adhesion occurring after hepatectomy cannot be completely prevented, and there is room for improvement in terms of the effect of preventing adhesion. was there.
  • a biocompatible material selected from proteins such as collagen and polysaccharides such as carboxymethylcellulose, hyaluronic acid, and alginic acid is formed into sheets and particles, and is used as a medical absorbent, medical patch, and anti-adhesion material. It is known to be used as a biological tissue reinforcing material (Patent Documents 1 to 6).
  • an anti-adhesive material having at least one performance, such as being easy to apply via a trocar in endoscopic surgery, being able to be re-adhered after adjusting the affixing position.
  • the present inventors have developed an adhesion prevention material that combines the advantages of a film (sheet) adhesion preventive material with the advantages of a spray (liquid / gel) adhesion prevention material in an animal adhesion model that assumes various types of surgery in clinical practice.
  • a sponge-like anti-adhesive material applicable to a living body having different dissolution rates of the first layer and the second layer specifically, a low endotoxin alginic acid having a relatively high weight average molecular weight Sponge-like first layer containing a monovalent metal salt of the above and a sponge-like second layer containing a monovalent metal salt of low endotoxin alginic acid having a relatively low weight average molecular weight.
  • the present inventors have found that the anti-adhesive material including the laminate has an anti-adhesion effect not only in the surgical local adhesion prevention but also in a wide range of application areas, and has completed the present invention.
  • a monovalent metal salt of alginic acid of the first layer comprising a sponge-like first layer and a second layer of a monovalent metal salt of low endotoxin alginic acid that is at least partially crosslinked with a curing agent
  • the weight average molecular weight of 10,000 to 2,000,000, the monovalent metal salt of alginic acid of the second layer is 1,000 to 1,000,000, and the weight average molecular weight is Measured by GPC-MALS method after decrosslinking treatment, the weight average molecular weight of the monovalent metal salt of alginic acid in the first layer is higher than the weight average molecular weight of the monovalent metal salt of alginic acid in the second layer
  • An anti-adhesion material comprising a sponge-like laminate that is sterilized and applicable to a living body.
  • An anti-adhesion material comprising a sponge-like laminate having a molecular weight higher than that of the second layer and applicable to a living body.
  • the curing agent of the first layer and the second layer is at least one metal ion compound selected from the group consisting of CaCl 2 , CaSO 4 , ZnCl 2 , SrCl 2 , FeCl 3 and BaCl 2.
  • the adhesion preventing material according to any one of the above [1-1] to [1-6].
  • [1-8] The antiadhesive material according to any one of [1-1] to [1-7] above, wherein the first layer is applied toward the wound side surface.
  • the anti-adhesive material according to Item. [1-10] comprising a sponge-like laminate applicable to a living body, comprising a first layer and a second layer each containing a monovalent metal salt of low endotoxin alginic acid at least partially crosslinked with a curing agent, An adhesion preventing material in which the dissolution rate of one layer is slower than that of the second layer.
  • [1-10a] including a sponge-like laminate that can be applied to a living body including a first layer and a second layer, each of which includes a monovalent metal salt of low endotoxin alginic acid, and the dissolution rate of the first layer is Anti-adhesion material, slower than the layer of.
  • the first layer contains 25 ⁇ 10% by weight of the monovalent metal salt of alginic acid.
  • the second layer is eluted within 4 hours, and 70 ⁇ 10% by weight of the monovalent metal salt of alginic acid is eluted within 1 hour.
  • [1-13] The adhesion preventing material according to any one of the above [1-1] to [1-12], wherein the sponge-like laminate is pressed.
  • the weight average molecular weight of 10,000 to 2,000,000, the monovalent metal salt of alginic acid of the second layer is 1,000 to 1,000,000, and the weight average molecular weight is Measured by GPC-MALS method after decrosslinking treatment, the weight average molecular weight of the monovalent metal salt of alginic acid in the first layer is higher than the weight average molecular weight of the monovalent metal salt of alginic acid in the second layer
  • An anti-adhesion method comprising applying a sterilized, sponge-like laminate applicable to a living body to a subject in need of anti-adhesion, with the first layer facing the surface on the wound site side.
  • a method for preventing adhesion comprising applying a sponge-like laminate that is higher than the second layer and applicable to a living body to a subject that requires prevention of adhesion.
  • the adhesion prevention method according to any one of the above [2-1] to [2-6].
  • An anti-adhesion method comprising applying a slower sponge-like laminate applicable to a living body to a subject that requires anti-adhesion.
  • a sponge applicable to a living body comprising a first layer and a second layer each containing a monovalent metal salt of low endotoxin alginic acid, wherein the dissolution rate of the first layer is slower than that of the second layer
  • a method for preventing adhesion comprising applying a laminate to a subject in need of adhesion prevention.
  • the elution amount of the monovalent metal salt of alginic acid in the second layer is 100%.
  • the ratio of the dissolution amount of the monovalent metal salt of alginic acid in the first layer is less than 50% at 1 hour from the start of measurement and less than 70% at 2 hours [2-9a] anti-adhesion material.
  • the first layer contains 25 ⁇ 10% by weight of the monovalent metal salt of alginic acid.
  • the second layer is eluted within 4 hours, and 70 ⁇ 10% by weight of the monovalent metal salt of alginic acid is eluted within 1 hour.
  • a method for producing an adhesion preventing material including a sponge-like laminate applicable to a living body including the following steps. (1) a step of curing a monovalent metal salt of low endotoxin alginic acid having a weight average molecular weight of 10,000 to 2,000,000 with a curing agent; (2) freezing the cured monovalent metal salt of alginic acid, (3) On the monovalent metal salt of alginic acid obtained in (2), a monovalent metal salt of low endotoxin alginic acid having a weight average molecular weight of 1,000 to 1,000,000 is cured with a curing agent, and a laminate.
  • the sponge-like laminate comprises a sponge-like first layer containing a monovalent metal salt of low endotoxin alginic acid having a weight average molecular weight of 10,000 to 2,000,000, and a weight average molecular weight of 1,000 to 1,000,000. And a sponge-like second layer containing a monovalent metal salt of low endotoxin alginic acid of 000, and the weight average molecular weight of the monovalent metal salt of alginic acid of the first layer is higher than that of the second layer.
  • a sponge-like laminate applicable to a living body obtained by the following steps (1) to (4).
  • (1) a step of curing a monovalent metal salt of low endotoxin alginic acid having a weight average molecular weight of 10,000 to 2,000,000 with a curing agent; (2) freezing the cured monovalent metal salt of alginic acid, (3) On the monovalent metal salt of alginic acid obtained in (2), a monovalent metal salt of low endotoxin alginic acid having a weight average molecular weight of 1,000 to 1,000,000 is cured with a curing agent, and a laminate.
  • the sponge-like laminate comprises a sponge-like first layer containing a monovalent metal salt of low endotoxin alginic acid having a weight average molecular weight of 10,000 to 2,000,000, and a weight average molecular weight of 1,000 to 1,000,000. And a sponge-like second layer containing a monovalent metal salt of low endotoxin alginic acid of 000, and the weight average molecular weight of the monovalent metal salt of alginic acid of the first layer is higher than that of the second layer.
  • [4-2] The sponge-like laminate according to [4-1], which is used as an adhesion preventing material.
  • [4-3] The sponge-like laminate according to the above [4-1] or [4-2], wherein the sponge-like laminate is sterilized by electron beam and / or ⁇ irradiation with an absorbed dose of 10 kGy to 150 kGy. Laminated body.
  • [4-4] The sponge-like laminate according to any one of [4-1] to [4-3], further including a step of pressing the laminate obtained in (4).
  • [5-1] A first raw material containing a monovalent metal salt of low endotoxin alginic acid having a weight average molecular weight of 10,000 to 2,000,000, and a low endotoxin alginic acid having a weight average molecular weight of 1,000 to 1,000,000 And a second raw material containing the monovalent metal salt, wherein the first raw material has a weight average molecular weight higher than that of the second raw material, and is a combination of raw materials for producing an adhesion preventing material.
  • a combination of raw materials according to the above [5-1] which is used for producing a sponge-like laminate.
  • the adhesion prevention effect is high, both wound adhesion and de novo adhesion can be suppressed, the applied living body is not adversely affected, wound healing is not hindered, intestinal anastomosis, etc. It is possible to provide an anti-adhesive material having at least one performance that can be used, is easy to apply through a trocar in endoscopic surgery, can be re-adjusted by adjusting the affixing position, and the like.
  • Adhesion refers to a condition in which the surfaces of tissues that should be separated from each other are connected or fused with a fibrous tissue.
  • causes of adhesion include trauma that can occur on the surface of a tissue during surgery, inflammation caused by the trauma, inflammation due to dry tissue surface during surgery, and the like. With these trauma and inflammation, exudate containing fibrin is generated on the surface of the tissue, and this exudate becomes organized and the tissue surface is connected or fused to form an adhesion.
  • Anti-adhesion refers to reducing the formation of adhesions.
  • the prevention of adhesion does not necessarily require completely preventing the formation of adhesion, and it is only necessary that the formation of adhesion is prevented as compared with the case where the adhesion preventing material of the present invention is not applied. That is, “adhesion prevention” may be rephrased as adhesion reduction. For example, it is sufficient that at least one selected from the frequency, range, and degree of adhesion is reduced.
  • Anti-adhesion means, for example, that when the adhesion grade evaluation described in the Examples is performed, the average adhesion grade is lower than the average adhesion grade when the adhesion prevention material of the present invention is not applied. It only needs to be lower.
  • “adhesion prevention” refers to, for example, when the extent evaluation of adhesion described in the examples is performed, compared to the extent of average adhesion when the adhesion prevention material of the present invention is not applied, the average adhesion It is sufficient that the extent is lower.
  • “Anti-adhesion” is preferably prevention of adhesions resulting from surgery, more preferably peritoneal adhesions resulting from surgery. That is, “adhesion prevention” is preferably prevention of postoperative adhesion.
  • the present invention relates to a low endotoxin having a relatively high weight average molecular weight, comprising a sponge-like first layer and a second layer of a monovalent metal salt of low endotoxin alginic acid at least partially crosslinked with a curing agent.
  • Sponge-like first layer containing a monovalent metal salt of alginic acid and a sponge-like second layer containing a monovalent metal salt of low endotoxin alginic acid having a relatively low weight average molecular weight.
  • An anti-adhesion material (hereinafter sometimes referred to as “adhesion prevention material A”) including a laminate is provided.
  • the weight average molecular weights of the monovalent metal salts of low endotoxin alginic acid used in the first layer and the second layer are, for example, 10,000 to 2,000,000 and 1,000 to 1,000,000, respectively. is there. Such a weight average molecular weight is measured by a GPC-MALS method after dissolving in a decrosslinking treatment, for example, a chelating agent solution.
  • a GPC-MALS method after dissolving in a decrosslinking treatment, for example, a chelating agent solution.
  • ⁇ when the symbol “ ⁇ ” is used in a numerical range, it means “more than the lower limit value and less than the upper limit value”, and the numerical values at both ends of the symbol are included in the range.
  • the adhesion preventing material A contains monovalent metal salts of low endotoxin alginic acid having different molecular weights in the first layer and the second layer of the sponge-like laminate. Specifically, the weight average molecular weight of the monovalent metal salt of alginic acid in the first layer is higher than that in the second layer.
  • the layer containing the monovalent metal salt of alginic acid has a low dissolution rate if the weight average molecular weight of the monovalent metal salt of alginic acid is large, whereas the dissolution rate is high if the weight average molecular weight is small.
  • the adhesion preventing material A of the present invention with the first layer facing the wound part and the second layer facing the abdominal cavity side, the first layer remains in the wound part and the second layer This layer can be expected to dissolve relatively quickly and suppress adhesion within the abdominal cavity.
  • the present invention also includes a sponge-like laminate that can be applied to a living body and includes a first layer and a second layer each containing a monovalent metal salt of low endotoxin alginic acid that is at least partially crosslinked with a curing agent,
  • An anti-adhesion material (“adhesion prevention material B”) in which the dissolution rates of the first layer and the second layer are different is provided.
  • the dissolution rate of the first layer is slower than that of the second layer.
  • the weight average molecular weight of the monovalent metal salt of alginic acid of the first layer as in the adhesion prevention material A is set.
  • the degree of cross-linking of the monovalent metal salt of alginic acid in the first layer can be increased by changing the type of the cross-linking agent, changing the concentration of the cross-linking agent, or the like. Higher than that.
  • the anti-adhesion material B has a first dissolution when the elution amount of the monovalent metal salt of alginic acid in the second layer is 100% in the dissolution test using elution of the monovalent metal salt of alginic acid as an index.
  • the ratio of the elution amount of the monovalent metal salt of alginic acid in the layer is less than 50% at 1 hour from the start of measurement and less than 70% at 2 hours.
  • the adhesion preventing material B is a dissolution test using elution of a monovalent metal salt of alginic acid as an index, and the first layer contains 25 ⁇ 10% by weight of the monovalent metal salt of alginic acid within 1 hour.
  • 70 ⁇ 10% by weight of the monovalent metal salt of alginic acid is eluted within 1 hour, and 90 ⁇ 10% by weight. % Elute within 4 hours.
  • the dissolution test is as described in Examples below.
  • “adhesion prevention material A” and “adhesion prevention material B” may be collectively referred to as “adhesion prevention material”.
  • the “first layer” is a lower layer when the sponge-like laminate is applied to a target, that is, a layer in contact with the surface of the tissue to be applied.
  • the “second layer” is a layer that becomes an upper layer when the sponge-like laminate is applied to the object, that is, a layer that does not come into contact with the surface of the tissue to be applied.
  • “Applicable to a living body” means that it can be placed on the surface of a tissue to be applied as a medical material.
  • the sponge-like laminate applicable to a living body used as an adhesion preventing material may have a third layer containing an optional component in addition to the first layer and the second layer. And may have a multilayer structure. Further, a sponge-like laminate having a structure in which each layer does not have a clear boundary surface and the molecular weight gradually increases or decreases continuously is included.
  • the adhesion preventing material 1 includes a sponge-like laminate 4 including a first layer 2 and a second layer 3.
  • the first layer 2 and the second layer 3 are each sponge-like.
  • “Sponge-like” means a state having porosity.
  • the shape of the sponge-like laminate that can be applied to a living body is not particularly limited, and can be appropriately selected in consideration of the range, shape, unevenness, etc. of the surface to be applied.
  • the shape of the sponge-like laminate may be, for example, a flat plate shape as shown in FIG. 1, or may be a disc shape, a cylindrical shape, a rectangular parallelepiped shape, or the like. A flat plate shape or a disk shape is preferable.
  • the adhesion preventing material can be further cut and applied to the surface in accordance with the range, shape, unevenness, etc. of the surface to be applied, so the size of the flat plate or the disc is not particularly limited.
  • the length of the length and width is not particularly limited, and the height (thickness) is preferably 0.2 mm to 30 mm. More preferably 0.3 mm to 15 mm, and still more preferably 0.5 mm to 10 mm. More preferably, in addition to such height (thickness), the vertical and horizontal lengths are 1 mm to 300 mm ⁇ 1 mm to 300 mm, respectively, particularly preferably 3 mm to 200 mm ⁇ 3 mm to 200 mm, More preferably, it is 5 mm to 150 mm ⁇ 5 mm to 150 mm. Note that the thickness may not be uniform, and an inclined structure in which one is thick and the other is thin may be used.
  • the sponge-like laminate of the adhesion-preventing material of the present invention has a high flexibility and is difficult to break compared to Seprafilm (trade name).
  • the sponge-like laminate is pressed. “Press” is as described later.
  • its height (thickness) is preferably 0.02 mm to 3 mm, more preferably 0.03 mm to 1.5 mm, still more preferably 0.05 mm to 1 mm.
  • the vertical and horizontal lengths are 1 mm to 300 mm ⁇ 1 mm to 300 mm, respectively, particularly preferably 3 mm to 200 mm ⁇ 3 mm to 200 mm, More preferably, it is 5 mm to 150 mm ⁇ 5 mm to 150 mm.
  • the thickness after pressing is uniform.
  • Monovalent metal salt of alginic acid is a water-soluble substance formed by ion exchange of the hydrogen atom of the 6-position carboxylic acid of alginic acid with monovalent metal ions such as Na + and K + . It is salt.
  • Specific examples of the monovalent metal salt of alginic acid include sodium alginate and potassium alginate. In particular, sodium alginate that is commercially available is preferable.
  • a solution of a monovalent metal salt of alginic acid forms a gel when mixed with a curing agent.
  • Alginic acid used in the present invention is a biodegradable polymer polysaccharide, a polymer in which two types of uronic acids, D-mannuronic acid (M) and L-guluronic acid (G), are polymerized in a straight chain. It is. More specifically, D-mannuronic acid homopolymer fraction (MM fraction), L-guluronic acid homopolymer fraction (GG fraction), and D-mannuronic acid and L-guluronic acid are randomly arranged. This is a block copolymer in which the fractions (MG fraction) are bound arbitrarily.
  • the composition ratio (M / G ratio) of D-mannuronic acid and L-guluronic acid of alginic acid varies depending on the type of organism mainly derived from seaweed, etc. It ranges from a high G type with an M / G ratio of about 0.4 to a high M type with an M / G ratio of about 5.
  • monovalent metal salts of alginic acid are high molecular polysaccharides, and it is difficult to accurately determine the molecular weight, and in measuring the molecular weight of a high molecular weight substance derived from a natural product, the value may vary depending on the measurement method. ing.
  • the absolute weight average molecular weight can be measured.
  • the weight average molecular weight of the monovalent metal salt of alginic acid used as a raw material measured by the GPC-MALS method is, for example, 10,000 to 2,000,000 in the first layer of the sponge-like laminate, preferably 15,000 to 1,500,000, more preferably 20,000 to 1,000,000, and particularly preferably 25,000 to 500,000.
  • the weight average molecular weight measured by the GPC-MALS method is, for example, 1,000 to 1,000,000 in the second layer, preferably 1 000 to 500,000, more preferably 2,000 to 250,000, and particularly preferably 3,000 to 100,000.
  • the weight average molecular weight measured by GPC-MALS method is, for example, 10,000-10,000 for the first layer of the sponge-like laminate. 300,000, preferably 10,000 to 200,000, more preferably 10,000 to 100,000, and particularly preferably 10,000 to 80,000.
  • the weight average molecular weight measured by the GPC-MALS method is, for example, 1,000 to 100,000, preferably 1,000, for the second layer. -80,000, more preferably 2,000-60,000, particularly preferably 3,000-60,000.
  • the weight average molecular weight as a monovalent metal salt of non-crosslinked alginic acid is measured by GPC-MALS method after any decrosslinking treatment. Can be measured.
  • the decrosslinking treatment include dissolution in an arbitrary chelating agent, for example, a chelating agent solution such as EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) or phytic acid. EDTA is preferred as the chelating agent used.
  • the weight average molecular weight of the monovalent metal salt of alginic acid in the first layer of the sponge-like laminate is higher than that in the second layer.
  • the weight average molecular weight of the raw material of the sponge-like laminate or the monovalent metal salt of alginic acid in the first layer contained in the sponge-like laminate is, for example, 1,000 to 1,000,000 higher than that of the second layer. , Preferably 2,000 to 500,000 higher, more preferably 3,000 to 300,000 higher.
  • the molecular weight of the high molecular polysaccharide is calculated by the above-described method, a measurement error of 10 to 20% by weight can be caused. For example, 10,000 is 8,000 to 12,000, 100,000 is 80,000 to 120,000, 200,000 is 160,000 to 240,000, 400,000 If it is 320,000 to 480,000, 500,000, the value may vary in the range of about 400,000 to 600,000.
  • the molecular weight of alginic acids can be measured according to a conventional method. Typical conditions when GPC-MALS is used for molecular weight measurement are as described in Example 1 of this specification.
  • the detector for example, an RI detector and a light scattering detector (MALS) can be used.
  • Alginic acids generally have a large molecular weight when initially extracted from brown algae, but the molecular weight gradually decreases in the course of drying and purification by heat.
  • Alginic acids having different molecular weights can be produced by techniques such as temperature control in the production process, selection of brown algae as a raw material, and molecular weight fractionation in the production process. Furthermore, it is possible to obtain alginic acids having a target molecular weight by mixing with alginic acids of different lots having different molecular weights.
  • the monovalent metal salt of alginic acid used in the present invention has been treated with a low endotoxin.
  • the low endotoxin treatment can be performed by a known method or a method analogous thereto.
  • the method of Takada et al. See, for example, JP-A-9-32001
  • the method of Yoshida et al. Eg, JP-A-8-269102
  • the low endotoxin treatment of the present invention is not limited thereto, but is washed, filtered with a filter (such as an endotoxin removal filter or a charged filter), ultrafiltration, a column (an endotoxin adsorption affinity column, a gel filtration column, a column with an ion exchange resin, etc.) ), Adsorption to hydrophobic substances, resin or activated carbon, organic solvent treatment (extraction with organic solvent, precipitation / precipitation by addition of organic solvent, etc.), surfactant treatment (for example, JP-A-2005-036036) It can be carried out by a known method such as a gazette) or a combination thereof. These processing steps may be appropriately combined with known methods such as centrifugation. It is desirable to select appropriately according to the type of alginic acid.
  • a filter such as an endotoxin removal filter or a charged filter
  • ultrafiltration such as an endotoxin removal filter or a charged filter
  • a column an endotoxin
  • the endotoxin level can be confirmed by a known method, and can be measured by, for example, a method using Limulus reagent (LAL), a method using Endspecy (registered trademark) ES-24S set (Seikagaku Corporation), or the like. .
  • LAL Limulus reagent
  • Endspecy registered trademark
  • ES-24S set Seikagaku Corporation
  • the endotoxin treatment method of the monovalent metal salt of alginic acid used in the present invention is not particularly limited.
  • LAL Limulus reagent
  • It is preferably 500 endotoxin units (EU) / g or less, more preferably 100 EU / g or less, particularly preferably 50 EU / g or less, and particularly preferably 30 EU / g or less.
  • Low endotoxin-treated sodium alginate can be obtained from commercially available products such as Sea Matrix (registered trademark) (Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.), PRONOVA TM UP LVG (FMCBioPolymer), and the like.
  • the amount of the monovalent metal salt of alginic acid used in the sponge-like laminate can be appropriately selected in consideration of the adhesion preventing effect.
  • the amount of monovalent metal salt of alginic acid, the sum of the first and second layers of sponge-like laminate for example, 0.1mg / cm 2 ⁇ 10.0mg / cm 2 and the like, preferably 0.1 mg / cm 2 to 3.0 mg / cm 2 , more preferably 0.5 mg / cm 2 to 2.5 mg / cm 2 , and still more preferably 1.8 mg / cm 2 to 2. 2 mg / cm 2 , particularly preferably 2.0 mg / cm 2 .
  • the ratio (weight ratio) of the monovalent metal salt of alginic acid used in the first layer and the second layer is preferably 1:20 to 20: 1, more preferably 1: 5 to 5: 1, more preferably 1: 3 to 3: 1 and particularly preferably 1: 2 to 2: 1.
  • either one of the first layer and the second layer may contain a curing agent (that is, either one of the first layer and the second layer does not contain a curing agent). Or both the first layer and the second layer may contain a curing agent. Alternatively, in the adhesion preventing material, neither the first layer nor the second layer may contain a curing agent.
  • the first layer and the second layer are at least partially crosslinked with a curing agent.
  • the curing agent include divalent or higher metal ion compounds such as Ca 2+ , Mg 2+ , Ba 2+ , Sr 2+ , Zn 2+ , and Fe 3+, and crosslinkable reagents having 2 to 4 amino groups in the molecule. Can be mentioned. More specifically, as a metal ion compound having a valence of 2 or more, CaCl 2 , MgCl 2 , CaSO 4 , ZnCl 2 , FeCl 3 , BaCl 2 , SrCl 2, etc.
  • a crosslinkable reagent having 2 to 4 amino groups in the molecule, a lysyl group (—COCH (NH 2 ) — (CH 2 ) 4 on the nitrogen atom
  • Diaminoalkanes that may have —NH 2
  • diaminoalkanes and derivatives in which the amino group is substituted with a lysyl group to form a lysylamino group specifically include diaminoethane, diaminopropane, N— (Lysyl) -diaminoethane and the like can be mentioned.
  • the amount of the curing agent used in the first layer and the second layer is appropriately adjusted according to the amount of monovalent metal salt of alginic acid and the molecular weight.
  • the amount of the curing agent used in the first layer is, for example, 0.1 ⁇ mol / cm 2 to 100 ⁇ mol / cm 2 , preferably 0.5 ⁇ mol / cm 2 to 2.0 ⁇ mol / cm. 2 .
  • the amount of the curing agent used in the second layer is, for example, 0.1 ⁇ mol / cm 2 to 10 ⁇ mol / cm 2 , preferably 0.6 ⁇ mol / cm 2 to 2.4 ⁇ mol / cm. 2 .
  • An adhesion prevention material including a bio-applicable sponge-like laminate and a bio-applicable sponge-like laminate can be produced, for example, through the following steps.
  • (1) a step of curing a monovalent metal salt of low endotoxin alginic acid having a weight average molecular weight of 10,000 to 2,000,000 with a curing agent; (2) freezing the cured monovalent metal salt of alginic acid, (3) On the monovalent metal salt of alginic acid obtained in (2), a monovalent metal salt of low endotoxin alginic acid having a weight average molecular weight of 1,000 to 1,000,000 is cured with a curing agent, and a laminate. Obtaining a step, (4) A step of freeze-drying the obtained laminate to obtain a sponge-like laminate.
  • first alginate a solution of a monovalent metal salt of a low endotoxin alginic acid having a weight average molecular weight of 10,000 to 2,000,000 (hereinafter referred to as “first alginate”) and a curing agent solution are prepared.
  • first alginate solution and the curing agent solution can be prepared by a known method or a method analogous thereto.
  • the solvent is not particularly limited as long as it is a solvent applicable to a living body, but is preferably an aqueous solvent, for example, purified water, pure water (for example, distilled water, ion-exchanged water), milli-Q water, physiological saline, Phosphate buffered saline, DMSO, etc., more preferably pure water. These are preferably sterilized and preferably treated with a low endotoxin.
  • an aqueous solvent for example, purified water, pure water (for example, distilled water, ion-exchanged water), milli-Q water, physiological saline, Phosphate buffered saline, DMSO, etc., more preferably pure water.
  • the first alginate can be cured by mixing the first alginate solution and the curing agent solution.
  • the first alginate hardened in the step (1) is frozen by a conventional method.
  • the mixing ratio of the first layer and the second layer can be reduced.
  • the freezing temperature and time are, for example, ⁇ 20 ° C. for 4 hours.
  • step (3) first, a solution of a monovalent metal salt of low endotoxin alginic acid (hereinafter referred to as “second alginate”) having a weight average molecular weight of 1,000 to 1,000,000 and a solution of a curing agent are prepared.
  • the solution of the second alginate and the solution of the curing agent can be prepared by a known method or a method analogous thereto.
  • the solvent is the same as that described in the above step (1).
  • the second alginate can be cured by mixing the second alginate solution and the curing agent solution.
  • the hardened second alginate may be frozen before the step (4).
  • the freezing temperature and time are, for example, ⁇ 20 ° C. for 4 hours.
  • step (4) above the laminate obtained in step (3) is freeze-dried to obtain a sponge-like laminate.
  • Freeze-drying can be performed by a known method. Freeze-drying conditions can be adjusted as appropriate, and a primary drying step, a secondary drying step, and the like may be provided.
  • a first layer of alginate containing a first alginate and a curing agent, a second layer of a sponge containing a second alginate and a curing agent, and alginate of the first layer A sponge-like laminate having a higher weight average molecular weight than that of the second layer can be obtained, and an adhesion preventing material containing the sponge-like laminate can be obtained.
  • a sponge-like first layer containing a first alginate and a curing agent is prepared, and a sponge-like second layer containing a second alginate and a curing agent is formed thereon.
  • the second layer may be formed, and the first layer may be formed thereon.
  • the sponge-like laminate can be produced through the following steps, for example. (1 ′) curing the second alginate with a curing agent; (2 ′) freezing the cured second alginate; (3 ′) a step of obtaining a laminate by curing the first alginate with a curing agent on the second alginate obtained in (2 ′); (4 ′) A step of freeze-drying the obtained laminate to obtain a sponge-like laminate.
  • the specific description of each process is the same as that of the said method.
  • the first alginate is cured and freeze-dried to produce a sponge-like first layer
  • the second alginate is cured and freeze-dried separately to form a sponge-like second layer. It is also possible to obtain a sponge-like laminate by pasting together the obtained sponge-like layers. The specific description of each process is the same as that of the said method.
  • a desired size can be obtained by using a container, mold, substrate, porous membrane, nonwoven fabric, woven fabric or the like having a desired size, height and shape.
  • An anti-adhesion material including a sponge-like laminate having a height and shape can be obtained.
  • the sponge-like laminate of the adhesion preventing material is further sterilized.
  • Sterilization includes, but is not limited to, ⁇ -ray sterilization, electron beam sterilization, ethylene oxide gas sterilization, ethanol sterilization, and the like.
  • the anti-adhesion material is sterilized by electron beam and / or ⁇ -ray irradiation. By irradiating the polymer material with ⁇ rays, electron beams or the like, it is preferable to obtain a biomaterial with high biocompatibility with controlled storage in vivo (see, for example, JP 2000-237294 A). .
  • Examples of irradiation conditions for electron beam and / or ⁇ -ray sterilization include an absorbed dose of 10 kGy to 150 kGy, more preferably 20 kGy to 100 kGy, and still more preferably 40 kGy to 80 kGy.
  • the absorbed dose is 20 kGy to 80 kGy, 20 kGy to 60 kGy, 40 kGy to 60 kGy, and the like.
  • Electron beam sterilization is preferred over gamma ray sterilization.
  • the method further includes a step of pressing the laminated body obtained in the above step (4) or the like.
  • the pressing is performed manually or by sandwiching the laminate with a press and pressurizing.
  • generally used processes such as compression and thinning are also included in the press referred to in the present invention.
  • the pressing pressure include 1 kPa to 100 MPa, more preferably 10 kPa to 80 MPa, and still more preferably 100 kPa to 60 MPa.
  • the manual pressing is performed through a material that can be pressed by hand so as to uniformly apply pressure to the laminate, for example, an acrylic ruler, an acrylic plate, a glass plate, a metal plate, or the like.
  • a press machine to be used for example, a hot press machine (AH-1T manufactured by As One Co., Ltd.) can be cited.
  • the anti-adhesion material is used by applying it to a subject in need of anti-adhesion.
  • the anti-adhesion material is usually absorbed and decomposed after staying at the application site for about one week necessary for exhibiting the anti-adhesion effect, and finally is not metabolized or excreted in about one to two months. Excellent safety.
  • the anti-adhesion material may be applied to the surface of a wound part, for example, the surface of a tissue related to surgery.
  • tissue related to surgery refers to tissue that has been traumatically damaged during surgery, or tissue that is inflamed or may be inflamed due to dryness of the surface during surgery.
  • the tissue associated with the surgery is preferably an organ wrapped in the peritoneum (eg, stomach, jejunum, ileum, appendix, colon, liver, spleen, duodenum, and pancreas).
  • the adhesion preventing material according to a preferred embodiment of the present invention can effectively prevent serious adhesion such as adhesion occurring after hepatectomy.
  • “apply” means that an adhesion preventing material is placed on the surface of a wound part (for example, the surface of a tissue related to a surgical operation).
  • the surface of the first layer of the sponge-like laminate is in contact with the surface on the wound part side (for example, the surface of the tissue), and the surface of the second layer is the surface on the wound part side (for example, the surface of the tissue)
  • the anti-adhesive material is placed on the wound side surface (for example, the surface of the tissue related to the surgical operation) so as to face the opposite side (for example, the abdominal side).
  • the first layer of the sponge-like laminate Since the first layer of the sponge-like laminate has a relatively high weight average molecular weight, it remains undegraded on the surface of the tissue for a time sufficient to prevent adhesion and acts as a physical barrier to the wound surface. On the other hand, since the second layer of the sponge-like laminate has a relatively low weight average molecular weight, it quickly melts and spreads, and plays a role in preventing adhesion on the non-wound surface.
  • the sponge-like laminate of anti-adhesion material has higher flexibility and is hard to break compared to Seprafilm (trade name).
  • the anti-adhesion material is not defined on the surface of the tissue to be applied, and can be used by being wrapped around the intestinal tract, for example, during an intestinal anastomosis.
  • the surgical instrument can be easily inserted from a passage through which the surgical instrument is taken in and out of the subject during a surgical operation using an endoscope.
  • the adhesion preventing material can be reapplied.
  • the sponge laminate of the anti-adhesive material has a broad range of anti-adhesion targets as compared to INTERCEED (trade name).
  • an anti-adhesion material having an appropriate size is prepared according to the range, shape, unevenness, etc. of the surface to be applied, and is applied to the surface of the tissue related to the surgical operation to be prevented from adhesion.
  • a “subject” is a human or non-human organism, such as avian and non-human mammals (eg, cows, monkeys, cats, mice, rats, guinea pigs, hamsters, pigs, dogs, rabbits, sheep, and horses). is there.
  • the sponge laminate of the anti-adhesive material especially the sponge laminate
  • the anti-adhesive material is relatively applied to the affected area via a trocar or the like. Can be easily applied.
  • the anti-adhesive material applied to the affected area preferably absorbs moisture present in the affected area or moisture applied to the affected area to recover the thickness.
  • the anti-adhesion material can be used safely on the subject, similar to Seprafilm (trade name) and INTERCEED (trade name).
  • stitching of the anti-adhesive material and the surgical-related tissue surface is usually not necessary, but if necessary, the anti-adhesive material and surgical-related tissue The surface may be sutured.
  • an adhesion prevention method comprising applying a sponge-like laminate to a subject in need of adhesion prevention.
  • a specific method is as described above.
  • a sponge-like laminate for preventing adhesion is provided.
  • the specific sponge-like laminate is as described above.
  • Concomitant drugs Before, simultaneously with, or after applying the anti-adhesion material of the present invention to a tissue related to surgery, antibiotics such as streptomycin, penicillin, tobramycin, amikacin, gentamicin, neomycin, and amphotericin B, aspirin, Concomitant drugs such as non-steroidal antipyretic analgesics (NSAIDs) and anti-inflammatory drugs such as acetaminophen may be administered. These agents may be used by being mixed in the adhesion preventing material of the present invention.
  • antibiotics such as streptomycin, penicillin, tobramycin, amikacin, gentamicin, neomycin, and amphotericin B, aspirin
  • Concomitant drugs such as non-steroidal antipyretic analgesics (NSAIDs) and anti-inflammatory drugs such as acetaminophen may be administered. These agents may be used by being mixed in the adhesion preventing material of the present invention.
  • the sponge-like laminate is porous and has a water-absorbing power, for example, compared with nonporous Seprafilm (trade name), it is easy to carry a drug by adjustment at the time of use.
  • a drug solution in a sponge By impregnating and administering a drug solution in a sponge, adhesion prevention and local sustained release of the drug can be achieved simultaneously in the abdominal cavity, thoracic cavity, heart chamber and the like. Furthermore, by loading the drug in layers having different dissolution rates, it becomes possible to release the drug at a high sustained release rate and a slow sustained release rate.
  • Each reagent used for the preparation of the alginate laminated sponge is as follows.
  • Low endotoxin sodium alginate was obtained from Mochida Pharmaceutical. -AL10: (Lot NO. 5K12202), endotoxin amount 4 EU / g.
  • AL500 (Lot NO. BL150713-500), endotoxin amount 19 EU / g.
  • Calcium chloride was obtained from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (product code: 036-00485).
  • Preparation procedure (1) Preparation of solution AL500 was dissolved in pure water at a concentration of 1.0 wt% to prepare an AL500 solution. Similarly, AL10 was dissolved in pure water at a concentration of 1.0 wt% to prepare an AL10 solution. Further, calcium chloride was dissolved in pure water to prepare 10 mM and 15 mM calcium chloride aqueous solutions, respectively.
  • the target alginate laminated sponge includes a sponge-like lower layer (ie, first layer) containing AL500 and calcium chloride, and a sponge-like upper layer (ie, second layer) containing AL10 and calcium chloride.
  • the total amount of sodium alginate used in the upper and lower layers was about 2.0 mg / cm 2 .
  • the ratio (weight ratio) of the usage-amount in the upper layer and lower layer of sodium alginate was 1: 1.
  • the amount of calcium chloride, the upper layer is about 1.0 [mu] mol / cm 2, at the lower, it was about 1.5 ⁇ mol / cm 2.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • Example 3 and Examples 3-2 and 4 described later the laminated sponge obtained was sterilized by electron beam (20 kGy).
  • a non-sterile one was used as the laminated sponge.
  • Example 1-2 Preparation of Alginate Stacked Sponge (1) Preparation of Sponge Using alginic acid described in [Reagent] below, using AL100 or AL500 as a lower layer material and AL10 or AL20 as an upper layer material In accordance with the method described in Example 1, each alginate laminated sponge was produced by a combination of AL10 (upper layer) -AL100 (lower layer), AL20 (upper layer) -AL100 (lower layer), AL20 (upper layer) -AL500 (lower layer). .
  • Example 2 Measurement of Dissolution Rate of Each Layer of Alginic Acid Laminated Sponge Laminated sponges in which the upper layer or the lower layer was fluorescently modified were prepared, and the dissolution rate was measured. A specific method is shown below.
  • As the fluorescent labeling reagent FTSC (Fluorescein-5-Thiochemicalcarbazide) was used, and alginic acid was labeled by a conventional method.
  • a laminated sponge was produced in accordance with the method described in Example 1 using fluorescently labeled alginic acid.
  • Low endotoxin sodium alginate is as described in Example 1.
  • Phosphate buffer solutions are sodium dihydrogen phosphate (Wako Pure Chemicals, 197-09705 (trade name)), potassium dihydrogen phosphate (Wako Pure Chemicals, 166-04255 (trade name)), sodium chloride (Japanese Kojun Pure Chemical Industries, 191-01665 (trade name)) and potassium chloride (Wako Pure Chemical Industries, 166-17945 (trade name)) were used.
  • Sodium ethylenediaminetetraacetate (N001) was purchased from Dojindo.
  • Diameter 8mm biopsy trepan (Kai medical BP-80F (trade name)) 96-well black microplate (Nunc 137101 (trade name)) Fluorescent plate reader (Perkin Elmer ARVO X3 (trade name))
  • the fluorescence-modified laminated sponge was punched with a biopsy trepan (Kai medical BP-60F (trade name)) having a diameter of 8 mm. This was immersed in 10 mL of 150 mM phosphate buffer (pH 7.5), and 200 ⁇ L of the immersion solution was collected at regular intervals. The collected solution was transferred to a 96-well plate, and the amount of dissolved alginic acid was quantified by measuring the fluorescence intensity with a fluorescence plate reader.
  • the ratio of the elution amount of the monovalent metal salt of the lower layer alginic acid is 36% (less than 50%) at one hour from the start of measurement. ) 55% (less than 70%) at 2 hours.
  • the dissolution rate of the upper layer was faster than that of the lower layer.
  • Example 1-2 Each of the laminated sponges prepared in Example 1-2 (AL10 (upper layer) -AL100 (lower layer); AL20 (upper layer) -AL100 (lower layer); AL20 (upper layer) -AL500 (lower layer)) was dissolved in the same manner. As a result of measuring the speed, the same dissolution behavior as that of the laminated sponge (AL10 (upper layer) -AL500 (lower layer)) produced in Example 1 was shown.
  • Example 3 Rat partial hepatectomy model
  • the rat partial hepatectomy model was used to evaluate the formation of adhesions.
  • the rat partial hepatectomy model is a model capable of reproducibly observing the formation of adhesions that cause severe inflammation and have high strength (Shimizu A et al., (2014) Surg Today. (44): 314-314. 323). Specifically, the formation of adhesions was evaluated as follows.
  • Seprafilm (trade name) is a sheet-like material obtained by mixing carboxymethylcellulose (CMC) and hyaluronic acid, and was obtained from Genzyme GmbH.
  • Interlaced (trade name) is a regenerated oxidized cellulose sheet and was obtained from Johnson & Johnson.
  • 500-10 laminated sponge group (n 8): The alginate sponge produced in Example 1 was applied as an adhesion preventing material.
  • Seprafilm group (n 8): 2 ⁇ 3 cm of Seprafilm was applied as an adhesion prevention material.
  • Interleaved group (n 8): 2 ⁇ 3 cm of Interceed was applied as an anti-adhesion material.
  • Rats were anesthetized by intraperitoneal administration equivalent to 35 mg / kg pentobarbital, and the body weight was measured with an electronic balance. The rats were then laparotomized with a midline incision. Next, the abdominal wall was pinched with tweezers and lifted to cut the abdominal wall. As a preparation prior to performing a hepatectomy, a left lateral lobe was drawn from the back of the abdominal cavity and a gauze was laid under it. Next, we moved on to actual hepatectomy. Specifically, a ruler was applied to the liver, a position where the separation cross-section was 3 cm was searched, and both ends were cauterized by bipolar and marked. A straight line was cut between the marked two points.
  • the abdomen was immediately closed and the treatment was terminated.
  • the anti-adhesive material was applied after removing the gauze.
  • the abdominal wall and skin were sutured twice and closed.
  • a biodegradable thread was used for suturing the abdominal wall, and a non-absorbable thread was used for suturing the skin.
  • the rats were euthanized by overdosing with about 2 mL of pentobarbital as an excessive amount of anesthesia, and the body weight was measured with an electronic balance.
  • the abdomen was opened again, and the adhesion was evaluated as follows. The spleen weight was measured with an electronic balance after removing the spleen from the abdominal cavity.
  • Adhesion was evaluated as follows.
  • Non-separation section Other than the hepatic section, the following evaluations (a) and (b) were performed on the liver surface, omentum, peritoneum, small intestine, directly under the midline, and the like.
  • Adhesion grade Adhesion was evaluated visually. Adhesion scores were assigned based on the following scoring method for sites other than the hepatic section. The site was not specified, and the maximum value of the observed adhesion score was recorded as the adhesion score of the test animal. Adhesion score: Grade 0: No adhesion is seen at all.
  • Grade 1 Adhesion to the extent that it peels off due to its own weight (physiological adhesion)
  • Grade 2 Adhesion that can be peeled off with tweezers (blunt adhesion)
  • Grade 3 Adhesion that cannot be removed without using scissors and scalpel (sharp adhesion)
  • Example 3-2 Rat partial hepatectomy model using Pean forceps Except for using Pean forceps at the time of transection of the liver, the same materials, experimental groups, procedures and adhesion evaluation methods as in Example 3 were used. Used to evaluate the adhesion grade and adhesion extent of the hepatic section and non-separated section.
  • the separation of the liver using the Pean forceps was performed as follows. That is, in the [Procedure] of Example 3, “to linearly cut between two marked points” was performed by crushing the liver parenchyma with Pean forceps and cauterizing the exposed blood vessel with bipolar. .
  • Example 4 Visualization of each layer of an alginate laminated sponge by fluorescent labeling Visualization test by fluorescent labeling of each layer of an alginate laminated sponge was performed as follows.
  • the AL10 layer was widely distributed on the surface of the peritoneum in addition to the separated surface.
  • the second layer of the sponge-like laminate has a relatively low weight average molecular weight of the monovalent metal salt of alginic acid, so that it quickly melts and spreads in the peritoneal cavity.
  • the AL500 layer was partially observed on the abdominal wall, fluorescence from the separated surface was observed more conspicuously.
  • the first layer of the sponge-like laminate has a relatively high weight average molecular weight of the monovalent metal salt of alginic acid, so that it remains on the separated surface and becomes a physical barrier.
  • Example 5 Winding test In order to show the follow-up property to the curved surface of the alginate laminated sponge, the winding test was performed as follows.
  • Low endotoxin sodium alginate is as described in Example 1.
  • Agar (010-08725) was purchased from Wako Pure Chemical.
  • the anti-adhesion material containing the sponge-like laminate can be used for intestinal anastomosis and the like.
  • Example 6 Sponge Press and Swelling Test Pressing of an alginate-laminated sponge, measurement of thickness after pressing, and swelling test were performed as follows.
  • Alginate laminated sponge (AL10 (upper layer) -AL500 (lower layer) is as described in Example 1.
  • Table 1 shows the measurement results of the thickness after pressing.
  • the average thickness of the sponge was about 1.5 mm before pressing, about 0.33 mm after manual pressing, and about 0.16 mm after pressing with a press.
  • the pressed sponge maintained the above thickness without increasing in thickness over time.
  • the change in the thickness of the sponge over time in the swelling test is shown in FIG. From the result of the swelling test, it was confirmed that the pressed alginate laminated sponge absorbs water and has a thickness almost equal to that of the alginate sponge not pressed. This suggests that the sponge, which is an adhesion preventing material, can be applied relatively easily to the affected area through a trocar or the like in endoscopic surgery because the sponge can be compacted by pressing. Furthermore, it was also suggested that the pressed sponge applied to the affected area absorbs moisture present in the affected area or applied to the affected area, and the thickness is restored. When the thickness is restored, the function as a laminated sponge can be exhibited.
  • Example 7 Spraying test The following tests were conducted on an alginate laminated sponge and Seprafilm (trade name) in order to evaluate the fragility during water absorption.
  • the alginate laminated sponge is as described in Example 1, and Seprafilm (trade name) is as described in Example 3. Moreover, what was pressed with the press as described in Example 6 was used as an alginate laminated sponge with a press.
  • test piece of 1 cm ⁇ 2 cm was prepared from an alginate laminated sponge and Seprafilm (trade name).
  • a double-sided tape was affixed to 1 cm ⁇ 1 cm of one end of the test piece and was gripped on the end of the test stand. In this way, the test piece was fixed so that the other end 1 cm ⁇ 1 cm was hollow.
  • Each test piece was sprayed with pure water five times using a spray bottle. The process of bending the specimen downward as it wets was filmed with a video. Both the height and the angle from the test stand at the tip of the test piece were calculated by image analysis of the obtained moving image, and the change with time was plotted.
  • the alginic acid laminated sponge had a height drop of 2 mm or less until 50 seconds after spraying, and was about 3 mm even after 90 seconds (FIG. 10A). Also, the alginic acid laminated sponge with press had a height drop of about 9 mm even after 90 seconds after spraying.
  • Seprafilm trade name
  • a significant decrease in height was observed immediately after spraying (FIG. 10A).
  • the angle was similar to the height result (FIG. 10B). This suggests that the alginate laminated sponge maintains its shape and strength for a while even in the water-absorbing state regardless of the presence or absence of pressing.

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Abstract

【課題】癒着防止効果の高い癒着防止材が求められていた。 【解決手段】少なくとも一部が硬化剤で架橋された、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩のスポンジ状の第１の層および第２の層を含み、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が１０，０００～２，０００，０００であり、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が１，０００～１，０００，０００であり、前記重量平均分子量が脱架橋処理後にＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定したものであり、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量よりも高い、滅菌された、生体に適用可能なスポンジ状積層体を含む、癒着防止材。

Description

癒着防止用組成物
　本発明は、癒着防止材、その製造方法およびスポンジ状積層体に関する。
　癒着とは、互いに分離しているべき組織の表面が線維性の組織で連結または融合された状態のことをいう。癒着は、外傷や炎症に伴い組織の表面にフィブリンを含む滲出液が生じ、この滲出液が器質化して組織表面が連結または融合されることにより生じる。外科手術において組織の表面にできる外傷や、外傷により引き起こされる炎症、および外科手術において組織表面が乾燥することによる炎症は、癒着が生じる原因となっている。
　癒着は、時に、不妊、腸の通過障害、慢性骨盤痛の原因となり得る。また、外科手術後に生じた癒着を剥離するために、再度の外科手術が必要となることもある。例えば、肝臓がんの再発例に対しては複数回の手術が有効であるが、再手術適用の可否判断、治療のリスク、手術時の出血量、手術時間等は、いずれも前回の手術-後の癒着防止に大きく左右される。これらのことから、癒着を防止する必要があり、癒着防止のためにこれまでに様々な手段が講じられている。
　癒着防止のためのそのような手段のいくつかは、外傷または炎症部位とその隣接組織の間に配置して組織の連結または融合を防止する物理的バリアを設けることである。そのような物理的バリアとしては、シート状のものなどが知られている。
　具体的には、シート状のものとしては、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）フィルム（Ｐｒｅｃｌｕｄｅ（商品名）（ＷＬ　Ｇｏｒｅ　ａｎｄ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．））、ヒアルロン酸（ＨＡ）とカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含有するシート（Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）（Ｇｅｎｚｙｍｅ　ＧｍｂＨ））、再生酸化セルロースシート（ＩＮＴＥＲＣＥＥＤ（商品名）（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ））などがある。このうちＰＴＦＥフィルムは、生分解性でないため、体内に残存するという問題がある。ＨＡとＣＭＣを含有するシートおよび再生酸化セルロースシートは、生分解性であるものの、肝切除後に生じる癒着のような重篤な癒着を完全に防止できず、癒着防止の効果の点で改善の余地があった。
　ここで、コラーゲンなどのタンパク質や、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、アルギン酸などの多糖から選択される生体適合性の材料をシート状、粒子状にして、医療用吸収物質、医療用貼付材、癒着防止材、生体組織補強材料などとして用いることが知られている（特許文献１～６）。
特開昭４８－７９８７０号公報 特開２００３－１２６２３５号公報 国際公開第２００５／２６２１４号 特開２０１１－２５０１３号公報 特開２０１３－１６５８８４号公報 特表２０１６－５０２８７４号公報
　このような状況の下、癒着防止効果が高い、創傷部の癒着とｄｅ　ｎｏｖｏ癒着の両方を抑えることができる、適用した生体に悪影響を及ぼさない、創傷部の治癒を妨げない、腸管吻合などにも使用できる、内視鏡手術においてトロッカーを介した適用が容易である、貼付位置を調整して貼り直すことが可能である、等の少なくとも一つの性能を有する癒着防止材が求められていた。
　本発明者らは、臨床における種々の手術を想定した動物による癒着モデルにおいて、フィルム（シート）状癒着防止材の長所とスプレー（液・ゲル）状癒着防止材の長所とを兼備する癒着防止材について鋭意検討を重ねた結果、第１の層と第２の層の溶解速度が異なる、生体に適用可能なスポンジ状の癒着防止材、具体的には、重量平均分子量の比較的高い低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第１の層と、重量平均分子量の比較的低い低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第２の層とを含む生体に適用可能なスポンジ状積層体を含む癒着防止材が、術局所の癒着防止のみならず、適用領域の広い範囲において癒着防止効果を有することなどを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は以下のとおりである。
［１－１］　少なくとも一部が硬化剤で架橋された低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩のスポンジ状の第１の層および第２の層を含み、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が１０，０００～２，０００，０００であり、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が１，０００～１，０００，０００であり、前記重量平均分子量が脱架橋処理後にＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定したものであり、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量よりも高い、滅菌された、生体に適用可能なスポンジ状積層体を含む、癒着防止材。
［１－１ａ］　重量平均分子量１０，０００～２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第１の層と、重量平均分子量１，０００～１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第２の層を含み、前記重量平均分子量はＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定したものであり、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が第２の層よりも高い、生体に適用可能なスポンジ状積層体を含む、癒着防止材。
［１－２］　第１の層および第２の層のいずれか一方が、硬化剤を含む上記［１－１］または［１－１ａ］に記載の癒着防止材。
［１－３］　第１の層および第２の層の両方が、硬化剤を含む上記［１－１］～［１－２］のいずれか１項に記載の癒着防止材。
［１－４］　低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩の第１の層と第２の層での使用量の合計が、０．１ｍｇ／ｃｍ２～３ｍｇ／ｃｍ２の範囲である、上記［１－１］～［１－３］のいずれか１項に記載の癒着防止材。
［１－５］　第１の層と第２の層のアルギン酸の１価金属塩のエンドトキシン含有量が、５００ＥＵ／ｇ以下である、上記［１－１］～［１－４］のいずれか１項に記載の癒着防止材。
［１－６］　第１の層と第２の層のアルギン酸の１価金属塩が、アルギン酸ナトリウムまたはアルギン酸カリウムである、上記［１－１］～［１－５］のいずれか１項に記載の癒着防止材。
［１－７］　第１の層と第２の層の硬化剤が、ＣａＣｌ２、ＣａＳＯ４、ＺｎＣｌ２、ＳｒＣｌ２、ＦｅＣｌ３およびＢａＣｌ２からなる群より選択される少なくとも１つの金属イオン化合物である、上記［１－１］～［１－６］のいずれか１項に記載の癒着防止材。
［１－８］　第１の層を創傷部側の表面に向けて適用するための、上記［１－１］～［１－７］のいずれか１項に記載の癒着防止材。
［１－９］　スポンジ状積層体が、吸収線量として１０ｋＧｙ～１５０ｋＧｙの電子線および／またはγ線照射により滅菌されたものである、上記［１－１］～［１－７］のいずれか１項に記載の癒着防止材。
［１－１０］　少なくとも一部が硬化剤で架橋された低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩をそれぞれ含む第１の層および第２の層を含む生体に適用可能なスポンジ状積層体を含み、第１の層の溶解速度が、第２の層よりも遅い、癒着防止材。
［１－１０ａ］　低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩をそれぞれ含む第１の層および第２の層を含む生体に適用可能なスポンジ状積層体を含み、第１の層の溶解速度が、第２の層よりも遅い、癒着防止材。
［１－１１］　ｐＨ７．５のリン酸緩衝液に対するアルギン酸の１価金属塩の溶出を指標とする溶解試験において、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の溶出量を１００％としたときの、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の溶出量の割合が、測定開始から１時間の時点で５０％未満、２時間の時点で７０％未満である、上記［１－１０］または［１－１０ａ］の癒着防止材。
［１－１２］　ｐＨ７．５のリン酸緩衝液に対するアルギン酸の１価金属塩の溶出を指標とする溶解試験において、第１の層は、アルギン酸の１価金属塩の２５±１０重量％が１時間以内に溶出し、８０±１０重量％が４時間以内に溶出するものであり、第２の層は、アルギン酸の１価金属塩の７０±１０重量％が１時間以内に溶出し、９０±１０重量％が４時間以内に溶出するものである、上記［１－１０］または［１－１０ａ］の癒着防止材。
［１－１３］　スポンジ状積層体がプレスしたものである、上記［１－１］～［１－１２］のいずれか１項に記載の癒着防止材。
 
［２－１］　少なくとも一部が硬化剤で架橋された低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩のスポンジ状の第１の層および第２の層を含み、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が１０，０００～２，０００，０００であり、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が１，０００～１，０００，０００であり、前記重量平均分子量が脱架橋処理後にＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定したものであり、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量よりも高い、滅菌された、生体に適用可能なスポンジ状積層体を、癒着防止を必要とする対象に、第１の層を創傷部側の表面に向けて適用することを含む、癒着防止方法。
［２－１ａ］　重量平均分子量１０，０００～２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第１の層と、重量平均分子量１，０００～１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第２の層とを含み、前記分子量がＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定したものであり、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が第２の層よりも高い、生体に適用可能なスポンジ状積層体を、癒着防止を必要とする対象に適用することを含む、癒着防止方法。
［２－２］　第１の層および第２の層のいずれか一方が、硬化剤を含む上記［２－１］または［２－１ａ］に記載の癒着防止方法。
［２－３］　第１の層および第２の層の両方が、硬化剤を含む上記［２－１］～［２－２］のいずれか１項に記載の癒着防止方法。
［２－４］　低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩の第１の層と第２の層での使用量の合計が、０．１ｍｇ／ｃｍ２～３ｍｇ／ｃｍ２の範囲である、上記［２－１］～［２－３］のいずれか１項に記載の癒着防止方法。
［２－５］　第１の層と第２の層のアルギン酸の１価金属塩のエンドトキシン含有量が、５００ＥＵ／ｇ以下である、上記［２－１］～［２－４］のいずれか１項に記載の癒着防止方法。
［２－６］　第１の層と第２の層のアルギン酸の１価金属塩が、アルギン酸ナトリウムまたはアルギン酸カリウムである、上記［２－１］～［２－５］のいずれか１項に記載の癒着防止方法。
［２－７］　第１の層と第２の層の硬化剤が、ＣａＣｌ２、ＣａＳＯ４、ＺｎＣｌ２、ＳｒＣｌ２、ＦｅＣｌ３およびＢａＣｌ２からなる群より選択される少なくとも１つの金属イオン化合物である、上記［２－１］～［２－６］のいずれか１項に記載の癒着防止方法。
［２－８］　スポンジ状積層体が、吸収線量として１０ｋＧｙ～１５０ｋＧｙの電子線および／またはγ照射により滅菌されたものである、上記［２－１］～［２－７］のいずれか１項に記載の癒着防止方法。
［２－９］　少なくとも一部が硬化剤で架橋された低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩をそれぞれ含む第１の層および第２の層を含み、第１の層の溶解速度が第２の層よりも遅い、生体に適用可能なスポンジ状積層体を、癒着防止を必要とする対象に適用することを含む、癒着防止方法。
［２－９ａ］　低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩をそれぞれ含む第１の層および第２の層を含み、第１の層の溶解速度が第２の層よりも遅い、生体に適用可能なスポンジ状積層体を、癒着防止を必要とする対象に適用することを含む、癒着防止方法。
［２－１０］　ｐＨ７．５のリン酸緩衝液に対するアルギン酸の１価金属塩の溶出を指標とする溶解試験において、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の溶出量を１００％としたときの、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の溶出量の割合が、測定開始から１時間の時点で５０％未満、２時間の時点で７０％未満である、上記［２－９］または［２－９ａ］の癒着防止材。
［２－１１］　ｐＨ７．５のリン酸緩衝液に対するアルギン酸の１価金属塩の溶出を指標とする溶解試験において、第１の層は、アルギン酸の１価金属塩の２５±１０重量％が１時間以内に溶出し、８０±１０重量％が４時間以内に溶出するものであり、第２の層は、アルギン酸の１価金属塩の７０±１０重量％が１時間以内に溶出し、９０±１０重量％が４時間以内に溶出するものである、上記［２－９］または［２－９ａ］の癒着防止方法。
［２－１２］　スポンジ状積層体がプレスしたものである、上記［２－１］～［２－１１］のいずれか１項に記載の癒着防止方法。
［３－１］　以下の工程を含む、生体に適用可能なスポンジ状積層体を含む癒着防止材の製造方法。
　（１）重量平均分子量１０，０００～２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を硬化剤により硬化させる工程、
　（２）硬化したアルギン酸の１価金属塩を凍結する工程、
　（３）（２）で得られたアルギン酸の１価金属塩の上で、重量平均分子量１，０００～１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を硬化剤により硬化して積層体を得る工程、
　（４）得られた積層体を凍結乾燥してスポンジ状積層体を得る工程、
　ここで、前記分子量がＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定したものであり、
　前記スポンジ状積層体は、重量平均分子量１０，０００～２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第１の層と、重量平均分子量１，０００～１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第２の層とを含み、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が第２の層よりも高い。
［３－２］　スポンジ状積層体が、吸収線量として１０ｋＧｙ～１５０ｋＧｙの電子線および／またはγ照射により滅菌されたものである、上記［３－１］に記載の癒着防止材の製造方法。
［３－３］　（４）で得られた積層体をプレスする工程をさらに含む、上記［３－１］または［３－２］に記載の癒着防止材の製造方法。
［４－１］　以下の工程（１）～（４）により得られる生体に適用可能なスポンジ状積層体。
　（１）重量平均分子量１０，０００～２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を硬化剤により硬化させる工程、
　（２）硬化したアルギン酸の１価金属塩を凍結する工程、
　（３）（２）で得られたアルギン酸の１価金属塩の上で、重量平均分子量１，０００～１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を硬化剤により硬化して積層体を得る工程、
　（４）得られた積層体を凍結乾燥してスポンジ状積層体を得る工程、
　ここで、前記分子量がＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定したものであり、
　前記スポンジ状積層体は、重量平均分子量１０，０００～２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第１の層と、重量平均分子量１，０００～１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第２の層とを含み、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が第２の層よりも高い。
［４－２］　癒着防止材として用いる、上記［４－１］のスポンジ状積層体。
［４－３］　スポンジ状積層体が、吸収線量として１０ｋＧｙ～１５０ｋＧｙの電子線および／またはγ照射により滅菌されたものである、上記［４－１］または［４－２］に記載のスポンジ状積層体。
［４－４］　（４）で得られた積層体をプレスする工程をさらに含む、上記［４－１］～［４－３］のいずれか１項に記載のスポンジ状積層体。
［５－１］　重量平均分子量１０，０００～２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含む第１の原料と、重量平均分子量１，０００～１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含む第２の原料とを含み、第１の原料の重量平均分子量が第２の原料よりも高い、癒着防止材を製造するための原料の組合せ。
［５－２］スポンジ状積層体の製造に用いるためのものである、上記［５－１］に記載の原料の組合せ。
 
　本発明によれば、癒着防止効果が高い、創傷部の癒着とｄｅ　ｎｏｖｏ癒着の両方を抑えることができる、適用した生体に悪影響を及ぼさない、創傷部の治癒を妨げない、腸管吻合などにも使用できる、内視鏡手術においてトロッカーを介した適用が容易である、貼付位置を調整して貼り直すことが可能である、等の少なくとも一つの性能を有する癒着防止材を提供することができる。
癒着防止材の一例を示す図である。 癒着防止材の各層の溶解速度の評価を示す図である。 一部肝臓切除モデルでの癒着形成の評価を示す図である。（Ａ）離断面で癒着形成した個体の数、（Ｂ）離断面グレード、（Ｃ）離断面Ｅｘｔｅｎｔ（ｍｍ）。**　ｐ＜０．０１、*　ｐ＜０．０５。 一部肝臓切除モデルでの癒着形成の評価を示す図である。（Ａ）非離断面で癒着形成した個体の数、（Ｂ）非離断面グレード、（Ｃ）非離断面Ｅｘｔｅｎｔ（ｍｍ）。**　ｐ＜０．０１、*　ｐ＜０．０５。 一部肝臓切除モデルでの体重変化および脾臓重量の評価を示す図である。（Ａ）体重変化、（Ｂ）脾臓重量。 ペアン肝臓切除モデルでの癒着形成の評価を示す図である。（Ａ）離断面で癒着形成した個体の数、（Ｂ）離断面グレード、（Ｃ）離断面Ｅｘｔｅｎｔ（ｍｍ）。**　ｐ＜０．０１、*　ｐ＜０．０５。 ペアン肝臓切除モデルでの癒着形成の評価を示す図である。（Ａ）非離断面で癒着形成した個体の数、（Ｂ）非離断面グレード、（Ｃ）非離断面Ｅｘｔｅｎｔ（ｍｍ）。**　ｐ＜０．０１、*　ｐ＜０．０５。 ペアン肝臓切除モデルでの体重変化および脾臓重量の評価を示す図である。（Ａ）体重変化、（Ｂ）脾臓重量。 プレス前後のスポンジの膨潤試験結果を示す図である。 霧吹き後の各試験片先端の高さ（Ａ）および試験台からの角度（Ｂ）の経時変化を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明するが、以下の実施の形態は本発明を説明するための例示であり、本発明はその要旨を逸脱しない限りさまざまな形態で実施することができる。
１．癒着防止
　「癒着」とは、互いに分離しているべき組織の表面が線維性の組織で連結または融合された状態のことをいう。癒着の原因は、外科手術において組織の表面にできる外傷や、外傷により引き起こされる炎症、外科手術において組織表面が乾燥することによる炎症などである。これらの外傷や炎症に伴い組織の表面にフィブリンを含む滲出液が生じ、この滲出液が器質化して組織表面が連結または融合されることにより癒着が形成される。
　「癒着防止」とは、癒着の形成を減少させることをいう。癒着防止は、必ずしも癒着の形成を完全に防止することまでも必要とせず、本発明の癒着防止材を適用しなかった場合の状態と比較して、癒着の形成が防止されていればよい。すなわち「癒着防止」は癒着の軽減と言い換えてもよく、例えば、癒着の頻度、範囲および程度から選ばれる少なくとも１つが軽減されていればよい。「癒着防止」は、例えば、実施例に記載した癒着のグレード評価を行った場合に、本発明の癒着防止材を適用しなかった場合の平均癒着のグレードと比較して、平均癒着のグレードがより低くなっていればよい。あるいは、「癒着防止」は、例えば、実施例に記載した癒着のＥｘｔｅｎｔ評価を行った場合に、本発明の癒着防止材を適用しなかった場合の平均癒着のＥｘｔｅｎｔと比較して、平均癒着のＥｘｔｅｎｔがより低くなっていればよい。「癒着防止」は、好ましくは、外科手術に起因して生じる癒着、より好ましくは、外科手術に起因して生じる腹膜癒着の防止である。すなわち、「癒着防止」は、好ましくは、術後の癒着防止である。
　また、実施例に示したとおり、対象となる癒着としては、手術時の対象臓器の切除した部位の癒着およびｄｅ　ｎｏｖｏ癒着（手術部位以外の周辺および腹腔および体内での広範な部位との癒着）がある。
２．癒着防止材
　本発明は、少なくとも一部が硬化剤で架橋された低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩のスポンジ状の第１の層および第２の層を含み、重量平均分子量が比較的高い低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第１の層と、重量平均分子量が比較的低い低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第２の層を含む生体に適用可能なスポンジ状積層体を含む、癒着防止材（以下、「癒着防止材Ａ」という場合がある）を提供する。第１の層と第２の層で用いる低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量は、それぞれ、例えば、１０，０００～２，０００，０００と、１，０００～１，０００，０００である。このような重量平均分子量は脱架橋処理、例えばキレート剤溶液に溶解した後にＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定したものである。
　なお、本明細書において、数値範囲に「～」の記号を用いる場合、「下限値以上、上限値以下」を意味するものであり、記号の両端の数値は当該範囲に含まれる。
　癒着防止材Ａは、スポンジ状積層体の第１の層と第２の層に、異なる分子量の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩が含まれる。具体的には、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が第２の層よりも高い。アルギン酸の１価金属塩を含む層は、アルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が大きければ溶解速度が遅くなり、一方、重量平均分子量が小さければ溶解速度が速くなる。このため、第１の層を創傷部側、第２の層を腹腔側に向けて本発明の癒着防止材Ａを適用することで、第１の層は、創傷部に残留するとともに、第２の層は比較的速く溶解して腹腔内全般の癒着を抑えることが期待できる。
　また、本発明は、少なくとも一部が硬化剤で架橋された低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩をそれぞれ含む第１の層および第２の層を含む生体に適用可能なスポンジ状積層体を含み、第１の層と第２の層の溶解速度が異なる、癒着防止材（「癒着防止材Ｂ」）を提供する。具体的には、第１の層の溶解速度が、第２の層よりも遅い。第１の層の溶解速度が第２の層の溶解速度よりも遅くなるようにするには、例えば、癒着防止材Ａのように第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量を第２の層よりも高いものとすること、架橋剤の種類を変更する、または架橋剤の濃度を変更する、等により第１の層のアルギン酸の１価金属塩の架橋度を第２の層よりも高いものとすること、などが挙げられる。
　好ましくは、癒着防止材Ｂは、アルギン酸の１価金属塩の溶出を指標とする溶解試験において、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の溶出量を１００％としたときの、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の溶出量の割合が、測定開始から１時間の時点で５０％未満、２時間の時点で７０％未満であるものである。
　別の好ましい例として、癒着防止材Ｂは、アルギン酸の１価金属塩の溶出を指標とする溶解試験において、第１の層は、アルギン酸の１価金属塩の２５±１０重量％が１時間以内に溶出し、８０±１０重量％が４時間以内に溶出するものであり、第２の層は、アルギン酸の１価金属塩の７０±１０重量％が１時間以内に溶出し、９０±１０重量％が４時間以内に溶出するものである。溶解試験は、具体的には、後述の実施例に記載の通りである。
　ここで、本明細書中、「癒着防止材Ａ」と「癒着防止材Ｂ」を合わせて、「癒着防止材」という場合がある。また、「第１の層」は、スポンジ状積層体を対象に適用したときに下層となる層、すなわち、対象の適用すべき組織の表面と接触する側の層である。「第２の層」は、スポンジ状積層体を対象に適用したときに上層となる層、すなわち、対象の適用すべき組織の表面と接触しない側の層である。「生体に適用可能」とは、医療材料として適用すべき組織の表面に配置することが可能であることを意味する。
　癒着防止材に用いられる生体に適用可能なスポンジ状の積層体は、上記の第１の層、第２の層以外に、任意の成分を含む第３の層を有していてもよく、また、多層構造を有していてもよい。また、各層が明瞭な境界面を持たず、分子量が連続的に漸増または漸減するような構造を有するスポンジ状積層体も含まれる。
　癒着防止材の一例を、図１に示す。癒着防止材１は、第１の層２と第２の層３とを含むスポンジ状積層体４を含む。第１の層２と第２の層３は、それぞれスポンジ状である。「スポンジ状」とは、多孔性を有した状態を意味する。
　生体に適用可能なスポンジ状積層体の形状は特に限定されず、適用する表面の範囲、形状、凹凸などを考慮し適宜選択することができる。スポンジ状積層体の形状は、例えば、図１に示すような平板状であってもよいし、あるいは円板状、円筒状、直方体状などの形状をとることができる。好ましくは平板状または円板状である。平板状や円板状のとき、適用する表面の範囲、形状、凹凸などに合わせて癒着防止材をさらに切断して表面に適用することができるため、平板や円板のサイズは特に限定されない。例えば、平板状の形状を、縦×横×高さ（厚さ）で表すと、縦と横の長さは特に限定されず、高さ（厚さ）は、好ましくは０．２ｍｍ～３０ｍｍであり、より好ましくは０．３ｍｍ～１５ｍｍ、さらに好ましくは０．５ｍｍ～１０ｍｍである。さらに好ましくは、そのような高さ（厚さ）であることに加えて、縦と横の長さは、それぞれ、１ｍｍ～３００ｍｍｘ１ｍｍ～３００ｍｍであり、特に好ましくは、３ｍｍ～２００ｍｍｘ３ｍｍ～２００ｍｍであり、さらに好ましくは、５ｍｍ～１５０ｍｍｘ５ｍｍ～１５０ｍｍである。なお、厚さは均一でなくても良く、一方が厚くて他方が薄い、傾斜構造であってもよい。
　本発明の癒着防止材のスポンジ状積層体は、Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）と比較して、柔軟性が高く、割れにくい。
　いくつかの態様では、スポンジ状積層体はプレスしたものである。「プレス」は後述の通りである。スポンジ状積層体がプレスしたものである場合、その高さ（厚さ）は、好ましくは、０．０２ｍｍ～３ｍｍであり、より好ましくは０．０３ｍｍ～１．５ｍｍ、さらに好ましくは０．０５ｍｍ～１ｍｍである。さらに好ましくは、そのような高さ（厚さ）であることに加えて、縦と横の長さは、それぞれ、１ｍｍ～３００ｍｍｘ１ｍｍ～３００ｍｍであり、特に好ましくは、３ｍｍ～２００ｍｍｘ３ｍｍ～２００ｍｍであり、さらに好ましくは、５ｍｍ～１５０ｍｍｘ５ｍｍ～１５０ｍｍである。なお、いくつかの態様ではプレス後の厚さは均一である。
３．アルギン酸の１価金属塩
　「アルギン酸の１価金属塩」は、アルギン酸の６位のカルボン酸の水素原子を、Ｎａ＋やＫ＋などの１価金属イオンとイオン交換することでつくられる水溶性の塩である。アルギン酸の１価金属塩としては、具体的には、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウムなどを挙げることができるが、特には、市販品により入手可能なアルギン酸ナトリウムが好ましい。アルギン酸の１価金属塩の溶液は、硬化剤と混合したときにゲルを形成する。
　本発明に用いる「アルギン酸」は、生分解性の高分子多糖類であって、Ｄ－マンヌロン酸（Ｍ）とＬ－グルロン酸（Ｇ）という２種類のウロン酸が直鎖状に重合したポリマーである。より具体的には、Ｄ－マンヌロン酸のホモポリマー画分（ＭＭ画分）、Ｌ－グルロン酸のホモポリマー画分（ＧＧ画分）、およびＤ－マンヌロン酸とＬ－グルロン酸がランダムに配列した画分（ＭＧ画分）が任意に結合したブロック共重合体である。アルギン酸のＤ－マンヌロン酸とＬ－グルロン酸の構成比（Ｍ／Ｇ比）は、主に海藻等の由来となる生物の種類によって異なり、また、その生物の生育場所や季節による影響を受け、Ｍ／Ｇ比が約０．４の高Ｇ型からＭ／Ｇ比が約５の高Ｍ型まで高範囲にわたる。
　アルギン酸の１価金属塩は高分子多糖類であり、分子量を正確に定めることは困難であり、天然物由来の高分子物質の分子量測定では、測定方法により値に違いが生じうることが知られている。
　ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法によれば、絶対重量平均分子量を測定することができる。原料として用いるアルギン酸の１価金属塩の、ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定した重量平均分子量は、スポンジ状積層体の第１の層では、例えば、１０，０００～２，０００，０００であり、好ましくは、１５，０００～１，５００，０００であり、より好ましくは、２０，０００～１，０００，０００であり、特に好ましくは、２５，０００～５００，０００である。そのような第１の層であることに加えて、ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定した重量平均分子量は、第２の層では、例えば、１，０００～１，０００，０００であり、好ましくは、１，０００～５００，０００であり、より好ましくは、２，０００～２５０，０００であり、特に好ましくは、３，０００～１００，０００である。
　いくつかの態様、例えば、電子線および／またはγ線滅菌による照射後においては、ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定した重量平均分子量は、スポンジ状積層体の第１の層では、例えば、１０，０００～３００，０００であり、好ましくは、１０，０００～２００，０００であり、より好ましくは、１０，０００～１００，０００であり、特に好ましくは、１０，０００～８０，０００である。そのような第１の層であることに加えて、ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定した重量平均分子量は、第２の層では、例えば、１，０００～１００，０００であり、好ましくは、１，０００～８０，０００であり、より好ましくは、２，０００～６０，０００であり、特に好ましくは、３，０００～６０，０００である。
　少なくとも一部が硬化剤で架橋されたアルギン酸の１価金属塩については、任意の脱架橋処理後にＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定することにより、架橋されていないアルギン酸の１価金属塩としての重量平均分子量を測定することができる。脱架橋処理としては、例えば、任意のキレート剤、例えばＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、フィチン酸などのキレート剤溶液に溶解することが挙げられる。用いるキレート剤としてはＥＤＴＡが好ましい。
 
　スポンジ状積層体の第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が第２の層よりも高い。スポンジ状積層体の原料、あるいはスポンジ状積層体に含まれる第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量は、第２の層よりも、例えば１，０００～１,０００,０００高く、好ましくは２，０００～５００，０００高く、より好ましくは、３，０００～３００，０００高い。
　通常、高分子多糖類の分子量を上記のような手法で算出する場合、１０～２０重量％の測定誤差を生じうる。例えば、１０，０００であれば８，０００～１２，０００、１００，０００であれば８０，０００～１２０，０００、２００，０００であれば１６０，０００～２４０，０００、４００，０００であれば３２０，０００～４８０，０００、５００，０００であれば４００，０００～６００，０００程度の範囲で値の変動が生じうる。
　アルギン酸類の分子量の測定は、常法に従い測定することができる。分子量測定にＧＰＣ－ＭＡＬＳを用いる場合の代表的な条件は、本明細書の実施例１に記載のとおりである。検出器として、例えば、ＲＩ検出器と光散乱検出器（ＭＡＬＳ）を用いることができる。
　アルギン酸類は、褐藻類から抽出された当初は一般的に分子量が大きいが、熱による乾燥、精製などの過程で、徐々に分子量が小さくなる。製造工程の温度等の条件管理、原料とする褐藻類の選択、製造工程における分子量の分画などの手法により分子量の異なるアルギン酸類を製造することができる。さらに、異なる分子量を持つ別ロットのアルギン酸類と混合することにより、目的とする分子量を有するアルギン酸類とすることも可能である。
　本発明で用いられるアルギン酸の１価金属塩は、低エンドトキシン処理されたものである。低エンドトキシン処理は、公知の方法またはそれに準じる方法によって行うことができる。例えば、ヒアルロン酸ナトリウムを精製する、菅らの方法（例えば、特開平９－３２４００１号公報など参照）、β１，３－グルカンを精製する、吉田らの方法（例えば、特開平８－２６９１０２号公報など参照）、アルギネート、ゲランガム等の生体高分子塩を精製する、ウィリアムらの方法（例えば、特表２００２－５３０４４０号公報など参照）、ポリサッカライドを精製する、ジェームスらの方法（例えば、国際公開第９３／１３１３６号パンフレットなど参照）、ルイスらの方法（例えば、米国特許第５５８９５９１号明細書など参照）、アルギネートを精製する、ハーマンフランクらの方法（例えば、Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９４）４０：６３８－６４３など参照）等またはこれらに準じる方法によって実施することができる。本発明の低エンドトキシン処理は、それらに限らず、洗浄、フィルター（エンドトキシン除去フィルターや帯電したフィルターなど）によるろ過、限外ろ過、カラム（エンドトキシン吸着アフィニティーカラム、ゲルろ過カラム、イオン交換樹脂によるカラムなど）を用いた精製、疎水性物質、樹脂または活性炭などへの吸着、有機溶媒処理（有機溶媒による抽出、有機溶剤添加による析出・沈降など）、界面活性剤処理（例えば、特開２００５－０３６０３６号公報など参照）など公知の方法によって、あるいはこれらを適宜組合せて実施することができる。これらの処理の工程に、遠心分離など公知の方法を適宜組み合わせてもよい。アルギン酸の種類に合わせて適宜選択するのが望ましい。
　エンドトキシンレベルは、公知の方法で確認することができ、例えば、リムルス試薬（ＬＡＬ）による方法、エンドスペシー（登録商標）ＥＳ－２４Ｓセット（生化学工業株式会社）を用いる方法などによって測定することができる。
　本発明に用いられるアルギン酸の１価金属塩のエンドトキシンの処理方法は特に限定されないが、その結果として、生体内吸収性多糖類のエンドトキシン含有量が、リムルス試薬（ＬＡＬ）によるエンドトキシン測定を行った場合に、５００エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｇ以下であることが好ましく、さらに好ましくは、１００ＥＵ／ｇ以下、とりわけ好ましくは、５０ＥＵ／ｇ以下、特に好ましくは、３０ＥＵ／ｇ以下である。低エンドトキシン処理されたアルギン酸ナトリウムは、例えば、Ｓｅａ　Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）（持田製薬株式会社）、ＰＲＯＮＯＶＡＴＭ　ＵＰ　ＬＶＧ（ＦＭＣＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ）など市販品により入手可能である。
　スポンジ状積層体におけるアルギン酸の１価金属塩の使用量は、癒着防止効果を考慮して、適宜選択することができる。アルギン酸の１価金属塩の使用量は、スポンジ状積層体の第１の層と第２の層の合計で、例えば、０．１ｍｇ／ｃｍ２～１０．０ｍｇ／ｃｍ２が挙げられ、好ましくは、０．１ｍｇ／ｃｍ２～３．０ｍｇ／ｃｍ２であり、より好ましくは、０．５ｍｇ／ｃｍ２～２．５ｍｇ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは、１．８ｍｇ／ｃｍ２～２．２ｍｇ／ｃｍ２であり、特に好ましくは、２．０ｍｇ／ｃｍ２である。アルギン酸の１価金属塩の使用量が、スポンジ状積層体の第１の層と第２の層の合計で、１．０ｍｇ／ｃｍ２～３．０ｍｇ／ｃｍ２であることで、より高い癒着防止効果が期待できる。使用量が１０．０ｍｇ／ｃｍ２以下であれば、生体内の蓄積や特定臓器の肥大などの有害事象のおそれが少なく、使用量が０．１ｍｇ／ｃｍ２以上であれば十分な癒着防止効果が期待できる。
　第１の層と第２の層のアルギン酸の１価金属塩の使用量の比（重量比）は、好ましくは、１：２０～２０：１であり、より好ましくは、１：５～５：１であり、さらに好ましくは、１：３～３：１であり、特に好ましくは、１：２～２:１である。
４．硬化剤（架橋剤）
　癒着防止材は、第１の層および第２の層のいずれか一方が硬化剤を含有してもよく（すなわち、第１の層および第２の層のいずれか一方が硬化剤を含有しなくてもよく）、あるいは、第１の層および第２の層の両方が硬化剤を含有してもよい。
　あるいは、癒着防止材は、第１の層および第２の層のいずれもが硬化剤を含有していなくてもよい。
　ここで、いくつかの態様では、第１の層および第２の層は、少なくとも一部が硬化剤で架橋されたものである。
　硬化剤は、アルギン酸の１価金属塩の溶液を架橋することにより、硬化するものである。硬化剤は、例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ３＋などの２価以上の金属イオン化合物、分子内に２～４個のアミノ基を有する架橋性試薬などが挙げられる。より具体的には、２価以上の金属イオン化合物として、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＣａＳＯ４、ＺｎＣｌ２、ＦｅＣｌ３、ＢａＣｌ２、ＳｒＣｌ２等（好ましくは、ＣａＣｌ２、ＣａＳＯ４、ＺｎＣｌ２、ＳｒＣｌ２、ＦｅＣｌ３、ＢａＣｌ２等）を、分子内に２～４個のアミノ基を有する架橋性試薬として、窒素原子上にリジル（ｌｙｓｙｌ）基（－ＣＯＣＨ（ＮＨ２）－（ＣＨ２）４－ＮＨ２）を有することもあるジアミノアルカン、すなわちジアミノアルカンおよびそのアミノ基がリジル基で置換されてリジルアミノ基を形成している誘導体が包含され、具体的にはジアミノエタン、ジアミノプロパン、Ｎ－（リジル）－ジアミノエタン等を挙げることができる。
　第１層および第２層における硬化剤の使用量は、アルギン酸の一価金属塩の使用量や分子量などに応じて適宜調節するのが望ましい。硬化剤を使用する場合、第１の層における硬化剤の使用量は、例えば、０．１μｍｏｌ／ｃｍ２～１００μｍｏｌ／ｃｍ２であり、好ましくは、０．５μｍｏｌ／ｃｍ２～２．０μｍｏｌ／ｃｍ２である。硬化剤を使用する場合、第２の層における硬化剤の使用量は、例えば、０．１μｍｏｌ／ｃｍ２～１０μｍｏｌ／ｃｍ２であり、好ましくは、０．６μｍｏｌ／ｃｍ２～２．４μｍｏｌ／ｃｍ２である。
５．癒着防止材の作製方法
　生体適用可能なスポンジ状積層体を含む癒着防止材や生体適用可能なスポンジ状積層体は、例えば、以下の工程を経て作製することができる。
　（１）重量平均分子量１０，０００～２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を硬化剤により硬化させる工程、
　（２）硬化したアルギン酸の１価金属塩を凍結する工程、
　（３）（２）で得られたアルギン酸の１価金属塩の上で、重量平均分子量１，０００～１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を硬化剤により硬化して積層体を得る工程、
　（４）得られた積層体を凍結乾燥してスポンジ状積層体を得る工程。
　上記工程（１）では、先ず、重量平均分子量１０，０００～２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩（以下、「第１のアルギン酸塩」という）の溶液と硬化剤の溶液を準備する。第１のアルギン酸塩の溶液と硬化剤の溶液は、公知の方法またはそれに準じる方法により調製することができる。溶媒は、生体へ適用可能な溶媒であれば特に限定されないが、好ましくは水性溶媒であり、例えば、精製水、純水（例えば、蒸留水、イオン交換水）、ミリＱ水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ＤＭＳＯなどであり、より好ましくは、純水である。これらは、滅菌されていることが好ましく、低エンドトキシン処理されたものが好ましい。
　そして、第１のアルギン酸塩の溶液と硬化剤の溶液を混合することにより、第１のアルギン酸塩を硬化させることができる。
　上記工程（２）では、工程（１）で硬化させた第１のアルギン酸塩を、常法により凍結させる。工程（３）の前に一度凍結させることにより、第１の層と第２の層が混和する割合を低減することができる。凍結温度および時間は、例えば、－２０℃で４時間である。
　上記工程（３）では、先ず、重量平均分子量１，０００～１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩（以下、「第２のアルギン酸塩」という）の溶液と硬化剤の溶液を準備する。第２のアルギン酸塩の溶液と硬化剤の溶液は、公知の方法またはそれに準じる方法により調製することができる。溶媒は、上記工程（１）で説明したものと同様である。
　そして、第２のアルギン酸塩の溶液と硬化剤の溶液を混合することにより、第２のアルギン酸塩を硬化させることができる。
　さらに硬化させた第２のアルギン酸塩を、工程（４）の前に凍結させるようにしてもよい。凍結温度および時間は、例えば、－２０℃で４時間である。
　上記工程（４）では、工程（３）で得られた積層体を凍結乾燥してスポンジ状積層体を得る。凍結乾燥は、公知の方法により行うことができる。凍結乾燥の条件は適宜調節可能であり、一次乾燥工程、二次乾燥工程等を設けてもよい。
　これらの工程により、第１のアルギン酸塩と硬化剤を含むスポンジ状の第１の層と、第２のアルギン酸塩と硬化剤を含むスポンジ状の第２の層を含み、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が第２の層よりも高い、生体適用可能なスポンジ状積層体、ならびにそのスポンジ状積層体を含む癒着防止材を得ることができる。
　なお、上記の方法では、最初に、第１のアルギン酸塩と硬化剤を含むスポンジ状の第１の層を作製し、その上に、第２のアルギン酸塩と硬化剤を含むスポンジ状の第２の層を作製しているが、最初に、第２の層を作製し、その上に、第１の層を作製するようにしてもよい。この場合、スポンジ状積層体は、例えば、以下の工程を経て作製することができる。
　（１’）第２のアルギン酸塩を硬化剤により硬化させる工程、
　（２’）硬化した第２のアルギン酸塩を凍結する工程、
　（３’）（２’）で得られた第２のアルギン酸塩の上で、第１のアルギン酸塩を硬化剤により硬化して積層体を得る工程、
　（４’）得られた積層体を凍結乾燥してスポンジ状積層体を得る工程。
　各工程の具体的な説明は、前記の方法と同様である。
　あるいは、第１のアルギン酸塩を硬化させて凍結乾燥することでスポンジ状の第１の層を作製し、別途、第２のアルギン酸塩を硬化させて凍結乾燥することでスポンジ状の第２の層を作製し、得られたスポンジ状の各層を貼り合わせることにより、スポンジ状積層体を得ることも可能である。
　各工程の具体的な説明は、前記の方法と同様である。
　第１のアルギン酸塩および第２のアルギン酸塩を硬化させるときに、所望の大きさ、高さおよび形状の容器、型、基板、多孔膜、不織布、織布などを用いることで、所望の大きさ、高さおよび形状のスポンジ状積層体を含む、癒着防止材を得ることができる。
　癒着防止材のスポンジ状積層体は、さらに、滅菌処理がなされていることが好ましい。滅菌は、γ線滅菌、電子線滅菌、エチレンオキシドガス滅菌、エタノール滅菌等が挙げられ、これらに限定されない。より好ましくは、癒着防止材は、電子線および／またはγ線照射により滅菌処理がされる。高分子材料をγ線、電子線等で照射処理することにより、好ましくは、生体内での貯留性を制御した生体適合性の高い医用材料が得られる（例えば、特開２０００－２３７２９４号参照）。
　電子線および／またはγ線滅菌する場合の照射条件として、例えば、吸収線量が１０ｋＧｙ～１５０ｋＧｙが挙げられ、より好ましくは２０ｋＧｙ～１００ｋＧｙが挙げられ、さらに好ましくは４０ｋＧｙ～８０ｋＧｙが挙げられる。電子線および／またはγ線滅菌する場合の照射条件の別の好ましい態様として、例えば、吸収線量が２０ｋＧｙ～８０ｋＧｙ、２０ｋＧｙ～６０ｋＧｙ、４０ｋＧｙ～６０ｋＧｙ等が挙げられる。γ線滅菌よりも電子線滅菌が好ましい。
　いくつかの態様では、上記工程（４）などで得られた積層体をプレスする工程をさらに含む。プレスは、手動で、あるいはプレス機によって積層体を挟み、加圧することで行う。また、一般的に用いられる圧縮、薄層化などの工程も、本発明でいうプレスに含まれるものとする。プレス圧力としては、例えば１ｋＰａ～１００ＭＰａが挙げられ、より好ましくは１０ｋＰａ～８０ＭＰａ、さらに好ましくは１００ｋＰａ～６０Ｍｐａが挙げられる。手動でのプレスは、積層体に均一に圧がかかるように手で押圧できるもの、例えば、アクリル定規、アクリル板、ガラス板、金属板等を介して行う。また、用いるプレス機としては、例えば、ホットプレス機（アズワン株式会社製　ＡＨ－１Ｔ）が挙げられる。
６．使用方法
　癒着防止材は、癒着防止を必要とする対象に適用することにより使用される。好ましくは、癒着防止材は、通常、癒着防止効果を奏するのに必要な１週間程度、適用局所に滞留した後に吸収分解され、最終的には１～２カ月程度で代謝・排泄されてなくなるため、安全性に優れる。
　癒着防止材は、創傷部の表面、例えば外科手術に関連した組織の表面に適用するようにしてもよい。
　「外科手術に関連した組織」とは、外科手術において表面に外傷を負った組織や、外科手術において表面が乾燥することにより炎症が生じたまたは炎症が生じる恐れのある組織である。外科手術に関連した組織は、好ましくは、腹膜に包まれている臓器（例えば、胃、空腸、回腸、虫垂、結腸、肝臓、脾臓、十二指腸、および膵臓）である。本発明の好ましい態様の癒着防止材は、肝切除後に生じる癒着のような重篤な癒着を効果的に防止することができる。
　また、「適用する」とは、癒着防止材を、創傷部の表面（例えば、外科出術に関連した組織の表面）に置くことをいう。具体的には、スポンジ状積層体の第１の層の表面が創傷部側の表面（例えば、組織の表面）と接触し、第２の層の表面が創傷部側の表面（例えば、組織の表面）とは反対側（例えば、腹腔側）を向くように、癒着防止材を創傷部側の表面（例えば、外科手術に関連した組織の表面）に置くようにする。スポンジ状積層体の第１の層は比較的重量平均分子量が高いため、組織の表面に癒着を防止するのに十分な時間分解されずに残留し、創傷面の物理的バリアとして働く。一方、スポンジ状積層体の第２の層は比較的重量平均分子量が低いため、速やかに溶けて広がり、非創傷面の癒着防止の役割を果たす。
　好ましくは、癒着防止材のスポンジ状積層体は、Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）と比較して、柔軟性が高く、割れにくい。このため、好ましい態様では、癒着防止材は、適用する組織の表面に規定されず、例えば、腸管吻合の際にも腸管に巻き付けて使用できる。また、別の好ましい態様では、内視鏡を用いた外科手術の際にも、手術器具を対象において出し入れする通路から、容易に挿入できる。さらに別の好ましい態様では、癒着防止材は、貼りなおしが可能である。
　また、好ましくは、癒着防止材のスポンジ積層体は、ＩＮＴＥＲＣＥＥＤ（商品名）と比較して、癒着防止対象が広範である。
　好ましくは、癒着防止材は、適用する表面の範囲、形状、凹凸などに応じて適当な大きさのものを準備し、癒着防止すべき外科手術に関連した組織の表面に適用する。「対象」は、ヒト、またはヒト以外の生物、例えば、トリおよび非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ、サル、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、およびウマ）である。
　癒着防止材のスポンジ積層体、とりわけスポンジ積層体がプレスしたものである場合には、コンパクトにまとめることができるので、例えば、内視鏡手術においてトロッカー等を介して癒着防止材を患部に比較的容易に適用することができる。そして、患部に適用された癒着防止材は、好ましくは、患部に存在する水分あるいは患部に適用された水分を吸収して厚みが回復する。
　好ましくは、癒着防止材は、Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）やＩＮＴＥＲＣＥＥＤ（商品名）と同様に、対象において安全に使用できる。
　外科手術に関連した組織の表面に適用した後、癒着防止材と外科手術に関連した組織の表面の縫合は通常は必要ないが、必要に応じて、癒着防止材と外科手術に関連した組織の表面を縫合してもよい。
　また、スポンジ状積層体を、癒着防止を必要とする対象に適用することを含む、癒着防止方法が提供される。具体的な方法は、前述の通りである。
　また、癒着防止材を製造するための、スポンジ状積層体の使用が提供される。具体的な使用は、前述の通りである。
　さらに、癒着防止のためのスポンジ状積層体が提供される。具体的な、スポンジ状積層体は、前述の通りである。
７．併用薬
　本発明の癒着防止材を外科手術に関連した組織に適用する前に、あるいは同時に、あるいは後で、ストレプトマイシン、ペニシリン、トブラマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、およびアンホテリシンＢ等の抗生物質、アスピリン、非ステロイド性解熱鎮痛剤（ＮＳＡＩＤｓ）、アセトアミノフェン等の抗炎症薬等の併用薬を投与するようにしてもよい。これらの薬剤は本発明の癒着防止材に混入して用いてもよい。
　スポンジ状積層体は多孔性で吸水力もあるため、例えば、無孔性のＳｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）に比べて、用時調整による薬物担持が容易である。薬剤溶液をスポンジに含浸させ、投与することで、腹腔、胸腔、心腔等において、癒着防止と薬物の局所徐放が同時に達成できる。さらに溶解速度が異なる層に薬物を担持することにより、速い徐放速度と遅い徐放速度での薬物の徐放も可能となる。
　なお、本明細書において引用した全ての刊行物、例えば、先行技術文献および公開公報、特許公報その他の特許文献は、その全体が本明細書において参照として組み込まれる。
　以下の実施例により本発明を更に詳述するが、本発明はこれら実施例に限定して理解されるべきものではない。
実施例１：アルギン酸積層スポンジの作製
　アルギン酸積層スポンジを、以下のように作製した。
［試薬］
　アルギン酸積層スポンジの調製に用いた各試薬は以下の通りである。
　低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムは、持田製薬株式会社から入手した。
　　・ＡＬ１０：（Ｌｏｔ　ＮＯ．５Ｋ１２２０２），エンドトキシン量４ＥＵ／ｇ。
　　・ＡＬ５００：（Ｌｏｔ　ＮＯ．ＢＬ１５０７１３－５００），エンドトキシン量１９ＥＵ／ｇ。
　塩化カルシウムは、和光純薬工業株式会社から入手した（商品コード：０３６－００４８５）。
［使用機器］
　３５ｍｍ無処理ディッシュ（ＩＷＡＫＩ社　商品コード１０００－０３５）
　マイクロピペット（Ｇｉｌｓｏｎ社　ピペットマン（商品名））
　純水製造装置（メルクミリポア社　Ｅｌｉｘ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ＵＶ５（商品名））
　冷凍庫（ＳＨＡＲＰ社　ＳＪ－５６Ｓ（商品名））
　凍結乾燥器（ＴＡＩＴＥＣ社　ＶＤ－５５０Ｒ（商品名））
［調製手順］
　（１）溶液の調製
　ＡＬ５００を１．０ｗｔ％の濃度で純水に溶解させて、ＡＬ５００溶液を調製した。同様に、ＡＬ１０を１．０ｗｔ％の濃度で純水に溶解させて、ＡＬ１０溶液を調製した。さらに、塩化カルシウムを純水に溶解させ、１０ｍＭおよび１５ｍＭの塩化カルシウム水溶液をそれぞれ調製した。
　（２）ＡＬ５００層（下層）の調製
　ＡＬ５００溶液１．０ｍＬおよび１０ｍＭ塩化カルシウム水溶液１．０ｍＬをマイクロピペットを使用して３５ｍｍ無処理ディッシュに加え、ピペッティングによって均一になるように混合した。これを一晩静置し、ゲル化させた。ディッシュを冷凍庫に移し、－２０℃で４時間凍結させた。
　（３）ＡＬ１０層（上層）の積層
　ディッシュを冷凍庫から取り出し、凍結したＡＬ５００層の上に、ＡＬ１０溶液１．０ｍＬおよび１５ｍＭ塩化カルシウム水溶液１．０ｍＬをマイクロピペットで加え、ピペッティングによって均一になるように混合した。これを再びディッシュを冷凍庫に移し、－２０℃で４時間凍結させた。
　（４）スポンジの作製
　凍結後のディッシュを凍結乾燥器にセットし、２晩凍結乾燥を行って、目的のアルギン酸積層スポンジを得た。
　目的のアルギン酸積層スポンジは、ＡＬ５００と塩化カルシウムを含むスポンジ状の下層（すなわち、第１の層）と、ＡＬ１０と塩化カルシウムを含むスポンジ状の上層（すなわち、第２の層）を含む。アルギン酸積層スポンジは、直径３５ｍｍ、厚み１．８３±０．１３ｃｍ（ｎ＝４）の略円状であった。アルギン酸ナトリウムの上層と下層での使用量の合計は、約２．０ｍｇ／ｃｍ２であった。また、アルギン酸ナトリウムの上層と下層での使用量の比（重量比）は、１：１であった。さらに、塩化カルシウムの使用量は、上層で、約１．０μｍｏｌ／ｃｍ２であり、下層で、約１．５μｍｏｌ／ｃｍ２であった。
　（５）重量平均分子量の測定
　製造原料として用いたアルギン酸について、以下のＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により重量平均分子量を測定した。
　［前処理方法］
　試料に溶離液を加え溶解後、０．４５μｍメンブランフィルター濾過したものを測定溶液とした。
　［測定条件（屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）測定）］
　示差屈折率計：Ｏｐｔｉｌａｂ　Ｔ－ｒＥＸ
　測定波長：６５８ｎｍ
　測定温度：４０℃
　溶媒：２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
　試料濃度：０．５～２．５ｍｇ／ｍＬ（５濃度）
　［測定条件（絶対分子量分布測定）］
　カラム：ＴＳＫｇｅｌ　ＧＭＰＷ－ＸＬ×２＋Ｇ２５００ＰＷ－ＸＬ（７．８ｍｍ　Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ×３本）
　溶離液：２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
　流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ．
　濃度：０．０５％
　検出器：ＲＩ検出器、光散乱検出器（ＭＡＬＳ）
　カラム温度：４０℃
　注入量：２００μＬ
　［結果］
　ＡＬ１０　：　５５，０００
　ＡＬ５００：　２８０，０００
　また、上記工程（１）、（２）および（４）の方法に準じて製造したＡＬ１０を含有する単層スポンジと、ＡＬ５００を含有する単層スポンジを電子線滅菌後、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液に溶解して、ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法によりそれぞれ分子量を測定した。結果を以下に示す。
　［結果］
（電子線滅菌の照射線量が２０ｋＧｙの場合）
　ＡＬ１０　：３６，０００
　ＡＬ５００：７５，０００
（電子線滅菌の照射線量が４０ｋＧｙの場合）
　ＡＬ１０　：２７，０００
　ＡＬ５００：４５，０００
　後述の実施例３、実施例３－２、および４では、積層スポンジとして、得られた積層スポンジを電子線滅菌（２０ｋＧｙ）したものを用いた。
　尚、後述の実施例６および７では、積層スポンジとして、非滅菌のものを用いた。
実施例１－２：アルギン酸積層スポンジの作製
（１）スポンジの作製
　以下の［試薬］に記載のアルギン酸を用い、ＡＬ１００またはＡＬ５００を下層の原料として、ＡＬ１０またはＡＬ２０を上層の原料として使用し、実施例１に記載の方法に準じて、ＡＬ１０（上層）－ＡＬ１００（下層）、ＡＬ２０（上層）－ＡＬ１００（下層）、ＡＬ２０（上層）－ＡＬ５００（下層）の組合せによる、各アルギン酸積層スポンジを作製した。
［試薬］
　　・ＡＬ１０：実施例１と同じ
　　・ＡＬ２０：（Ｌｏｔ　ＮＯ．ＢＬ１５０７１３－２０），エンドトキシン量１３ＥＵ／ｇ。
　　・ＡＬ１００：（Ｌｏｔ　ＮＯ．５Ｇ１７２０１），エンドトキシン量６ＥＵ／ｇ。
　　・ＡＬ５００：実施例１と同じ
（２）重量平均分子量の測定
　また、スポンジ作製に用いたアルギン酸のうち、ＡＬ２０およびＡＬ１００について、実施例１に記載の方法を用いて、ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により重量平均分子量を測定した。
　［結果］
　ＡＬ２０　：　８２，０００
　ＡＬ１００：　１７０，０００
　また、実施例１に記載の方法に準じて製造したＡＬ２０を含有する単層スポンジと、ＡＬ１００を含有する単層スポンジについて、実施例１に記載の方法を用いて、電子線滅菌後の分子量を測定した。結果を以下に示す。
　［結果］
（電子線滅菌の照射線量が２０ｋＧｙの場合）
　ＡＬ２０　：４６，０００
　ＡＬ１００：６３，０００
（電子線滅菌の照射線量が４０ｋＧｙの場合）
　ＡＬ２０　：３３，０００
　ＡＬ１００：４０，０００
実施例２：アルギン酸積層スポンジの各層の溶解速度の測定
　上層または下層が蛍光修飾された積層スポンジをそれぞれ作製し、溶解速度の測定を行った。具体的な方法を以下に示す。なお、蛍光標識試薬としてはＦＴＳＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－５－Ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｉｄｅ）を使用し、アルギン酸の標識は常法により行った。
　蛍光標識されたアルギン酸を用い、実施例１に記載の方法に準じて積層スポンジを作製した。
［材料］
　低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムは、実施例１に記載の通りである。リン酸緩衝液は、リン酸二水素ナトリウム（和光純薬社、１９７－０９７０５（商品名））、リン酸二水素カリウム（和光純薬社、１６６－０４２５５（商品名））、塩化ナトリウム（和光純薬社、１９１－０１６６５（商品名））、塩化カリウム（和光純薬社、１６６－１７９４５（商品名））を用いて調整した。エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（Ｎ００１）はＤｏｊｉｎｄｏ社から購入した。
［使用機器］
　直径８ｍｍ生検トレパン（Ｋａｉ　ｍｅｄｉｃａｌ社　ＢＰ－８０Ｆ（商品名））
　９６穴黒色マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社　１３７１０１（商品名））
　蛍光プレートリーダー　（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社　ＡＲＶＯ　Ｘ３（商品名））
［手順］
　まず、蛍光修飾された積層スポンジを直径８ｍｍの生検トレパン（Ｋａｉ　ｍｅｄｉｃａｌ社　ＢＰ－６０Ｆ（商品名））で打ち抜いた。これを１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍＬ中に浸漬し、一定時間毎に浸漬液を２００μＬずつ回収した。回収した溶液を９６穴プレートに移し、蛍光プレートリーダーによって蛍光強度を測定することで、溶解したアルギン酸量を定量化した。
［結果］
　積層スポンジの各層の溶解挙動の測定結果を、図２に示す。図２に示されているように、下層では、アルギン酸の１価金属塩の２５±１０重量％が１時間以内に溶出し、８０±１０重量％が４時間以内に溶出していた。一方、上層は、アルギン酸の１価金属塩の７０±１０重量％が１時間以内に溶出し、９０±１０重量％が４時間以内に溶出していた。また、上層のアルギン酸の１価金属塩の溶出量を１００％としたときの、下層のアルギン酸の１価金属塩の溶出量の割合は、測定開始から１時間の時点で３６％（５０％未満）、２時間の時点で５５％（７０％未満）であった。
　このように上層の溶解速度が、下層に比べて速いことが確認できた。下層を創傷部側、上層を腹腔側に向けてアルギン酸スポンジを適用することで、下層は、創傷部に残留して創傷部の癒着を防止することができるとともに、上層は比較的速く溶解して創傷部から遠く離れた場所にも多数形成されるｄｅ　ｎｏｖｏ癒着、例えば、腹腔内全般の癒着等を抑えることができると考えられる。
　なお、実施例１－２で作製した各積層スポンジ（ＡＬ１０（上層）－ＡＬ１００（下層）；ＡＬ２０（上層）－ＡＬ１００（下層）；ＡＬ２０（上層）－ＡＬ５００（下層））についても同様にして溶解速度の測定を行った結果、実施例１で作製した積層スポンジ（ＡＬ１０（上層）－ＡＬ５００（下層））と同様の溶解挙動を示した。
実施例３：ラット一部肝切除モデル
　ラット一部肝切除モデルを用いて、癒着の形成を評価した。ラット一部肝切除モデルは、重篤な炎症を惹起し高い強度を有する癒着の形成を再現性高く観察できるモデルである（Ｓｈｉｍｉｚｕ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．，（２０１４）Ｓｕｒｇ　Ｔｏｄａｙ．（４４）：３１４－３２３）。具体的には、以下のように癒着の形成を評価した。
［材料］
　低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムは、実施例１に記載の通りである。
　Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）とヒアルロン酸を混合したシート状材料であり、Ｇｅｎｚｙｍｅ　ＧｍｂＨより入手した。
　Ｉｎｔｅｒｃｅｅｄ（商品名）は、再生酸化セルロースシートであり、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎより入手した。
［実験群］
　Ｃｏｎｔｒｏｌ群（ｎ＝８）：ｌｅｆｔ　ｌａｔｅｒａｌ　ｌｏｂｅの辺縁を３ｃｍ計測し切離し凝固止血した（無処置対照群）。
　５００－１０積層スポンジ群（ｎ＝８）：実施例１で作製したアルギン酸スポンジを癒着防止材として適用した。
　Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ群（ｎ＝８）：２×３ｃｍのＳｅｐｒａｆｉｌｍを癒着防止材として適用した。
　Ｉｎｔｅｒｃｅｅｄ群（ｎ＝８）：２×３ｃｍのＩｎｔｅｒｃｅｅｄを癒着防止材として適用した。
　［手順］
　ペントバルビタール３５ｍｇ／ｋｇ相当の腹腔投与によりラットに麻酔をかけ、体重を電子天秤で測定した。その後、ラットを、正中切開で開腹した。次に、腹壁をピンセットでつまんで持ち上げ、腹壁を切断した。肝切除を行う前準備として、ｌｅｆｔ　ｌａｔｅｒａｌ　ｌｏｂｅを腹腔の奥から引き出し、その下にガーゼを敷いた。次に、実際の肝切除に移った。具体的には、ものさしを肝臓にあて、離断面が３ｃｍになる位置を探し、その両端に、バイポーラで焼灼し、印をつけた。印をつけた２点の間を直線的に切除していった。Ｃｏｎｔｒｏｌ群では、この後すぐ閉腹して処置を終了した。癒着防止材を適用する群では、この後、ガーゼを除去したのちに癒着防止材を適用した。次に、腹壁と皮膚を二回に分けて縫合し閉腹した。腹壁を縫合する際には生分解糸を用い、皮膚を縫合する際には非吸収糸を用いた。閉腹から一週間後に、ラットに過剰量の麻酔として約２ｍＬのペントバルビタールの過剰投与によって安楽死させ、体重を電子天秤で測定した。その後、再び開腹し、以下の通り癒着を評価した。脾臓重量は、腹腔から脾臓を摘出した後、電子天秤で測定した。
　［癒着の評価］
　以下の通り、癒着の評価を行った。
（１）離断面
　上記［手順］に記載した肝離断面について、以下の（ａ）、（ｂ）の評価を行った。
（ａ）癒着グレード
　癒着の評価は、目視により行った。肝離断面について、下記スコアリング法に基づき癒着スコアをつけた。
　癒着スコア：
　　Ｇｒａｄｅ０：癒着が全く見られない。
　　Ｇｒａｄｅ１：自重により剥離する程度の癒着（生理的な癒着）
　　Ｇｒａｄｅ２：ピンセットによる剥離が可能な癒着（鈍的な癒着）
　　Ｇｒａｄｅ３：ハサミ、メスを使わないと剥離できない癒着（鋭的な癒着）
（ｂ）癒着Ｅｘｔｅｎｔ
　３ｃｍの肝離断面のうち、癒着が形成された幅を定規（ものさし）にて計測し、長さ（単位：ｍｍ）で表した（従って、離断面の最大Ｅｘｔｅｎｔは３０ｍｍとなる）。
（２）非離断面
　肝離断面以外、具体的には肝表面、大網、腹膜、小腸、正中創直下、等について、以下の（ａ）、（ｂ）の評価を行った。
（ａ）癒着グレード
　癒着の評価は、目視により行った。肝離断面以外の部位について、下記スコアリング法に基づき癒着スコアをつけた。部位は特定せず、認められた癒着スコアの最大値を、その試験動物の癒着スコアとして記録した。
　癒着スコア：
　　Ｇｒａｄｅ０：癒着が全く見られない。
　　Ｇｒａｄｅ１：自重により剥離する程度の癒着（生理的な癒着）
　　Ｇｒａｄｅ２：ピンセットによる剥離が可能な癒着（鈍的な癒着）
　　Ｇｒａｄｅ３：ハサミ、メスを使わないと剥離できない癒着（鋭的な癒着）
（ｂ）癒着Ｅｘｔｅｎｔ
　肝離断面以外の部位について、癒着が形成された組織部分について、定規（ものさし）にて、その接着している幅を計測し、長さ（単位：ｍｍ）で表した。上記（２）（ａ）と同様、部位は特定せず、認められた癒着が形成された幅の最大値を、その試験動物の癒着Ｅｘｔｅｎｔとして記録した。
　［結果］
　癒着の評価の結果を図３（離断面）および図４（非離断面）に示した。また、体重測定および脾臓重量測定の結果を図５に示した。
　離断面においては、各群とも、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べて癒着が抑制される傾向が認められた（図３（Ａ）～（Ｃ））。
　非離断面において、５００－１０積層スポンジ群での顕著な癒着防止効果が確認された（図４（Ａ）～（Ｃ））。陽性対照として用いたＳｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）およびＩｎｔｅｒｃｅｅｄ（商品名）では癒着防止効果は認められず、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べて癒着が増悪する傾向が認められた。一方、５００－１０積層スポンジ群では顕著な癒着防止効果が確認された。
　体重および脾臓重量については、Ｃｏｎｔｒｏｌ群、Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ群、Ｉｎｔｅｒｃｅｅｄ群、および５００－１０積層スポンジ群間で有意差はなく、５００－１０積層スポンジを適用しても、生体に悪影響がないことが確認された（図５（Ａ）および（Ｂ））。
　ここで、実施例における有意差検定は、特に断りがない限りStudent’s t-testによって行い、Gradeの評価のみMann-Whitney U testで行った。
実施例３－２：ペアン鉗子を用いたラット一部肝切除モデル
　肝臓の離断の際にペアン鉗子を用いたことを除き、実施例３と同じ材料、実験群、手順および癒着の評価方法を用いて、肝離断面と非離断面の癒着グレードと癒着Ｅｘｔｅｎｔを評価した。
　ペアン鉗子を用いた肝臓の離断は、具体的には、次のように行った。すなわち、実施例３の［手順］において「印をつけた２点の間を直線的に切除する」のを、ペアン鉗子で肝実質を破砕し、露出した血管をバイポーラで焼灼することにより行った。
［結果］
　癒着の評価の結果を図６（離断面）および図７（非離断面）に示した。また、体重測定および脾臓重量測定の結果を図８に示した。
　離断面においては、各群（ｎ＝８）とも、Ｃｏｎｔｒｏｌ群（ｎ＝８）に比べて癒着が抑制される傾向が認められ、５００－１０積層スポンジ群においては、Ｃｏｎｔｒｏｌ群との間に統計的に有意な差が認められた（図６（Ａ）～（Ｃ））。
　非離断面において、５００－１０積層スポンジ群での顕著な癒着防止効果が確認された（図７（Ａ）～（Ｃ））。陽性対照として用いたＳｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）については癒着防止効果が認められず、Ｉｎｔｅｒｃｅｅｄ（商品名）についてはＣｏｎｔｒｏｌ群に比べて癒着が増悪する傾向が認められた。一方、５００－１０積層スポンジ群では顕著な癒着防止効果が確認された。
　体重および脾臓重量については、Ｃｏｎｔｒｏｌ群、Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ群、Ｉｎｔｅｒｃｅｅｄ群、および５００－１０積層スポンジ群間で有意差はなく、５００－１０積層スポンジを適用しても、生体に悪影響がないことが確認された（図８（Ａ）および（Ｂ））。
実施例４：アルギン酸積層スポンジの各層の蛍光標識による可視化
　アルギン酸積層スポンジの各層について蛍光標識による可視化の試験を以下のように行った。
［材料］
　低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムは、実施例１に記載の通りである。
［使用機器］
　ハンディー紫外線ランプ（ＵＶＰ社　ＵＶＧＬ－５８（商品名））
［手順］
　ラットの肝臓切除の手順は、実施例３に記載の通りである。作製された肝臓の離断面に、第１の層または第２の層が蛍光標識されたアルギン酸スポンジを貼付した。貼付には、材料の残存を観察しやすくするために、実施例１よりも多い４．０ｍｇ／ｃｍ２のアルギン酸を使用した積層スポンジを実施例１の方法に準じて作製し、使用した。その後、実施例３に記載の手順で閉腹し、１週間後に開腹を行った。露出した腹腔内にランプで紫外線を照射し、蛍光標識されたアルギン酸の腹腔内分布を可視化した。
　その結果、ＡＬ１０層は、離断面に加え、腹膜の表面にも広く分布することが確認できた。このことから、スポンジ状積層体の第２の層はアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が比較的低いため、速やかに腹腔内で溶けて広がることが示唆された。
　また、ＡＬ５００層は、一部腹壁などでも見られるものの、離断面からの蛍光がより際立って観察された。このことから、スポンジ状積層体の第１の層はアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が比較的高いため、離断面に留まって物理的なバリアとなることが示唆された。
実施例５：巻き付け試験
　アルギン酸積層スポンジの曲面への貼付追従性を示すために、巻き付け試験を以下のように行った。
［材料］
　低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムは、実施例１に記載の通りである。寒天（０１０－０８７２５）は、和光純薬から購入した。
［手順］
　寒天をお湯に溶解した後、円柱状の型に流し込んで冷やし、直径２０ｍｍのアガロースゲル円柱を作製した。これをモデル管状臓器とし、実施例１で作製したスポンジを巻き付けることで、巻き付けの追従性を検証した。
　その結果、アルギン酸積層スポンジの柔軟性から、腸管を模した円柱への巻き付けが可能であることが確認できた。このことから、スポンジ状積層体を含む癒着防止材が、腸管吻合などにも使用が可能になることが示唆された。
実施例６：スポンジのプレスと膨潤試験
　アルギン酸積層スポンジのプレス、プレス後の厚みの測定および膨潤試験を以下のように行った。
［材料］
　アルギン酸積層スポンジ（ＡＬ１０（上層）－ＡＬ５００（下層））は、実施例１に記載の通りである。
［試薬］
　アガロースは、和光純薬工業株式会社から入手した（商品コード：０１０－０８７２５）。
［手順］
（１）プレスおよびプレス後の厚みの測定
（１－１）手動プレス
　アルギン酸積層スポンジを平面上に静置し、手のひらで、アクリル定規を介してスポンジ全体に均一に圧がかかるよう押圧した。押圧前後のスポンジの厚みを電子ノギスにて計測し、平均値を算出した（ｎ＝４）。
（１－２）プレス機によるプレス
　アルギン酸積層スポンジをプレス機（アズワン株式会社製、製品名ＡＨ－１Ｔ）にセットした。１０ＭＰａの圧力で室温にてアルギン酸積層スポンジをプレスし、５分間保持した。プレス後のスポンジの厚みを電子ノギスで測定し、平均値を算出した（ｎ＝４）。
（２）膨潤試験
　アガロースを熱湯に２重量％で溶解させ、室温まで冷却することでアガロースゲルを作製した。アガロースゲルを２ｃｍ×２ｃｍ角に切り取り、ガラスシャーレ上で純水に浸漬し、湿潤させた。
　１ｃｍ×１ｃｍ角に切り取ったプレス前後のアルギン酸積層スポンジをアガロースゲル上に静置した。一定時間毎に横方向から撮影し、撮影した画像からスポンジの厚みを算出し、膨潤に及ぼすプレスの影響の有無を確認した（プレス前：ｎ＝３；プレス後：ｎ＝３。尚、膨潤試験では、プレスしたアルギン酸積層スポンジとして、プレス機によりプレスしたものを用いた。
［結果］
　プレス後の厚みの測定結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　スポンジの厚みの平均値は、プレス前は約１．５ｍｍ、手動プレス後は約０．３３ｍｍ、プレス機によるプレス後は約０．１６ｍｍであった。なお、プレスしたスポンジは、時間経過により厚みが増すことなく、上記の厚みが維持された。
　膨潤試験における経時的なスポンジの厚みの変化を図９に示す。膨潤試験の結果から、プレスしたアルギン酸積層スポンジは、吸水して、プレスしないアルギン酸スポンジとほぼ同等の厚みとなることが確認された。
　このことから、スポンジをプレスすることによりコンパクトにまとめることができるので、内視鏡手術においてトロッカー等を介して癒着防止材であるスポンジを患部に比較的容易に適用できることが示唆された。
　さらに、患部に適用されたプレスしたスポンジは、患部に存在する、または患部に適用される水分を吸収して、厚みが回復することも示唆された。厚みが回復することにより、積層スポンジとしての機能を発揮し得る。
実施例７：霧吹き試験
　アルギン酸積層スポンジおよびＳｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）について、吸水時の脆弱性を評価するために以下の試験を行った。
［材料］
　アルギン酸積層スポンジは実施例１に、Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）は実施例３に記載の通りである。また、アルギン酸積層スポンジのプレス有りものとして、実施例６に記載のプレス機によりプレスしたものを用いた。
［手順］
　アルギン酸積層スポンジおよびＳｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）から１ｃｍ×２ｃｍの試験片を作成した。試験片の片端１ｃｍ×１ｃｍに両面テープを貼付し、試験台の端に把持した。これにより他方の端１ｃｍ×１ｃｍが中空に出るように試験片を固定した。
　各試験片に対し、霧吹きを用いて純水を５回噴霧した。試験片が湿潤に伴って下方に折れ曲がっていく過程を動画で撮影した。
　得られた動画の画像解析によって、試験片先端の試験台からの高さと角度の両方を算出し、その時間変化をプロットした。
［結果］
　結果を図１０に示した。
　高さについては、アルギン酸積層スポンジは、霧吹き後５０秒まで高さの低下は２ｍｍ以内であり、９０秒後においても３ｍｍ程度であった（図１０（Ａ））。また、プレス有りのアルギン酸積層スポンジも、霧吹き後９０秒後においても高さの低下は９ｍｍ程度であった。いっぽう、Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ（商品名）は、霧吹き直後から著しい高さの低下が認められた（図１０（Ａ））。角度についても、高さの結果と同様の結果であった（図１０（Ｂ））。
　このことから、アルギン酸積層スポンジは、プレスの有無に関わらず吸水状態にあっても暫くはその形状、強度が維持されることが示唆された。このため、癒着防止材として患部に適用した際に、貼付位置を調整して貼り直すことが可能である、あるいは、内視鏡手術の際、トロッカー等を介して癒着防止材であるスポンジを患部に適用する際に、トロッカー内の水分を吸収して上手く広げることができない等の事態が避けられる、などの利点がある。なお、アルギン酸積層スポンジが、患部、あるいはそのモデル系に対して好適な圧着性を有することは、実施例３、実施例５等において確認している。
　１　　癒着防止材
　２　　第１の層
　３　　第２の層
　４　　スポンジ状積層体
 

Claims (16)

  1. 　少なくとも一部が硬化剤で架橋された、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩のスポンジ状の第１の層および第２の層を含み、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が１０，０００～２，０００，０００であり、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が１，０００～１，０００，０００であり、前記重量平均分子量が脱架橋処理後にＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定したものであり、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量よりも高い、滅菌された、生体に適用可能なスポンジ状積層体を含む、癒着防止材。
  2. 　第１の層および第２の層のいずれか一方が、硬化剤を含む請求項１
    に記載の癒着防止材。
  3. 　第１の層および第２の層の両方が、硬化剤を含む請求項１または２に記載の癒着防止材。
  4. 　低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩の第１の層と第２の層での使用量の合計が、０．１ｍｇ／ｃｍ２～３ｍｇ／ｃｍ２の範囲である、請求項１～３のいずれか１項に記載の癒着防止材。
  5. 　第１の層と第２の層のアルギン酸の１価金属塩のエンドトキシン含有量が、５００ＥＵ／ｇ以下である、請求項１～４のいずれか１項に記載の癒着防止材。
  6. 　第１の層と第２の層のアルギン酸の１価金属塩が、アルギン酸ナトリウムまたはアルギン酸カリウムである、請求項１～５のいずれか１項に記載の癒着防止材。
  7. 　第１の層と第２の層の硬化剤が、ＣａＣｌ２、ＣａＳＯ４、ＺｎＣｌ２、ＳｒＣｌ２、ＦｅＣｌ３およびＢａＣｌ２からなる群より選択される少なくとも１つの金属イオン化合物である、請求項１～６のいずれか１項に記載の癒着防止材。
  8. 　第１の層を創傷部側の表面に向けて適用するための、請求項１～７のいずれか１項に記載の癒着防止材。
  9. 　少なくとも一部が硬化剤で架橋された低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩をそれぞれ含む第１の層および第２の層を含む生体に適用可能なスポンジ状積層体を含み、第１の層の溶解速度が、第２の層よりも遅い、癒着防止材。
  10. 　ｐＨ７．５のリン酸緩衝液に対するアルギン酸の１価金属塩の溶出を指標とする溶解試験において、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の溶出量を１００％としたときの、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の溶出量の割合が、測定開始から１時間の時点で５０％未満、２時間の時点で７０％未満である、請求項９の癒着防止材。
  11. 　ｐＨ７．５のリン酸緩衝液に対するアルギン酸の１価金属塩の溶出を指標とする溶解試験において、第１の層は、アルギン酸の１価金属塩の２５±１０重量％が１時間以内に溶出し、８０±１０重量％が４時間以内に溶出するものであり、第２の層は、アルギン酸の１価金属塩の７０±１０重量％が１時間以内に溶出し、９０±１０重量％が４時間以内に溶出するものである、請求項９の癒着防止材。
  12. 　スポンジ状積層体がプレスしたものである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の癒着防止材。
  13. 　少なくとも一部が硬化剤で架橋された低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩のスポンジ状の第１の層および第２の層を含み、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が１０，０００～２，０００，０００であり、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が１，０００～１，０００，０００であり、前記重量平均分子量が脱架橋処理後にＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定したものであり、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が、第２の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量よりも高い、滅菌された、生体に適用可能なスポンジ状積層体を、癒着防止を必要とする対象に、第１の層を創傷部側の表面に向けて適用することを含む、癒着防止方法。
  14. 　以下の工程を含む、生体に適用可能なスポンジ状積層体を含む癒着防止材の製造方法。
    　（１）重量平均分子量１０，０００～２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を硬化剤により硬化させる工程、
    　（２）硬化したアルギン酸の１価金属塩を凍結する工程、
    　（３）（２）で得られたアルギン酸の１価金属塩の上で、重量平均分子量１，０００～１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を硬化剤により硬化して積層体を得る工程、
    　（４）得られた積層体を凍結乾燥してスポンジ状積層体を得る工程、
    　ここで、前記分子量がＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定したものであり、
    　前記スポンジ状積層体は、重量平均分子量１０，０００～２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第１の層と、重量平均分子量１，０００～１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第２の層とを含み、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が第２の層よりも高い。
  15. 　以下の工程（１）～（４）により得られる生体に適用可能なスポンジ状積層体。
    　（１）重量平均分子量１０，０００～２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を硬化剤により硬化させる工程、
    　（２）硬化したアルギン酸の１価金属塩を凍結する工程、
    　（３）（２）で得られたアルギン酸の１価金属塩の上で、重量平均分子量１，０００～１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を硬化剤により硬化して積層体を得る工程、
    　（４）得られた積層体を凍結乾燥してスポンジ状積層体を得る工程、
    　ここで、前記分子量がＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定したものであり、
    　前記スポンジ状積層体は、重量平均分子量１０，０００～２，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第１の層と、重量平均分子量１，０００～１，０００，０００の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含むスポンジ状の第２の層とを含み、第１の層のアルギン酸の１価金属塩の重量平均分子量が第２の層よりも高い。
  16. 　癒着防止材として用いる、請求項１５のスポンジ状積層体。
     
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