WO2021145325A1 - アルギン酸塩を使用した対象の処置のための組合せ及び方法 - Google Patents

アルギン酸塩を使用した対象の処置のための組合せ及び方法 Download PDF

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水野　均
彬 ▲高▼橋
俊弥 遠藤
真一 阪上
倫政 岩崎
智洋 小野寺
岩崎　浩司
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持田製薬株式会社
国立大学法人北海道大学
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    • A61L2430/06—Materials or treatment for tissue regeneration for cartilage reconstruction, e.g. meniscus

Definitions

  • the present invention relates to a treatment technique for a subject using an alginic acid monovalent metal salt, which is useful for cartilage regeneration and the like.
  • Articular cartilage such as the knee, has little self-healing ability due to the lack of blood vessels and nerve networks, so if cartilage defects are left untreated, it can lead to joint pain and loss of joint function, often with osteoarthritis of the joint. It may develop into a disease.
  • the progression of the condition may result in extensive cartilage defects.
  • Treatments for cartilage damage include autologous osteochondral column transplantation (mosaicplasty), pick-drilling (microfracture), drilling, bar-shaving (abrasion), and injured cartilage resection (abrasion). Surgical procedures such as debridement) are known.
  • the microfracture method, drilling, and abrasion method are called bone marrow stimulation techniques, which promote bleeding from the bone marrow, induce bone marrow-derived cartilage progenitor cells, and are expected to differentiate into cartilage. be.
  • the bone marrow stimulation method has a problem that fibrocartilage having different mechanical properties from the original hyaline cartilage is formed.
  • a material in which a monovalent metal salt of alginic acid is dissolved to make it fluid is applied to a defect portion of cartilage tissue, a cross-linking agent is added for fixation to gelate, and the material is left in place for a predetermined period. It is known that the formation of hyaline cartilage is promoted and it is useful as a composition for cartilage regeneration (Patent Document 1).
  • Patent Document 2 a composition for local hemostatic activity containing a component having a hemostatic effect and a pigment applicable to the human body is disclosed, and examples of the component having a hemostatic effect include thrombin, sodium alginate, and a vasoconstrictor, and one of the pigments is Blue No. 1 is mentioned.
  • Patent Document 3 no specific example of actually using sodium alginate is disclosed.
  • the present inventors When using the alginic acid monovalent metal salt, the present inventors have determined whether the alginic acid monovalent metal salt has been applied to a desired location, whether the gelation by a cross-linking agent is sufficient, and whether the once gelled portion is damaged. I realized that it is difficult to confirm. That is, for example, in arthroscopic treatment, the user may use an excessive amount of a material containing an alginic acid monovalent metal salt or a material for gelation thereof due to the uncertainty of fixation. After the administration of the above, it was necessary to take measures such as washing with a sufficient amount of physiological saline or the like. However, it is desirable that the material applied in this way does not spread to the periphery other than the target location as much as possible. It is also desired to save labor in cleaning work.
  • an object of the present invention is to realize reliable fixing of a material containing a monovalent metal salt of alginic acid in a fluid state when the material is applied.
  • Another object of the present invention is to contain a coloring component and an alginic acid monovalent metal salt, and the coloring component does not precipitate even when stored at a low temperature of about 2 to 8 ° C. for a certain period of time (for example, one month). That is, to provide a composition that can be stably stored.
  • the present invention is as follows.
  • a first agent (material) composition containing an alginic acid monovalent metal salt and a second agent (material) composition containing a cross-linking agent having an action of cross-linking the alginic acid monovalent metal salt are included.
  • the first agent (material) composition is applied to the subject in a fluid state, and the second agent (material) composition is brought into contact with the first agent (material) composition applied to the subject.
  • the first agent (material) composition is a combination of the compositions used so as to gel at least a part thereof, and the first agent (material) composition is applied to the subject by further containing a coloring component.
  • the combination is characterized in that the state of formation of a gel film on the surface of the first agent (material) composition can be evaluated.
  • a first agent (material) composition containing an alginic acid monovalent metal salt and a second agent (material) composition containing a cross-linking agent having an action of cross-linking the alginic acid monovalent metal salt are included.
  • the first agent (material) composition is applied to the subject in a fluid state, and the second agent (material) composition is brought into contact with the first agent (material) composition applied to the subject.
  • the combination is characterized in that the state of formation of a gel film on the surface of the given first agent (material) composition can be evaluated.
  • the evaluation of the formation state of the gel film is an evaluation of the presence or absence of outflow of the fluidized state of the first agent (material) composition applied to the subject.
  • the combination according to. [3] The evaluation of the formation state of the gel film is carried out after (1) cleaning the surface of the gel film of the first agent (material) composition applied to the target and / or (2) the target.
  • the combination according to the above [3] wherein the pressure on the gel film surface is performed by bringing an instrument into contact with the gel film surface.
  • the subject is at least one selected from the group consisting of bone tissue, cartilage tissue, osteochondral tissue, intervertebral disc tissue, meniscus tissue, and ligament, any one of the above [1] to [4].
  • [6] The combination according to any one of the above [1] to [5], wherein the first material composition contains a blue to green dye that can be applied to a living body as the coloring component.
  • the composition of the first material contains a monovalent metal salt of alginic acid, a blue to green dye that can be applied to a living body, and sodium chloride, and is a composition that can be stored under the conditions of 2 ° C to 8 ° C.
  • the coloring component is 0.0005% by mass to 0.05% by mass of Blue No.
  • the medium environment is a pH environment.
  • the first material composition is a sol or liquid having a pH of 6 or more and a pH of 8 or less
  • the second material composition is a liquid having a pH of 4 or more and less than pH 6 or a pH of more than pH 8 and a pH of 12 or less.
  • the coloring component is a pH-sensitive dye or a pH-sensitive dye coated with a material for delaying dissolution.
  • the present invention provides the following treatment methods for the subject, and for example, the following configurations may be adopted.
  • [2-1] A step of applying a first agent (material) composition containing an alginic acid monovalent metal salt and a coloring component to a subject in a fluid state, and an action of cross-linking the alginic acid monovalent metal salt.
  • a method for treating the subject which comprises a step of evaluating the formation state of a gel film on the surface of the first agent (material) composition.
  • the evaluation of the formation state of the gel film is an evaluation of the presence or absence of outflow of the fluidized state of the first agent (material) composition applied to the subject.
  • [2-3] The evaluation of the formation state of the gel film is carried out after (1) cleaning the surface of the gel film of the first agent (material) composition applied to the target and / or (2) the target.
  • the subject is at least one selected from the group consisting of bone tissue, cartilage tissue, osteochondral tissue, intervertebral disc tissue, crescent tissue, and ligament, as described above [2-1] to [2-]. 4] The method according to any one of the items. [2-6] In any one of the above [2-1] to [2-5], wherein the first material composition contains a blue to green dye that can be applied to a living body as the coloring component. The method described.
  • the first material composition contains an alginic acid monovalent metal salt, a blue to green dye that can be applied to a living body, and sodium chloride, and can be stored under the conditions of 2 ° C to 8 ° C.
  • the present invention provides alginic acid monovalent metal salts for use in the following treatments of the subject, for example the following configurations may be employed.
  • the first agent (material) and the second agent (material) composition for use in the treatment of the subject which comprises a step of evaluating the formation state of a gel film on the surface of the first agent (material) composition. Combination of.
  • bioapplicable compositions are provided, and for example, the following configurations may be adopted.
  • [4-1] A biologically applicable composition containing a monovalent metal salt of alginic acid and to be applied to a subject in a fluid state, and is a blue to green color that can be applied to a living body as a coloring component.
  • the bioapplyable composition which comprises a dye.
  • [4-2] The biological application according to [4-1], wherein the subject is at least one selected from the group consisting of bone tissue, cartilage tissue, osteochondral tissue, intervertebral disc tissue, meniscus tissue, and ligament. Composition.
  • a spectrocolorimeter (light source: D65 / 2, measurement mode:) when comparing the composition of the bioapplied composition after storage for one month in a refrigerator at a set temperature of 5 ° C. and before storage.
  • the alginic acid monovalent metal salt has a weight average molecular weight (absolute molecular weight) of 10,000 to 1,000,000 as measured by the GPC-MALS method, according to the above [4-1] to [4-6].
  • the bioapplicable composition according to any one of the following items.
  • [4-9] The bioapplyable composition according to any one of [4-1] to [4-8], wherein the bioapplied composition further contains another monovalent metal salt.
  • the bioapplied composition contains a monovalent metal salt of alginic acid, a blue to green dye that can be applied to a living body, and sodium chloride, and can be stored under the conditions of 2 ° C to 8 ° C.
  • the bioapplyable composition according to any one of [4-1] to [4-10] which is a composition and is in a solution state or a dry state at the time of storage.
  • the bioapplied composition is any one of [4-1] to [4-11], which is a composition for use so that at least a part of the composition is gelled when applied to a subject.
  • [4-13] Any one of the above [4-1] to [4-12], wherein the coloring component is 0.0005% by mass to 0.05% by mass of Blue No. 1 (Brilliant Blue FCF).
  • the action of cross-linking the monovalent metal salt of alginic acid by containing a coloring component when a material in which a monovalent metal salt of alginic acid is dissolved to be in a fluid state is applied to a subject, the action of cross-linking the monovalent metal salt of alginic acid by containing a coloring component. It is possible to easily confirm whether or not the treatment for gelling and fixing with a cross-linking agent having is sufficient. Thereby, the reliable fixing can be realized.
  • a pigment that is permitted to be used in a living body by national regulations as a coloring component that gives visibility that is, a dye that can be applied to a living body, it can be safely used for humans and the like. ..
  • compositions containing a coloring component and an alginic acid monovalent metal salt that can be stably stored for a certain period of time under a low temperature condition of about 2 ° C. to 8 ° C. are provided, it is highly safe and easy to use.
  • the combination, treatment method, and bioapplyable composition of the present invention have one or more of the above effects.
  • the present invention relates to the use of alginic acid monovalent metal salts. Specifically, for example, it has been reported that application of a monovalent metal salt of alginic acid to a damaged or defective part of cartilage promotes regeneration of cartilage tissue at that part (Patent No. 4740369). .. In addition, for example, by applying an alginic acid monovalent metal salt to the cavity after excision (excision) of the intervertebral disc nucleus pulposus as a nucleus pulposus filling material, regeneration of the intervertebral disc nucleus pulposus is promoted and degeneration of the entire intervertebral disc tissue is suppressed. (Patent No. 6487110).
  • alginic acid monovalent metal salts are useful for regenerating, repairing, and protecting damaged or defective tissues.
  • the combination, method or bioapplicable composition of the present invention is preferably used for injured or defective parts such as bone tissue, cartilage tissue, osteochondral tissue, intervertebral disc tissue, crescent tissue and ligament.
  • "damage” also includes “deficiency”, “rupture”, “lesion” and the like.
  • the range of organisms is not limited to humans. Non-human organisms such as dogs, cats, pigs, rabbits, sheep, horses, cows, monkeys, birds, mice, rats, guinea pigs, hamsters and the like are also included.
  • a composition containing the alginic acid monovalent metal salt is used as the first agent (material).
  • a composition containing a cross-linking agent having an action of cross-linking an alginic acid monovalent metal salt is used as the second agent (material). Then, the first agent (material) composition was applied to the subject in a fluid state, and the first agent (material) composition applied to the second agent (material) composition was applied. Contact is made to gel at least a portion of it. As a result, the first agent (material) composition applied to the subject can be fixed and prevented from being displaced or leaking from the applied position.
  • the first material composition further contains a coloring component. Then, by observing the colored component as an index, it is possible to evaluate the formation state of the gel film on the surface of the first material composition applied to the subject.
  • the “gel film” is a gel formed on the surface of the first material composition by bringing the second material composition containing the cross-linking agent into contact with the first material composition.
  • “Can be evaluated” means that the formation state of the gel film on the surface of the first material composition can be visually confirmed, and further, not only by direct visual inspection but also by a microscope or inside. It means that confirmation can be performed through an endoscope (especially in the case of joint application, an arthroscope).
  • the composition in a fluid state among the first material compositions applied to the subject flows out is included in the first material composition. It can be carried out by observing the colored components as an index.
  • the state of formation of the gel film is evaluated when the first material composition is applied to bone tissue, cartilage tissue, osteochondral tissue, intervertebral disc tissue, meniscus tissue, ligament and the like. It is preferably easy.
  • a pigment exhibiting a color tone such as a neutral color system (for example, green) or a cold color system (for example, blue)
  • the peripheral tissue, blood (red / yellow color tone), and cartilage (white color tone) are in the visual field in the treatment or the like.
  • Shadows blackish color tone
  • examples of such pigments include Green No.
  • the coloring component used in the present invention is preferably a dye that is permitted to be used in a living body by regulations of the country or the like, that is, a dye that can be applied to a living body, which will be described later.
  • the coloring component used in the present invention is used under low temperature conditions of about 2 to 8 ° C. when the first material composition or the bioapplyable composition is prepared according to the description of the present specification. It is preferable that the coloring component can be stably stored for a certain period of time.
  • the coloring component may bring about a color tone change according to the medium environment.
  • the coloring component when the first material composition applied to the subject flows out, the coloring component is exposed to changes in the medium environment, and the color tone also changes accordingly. It will be easier to know more reliably whether or not it has leaked.
  • the formation of the gel film occurs by contact with the first material composition as the second material composition containing the cross-linking agent diffuses near the surface of the first material composition applied to the subject. Therefore, by grasping the situation where the coloring component causes the color tone change, the color tone change reflects the gelling state near the surface of the first material composition applied to the target, and thus the gel. It becomes easier to grasp the formation state of the film.
  • a pH-sensitive dye that causes a color tone change according to the pH environment is preferable.
  • pH-sensitive dyes include dyes having a color change range on the acidic side and dyes having a color change range on the basic side. Therefore, if desired, a dye having an appropriate color change range can be used. Tables 1 and 2 show typical pH-sensitive dyes.
  • the pH of the second material composition when the pH of the second material composition is pH 4 or more and less than pH 6, the pH of the first material composition is set to pH 6 or more and pH 8 or less, and a diazo such as methyl red is used.
  • a salton-based pigment such as bromocresol green may be used.
  • the pH of the second material composition is more than pH 8 and pH 12 or less, the pH of the first material composition is set to pH 6 or more and pH 8 or less, and a lactone-based dye such as phenolphthalein is used as described above. It can have the effect of visualizing the gel film.
  • an anthocyanin-based pigment such as anthocyanidin may be used.
  • an appropriate content can be appropriately set as needed, but typically, as an example, 0.0005 w / v% to 1.) of the entire first material composition. It is preferably 0 w / v%, more preferably 0.001 w / v% to 1.0 w / v%, and even more preferably 0.01 w / v% to 1.0 w / v%.
  • the content of the coloring component may be 0.0005 w / w% to 1.0 w / w% of the entire first material composition, preferably 0.0005 w / w% to 0. .1w / w%.
  • the numerical range indicated by using "-" indicates the range including the numerical values before and after "-" as the minimum value and the maximum value, respectively.
  • the pH-sensitive dye may be coated with a material for delaying dissolution.
  • a material for delaying dissolution that can be used in such an embodiment, CMEC (carboxymethyl ethyl cellulose), methacrylic acid copolymer S, methacrylic acid copolymer L, or a pH range in which these are dissolved by mixing them in an appropriate ratio is pH 8 Examples thereof include those appropriately adjusted within the range of ⁇ 12.
  • a method for coating the dye As a method for coating the dye, a method of microencapsulating using a material for delaying dissolution, a method of kneading with a material for delaying dissolution and then granulating by pulverization or extrusion granulation, and a method of forming fine particles by a spray-drying method. It can be prepared by such a well-known method.
  • FIG. 1 illustrates the operation in more detail by taking as an example the case where the above two agents (materials) are applied to a cartilage defect portion as an embodiment of the present invention.
  • the first agent (material) composition 1 containing an alginic acid monovalent metal salt is prepared into a fluid composition in a sol or liquid state, and the cartilage defect portion 2 is prepared with an injector such as a syringe (not shown).
  • the cartilage defect portion 2 may be subjected to, for example, a bone marrow stimulation technique that promotes bleeding from the bone marrow, induces cartilage progenitor cells derived from the bone marrow, and expects differentiation into cartilage.
  • a bone marrow stimulation technique specifically, one or a plurality of holes reaching the subchondral bone with a diameter of about 1.5 mm may be formed by using a pick, a power drill, or the like.
  • one or a plurality of holes having a diameter of about 1.5 mm and not reaching the subchondral bone may be formed. ..
  • the cross-linking agent contained in the second agent (material) composition 3 diffuses to the entire surface of the first agent (material) composition 1 together with the diffusion of the second agent (material) composition 3 (in FIG. 1, in FIG. 1).
  • the first agent (the portion indicated by the reference numeral “1a") is filled in the cartilage defect portion 2 so as to exert a cross-linking action on the alginic acid monovalent metal salt so that the opening of the cartilage defect portion 2 is covered.
  • Material A gel film is formed on the surface of the composition 1 (FIG. 1c).
  • the first agent (material) composition 1 which was in a fluid state when filling the cartilage defect portion 2 is fixed to the cartilage defect portion 2, and the application position thereof is displaced. Leakage from the cartilage defect 2 can be prevented.
  • the inside of the first agent (material) composition 1 other than the vicinity of the surface does not necessarily have to be gelled. Rather, non-gelation may favor the migration and organization of progenitor cells that form the basis of tissue.
  • the first material composition containing an alginic acid monovalent metal salt is applied to the target, and then the second material composition containing a cross-linking agent having an action of cross-linking the alginic acid monovalent metal salt.
  • the method for causing the action is not particularly limited, but for example, a typical surgical method for a living body includes a treatment in which the affected area is incised under direct vision. Alternatively, a percutaneous surgical method (incision of about 5 mm) may be used. Alternatively, as a less invasive procedure, the procedure is performed under a microscope (about 3 to 4 cm incision) or under an endoscope (arthroscope, especially in the case of joint application) (about 1 to 2 cm incision). You may.
  • the visibility at the time of application of the first material composition is improved, so that the field of view is similar to that of the treatment under a microscope or an endoscope (particularly, in the case of joint application, an arthroscope).
  • the merit is especially great when the technique with limited is adopted. For example, in a narrow joint space under arthroscopy, when the first material composition 1 is injected into the cartilage defect portion 2 until it becomes the same height as the surrounding tissue, whether the composition can be properly filled if it is transparent. I don't know and the procedure is difficult. By coloring the composition, the state of filling can be seen, so that the composition can be filled appropriately.
  • the activity of the first material composition on the second material composition can be evaluated in advance by an in vitro test. That is, using the same usage ratio as in actual use, for example, 500 ⁇ L of the first material composition was placed in a test tube having a diameter of 6 mm, and the cross-linking agent was prepared at a predetermined usage ratio. After filling the product from above and allowing it to stand for 1 hour, the surface portion of the composition in the test tube is gelled, while at least 50% of the volume of the composition in the test tube is not gelled and is gelled. The missing portion may be evaluated in advance, for example, at least 50% of the volume of the composition in the test tube can be aspirated with a syringe equipped with a 21G injection needle.
  • Alginic acid monovalent metal salt Alginic acid is a biodegradable high molecular weight polysaccharide, which is a polymer in which two types of uronic acids, D-mannuronic acid (M) and L-gluuronic acid (G), are linearly polymerized. be. More specifically, the homopolymer fraction of D-mannuronic acid (MM fraction), the homopolymer fraction of L-glulonic acid (GG fraction), and D-mannuronic acid and L-gluuronic acid are randomly arranged. It is a block copolymer in which the obtained fractions (MG fractions) are arbitrarily bonded.
  • the composition ratio (M / G ratio) of D-mannuronic acid and L-gluuronic acid of alginic acid differs mainly depending on the type of organism from which seaweed is derived, and is also affected by the habitat and season of the organism. It ranges from a high G type with an M / G ratio of about 0.4 to a high M type with an M / G ratio of about 5.
  • Alginic acid may be of natural origin or a synthetic product, but for example, naturally derived alginic acid derived from brown algae or the like may be used.
  • Alginic acid-containing brown algae thrive in coastal areas around the world, but in practice, the brown algae that can be used as raw materials are limited, such as Lessonia in South America, Macrocistis in North America, Laminaria and Ascophyllum in Europe, Australia's Daviria is a typical example.
  • the genus Lessonia, the genus Macrocytis, the genus Laminaria (the genus Kelp), the genus Ascophyllum, the genus Durvillea, the genus Ecklonia, the genus Ecklonia, etc. Can be mentioned.
  • a monovalent metal salt of alginic acid is used.
  • the alginic acid monovalent metal salt has good solubility and dissolution stability, and is suitable for being applied to a target such as a living tissue in a state of being dissolved in a solvent such as water and having fluidity. It is a form.
  • the alginic acid monovalent metal salt can be prepared by using the above-mentioned brown algae by a known method such as an acid method or a calcium method, or a method similar thereto.
  • the monovalent metal salt of alginate include sodium alginate and potassium alginate, but sodium alginate, which is commercially available, is particularly preferable.
  • the weight average molecular weight is generally 10,000 to 10 million, preferably 20,000 to 8 million, and more preferably 5. It is in the range of 10,000 to 5 million.
  • the molecular weight of the alginic acid monovalent metal salt used in the present invention can be measured according to a conventional method.
  • a typical condition when gel permeation chromatography is used for molecular weight measurement for example, GMPW-XL ⁇ 2 + G2500PW-XL (7.8 mm ID ⁇ 300 mm) can be used as a column.
  • GMPW-XL ⁇ 2 + G2500PW-XL (7.8 mm ID ⁇ 300 mm can be used as a column.
  • a 200 mM aqueous sodium nitrate solution can be used, and as a molecular weight standard, for example, pullulan can be used.
  • an RI detector and a light scattering detector (MALS) can be used as detectors.
  • the molecular weight of the alginic acid monovalent metal salt used in the present invention for example, the weight average molecular weight measured by gel permeation chromatography (GPC) or gel filtration chromatography (collectively referred to as size exclusion chromatography) is preferable.
  • GPC gel permeation chromatography
  • size exclusion chromatography size exclusion chromatography
  • the absolute weight average molecular weight can be measured.
  • the weight average molecular weight (absolute molecular weight) measured by such a GPC-MALS method is preferably 10,000 or more, more preferably 80,000 or more, still more preferably 90,000.
  • the above is more preferably 1 million or less, more preferably 800,000 or less, still more preferably 700,000 or less, and particularly preferably 500,000 or less.
  • the preferred range is 10,000 to 1,000,000, more preferably 80,000 to 800,000, even more preferably 90,000 to 700,000, and particularly preferably 90,000 to 500,000.
  • a measurement error of 10 to 20% or more may occur.
  • the value may fluctuate in the range of 320,000 to 480,000 for 400,000, 400,000 to 600,000 for 500,000, and 800 to 1.2 million for 1,000,000.
  • alginic acid monovalent metal salt tends to have a large molecular weight and a high apparent viscosity, and after undergoing processes such as drying and purification by heat, the molecular weight becomes small and the apparent viscosity is low.
  • Alginic acid monovalent metal salts having different molecular weights can be produced by methods such as controlling conditions such as temperature in the production process, selecting brown algae as a raw material, and fractionating the molecular weight in the production process. Further, it is also possible to obtain an alginic acid monovalent metal salt having a desired molecular weight by mixing it with another lot of alginic acid monovalent metal salt having a different molecular weight or viscosity.
  • the quality of the alginic acid monovalent metal salt used in the present invention can be tested not only by the above-mentioned molecular weight but also by the characteristics of viscosity.
  • the viscosity when dissolved in Milli-Q water to obtain a solution having a concentration of 1 w / w% and the viscosity was measured at 20 ° C. using a cone plate viscometer was 40 mPa ⁇ s to 800 mPa ⁇ ⁇ . It is preferably s, and more preferably 50 mPa ⁇ s to 600 mPa ⁇ s.
  • the alginic acid monovalent metal salt used in the present invention is preferably treated with low endotoxin. According to this, it can be safely applied to a target such as a living tissue without causing fever or the like.
  • the endotoxin level can be confirmed by a known method, for example, it can be measured by a method using Limulus reagent (LAL), a method using Entspecy (registered trademark) ES-24S set (Seikagaku Corporation), or the like. ..
  • the low endotoxin treatment can be performed by a known method known for a polymer material derived from a natural product or a method similar thereto.
  • a known method known for a polymer material derived from a natural product or a method similar thereto for example, the method of Suga et al. For purifying sodium hyaluronate (see, for example, JP-A-9-324001) and the method of Yoshida et al. For purifying ⁇ -1,3-glucan (for example, JP-A-8-269102).
  • William et al.'S method for purifying high molecular weight salts such as alginate and gellan gum (see, eg, JP-A-2002-530440), James et al.'S method for purifying polysaccharides (eg, International Publication No.
  • the low endotoxin treatment of the present invention is not limited to these, such as washing, filtration by a filter (endotoxin removal filter, charged filter, etc.), extrafiltration, column (endotoxin adsorption affinity column, gel filtration column, column with ion exchange resin, etc.) ), Adsorption to hydrophobic substances, resins or activated charcoal, organic solvent treatment (extraction with organic solvent, precipitation / precipitation by addition of organic solvent, etc.), surfactant treatment (for example, JP-A-2005-036036) It can be carried out by a known method such as (see Gazette) or a combination thereof as appropriate. A known method such as centrifugation may be appropriately combined with these treatment steps. It is desirable to appropriately select it according to the type of alginic acid monovalent metal salt and the like.
  • the method of low endotoxin treatment is not particularly limited, but as a result, the endotoxin content is preferably 500 endotoxin units (EU) / g or less, preferably 100 EU, when endotoxin measurement with Limulus reagent (LAL) is performed. It is more preferably / g or less, even more preferably 50 EU / g or less, and particularly preferably 30 EU / g or less.
  • the low-endotoxin-treated sodium alginate can be obtained from commercially available products such as SeaMatrix (registered trademark) (Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.) and PRONOVATMUP LVG (FMC BioPolymer).
  • cross-linking agent having an action of cross-linking a monovalent metal salt of alginic acid is used.
  • a cross-linking agent having an action of cross-linking a monovalent metal salt of alginic acid is used.
  • divalent or higher valent metal ionic compounds such as Ca 2+ , Mg 2+ , Ba 2+ , and Sr 2+.
  • examples of the divalent or higher valent metal ion compound include CaCl 2 , MgCl 2 , CaSO 4 , and BaCl 2 , but CaCl is particularly available because of its availability and gel strength. Two solutions are preferred.
  • the first agent (material) composition in the present invention may contain the above-mentioned alginic acid monovalent metal salt and the coloring component described in the present specification, and is particularly pharmaceutical.
  • a solution once prepared may be provided in a dry state by freeze-drying or the like.
  • the solvent for that purpose is not particularly limited, and examples thereof include purified water, distilled water, ion-exchanged water, milliQ water, physiological saline, and phosphate buffered saline (PBS). These are preferably sterilized and preferably treated with low endotoxin.
  • Milli-Q water can be sterilized by filtration before use. That is, the first material composition is preferably in a solution state or a dry state when it is stored (or provided).
  • the first material composition in the present invention may contain a component other than the above-mentioned alginic acid monovalent metal salt, and in order to obtain the above-mentioned first material composition by a mixing operation thereof, etc. It is desirable to perform this operation in an environment with low endotoxin and bacterial levels.
  • the operation is preferably performed on a clean bench using sterile instruments, and the instruments used may be treated with a commercially available endotoxin remover.
  • the first material composition in the present invention has a property of being applied to an object such as a living tissue, for example, having a fluidity that allows the composition to be allowed to stand at 20 ° C. for 1 hour and then injected with a 21 G injection needle. Is desirable. At this time, if the viscosity is too low, the adhesion to the surrounding tissue of the applied site may be weakened. Therefore, the apparent viscosity is not particularly limited, but is preferably 10 mPa ⁇ s or more, more preferably 100 mPa ⁇ s or more, and further. It is preferably 200 mPa ⁇ s or more, and particularly preferably 500 mPa ⁇ s or more.
  • the apparent viscosity is preferably 50,000 mPa ⁇ s or less, more preferably 20,000 mPa ⁇ s or less, and further preferably 10,000 mPa ⁇ s or less.
  • the apparent viscosity is 20000 mPa ⁇ s or less, it can be more easily applied with a syringe or the like.
  • the apparent viscosity is 20000 mPa ⁇ s or more, it can be applied by using a pressure type or electric type filling device or other means.
  • the preferred range of the composition of the present invention is 10 mPa ⁇ s to 50,000 mPa ⁇ s, more preferably 100 mPa ⁇ s to 30,000 mPa ⁇ s, still more preferably 200 mPa ⁇ s to 20000 mPa ⁇ s, still more preferably 500 mPa ⁇ s to 20000 mPa. ⁇ S, particularly preferably 700 mPa ⁇ s to 20000 mPa ⁇ s. In another preferred embodiment, it may be 500 mPa ⁇ s to 10000 mPa ⁇ s, or 2000 mPa ⁇ s to 10000 mPa ⁇ s. Some, but not limited to, compositions of the present invention have viscosities that can also be applied to the subject with a syringe or the like.
  • the apparent viscosity of the first material composition can be measured according to a conventional method.
  • a co-axis double-cylindrical rotational viscometer, a single cylindrical rotational viscometer (Brookfield type viscometer), a cone-plate type rotational viscometer (cone plate type viscometer), etc. by the rotational viscometer method are used.
  • the apparent viscosity should be set so that it is insoluble in a solvent such as cells in order to accurately measure the viscosity. Is preferable.
  • the apparent viscosity of the first material composition is more preferably measured using a cone plate type viscometer and a sensor 35/1 (cone diameter 35 mm, 1 °).
  • the sample solution is prepared using Milli-Q water.
  • the measurement temperature is 20 ° C.
  • the rotation speed of the cone plate type viscometer is 1 rpm when measuring a 1% solution of alginic acid monovalent metal salt, and 0.5 rpm when measuring a 2% solution, and this is used as a guide for determination.
  • the reading time is measured for 2 minutes in the case of measuring a 1% solution of alginic acid monovalent metal salt, and is an average value from 1 minute to 2 minutes after the start. In the case of 2% solution measurement, measure for 2.5 minutes and use the average value from 0.5 minutes to 2.5 minutes after the start.
  • the test value shall be the average value of three measurements.
  • the apparent viscosity of the first material composition can be adjusted by, for example, the concentration of the alginic acid monovalent metal salt in the composition, the molecular weight of the alginic acid monovalent metal salt used, the M / G ratio, or the like. Alternatively, it can also be adjusted by using two or more kinds of alginic acid monovalent metal salts of different lots having properties of different molecular weights or viscosities in combination.
  • the apparent viscosity of the first material composition tends to increase when the concentration of the alginic acid monovalent metal salt in the composition is high, and the apparent viscosity tends to decrease when the concentration is low. be. Further, when the molecular weight of the alginic acid monovalent metal salt is large, the apparent viscosity tends to be high, and when the molecular weight is small, the apparent viscosity tends to be low. In addition, the apparent viscosity is affected by the M / G ratio of the alginic acid monovalent metal salt used. In this respect, the M / G ratio of the alginic acid monovalent metal salt used in the present invention is preferably 0.1 to 5.0, more preferably 0.1 to 4.0, and 0.2. It is even more preferably ⁇ 3.5.
  • the alginic acid monovalent metal salt used in the present invention is preferably derived from brown algae belonging to the genus Lessonia, Macrocystis, Laminaria, Ascophyllum, Derbilia, etc., and is preferably derived from the genus Lessonia. It is more preferable that it is derived from brown algae belonging to the genus, and it is particularly preferable that it is derived from Lessonia nigressens.
  • the content of the monovalent metal salt of alginic acid is affected by the molecular weight in order to have a property of a certain viscosity, and therefore cannot be unequivocally determined, but 0.1 w / of the entire composition of the first material in the present invention. It is preferably v% or more, more preferably 0.5 w / v% or more, still more preferably 1 w / v% or more. More specifically, the concentration of the alginic acid monovalent metal salt is preferably 0.5 w / v% to 5 w / v%, more preferably 1 w / v% to 5 w / v%, and even more preferably 1 w / v% to 3 w.
  • the concentration of the alginic acid monovalent metal salt is preferably 0.5 w / w% to 5 w / w%, more preferably 1 w / w% to 5 w / w%, still more preferably 1 w / w%. It may be ⁇ 3w / w%, particularly preferably 1.5w / w% ⁇ 2.5w / w%.
  • the first material composition in the present invention is a monovalent alginate metal subjected to the above-mentioned low endotoxin treatment from the viewpoint of being safely applied to a target such as a living tissue without causing heat generation or the like.
  • the endotoxin content of the composition using a salt is preferably 500 endotoxin units (EU) / g or less, preferably 300 EU / g or less, when endotoxin measurement with Limulus reagent (LAL) is performed. It is more preferably 150 EU / g or less, and particularly preferably 100 EU / g or less.
  • the first material composition may contain cells.
  • cells include nucleus pulposus cells, stem cells, stromal cells, mesenchymal stem cells, bone marrow stromal cells, and the like, and the origin is not particularly limited, but includes disc nucleus pulposus, bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood, and the like. Can be mentioned.
  • ES cells and iPS cells can also be mentioned as cells.
  • the cells to be used are collected from the nucleus pulposus, bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood, etc., as necessary, and subjected to a treatment for concentrating the target cells or a treatment for culturing to increase the number of cells.
  • Prepared cells can be used. And, although it depends on the type of cells, typically, for example, 1 ⁇ 10 4 cells / ml or more, or 1 ⁇ 10 5 cells / ml or more, preferably 1 ⁇ 10 4 in the first material composition. It can contain cells / ml to 1 ⁇ 10 7 cells / ml.
  • the cells may be commercially available and used.
  • the first material composition may contain a factor that promotes cell growth.
  • factors include BMP (Bone morphogenetic protein), FGF (Fibroblast growth factor), VEGF (Vascular endothelial growth factor), HGF (Hepatocyte growth factor), TGF- ⁇ (Transforming growth factor- ⁇ ), and IGF.
  • BMP Bismaleic acid
  • FGF Fibroblast growth factor
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • HGF Hepatocyte growth factor
  • TGF- ⁇ Transforming growth factor- ⁇
  • IGF IGF.
  • -1 Insulin-like growth factor-1
  • PDGF Platinum-derived growth factor
  • CDMP Cartilage-derived-morphogenetic protein
  • CSF Coldy stimulating factor
  • EPO Erythropoietin
  • IL Interleukin
  • PRP Platelet rich plasma
  • SOX transcription factor
  • IF Interferon
  • the first material composition does not contain these factors. Even when the growth factor is not contained, the action and effect of alginic acid monovalent metal salt such as regeneration of cartilage tissue is sufficiently good, and the safety is higher than that in the case of actively suppressing cell death.
  • the first material composition may contain a factor that suppresses cell death.
  • factors that cause cell death include Caspase, TNF ⁇ , and the like, and examples of factors that suppress these include antibodies, siRNA, and the like. These factors that suppress cell death may be produced by a recombinant method or may be purified from a protein composition.
  • the first material composition does not contain these factors. Even when the factor that suppresses cell death is not contained, the action and effect of alginic acid monovalent metal salt such as regeneration of cartilage tissue is sufficiently good, and it is safer than the case where cell death is actively suppressed. Is also expensive.
  • the first material composition is optionally further tensioned with other pharmaceutically active ingredients, stabilizers, emulsifiers, osmoregulators, buffers, isotonic.
  • Ingredients commonly used in pharmaceuticals such as conventional ingredients such as agents, preservatives, and soothing agents, may be included.
  • the first material composition may contain a monovalent metal salt such as sodium chloride or potassium chloride, or an ammonium salt such as ammonium chloride, and is preferably a monovalent metal salt. , More preferably sodium chloride.
  • the first material composition basically does not necessarily require a cross-linking agent that gels the composition.
  • the first material composition may contain an amount of a cross-linking agent that causes the composition to gel only after a certain period of time.
  • the fixed time here is not particularly limited, but is preferably about 30 minutes to 12 hours.
  • the absence of an amount of cross-linking agent that gels the composition may be indicated, for example, by allowing the composition to stand at 20 ° C. for 1 hour and then injecting with a syringe equipped with a 21 G needle.
  • the first material composition does not contain a cross-linking agent.
  • the second agent (material) composition in the present invention may be any one containing the above-mentioned cross-linking agent, and the pharmaceutical form thereof is not particularly limited.
  • a solution once prepared may be provided in a dry state by freeze-drying or the like.
  • an injector such as a syringe at the time of use. Therefore, it is preferable to use it in a liquid state at the time of application.
  • the solvent for that purpose is not particularly limited, and examples thereof include purified water, distilled water, ion-exchanged water, milliQ water, physiological saline, and phosphate buffered saline (PBS). These are preferably sterilized and preferably treated with low endotoxin.
  • Milli-Q water can be sterilized by filtration before use.
  • the second material composition in the present invention may contain a component other than the above-mentioned cross-linking agent, and the operation for obtaining the above-mentioned second material composition such as the mixing operation thereof is performed by the above-mentioned first material composition.
  • the lumber composition it is desirable to carry out in an environment with low endotoxin and bacterial levels.
  • the operation is preferably performed on a clean bench using sterile instruments, and the instruments used may be treated with a commercially available endotoxin remover.
  • the concentration of the cross-linking agent in the second material composition and the like may be appropriately set according to the type of the cross-linking agent used and the like.
  • concentration varies depending on the concentration and molecular weight of the alginic acid monovalent metal salt of the first material composition to be applied, and is generally determined.
  • it may be preferably 10 mM to 1000 mM, more preferably 25 mM to 200 mM, and particularly preferably 50 mM to 150 mM.
  • Bioapplicable Compositions in another aspect of the present invention, further provides bioapplyable compositions.
  • biologically applicable composition is defined as a coloring component in the combination of the compositions described above or the first material composition in the treatment method, and its use in a living body is permitted by the regulations of the country and the like.
  • a dye that is present that is, a dye that can be applied to a living body. Therefore, “bioapplicable composition” is a form of "first material composition”, and the term “first material composition” is used to include “bioapplicable composition", unless otherwise specified.
  • the "first material composition” can be read and used as a “biologically applicable composition”.
  • this bioapplyable composition contains a coloring component and a monovalent metal salt of alginic acid and is applied to a subject in a fluid state, and preferably at least a part of the composition gels when applied to the subject. It is used as a.
  • a coloring component By containing a coloring component, the state of gelation when applied to the subject can be reliably visually recognized, and further, the use as a coloring component in a living body is permitted by the regulations of the national government.
  • a dye that has been used that is, a dye that can be applied to a living body, it can be safely used for humans and the like.
  • Dyes that can be applied to living organisms according to national regulations include, for example, dyes approved for use in pharmaceuticals, quasi-drugs, and cosmetics by the Ministry of Health, Labor and Welfare in Japan, and by the FDA in the United States. , Pigments approved for use in pharmaceuticals, medical devices, cosmetics, etc.
  • the coloring component makes it easy to evaluate the formation state of the gel film when the bioapplyable composition is applied to bone tissue, cartilage tissue, osteochondral tissue, intervertebral disc tissue, meniscus tissue, ligament, etc. Is preferable, and from the viewpoint of distinguishability, a blue to green dye is preferable. Examples of such coloring components include Green No. 3 (Fast Green FCF), Blue No. 1 (Brilliant Blue FCF), Blue No.
  • Green No. 2 Indigo Carmine
  • Green No. 201 Aligna Cynthianin Green F
  • Green 202 No.
  • Kinizarin Green SS Blue No. 201 (Indigo)
  • Blue No. 202 Patent Blue NA
  • Blue No. 203 Patent Blue CA
  • Green No. 3 Green Fast Green FCF
  • Blue No. 1 Brown Blue FCF
  • the above-mentioned dye is contained at a concentration that gives visibility by the dye and at a concentration that does not cause precipitation during refrigerated storage. Is preferable. According to this, even when the dye contained in the composition as a coloring component that gives visibility is stored in a refrigerator before being applied to the subject, its dispersibility or uniformity is kept stable. , The state of gelation when applied to the subject can be visually recognized more reliably.
  • the concentration of the dye in the above composition is a concentration that gives visibility may be confirmed visually, but may be evaluated by measuring the color.
  • the L * a * b * color space used to represent the color of an object was standardized by the International Commission on Illumination (CIE) in 1976, and is also a Japanese Industrial Standard (JIS Z 8781-4) in Japan. It is a color system adopted in.
  • L * represents the lightness of the color
  • the chromaticity (hue and saturation) is represented by the numerical values of a * and b *.
  • a * and b * indicate the color direction
  • a * indicates the red direction
  • -a * indicates the green direction
  • b * indicates the yellow direction
  • -b * indicates the blue direction.
  • the range of the L * a * b * color system of the 2 w / w% sodium alginate solution containing Blue No. 1 at a concentration of 0.001 to 0.01 w / w% is that the light source is D65. / 2
  • L * (brightness) is when measured in a normal temperature (15 to 25 ° C) environment using a spectral color difference meter (SE-6000) (manufactured by Nippon Denshoku Kogyo Co., Ltd.) with the measurement mode as transmission measurement. 40 to 80, a * was -40 to -5 (green direction), and b * was -60 to -20 (blue direction).
  • the color is in this range, it is easy to distinguish it from cartilage and surrounding tissues, and it is easy to evaluate the formation state of the gel film.
  • L * blueness
  • the black tendency of the composition becomes strong, and it is difficult to distinguish due to the shadow at the time of application.
  • L * is too high (close to 100)
  • the white tendency of the composition becomes strong, and it becomes difficult to distinguish it from white cartilage or the like.
  • the 2 w / w% sodium alginate solution containing Blue No. 1 at a concentration of 0.1 w / w% has a strong tendency to be black and is not suitable for use in the present invention.
  • the range of color values in the preferable L * a * b * color system of the first material composition or the bioapplyable composition of the present invention is 40 to 80 for L * (brightness) and -40 to 0 for a *.
  • B * are -60 to -20.
  • the color difference in which a human has an image of a clearly different color name is about 13 to 25 as the value of the color difference ⁇ E represented by the following formula (1).
  • Most parts of cartilage tissue, intervertebral disc tissue, and surrounding tissues are white and red (a * is a positive value) to yellow (b * is a positive value), and the a * and b * values are. , Each is often a positive value.
  • the first material composition or the bioapplyable composition of the present invention has a * of -40 to 0 and b * of -60 to -20, and it can be seen that a sufficient difference in color tone can be obtained.
  • L1 *, a1 *, and b1 * are the values of the L * a * b * color space of the comparative control, and L2 *, a2 *, and b2 * are the values when the target sample is measured. Each value of the L * a * b * color space of.
  • the L *, a *, and b * values can be measured using, for example, a spectroscopic color difference meter (“SE-6000”, manufactured by Nippon Denshoku Industries Co., Ltd.) or the like.
  • the spectroscopic color difference meter may also be called a spectroscopic colorimeter or the like.
  • the composition is used for a certain period of time (for example, 1 day, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 1). Months, 2 months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, 1 year, 2 years, 3 years, etc.), refrigerator (for example, set temperature: 2 ° C, 3 ° C, 4 ° C, After storing at 5 ° C, 6 ° C, 7 ° C, 8 ° C, etc.), visually observe the presence or absence of precipitation, or after filtering with a filter (0.45 ⁇ m pore), measure the color difference before and after the filtration. You can make a judgment.
  • the composition is stored in a refrigerator at a set temperature of 5 ° C. for one month for evaluation.
  • a state in which the color tone becomes invisible can be detected as a decrease in the value of the color difference represented by the above formula (1). That is, when the pigment is precipitated, the amount of the dissolved pigment is reduced, and the degree of color tone is lowered.
  • the evaluation may be made by focusing on a specific chromaticity value such as an a * value or a b * value. Therefore, as the concentration of the coloring component in the above composition, for example, if the coloring component is blue, pay attention to the b * value and store it as the b * value after storage in a refrigerator set at 5 ° C. for one month. A concentration is preferable so that the difference from the previous b * value is kept in the range of 25 or less.
  • the color of the first material composition or the bioapplyable composition of the present invention is stable even after storage for a certain period of time as described above.
  • the value of the color difference ⁇ E between the composition after being stored in a refrigerator at a set temperature of 5 ° C. for one month and the composition before storage is preferably 35 or less, more preferably. It is 30 or less.
  • the first material composition or the bioapplyable composition of the present invention is, for example, under a low temperature condition of about 2 ° C. to 8 ° C. (for example, in a refrigerator set at 5 ° C.) for a certain period of time (for example, as described above).
  • a low temperature condition of about 2 ° C. to 8 ° C. (for example, in a refrigerator set at 5 ° C.) for a certain period of time (for example, as described above).
  • the composition does not cause precipitation of coloring components even after storage (for example, for one month), that is, the composition can be stably stored.
  • Typical examples of the dyes that can be applied to a living body used in the present invention include Blue No. 1 (Brilliant Blue FCF), Blue No. 2 (Indigo Carmine), and Green No. 3 (Fast Green FCF).
  • Blue No. 1 (Brilliant Blue FCF)
  • the concentration range thereof may be 0.0005% by mass or more and 0.05% by mass or less, and 0.001% by mass or more and 0.01% by mass. It may be:
  • the term "combination" exists because the above-mentioned first agent (material) composition and second agent (material) composition are used in the present invention when applied to an object.
  • the method for providing the first agent (material) composition and the second agent (material) composition is not particularly limited.
  • the first material composition and the second material composition may be provided as a kit, or only the first material composition is provided, and the second material composition is separately prepared from a commercially available product and used. May be good.
  • the first material composition may be in a solution state or a dry state at the time of storage (or at the time of provision), and in the dry state, it preferably contains a freeze-dried product of a monovalent metal salt of alginic acid.
  • the first material composition may be encapsulated in a vial or a prefilled syringe.
  • the first material composition and the second material composition are used as a kit, for example, (1) a blue to green dye that can be applied to a living body such as sodium alginate and blue No. 1 as the first material composition, and , A prefilled syringe containing a solution containing a monovalent metal salt such as sodium chloride, (2) an ampol containing a solution of a divalent or higher valent metal ionic compound such as a calcium chloride solution as a second material composition, (3) a syringe, (4) A kit containing an injection needle or the like in one package can be used. Further, for example, a double syringe capable of separately encapsulating two kinds of solutions may be provided by encapsulating (1) the solution of the first material composition and (2) the solution of the second material composition, respectively.
  • the first agent (material) composition was applied to a subject in a fluid state, and the second agent (material) composition was applied to the subject. It is used so as to be in contact with the first agent (material) composition to gel at least a part thereof. Details such as application of the first material composition to the object, gelation of the first material composition, evaluation of the formation state of the gel film, and the like are as described in the mode for carrying out the invention.
  • a step of applying a first agent (material) composition containing an alginic acid monovalent metal salt and a coloring component to a subject in a fluid state and a cross-linking of the alginic acid monovalent metal salt A step of bringing a second agent (material) composition containing a cross-linking agent having an action to perform an action into contact with the first agent (material) composition applied to the subject to gel at least a part thereof, and the subject.
  • a method for treating the subject is provided, which comprises a step of evaluating the formation state of a gel film on the surface of the applied first agent (material) composition. Details of the first material composition, its application to the subject, the second material composition, the gelation of the first material composition, the evaluation of the formation state of the gel film, and the like are as described above.
  • Example 1 Under arthroscopy, the articular cartilage defect was filled with a colored sodium alginate solution (2 w / w%). A 100 mM calcium chloride aqueous solution was brought into contact with the periphery including the liquid surface of the filled sodium alginate solution to gel the surface (formation of a gel film). After about 5 minutes, the area around the cartilage defect including the gel membrane surface was washed with physiological saline. After washing, when the formation of the gel film is insufficient, the outflow of sol-like colored alginate is observed.
  • Example 2 Under arthroscopy, the articular cartilage defect was filled with a colored sodium alginate solution (2 w / w%). A 100 mM calcium chloride aqueous solution was brought into contact with the periphery including the liquid surface of the filled sodium alginate solution to gel the surface (formation of a gel film). After about 4 minutes, the gel film surface was touched with the tip of the syringe to confirm the formation of the gel film. You may touch the surface of the gel film with a sonde. When the formation of the gel film is inadequate, an outflow of sol-like colored alginate is observed.
  • Example 3 Under arthroscopy, the articular cartilage defect was filled with a pH-6.5, purple sodium alginate solution (2 w / w%) colored with the pH-sensitive pigment anthocyanin. A 100 mM calcium chloride aqueous solution adjusted to pH 9.0 was brought into contact with the periphery including the liquid surface of the filled sodium alginate solution to gel the surface (formation of a gel film). The surface of the gel film that has come into contact with the calcium chloride aqueous solution changes from purple to blue, and the state of formation of the gel film can be evaluated.
  • a first lumber composition (bioapplicable composition) can be prepared based on the formulations shown in the table below.
  • the numerical value in the table means mass%.
  • the preparation method can be carried out according to Test Example 1. It can also be prepared by methods commonly used in pharmaceuticals and medical devices.
  • the second material composition can be a 0.1 mol / L calcium chloride solution.
  • Blue No. 1 (Brilliant Blue FCF), which is a dye that can be applied to a living body, is added to a sodium alginate solution (2 w / w%) at concentrations of 0.001 w / w%, 0.004 w / w%, and 0.007 w / w%. Or, it was added so as to be 0.01 w / w%, colored, and 5 g each was dispensed into 3 glass vials. This was stored in a refrigerator set at 5 ° C., and sampled after 1 week, 2 weeks, and 1 month, and the sample was observed to confirm the presence or absence of pigment precipitation.
  • Blue No. 1 (Brilliant Blue FCF) exhibited a bright blue color in the range of 0.001 w / w% to 0.01 w / w% in concentration, and was stored in a refrigerator for 1 month from the time of preparation. No precipitation of the dye was observed until later, and the color tone was stably maintained.
  • the range of color values in the color system of the sodium alginate solution containing blue No. 1 is about 40 to 80 for L * (brightness), about -40 to -5 (green direction) for a *, and about b *. It turned out to be -60 to -20 (blue direction).
  • Blue No. 2 (indigo carmine) exhibited a bright blue color at a concentration of 0.004 w / w%, and no pigment precipitation was observed after overnight refrigerated storage. However, the observation after 19 days showed the precipitation of the dye, and the precipitation disappeared when left at room temperature.
  • Blue No. 1 (Brilliant Blue FCF) and Blue No. 2 (indigo carmine), which are dyes that can be applied to a living body, are both bright blue with respect to the sodium alginate solution. It became clear that the color tone can be given. In addition, it was clarified that Blue No. 1 (Brilliant Blue FCF) can give a more stable blue color tone than Blue No. 2 (Indigo Carmine).
  • composition 1a Near the surface of the 1st agent (material) composition 1b Inside other than near the surface of the 1st agent (material) composition 2 Cartilage defect 3 2nd agent (material) composition

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Abstract

アルギン酸１価金属塩を含有する流動性がある状態の材を対象に施与する際、その確実な固定を実現する。アルギン酸１価金属塩を含有する第１材組成物と、アルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤を含有する第２材組成物とを含み、前記第１材組成物を、流動性がある状態で対象に施与し、前記第２材組成物を、前記対象に施与した該第１材組成物に接触させてその少なくとも一部分をゲル化させるようにして用いるための、該組成物の組合せ物であって、前記第１材組成物が、更に着色成分を含有することにより、前記対象に施与した該第１材組成物の表面のゲル膜の形成状態を評価することができるようにした、該組合せ物である。

Description

アルギン酸塩を使用した対象の処置のための組合せ及び方法
　本発明は、軟骨再生等に有用な、アルギン酸１価金属塩を使用した対象の処置技術に関する。
　膝などの関節軟骨には血管や神経のネットワークが存在しないため、自己修復能がほとんどなく、そのため、軟骨欠損が放置されると、関節痛や関節機能の喪失がもたらされ、しばしば変形性関節症へと発展することがある。また、加齢や関節の酷使によって関節軟骨の表面の磨耗が始まった変形性関節症の初期段階から、病状が進行した結果として、広範な領域での軟骨欠損に至ることもある。
　軟骨損傷に対する治療法としては、自家骨軟骨柱移植術（mosaicplasty）、ピックで穿孔する方法（microfracture法）、ドリリング（drilling）、バーで軟骨下骨を削る方法（abrasion法）、損傷軟骨切除（debridement）などの外科的処置が知られている。これらのうち、microfracture法、drilling、abrasion法は、骨髄刺激法（Marrow stimulation technique）と呼ばれ、骨髄から出血を促し、骨髄由来の軟骨前駆細胞を誘導し、軟骨への分化を期待するものである。しかしながら、骨髄刺激法では、本来の硝子軟骨とは力学的特性の異なる線維軟骨が形成されてしまうという問題があった。
　一方、アルギン酸１価金属塩を溶解して流動性がある状態にした材を軟骨組織の欠損部に施与し、固定のため架橋剤を添加してゲル化して、所定期間留置することにより、硝子軟骨の形成が促され、軟骨再生用組成物等として有用であることが知られている（特許文献１）。また、椎間板組織については、椎間板髄核摘出（切除）術後の空洞にアルギン酸１価金属塩を髄核補填材として充填することで、椎間板髄核の再生が促されることが示されている（特許文献２）。更に、止血作用を有する成分と人体に適用可能な色素を含有する局所止血用組成物が開示され、止血作用を有する成分として、トロンビン、アルギン酸ナトリウム、血管収縮剤が挙げられ、色素の一つに青色１号が挙げられている。しかし、アルギン酸ナトリウムを実際に用いた具体例は開示されていない（特許文献３）。
特許第４７４０３６９号公報 特許第６４８７１１０号公報 特開２００２－１０４９９６号公報
　本発明者らは、アルギン酸１価金属塩の使用の際、所望する箇所に施与されたかどうかや、架橋剤によるゲル化が十分かどうか、一旦ゲル化した部分に破損が生じていないかどうかなど、確認することが難しいという側面があることを認識した。すなわち、例えば関節鏡下における施術などではことさらに、使用者としては、固定の不確実さのため、アルギン酸１価金属塩を含む材やそのゲル化のための材を過剰量に用いたり、それらの施与後には生理食塩水等を十分量用いて洗浄したりすることなどして対処しなければならなかった。しかしながらそのように適用される材は、目的の箇所以外の周辺にはできるだけ拡がらないようにすることが望まれる。また、洗浄作業の省力化も望まれる。
　本発明の目的は、上記のような課題に鑑み、アルギン酸１価金属塩を含有する流動性がある状態の材を対象に施与する際、その確実な固定を実現することにある。
　また本発明の別の目的は、着色成分とアルギン酸１価金属塩を含有し、約２～８℃の低温で、一定期間（例えば１か月間等）の保存によっても着色成分の析出が生じない、すなわち、安定に保存可能な組成物を提供することである。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
　［０］　アルギン酸１価金属塩を含有する第１剤（材）組成物と、アルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤を含有する第２剤（材）組成物とを含み、前記第１剤（材）組成物を、流動性がある状態で対象に施与し、前記第２剤（材）組成物を、前記対象に施与した該第１剤（材）組成物に接触させてその少なくとも一部分をゲル化させるようにして用いる、該組成物の組合せであって、前記第１剤（材）組成物が、更に着色成分を含有することにより、前記対象に施与した該第１剤（材）組成物の表面のゲル膜の形成状態を評価することができるようにしたことを特徴とする、該組合せ。
　［１］　アルギン酸１価金属塩を含有する第１剤（材）組成物と、アルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤を含有する第２剤（材）組成物とを含み、前記第１剤（材）組成物を、流動性がある状態で対象に施与し、前記第２剤（材）組成物を、前記対象に施与した該第１剤（材）組成物に接触させてその少なくとも一部分をゲル化させるようにして用いるための、該組成物の組合せ物であって、前記第１剤（材）組成物が、更に着色成分を含有することにより、前記対象に施与した該第１剤（材）組成物の表面のゲル膜の形成状態を評価することができるようにしたことを特徴とする、該組合せ物。
　［２］　前記ゲル膜の形成状態の評価が、前記対象に施与した該第１剤（材）組成物のうちの流動性がある状態の組成物の流出の有無の評価である、上記［１］に記載の組合せ物。
　［３］　前記ゲル膜の形成状態の評価が、（１）前記対象に施与した該第１剤（材）組成物のゲル膜表面の洗浄後、及び／又は、（２）前記対象に施与した該第１剤（材）組成物のゲル膜表面への加圧後に行われる、上記［１］又は［２］に記載の組合せ物。
　［４］　前記ゲル膜表面への加圧が、該ゲル膜表面に器具を接触させることにより行われる、上記［３］に記載の組合せ物。
　［５］　前記対象は、骨組織、軟骨組織、骨軟骨組織、椎間板組織、半月板組織、靭帯からなる群から選択される少なくとも１種である、上記［１］～［４］のいずれか１項に記載の組合せ物。
　［６］　前記第１材組成物が、前記着色成分として生体に施与可能な青色～緑色の色素を含有する、上記［１］～［５］のいずれか１項に記載の組合せ物。
　［７］　前記第１材組成物の、分光色差計（光源：Ｄ６５／２、測定モード：透過測定）での測定によるＬ＊ａ＊ｂ＊表色系における色彩値が、Ｌ＊＝４０～８０、ａ＊＝－４０～０、ｂ＊＝－６０～－２０である、上記［１］～［６］のいずれか１項に記載の組合せ物。
　［８］　前記着色成分が、設定温度５℃の冷蔵庫で１か月間の保存後に析出が生じない濃度で含有されている、上記［１］～［７］のいずれか１項に記載の組合せ物。
　［９］　前記第１材組成物の、設定温度５℃の冷蔵庫で１か月間保存後と保存前とを比べたときの、分光色差計（光源：Ｄ６５／２、測定モード：透過測定）での測定によるＬ＊ａ＊ｂ＊表色系における色差ΔＥ値が３５以下である、上記［１］～［８］のいずれか１項に記載の組合せ物。
　［１０］　前記第１材組成物が、２℃～８℃の条件下で保存可能である、上記［１］～［９］のいずれか１項に記載の組合せ物。
　［１１］　前記第１材組成物が、更に他の１価金属塩を含有する、上記［１］～［１０］のいずれか１項に記載の組合せ物。
　［１２］　前記第１材組成物が、保存時に、溶液状態又は乾燥状態である、上記［１］～［１１］のいずれか１項に記載の組合せ物。
　［１３］　前記第１材組成物が、アルギン酸１価金属塩、生体に施与可能な青色～緑色の色素、及び、塩化ナトリウムを含有し、２℃～８℃の条件下で保存可能な組成物であって、該組成物は保存時に溶液状態又は乾燥状態である、上記［１］～［１２］のいずれか１項に記載の組合せ物。
　［１４］　前記着色成分は、０．０００５質量％～０．０５質量％の青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）である、上記［１］～［１３］のいずれか１項に記載の組合せ物。
　［１５］　前記着色成分は、該成分の媒体環境に応じた色調変化をもたらすものである、上記［１］～［１３］のいずれか１項に記載の組合せ物。
　［１６］　前記媒体環境はｐＨ環境である、上記［１５］に記載の組合せ物。
　［１７］　前記第１材組成物はｐＨ６以上ｐＨ８以下のゾル又は液体であり、前記第２材組成物はｐＨ４以上ｐＨ６未満、又はｐＨ８超ｐＨ１２以下の液体である、上記［１５］又は［１６］に記載の組合せ物。
　［１８］　前記着色成分は、ｐＨ感受性色素、又は溶解遅延用素材で被覆されたｐＨ感受性色素である、上記［１５］～［１７］のいずれか１項に記載の組合せ物。
　本発明では、以下の対象の処置方法を提供し、例えば、下記の構成を採用してもよい。
　［２－１］　アルギン酸１価金属塩及び着色成分を含有する第１剤（材）組成物を、流動性がある状態で対象に施与する工程と、アルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤を含有する第２剤（材）組成物を、前記対象に施与した該第１剤（材）組成物に接触させてその少なくとも一部分をゲル化させる工程と、前記対象に施与した該第１剤（材）組成物の表面のゲル膜の形成状態を評価する工程とを含む、該対象の処置方法。
　［２－２］　前記ゲル膜の形成状態の評価が、前記対象に施与した該第１剤（材）組成物のうちの流動性がある状態の組成物の流出の有無の評価である、上記［２－１］に記載の方法。
　［２－３］　前記ゲル膜の形成状態の評価が、（１）前記対象に施与した該第１剤（材）組成物のゲル膜表面の洗浄後、及び／又は、（２）前記対象に施与した該第１剤（材）組成物のゲル膜表面への加圧後に行われる、上記［２－１］又は［２－２］に記載の方法。
　［２－４］　前記ゲル膜表面への加圧が、該ゲル膜表面に器具を接触させることにより行われる、上記［２－３］に記載の方法。
　［２－５］　前記対象は、骨組織、軟骨組織、骨軟骨組織、椎間板組織、半月板組織、靭帯からなる群から選択される少なくとも１種である、上記［２－１］～［２－４］のいずれか１項に記載の方法。
　［２－６］　前記第１材組成物が、前記着色成分として生体に施与可能な青色～緑色の色素を含有する、上記［２－１］～［２－５］のいずれか１項に記載の方法。
　［２－７］　前記第１材組成物の、分光色差計（光源：Ｄ６５／２、測定モード：透過測定）での測定によるＬ＊ａ＊ｂ＊表色系における色彩値が、Ｌ＊＝４０～８０、ａ＊＝－４０～０、ｂ＊＝－６０～－２０である、上記［２－１］～［２－６］のいずれか１項に記載の方法。
　［２－８］　前記着色成分が、設定温度５℃の冷蔵庫で１か月間の保存後に析出が生じない濃度で含有されている、上記［２－１］～［２－７］のいずれか１項に記載の方法。
　［２－９］　前記第１材組成物の、設定温度５℃の冷蔵庫で１か月間保存後と保存前とを比べたときの、分光色差計（光源：Ｄ６５／２、測定モード：透過測定）での測定によるＬ＊ａ＊ｂ＊表色系における色差ΔＥ値が３５以下である、上記［２－１］～［２－８］のいずれか１項に記載の方法。
　［２－１０］　前記第１材組成物が、２℃～８℃の条件下で保存可能である、上記［２－１］～［２－９］のいずれか１項に記載の方法。
　［２－１１］　前記第１材組成物が、更に他の１価金属塩を含有する、上記［２－１］～［２－１０］のいずれか１項に記載の方法。
　［２－１２］　前記第１材組成物が、保存時に、溶液状態又は乾燥状態である、上記［２－１］～［２－１１］のいずれか１項に記載の方法。
　［２－１３］　前記第１材組成物が、アルギン酸１価金属塩、生体に施与可能な青色～緑色の色素、及び、塩化ナトリウムを含有し、２℃～８℃の条件下で保存可能な組成物であって、該組成物は保存時に溶液状態又は乾燥状態である、上記［２－１］～［２－１２］のいずれか１項に記載の方法。
　［２－１４］　前記着色成分は、０．０００５質量％～０．０５質量％の青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）である、上記［２－１］～［２－１３］のいずれか１項に記載の方法。
　本発明では、以下の対象の処置に用いるためのアルギン酸１価金属塩を提供し、例えば、下記の構成を採用してもよい。
　［３－１］　アルギン酸１価金属塩及び着色成分を含有する第１剤（材）組成物を、流動性がある状態で対象に施与する工程と、アルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤を含有する第２剤（材）組成物を、前記対象に施与した該第１剤（材）組成物に接触させてその少なくとも一部分をゲル化させる工程と、前記対象に施与した該第１剤（材）組成物の表面のゲル膜の形成状態を評価する工程とを含む、該対象の処置に用いるための該第１剤（材）及び第２剤（材）組成物の組合せ。
　本発明では、以下の生体適用組成物を提供し、例えば、下記の構成を採用してもよい。
　［４－１］　アルギン酸１価金属塩を含有し、流動性がある状態で対象に施与されるための生体適用組成物であって、着色成分として、生体に施与可能な青色～緑色の色素を含有することを特徴とする、該生体適用組成物。
　［４－２］　前記対象は、骨組織、軟骨組織、骨軟骨組織、椎間板組織、半月板組織、靭帯からなる群から選択される少なくとも１種である、［４－１］に記載の生体適用組成物。
　［４－３］　前記生体適用組成物の、分光色差計（光源：Ｄ６５／２、測定モード：透過測定）での測定によるＬ＊ａ＊ｂ＊表色系における色彩値が、Ｌ＊＝４０～８０、ａ＊＝－４０～０、ｂ＊＝－６０～－２０である、上記［４－１］又は［４－２］に記載の生体適用組成物。
　［４－４］　前記着色成分が、設定温度５℃の冷蔵庫で１か月間の保存後に析出が生じない濃度で含有されている、上記［４－１］～［４－３］のいずれか１項に記載の生体適用組成物。
　［４－５］　前記生体適用組成物の、設定温度５℃の冷蔵庫で１か月間保存後と保存前の組成物とを比べたときの、分光色差計（光源：Ｄ６５／２、測定モード：透過測定）での測定によるＬ＊ａ＊ｂ＊表色系における色差ΔＥ値が３５以下である、上記［４－１］～［４－４］のいずれか１項に記載の生体適用組成物。
　［４－６］　前記生体適用組成物が、２℃～８℃の条件下で保存可能である、［４－１］～［４－５］のいずれか１項に記載の生体適用組成物。
　［４－７］　前記アルギン酸１価金属塩は、ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定された重量平均分子量（絶対分子量）が１万～１００万である、上記［４－１］～［４－６］のいずれか１項に記載の生体適用組成物。
　［４－８］　前記アルギン酸１価金属塩が、低エンドトキシンアルギン酸１価金属塩である、上記［４－１］～［４－７］のいずれか１項に記載の生体適用組成物。
　［４－９］　前記生体適用組成物が、更に他の１価金属塩を含有する、［４－１］～［４－８］のいずれか１項に記載の生体適用組成物。
　［４－１０］　前記生体適用組成物が、保存時に、溶液状態又は乾燥状態である、［４－１］～［４－９］のいずれか１項に記載の生体適用組成物。
　［４－１１］　前記生体適用組成物が、アルギン酸１価金属塩、生体に施与可能な青色～緑色の色素、及び、塩化ナトリウムを含有し、２℃～８℃の条件下で保存可能な組成物であって、該組成物は保存時に溶液状態又は乾燥状態である、［４－１］～［４－１０］のいずれか１項に記載の生体適用組成物。
　［４－１２］　前記生体適用組成物は、対象に施与したときに少なくとも一部分がゲル化するようにして用いるための組成物である、［４－１］～［４－１１］のいずれか１項に記載の生体適用組成物。
　［４－１３］　前記着色成分は、０．０００５質量％～０．０５質量％の青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）である、上記［４－１］～［４－１２］のいずれか１項に記載の生体適用組成物。
　本発明によれば、アルギン酸１価金属塩を溶解して流動性がある状態にした材を対象に施与する際、着色成分を含有することにより、その後にアルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤でゲル化して固定するための処理が十分かどうか、簡便に確認することができる。これにより、その確実な固定を実現することができる。
　また、視認性を与える着色成分として国等の規制により生体への使用が許可されている色素、すなわち生体へ施与可能な色素を用いることにより、ヒト等に対して安全に使用することができる。
　更に、約２℃～８℃の低温条件下で一定期間安定に保存可能な、着色成分及びアルギン酸１価金属塩を含有する組成物が提供されるため、安全性も高く、使い勝手がよい。
　本発明の組合せ物、処置方法、及び、生体適用組成物は、上記のうちいずれか一つ以上の効果を有する。
本発明の一実施形態を表わす概略説明図であり、アルギン酸１価金属塩を含有する第１剤（材）組成物と、アルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤を含有する第２剤（材）組成物とを、対象に施与する操作を説明する概略説明図である。 試験例２において、アルギン酸ナトリウム溶液（２ｗ／ｗ％）に生体へ施与可能な色素である青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）を所定濃度で添加して、着色し、５℃に設定した冷蔵庫で保存したときの色調と外観の経時変化を調べた結果を示す図表である。
　本発明は、アルギン酸１価金属塩の利用に関する。具体的には、例えば、アルギン酸１価金属塩を軟骨の損傷部もしくは欠損部に施与することで、その部位における軟骨組織の再生が促されることが報告されている（特許第４７４０３６９号公報）。また、例えば、アルギン酸１価金属塩を椎間板髄核摘出（切除）術後の空洞に髄核補填材として施与することで、椎間板髄核の再生が促され、椎間板組織全体の変性も抑制されることが報告されている（特許第６４８７１１０号公報）。これらのように、アルギン酸１価金属塩は、損傷もしくは欠損した組織を再生・修復したり、保護したりする用途に有用である。本発明の組合せ物、方法又は生体適用組成物は、例えば、骨組織、軟骨組織、骨軟骨組織、椎間板組織、半月板組織、靭帯などの損傷部や欠損部に好ましく用いられる。本明細書において「損傷」とは、「欠損」「断裂」「病変」等も含む。なお、生物の範囲はヒトに限定されるものではない。ヒト以外の生物、例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、サル、トリ、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなども挙げられる。
　本発明においては、アルギン酸１価金属塩の利用のため、第１剤（材）として、アルギン酸１価金属塩を含有する組成物を用いる。また、第２剤（材）として、アルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤を含有する組成物を用いる。そして、上記第１剤（材）組成物を、流動性がある状態で対象に施与し、上記第２剤（材）組成物を対象に施与した該第１剤（材）組成物に接触させてその少なくとも一部分をゲル化させる。これにより、対象に施与した上記第１剤（材）組成物を固定し、適用した位置からズレたり、漏出したりするのを防ぐことができる。
　本発明においては、上記構成に加えて、上記第１材組成物が、更に着色成分を含有する。そして、その着色成分を指標にして観察することにより、対象に施与した上記第１材組成物の表面のゲル膜の形成状態を評価することができるようにしている。ここで「ゲル膜」とは、架橋剤を含有する第２材組成物を、第１材組成物に接触させて、第１材組成物の表面に形成されたゲルである。「評価することができる」とは、上記第１材組成物の表面のゲル膜の形成状態を目視により確認できることを包含する意味であり、更に、直接の目視による場合だけでなく、顕微鏡や内視鏡（特に関節適用の場合は関節鏡）を介した確認をすることができることを包含する意味である。
　上記ゲル膜の形成状態の評価は、対象に施与した上記第１材組成物のうちの流動性がある状態の組成物が流出してくるかどうかを、上記第１材組成物に含有された着色成分を指標にして、観察することにより行うことができる。例えば、限定されないいくつかの典型的な態様においては、生理食塩水等によってゲル膜表面を洗浄した後に、対象に施与した上記第１材組成物のうちの流動性がある状態の組成物が流出してくるかどうかを観察することにより評価を行うことができる。あるいは、例えば、上記ゲル膜表面に、ゾンデ（消息子）、鉗子、鑷子、シリンジ等の注入器の先端部等の器具を接触させることにより加圧した後に、対象に施与した上記第１材組成物のうちの流動性がある状態の組成物が流出してくるかどうかを観察してもよい。
　本発明に用いられる着色成分としては、骨組織、軟骨組織、骨軟骨組織、椎間板組織、半月板組織、靭帯などへ第１材組成物を施与したときに、ゲル膜の形成状態を評価しやすいものであることが好ましい。例えば、中間色系（例えば緑色）、寒色系（例えば青色）等の色調を呈する色素であれば、施術等において、視野に周辺組織、血液（赤・黄色系統の色調）、軟骨（白色系統の色調）、影（黒色系統の色調）などが含まれる環境下においても、それらからより判別しやすくなるので好ましい。このような色素としては、例えば、緑色３号（ファストグリーンＦＣＦ）、銅クロロフィル、銅クロロフィルナトリウム、スルホブロモフタレインナトリウム、インドシアニングリーン、フルオロレインナトリウム、メチレンブルー、青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）、青色２号（インジゴカルミン）、トルイジンブルー、ピオクタニンブルー、リン酸マンガンアンモニウムなどが挙げられる。
　また、いくつかの態様では、本発明に用いる着色成分は、国等の規制により生体への使用が許可されている色素、すなわち生体に施与可能な色素が好ましく、これについては後述する。
　また、別の態様では、本発明に用いる着色成分は、本明細書の記載に準じて第１材組成物又は生体適用組成物を調製したときに、約２～８℃の低温条件下で、一定期間安定に保存可能な着色成分であることが好ましい。
　本発明の限定されないいくつかの態様においては、上記着色成分は、媒体環境に応じた色調変化をもたらすものであってもよい。これによれば、対象に施与した上記第１材組成物が流出してくる場合には、その着色成分は媒体環境の変化に曝されることになり、それにともなって色調も変化するので、流出しているかどうかをより確実に把握し易くなる。また、上記ゲル膜の形成は、架橋剤を含有する第２材組成物が、対象に施与した第１材組成物の表面付近を拡散するにつれ、第１材組成物との接触により起こる。よって、着色成分が色調変化を起こす状況を把握することにより、その色調変化は対象に施与した上記第１材組成物の表面付近のゲル化の状況を反映しており、ひいてはこれにより、ゲル膜の形成状態が更に把握し易くなる。
　上記したような態様に使用するための、媒体環境に応じた色調変化をもたらす着色成分としては、ｐＨ環境に応じた色調変化をもたらすｐＨ感受性色素が好ましい。一般に、ｐＨ感受性色素には酸性側に変色域を有する色素と、塩基性側に変色域を有する色素があるので、所望に応じて、適宜に適切な変色域を有する色素を用いることができる。表１，２には、代表的なｐＨ感受性色素を示す。
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　例えば、限定されないいくつかの典型的な態様においては、第２材組成物のｐＨがｐＨ４以上ｐＨ６未満の場合は、第１材組成物のｐＨをｐＨ６以上ｐＨ８以下としたうえメチルレッド等のジアゾ系色素を用いることにより、上記したようなゲル膜の視認化の効果を奏し得る。また、ブロモクレゾールグリーン等のサルトン系の色素を用いてもよい。上記第２材組成物のｐＨがｐＨ８超ｐＨ１２以下の場合は、上記第１材組成物のｐＨをｐＨ６以上ｐＨ８以下としたうえフェノールフタレイン等のラクトン系色素を用いることにより、上記したようなゲル膜の視認化の効果を奏し得る。また、アントシアニジン等のアントシアニン系の色素を用いてもよい。
　着色成分の含有量としては、必要に応じて適宜に適切な含有量を設定することができるが、典型的に例示するとすれば、第１材組成物全体の０．０００５ｗ／ｖ％～１．０ｗ／ｖ％であることが好ましく、より好ましくは０．００１ｗ／ｖ％～１．０ｗ／ｖ％であり、更に好ましくは０．０１ｗ／ｖ％～１．０ｗ／ｖ％である。また、別の態様では、着色成分の含有量は、第１材組成物全体の０．０００５ｗ／ｗ％～１．０ｗ／ｗ％であってよく、好ましくは、０．０００５ｗ／ｗ％～０．１ｗ／ｗ％である。なお、本明細書において、「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
　上記ｐＨ感受性色素は、溶解遅延用素材で被覆してもよい。これによれば、一定時間経過後にその素材が溶解するまで、着色成分による色調変化が起こらないので、上記第１材組成物に上記第２材組成物が接触してから、一定の時間が経過したことに関する情報を、あわせて可視化することができる。そのような態様に使用し得る溶解遅延用素材でとしては、ＣＭＥＣ（カルボキシメチルエチルセルロース）、メタクリル酸コポリマーＳ、メタクリル酸コポリマーＬ、又はこれらを適切な比率で混合することによって溶解するｐＨ域をｐＨ８～１２の範囲内で適切に調節したものなどが挙げられる。また、色素を被覆する方法としては、溶解遅延用素材を用いてマイクロカプセル化する方法、溶解遅延用素材と練合した後に粉砕や押出し造粒によって顆粒化する方法、スプレードライ法による微粒子を形成する方法等、このような周知の方法で調製することができる。
　図１には、本発明の一実施形態として、上記２剤（材）を軟骨欠損部に適用する場合を例として、その操作を更に詳細に説明する。
　まず、アルギン酸１価金属塩を含有する第１剤（材）組成物１を、流動性があるゾル又は液体の状態の組成物に調製して、図示しないシリンジ等の注入器で軟骨欠損部２に充填する（図１ａ）。軟骨欠損部２には、例えば、骨髄から出血を促し、骨髄由来の軟骨前駆細胞を誘導し、軟骨への分化を期待する骨髄刺激法（Marrow stimulation technique）の施術がなされてもよい。骨髄刺激法では、具体的には、ピック、パワードリル等を用いて、直径１．５ｍｍ程度で軟骨下骨に達する１又は複数個の穴が形成されてもよい。また、軟骨損傷部に骨髄由来の軟骨前駆細胞が残存している場合には、同様に直径１．５ｍｍ程度であって、軟骨下骨まで達しない１又は複数個の穴を形成してもよい。
　次に、アルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤を含有する第２剤（材）組成物３をシリンジ等の注入器から、軟骨欠損部２に充填した第１剤（材）組成物１の表面に滴下する（図１ｂ）。第２剤（材）組成物３に含まれる架橋剤が、第２剤（材）組成物３の拡散とともに、第１剤（材）組成物１の表面付近全体に拡散し（図１中、「１ａ」の符号で指し示す部分）、アルギン酸１価金属塩に対する架橋作用が発揮されて、それにより軟骨欠損部２の開口部に蓋がされるように軟骨欠損部２に充填した第１剤（材）組成物１の表面にゲル膜が形成する（図１ｃ）。このようにして、軟骨欠損部２への充填の際には流動性がある状態であった第１剤（材）組成物１が、軟骨欠損部２に固定され、その適用位置がズレたり、軟骨欠損部２から漏出したりすることが防がれる。なお、第１剤（材）組成物１の表面付近以外の内部（図１中、「１ｂ」の符号で指し示す部分）については、必ずしもゲル化していなくてもよい。むしろゲル化していないほうが、組織の基となる前駆細胞の移動や組織化に有利に働く場合がある。
　本発明において、アルギン酸１価金属塩を含有する上記第１材組成物を対象に施与したり、その後、アルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤を含有する上記第２材組成物を作用させたりする方式としては、特に制限はないが、例えば生体に対する典型的な術式としては、患部を切開により直視下においてする施術などが挙げられる。また、経皮的術式（約５ｍｍの切開）でもよい。あるいは、より侵襲性の低い術式の選択としては、顕微鏡下（約３～４ｃｍの切開）もしくは内視鏡（特に関節適用の場合は関節鏡）下（約１～２ｃｍの切開）に施術してもよい。本発明によれば、上記第１材組成物の適用時の視認性が向上しているので、顕微鏡下や内視鏡（特に関節適用の場合は関節鏡）下での施術のように、視野が限られる術式を採用した場合に特にメリットが大きい。例えば、関節鏡視下の狭い関節空間において、第１材組成物１を軟骨欠損部２に周辺組織と同じ高さになるまで注入する際、組成物が透明だと適切に充填できているかが分からず施術が難しい。組成物を着色することにより、充填の様子が見えるため適切に充填できる。
　本発明の限定されないいくつかの態様においては、上記第１材組成物の上記第２材組成物に対する作用性を、予めインビトロ試験により評価しておくこともできる。すなわち、実際の使用時と同様の使用比率を用いて、例えば、直径６ｍｍの試験管に上記第１材組成物５００μＬを入れ、及び、所定の使用比率に架橋剤を調製した上記第２材組成物をその上から充填して１時間静置後に、試験管内の組成物の表面部分がゲル化している一方、試験管内の組成物の容量の少なくとも５割はゲル化しておらず、ゲル化していない部分は、試験管内の組成物の容量の少なくとも５割が２１Ｇの注射針をつけたシリンジで吸引できることなどで、予め評価されてもよい。
　以下、本発明を更に詳細に説明する。
　１．アルギン酸１価金属塩
　アルギン酸は、生分解性の高分子多糖類であって、Ｄ‐マンヌロン酸（Ｍ）とＬ‐グルロン酸（Ｇ）という２種類のウロン酸が直鎖状に重合したポリマーである。より具体的には、Ｄ‐マンヌロン酸のホモポリマー画分（ＭＭ画分）、Ｌ‐グルロン酸のホモポリマー画分（ＧＧ画分）、及びＤ‐マンヌロン酸とＬ‐グルロン酸がランダムに配列した画分（ＭＧ画分）が任意に結合したブロック共重合体である。アルギン酸のＤ‐マンヌロン酸とＬ‐グルロン酸の構成比（Ｍ／Ｇ比）は、主に海藻等の由来となる生物の種類によって異なり、また、その生物の生育場所や季節による影響を受け、Ｍ／Ｇ比が約０．４の高Ｇ型からＭ／Ｇ比が約５の高Ｍ型まで高範囲にわたる。
　アルギン酸は天然由来のものでもよく、合成物であってもよいが、例えば、褐藻類等に由来する天然由来のものを用いてもよい。アルギン酸を含有する褐藻類は世界中の沿岸域に繁茂しているが、実際上、原料として使用できる褐藻類は限られており、南米のレッソニア、北米のマクロシスティス、欧州のラミナリアやアスコフィラム、豪のダービリアなどが代表的なものである。例えば、レッソニア（Ｌｅｓｓｏｎｉａ）属、マクロシスティス（Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）属、ラミナリア（Ｌａｍｉｎａｒｉａ）属（コンブ属）、アスコフィラム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、ダービリア（Ｄｕｒｖｉｌｌｅａ）属、アラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ）属、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ）属などが挙げられる。
　本発明においては、アルギン酸１価金属塩を用いる。これによれば、アルギン酸１価金属塩は、溶解性や溶解安定性が良好であり、水等の溶媒に溶解させて流動性がある状態で生体組織等の対象に施与することに適した形態である。アルギン酸１価金属塩は、上記した褐藻類を用いて、酸法、カルシウム法等の公知の方法又はそれに準じる方法により調製することができる。具体的には、例えば、褐藻類から炭酸ナトリウム水溶液などのアルカリ水溶液を用いて抽出し、酸（例えば、塩酸、硫酸など）で中和した後、イオン交換処理することなどにより得ることができる。アルギン酸１価金属塩としては、具体的には、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウムなどを挙げることができるが、特には、市販品により入手可能なアルギン酸ナトリウムが好ましい。
　本発明に用いるアルギン酸１価金属塩のような高分子多糖類は、通常、その分子量を正確に定めることは困難であるが、分子量が低すぎると水等に溶解したときの見掛け粘度が低くなり、適用した生体組織等の対象への密着性が弱くなる虞があり、また、分子量が高すぎるものは調製が困難であるとともに、溶解性が低下する、水等に溶解したときに見掛け粘度が高すぎて取扱いが悪くなる、長期間の保存で物性を維持しにくい等の問題を生じるため、一般的に重量平均分子量で１万～１０００万、好ましくは２万～８００万、より好ましくは５万～５００万の範囲である。
　本発明に用いるアルギン酸１価金属塩の分子量は、常法に従い測定することができる。一例として、例えば、分子量測定にゲル浸透クロマトグラフィーを用いる場合の代表的な条件においては、カラムとして、例えば、ＧＭＰＷ‐ＸＬ×２＋Ｇ２５００ＰＷ‐ＸＬ（７．８ｍｍ　Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ）を用いることができ、溶離液として、例えば、２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液を用いることができ、分子量標準として、例えば、プルランを用いることができる。また、他の一例として、分子量測定にＧＰＣ‐ＭＡＬＳを用いる場合の代表的な条件においては、検出器として、例えば、ＲＩ検出器と光散乱検出器（ＭＡＬＳ）を用いることができる。
　一般に、天然物由来の高分子物質の分子量測定では、測定方法により値に違いが生じうることが知られている。よって、本発明に用いるアルギン酸１価金属塩の分子量について、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）又はゲルろ過クロマトグラフィー（これらを合わせてサイズ排除クロマトグラフィーともいう）により測定した重量平均分子量は、好ましくは１０万以上、より好ましくは５０万以上であり、また好ましくは、５００万以下、より好ましくは３００万以下である。その好ましい範囲は、１０万～５００万であり、より好ましくは５０万～３５０万である。
　また、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）と多角度光散乱検出器（Multi Angle Light Scattering：ＭＡＬＳ）とを組み合わせたＧＰＣ‐ＭＡＬＳ法によれば、絶対重量平均分子量を測定することができる。本発明に用いるアルギン酸１価金属塩の分子量について、このようなＧＰＣ‐ＭＡＬＳ法により測定した重量平均分子量（絶対分子量）は、好ましくは１万以上、より好ましくは８万以上、更に好ましくは９万以上であり、また好ましくは、１００万以下、より好ましくは８０万以下、更に好ましくは７０万以下、とりわけ好ましくは５０万以下である。その好ましい範囲は、１万～１００万であり、より好ましくは８万～８０万であり、より更に好ましくは９万～７０万、とりわけ好ましくは９万～５０万である。
　なお、通常、高分子多糖類の分子量を上記のような手法で算出する場合、１０～２０％以上の測定誤差を生じうる。例えば、４０万であれば３２～４８万、５０万であれば４０～６０万、１００万であれば８０～１２０万程度の範囲で値の変動が生じうる。
　アルギン酸１価金属塩は、褐藻類から抽出された当初は、分子量が大きく、見掛け粘度が高い傾向にあり、熱による乾燥、精製などの過程を経ることで、分子量が小さくなり、見掛け粘度が低くなる。製造工程の温度等の条件管理、原料とする褐藻類の選択、製造工程における分子量の分画などの手法により分子量の異なるアルギン酸１価金属塩を製造することができる。更に、異なる分子量あるいは粘度を持つ別ロットのアルギン酸１価金属塩と混合することにより、目的とする分子量を有するアルギン酸１価金属塩とすることも可能である。
　よって、本発明に用いるアルギン酸１価金属塩の品質は、上記した分子量とともに、粘度の特性によっても検定することができる。この点、例えば、ミリＱ水に溶解して１ｗ／ｗ％濃度の溶液とし、コーンプレート型粘度計を用いて２０℃の条件で粘度測定を行ったときの粘度が、４０ｍＰａ・ｓ～８００ｍＰａ・ｓであることが好ましく、５０ｍＰａ・ｓ～６００ｍＰａ・ｓであることがより好ましい。
　本発明に用いるアルギン酸１価金属塩は、低エンドトキシン処理されていることが好ましい。これによれば、発熱等を惹起することなく、生体組織等の対象に適用する場合により安全に施与することができる。エンドトキシンレベルは、公知の方法で確認することができ、例えば、リムルス試薬（ＬＡＬ）による方法、エントスペシー（登録商標）ＥＳ‐２４Ｓセット（生化学工業株式会社）を用いる方法などによって測定することができる。
　低エンドトキシン処理は、天然物由来高分子素材について知られた公知の方法又はそれに準じる方法によって行うことができる。例えば、ヒアルロン酸ナトリウムを精製する菅らの方法（例えば、特開平９‐３２４００１号公報など参照）、β－１，３‐グルカンを精製する吉田らの方法（例えば、特開平８‐２６９１０２号公報など参照）、アルギネート、ゲランガム等の高分子塩を精製するウィリアムらの方法（例えば、特表２００２‐５３０４４０号公報など参照）、ポリサッカライドを精製するジェームスらの方法（例えば、国際公開第９３／１３１３６号パンフレットなど参照）又はルイスらの方法（例えば、米国特許第５５８９５９１号明細書など参照）、アルギネートを精製するハーマンフランクらの方法（例えば、Ａｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　（１９９４）４０：６３８‐６４３など参照）等又はこれらに準じる方法によって実施することができる。本発明の低エンドトキシン処理は、それらに限らず、洗浄、フィルター（エンドトキシン除去フィルターや帯電したフィルターなど）によるろ過、限外ろ過、カラム（エンドトキシン吸着アフィニティーカラム、ゲルろ過カラム、イオン交換樹脂によるカラムなど）を用いた精製、疎水性物質、樹脂又は活性炭などへの吸着、有機溶媒処理（有機溶媒による抽出、有機溶剤添加による析出・沈降など）、界面活性剤処理（例えば、特開２００５‐０３６０３６号公報など参照）など公知の方法によって、あるいはこれらを適宜組合せて実施することができる。これらの処理の工程に、遠心分離など公知の方法を適宜組み合わせてもよい。アルギン酸１価金属塩の種類などに合わせて適宜選択するのが望ましい。
　低エンドトキシン処理の方法は、特に限定されないが、その結果としてエンドトキシン含有量が、リムルス試薬（ＬＡＬ）によるエンドトキシン測定を行った場合に、５００エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｇ以下であることが好ましく、１００ＥＵ／ｇ以下であることがより好ましく、５０ＥＵ／ｇ以下であることが更により好ましく、３０ＥＵ／ｇ以下であることが特に好ましい。低エンドトキシン処理されたアルギン酸ナトリウムは、例えば、Ｓｅａ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）（持田製薬株式会社）、ＰＲＯＮＯＶＡＴＭＵＰ  ＬＶＧ（ＦＭＣ ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ）など市販品により入手可能である。
　２．架橋剤
　本発明においては、アルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤を用いる。具体的には、例えば、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、Ｂａ2+、Ｓｒ2+などの２価以上の金属イオン化合物などが挙げられる。より具体的には、２価以上の金属イオン化合物として、ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、ＣａＳＯ4、ＢａＣｌ2等を挙げることができるが、入手しやすいこと、ゲルの強度等の理由から、特に、ＣａＣｌ2溶液が好ましい。
　３．第１剤（材）組成物
　本発明における第１剤（材）組成物は、上記したアルギン酸１価金属塩及び本明細書に記載の着色成分を含有するものであればよく、特にその製剤的形態に制限はない。例えば、一旦溶液として調製したものを凍結乾燥等して乾燥状態で提供してもよい。ただし、生体組織等の対象への施与の際には一定の流動性と粘度の特性を備えている必要がある。よって、適用時にはゾル又は液体の状態（本明細書ではこれらを併せて「溶液状態」という）であるのが好ましい。そのための溶媒は特に制限されないが、例えば、精製水、蒸留水、イオン交換水、ミリＱ水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられる。これらは、滅菌されていることが好ましく、低エンドトキシン処理されたものが好ましい。例えば、ミリＱ水をろ過滅菌して用いることができる。すなわち、第１材組成物は、その保存時（又は提供時）に、溶液状態又は乾燥状態であることが好ましい。
　また、後述するように、本発明における第１材組成物には、上記したアルギン酸１価金属塩以外の成分が含有されていてもよく、その混合操作等、上記第１材組成物を得るための操作は、エンドトキシンレベル及び細菌レベルの低い環境下で行うことが望ましい。例えば、操作はクリーンベンチで、滅菌器具を使用して行うことが好ましく、使用する器具を市販のエンドトキシン除去剤で処理してもよい。
　本発明における第１材組成物は、生体組織等の対象に施与する際の性状として、例えば、組成物を２０℃で１時間静置した後に２１Ｇの注射針で注入できる流動性を有することが望ましい。このとき粘度が低すぎると適用した部位の周辺組織への密着性が弱くなる虞があるため、見掛け粘度は、特に限定されないが、好ましくは１０ｍＰａ・ｓ以上、より好ましくは１００ｍＰａ・ｓ以上、更に好ましくは２００ｍＰａ・ｓ以上、とりわけ好ましくは５００ｍＰａ・ｓ以上である。見掛け粘度が高すぎると取扱性が悪くなる虞があるため、好ましくは５００００ｍＰａ・ｓ以下、より好ましくは２００００ｍＰａ・ｓ以下、更に好ましくは１００００ｍＰａ・ｓ以下である。見掛け粘度が２００００ｍＰａ・ｓ以下のときシリンジ等での適用がより容易に行える。しかし、見掛け粘度が２００００ｍＰａ・ｓ以上であっても加圧型や電動型の充填器具やその他の手段を用いて適用可能である。本発明の組成物の好ましい範囲は、１０ｍＰａ・ｓ～５００００ｍＰａ・ｓ、より好ましくは、１００ｍＰａ・ｓ～３００００ｍＰａ・ｓ、更に好ましくは２００ｍＰａ・ｓ～２００００ｍＰａ・ｓ、更により好ましくは５００ｍＰａ・ｓ～２００００ｍＰａ・ｓ、とりわけ好ましくは７００ｍＰａ・ｓ～２００００ｍＰａ・ｓである。別の好ましい態様では、５００ｍＰａ・ｓ～１００００ｍＰａ・ｓ、あるいは２０００ｍＰａ・ｓ～１００００ｍＰａ・ｓであってもよい。本発明の限定されないいくつかの態様の組成物は、シリンジ等で対象に適用することもできる粘度である。
　上記第１材組成物の見掛け粘度の測定は、常法に従い測定することができる。例えば、回転粘度計法による、共軸二重円筒形回転粘度計、単一円筒形回転粘度計（ブルックフィールド型粘度計）、円すい‐平板形回転粘度計（コーンプレート型粘度計）等を用いて測定することができる。好ましくは、日本薬局方（第１６版）の粘度測定法に従うことが望ましい。粘度測定は２０℃の条件で行うことが望ましい。なお、後述のように本発明における第１材組成物が細胞など溶媒に溶解しないものを含有する場合には、粘度測定を正確に行うため、細胞など溶媒に溶解しない状態の見掛け粘度とすることが好ましい。
　上記第１材組成物の見掛け粘度の測定は、特に、コーンプレート型粘度計、センサー３５／１（コーンの径３５ｍｍ、１°）を用いて測定することがより好ましい。例えば、以下のような測定条件で測定することが望ましい。試料溶液の調製は、ミリＱ水を用いて行う。測定温度は２０℃とする。コーンプレート型粘度計の回転数は、アルギン酸１価金属塩の１％溶液測定時は１ｒｐｍ、２％溶液測定時は０．５ｒｐｍとし、これを目安にして決定する。読み取り時間は、アルギン酸１価金属塩の１％溶液測定の場合は２分間測定し、開始１分から２分までの平均値とする。２％溶液測定の場合は２．５分間測定し、開始０．５分から２．５分までの平均値とする。試験値は３回の測定の平均値とする。
　上記第１材組成物の見掛け粘度の調整は、例えば、組成物中のアルギン酸１価金属塩の濃度、用いるアルギン酸１価金属塩の分子量又はＭ／Ｇ比等により行うことができる。あるいは、異なる分子量あるいは粘度の性状を有する別ロットのアルギン酸１価金属塩の２種以上を併用することによっても調整することができる。
　上記第１材組成物の見掛け粘度の調整においては、組成物中のアルギン酸１価金属塩の濃度が高い場合に見掛け粘度が高くなる傾向があり、濃度が低い場合に見掛け粘度が低くなる傾向がある。また、アルギン酸１価金属塩の分子量が大きい場合に見掛け粘度が高くなる傾向があり、分子量が小さい場合に見掛け粘度が低くなる傾向がある。また、用いるアルギン酸１価金属塩のＭ／Ｇ比によって、見掛け粘度が影響を受ける。この点、本発明に用いるアルギン酸１価金属塩のＭ／Ｇ比としては、０．１～５．０であることが好ましく、０．１～４．０であることがより好ましく、０．２～３．５であることが更により好ましい。
　一般に、Ｍ／Ｇ比が主に海藻の種類によって決まることなどから、原料として用いられる褐藻類の種類が、得られるアルギン酸１価金属塩の粘度の特性に影響を及ぼす。この点、本発明に用いるアルギン酸１価金属塩の由来としては、好ましくは、レッソニア属、マクロシスティス属、ラミナリア属、アスコフィラム属、ダービリア属等に属する褐藻類由来であることが好ましく、レッソニア属に属する褐藻類由来であることがより好ましく、レッソニア・ニグレッセンズ（Ｌｅｓｓｏｎｉａ  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）由来であることが特に好ましい。
　アルギン酸１価金属塩の含有量としては、一定の粘度の性状を備えるためには、分子量の影響を受けるので、一概にはいえないが、本発明における第１材組成物全体の０．１ｗ／ｖ％以上であることが好ましく、より好ましくは０．５ｗ／ｖ％以上、更に好ましくは１ｗ／ｖ％以上である。更に具体的に、アルギン酸１価金属塩の濃度は、好ましくは０．５ｗ／ｖ％～５ｗ／ｖ％、より好ましくは１ｗ／ｖ％～５ｗ／ｖ％、更に好ましくは１ｗ／ｖ％～３ｗ／ｖ％、とりわけ好ましくは１．５ｗ／ｖ％～２．５ｗ／ｖ％である。また、別の態様では、アルギン酸１価金属塩の濃度は、好ましくは０．５ｗ／ｗ％～５ｗ／ｗ％、より好ましくは１ｗ／ｗ％～５ｗ／ｗ％、更に好ましくは１ｗ／ｗ％～３ｗ／ｗ％、とりわけ好ましくは１．５ｗ／ｗ％～２．５ｗ／ｗ％であってもよい。
　本発明における第１材組成物は、発熱等を惹起することなく、生体組織等の対象に適用する場合により安全に施与する観点から、上記したような低エンドトキシン処理を施したアルギン酸１価金属塩を用いて、組成物のエンドトキシン含有量が、リムルス試薬（ＬＡＬ）によるエンドトキシン測定を行った場合に、５００エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｇ以下であることが好ましく、３００ＥＵ／ｇ以下であることがより好ましく、１５０ＥＵ／ｇ以下であることが更により好ましく、１００ＥＵ／ｇ以下であることが特に好ましい。
　本発明において、上記第１材組成物は、組織再生等の目的で細胞を含有せしめることは、必ずしも必要ではない。ただし、そのような細胞の使用をまったく排除するものではない。すなわち、本発明の限定されないいくつかの態様においては、上記第１材組成物に細胞を含有せしめてもよい。細胞としては、例えば、髄核細胞、幹細胞、間質細胞、間葉系幹細胞、骨髄間質細胞などが挙げられ、由来は特に限定されないが、椎間板髄核、骨髄、脂肪組織、臍帯血などを挙げることができる。また、細胞として、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞を挙げることもできる。
　具体的には、用いる細胞は、必要に応じて、椎間板髄核、骨髄、脂肪組織、臍帯血などから回収し、目的とする細胞を濃縮する処理や培養して細胞数を増やす処理を行い、調製した細胞を用いることができる。そして、細胞の種類によっても異なるが、上記第１材組成物中に、典型的に、例えば、１×１０4個／ｍｌ以上、もしくは１×１０5個／ｍｌ以上、好ましくは１×１０4個／ｍｌ～１×１０7個／ｍｌの細胞を含有せしめることができる。細胞は市販品を入手して用いてもよい。
　本発明の限定されないいくつかの態様では、上記第１材組成物には、細胞の成長を促進する因子を含有せしめてもよい。そのような因子としては、例えば、ＢＭＰ（Bone morphogenetic protein）、ＦＧＦ（Fibroblast growth factor）、ＶＥＧＦ（Vascular endothelial growth factor）、ＨＧＦ（Hepatocyte growth factor）、ＴＧＦ‐β（Transforming growth factor-β）、ＩＧＦ‐１（Insulin-like growth factor-1）、ＰＤＧＦ（Platelet-derived growth factor)、ＣＤＭＰ（Cartilage-derived-morphogenetic protein）、ＣＳＦ（Colony stimulating factor）、ＥＰＯ（Erythropoietin）、ＩＬ（Interleukin）、ＰＲＰ（Platelet rich plasma）、ＳＯＸ（転写因子）、ＩＦ（Interferon）などが挙げられる。これらの因子は、組み換え法により製造してもよく、あるいは蛋白組成物から精製してもよい。なお、本発明の限定されない別の態様においては、上記第１材組成物は、これらの因子を含まない。成長因子を含まない場合でも、アルギン酸１価金属塩による軟骨組織の再生等の作用効果は十分に良好であるし、積極的に細胞死を抑制する場合と比較してより安全性も高い。
　本発明の限定されないいくつかの態様では、上記第１材組成物には、細胞死を抑制する因子を含有せしめてもよい。細胞死を引き起こす因子としては、例えば、Ｃａｓｐａｓｅ、ＴＮＦα等が挙げられ、これらを抑制する因子としては、抗体やｓｉＲＮＡ等が挙げられる。これらの細胞死を抑制する因子は、組み換え法により製造してもよく、あるいは蛋白組成物から精製してもよい。なお、本発明の限定されない別の態様においては、上記第１材組成物は、これらの因子を含まない。細胞死を抑制する因子を含まない場合でも、アルギン酸１価金属塩による軟骨組織の再生等の作用効果は十分に良好であるし、積極的に細胞死を抑制する場合と比較してより安全性も高い。
　本発明の限定されないいくつかの態様では、上記第１材組成物には、必要に応じて、更に、他の医薬活性成分や、安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤等の慣用成分など、通常医薬に用いられる成分を含有せしめてもよい。具体的には、例えば、第１材組成物は、塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの１価金属塩、あるいは、塩化アンモニウム等のアンモニウム塩などを含有してもよく、好ましくは１価金属塩であり、より好ましくは塩化ナトリウムである。
　本発明において、上記第１材組成物には、基本的には、組成物をゲル化させる架橋剤を、必ずしも必要としていない。ただし、本発明の限定されないいくつかの態様では、上記第１材組成物には、一定時間経過後に初めて組成物がゲル化される程度の量の架橋剤が含まれていてもよい。ここでの一定時間とは、特に限定されないが、好ましくは３０分～１２時間程度である。組成物をゲル化させる量の架橋剤を含有しないことは、例えば、組成物を２０℃で１時間静置した後に、２１Ｇの注射針をつけたシリンジで注入できることで示されてもよい。一方、本発明の限定されない別のいくつかの態様では、上記第１材組成物には、架橋剤が含まれていない。
　４．第２剤（材）組成物
　本発明における第２剤（材）組成物は、上記した架橋剤を含有するものであればよく、特にその製剤的形態に制限はない。例えば、一旦溶液として調製したものを凍結乾燥等して乾燥状態で提供してもよい。ただし、使用時にはシリンジ等の注入器を用いることが、操作性がよく、便利である。よって、適用時には液体の状態にして用いることが好ましい。そのための溶媒は特に制限されないが、例えば、精製水、蒸留水、イオン交換水、ミリＱ水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられる。これらは、滅菌されていることが好ましく、低エンドトキシン処理されたものが好ましい。例えば、ミリＱ水をろ過滅菌して用いることができる。
　また、本発明における第２材組成物には、上記した架橋剤以外の成分が含有されていてもよく、その混合操作等、上記第２材組成物を得るための操作は、上記した第１材組成物と同様に、エンドトキシンレベル及び細菌レベルの低い環境下で行うことが望ましい。例えば、操作はクリーンベンチで、滅菌器具を使用して行うことが好ましく、使用する器具を市販のエンドトキシン除去剤で処理してもよい。
　上記第２材組成物中の架橋剤の濃度等は、用いる架橋剤の種類等に応じて適宜設定すればよい。本発明の限定されないいくつかの態様において、例えば、架橋剤としてＣａＣｌ2を用いる場合、その濃度は、適用する上記第１材組成物のアルギン酸１価金属塩の濃度や分子量等によっても異なり、一概にはいえないが、好ましくは１０ｍＭ～１０００ｍＭ、より好ましくは２５ｍＭ～２００ｍＭ、とりわけ好ましくは５０ｍＭ～１５０ｍＭであってもよい。
　５．生体適用組成物
　本発明の別の観点においては、本発明は、更に、生体適用組成物を提供する。本明細書において「生体適用組成物」とは、上記に説明した組成物の組合せ物又は処置方法における第１材組成物のうち着色成分として、国等の規制により生体への使用が許可されている色素、すなわち生体に施与可能な色素を用いるものをいう。したがって「生体適用組成物」は「第１材組成物」の一形態であって、「第１材組成物」の語は「生体適用組成物」を含む意味で用いられ、特に断らない限り、「第１材組成物」は「生体適用組成物」に読み替えて用いることができる。すなわち、この生体適用組成物は、着色成分及びアルギン酸１価金属塩を含有し、流動性がある状態で対象に施与され、好ましくは、対象に施与したときに少なくとも一部分がゲル化するようにして用いられるものである。そして、着色成分を含有することにより、対象に施与したときのゲル化の様子を確実に視認することができるようにしており、更に、着色成分として国等の規制により生体への使用が許可されている色素、すなわち、生体へ施与可能な色素を用いることにより、ヒト等に対して安全に使用することができるようにしている。国等の規制により生体への施与が可能な色素としては、例えば、日本において、厚生労働省により、医薬品、医薬部外品、化粧品への使用が認められている色素、また、米国においてＦＤＡにより、医薬品、医療機器、化粧品などへの使用が認められている色素等が挙げられる。また、着色成分は、生体適用組成物を、骨組織、軟骨組織、骨軟骨組織、椎間板組織、半月板組織、靭帯などに施与したときにゲル膜の形成状態を評価しやすいものであることが好ましく、識別性の観点から、青色～緑色の色素が好ましい。このような着色成分としては、例えば、緑色３号（ファストグリーンＦＣＦ）、青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）、青色２号（インジゴカルミン）、緑色２０１号（アリザシンシアニングリーンＦ）、緑色２０２号（キニザリングリーンＳＳ）、青色２０１号（インジゴ）、青色２０２号（パテントブルーＮＡ）、青色２０３号（パテントブルーＣＡ）などが挙げられ、より好ましくは、緑色３号（ファストグリーンＦＣＦ）、青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）である。
　本発明により提供される第１材組成物又は生体適用組成物においては、上記色素が、その色素による視認性を与える濃度であって、且つ、冷蔵保存時に析出が生じない濃度で含有されていることが好ましい。これによれば、視認性を与える着色成分として組成物中に含有されている色素が、対象に施与する前に冷蔵保存するような場合でも、その分散性もしくは均一性が安定に保たれて、対象に施与したときのゲル化の様子をより確実に視認することができる。
　上記組成物中の色素の濃度が視認性を与える濃度であるかどうかについては、視認により確認してもよいが、色の測定により評価してもよい。例えば、物体の色を表すのに使用されているＬ＊ａ＊ｂ＊色空間は、１９７６年に国際照明委員会（ＣＩＥ）で規格化され、日本でも日本工業規格（ＪＩＳ　Ｚ　８７８１－４）において採用されている表色系である。Ｌ＊は、色の明度を表し、Ｌ＊＝０は黒、Ｌ＊＝１００は白の拡散色であり、０～１００の数値で表される。色度（色相と彩度）は、ａ＊、ｂ＊の数値で表される。ａ＊、ｂ＊は、色の方向を示し、a＊は赤方向、－ａ＊は緑方向、ｂ＊は黄方向、－ｂ＊は青方向を示し、数値が大きくなるに従って色あざやかになり、数値が小さくなるに従ってくすんだ色になる。
　本明細書の試験例１において、青色１号を濃度０．００１～０．０１ｗ／ｗ％で含む２ｗ／ｗ％アルギン酸ナトリウム溶液のＬ＊ａ＊ｂ＊表色系の範囲は、光源をＤ６５／２、測定モードを透過測定とした分光色差計（ＳＥ－６０００）（日本電色工業株式会社製）を用いて常温（１５～２５℃）環境下で測定したとき、Ｌ＊（明度）は４０～８０、ａ＊は－４０～－５（緑方向）、ｂ＊は－６０～－２０（青方向）であった。この範囲の色であれば、軟骨や周辺組織との識別もしやすく、ゲル膜の形成状態の評価が容易である。特に、Ｌ＊（明度）の数値が低すぎると（０に近くなると）組成物の黒色傾向が強くなり、施与時の影により識別しにくい。また、Ｌ＊が高すぎると（１００に近くなると）組成物の白色傾向が強くなり、白色の軟骨等と識別しにくくなる。実際に、青色１号を濃度０．１ｗ／ｗ％で含む２ｗ／ｗ％アルギン酸ナトリウム溶液は黒色傾向が強く、本発明への使用に適さないことが確認された。従って、本発明の第１材組成物又は生体適用組成物の好ましいＬ＊ａ＊ｂ＊表色系における色彩値の範囲は、Ｌ＊（明度）は４０～８０、ａ＊は－４０～０、ｂ＊は－６０～－２０である。
　このようなＬ＊ａ＊ｂ＊色空間において、下記式（１）で表される色差ΔＥの値などを指標にすることで、より客観的に評価することができる。ここで、人間が明確に別の色名のイメージを持つ色差は、下記式（１）で表される色差ΔＥの値として１３～２５程度であると言われている。軟骨組織、椎間板組織、それらの周辺組織等のほとんどの部分は、白色、赤色（ａ＊はプラスの数値）～黄色（ｂ＊はプラスの数値）の色調であり、ａ＊、ｂ＊値は、それぞれプラスの値であることが多い。本発明の第１材組成物又は生体適用組成物のａ＊は－４０～０、ｂ＊は－６０～－２０であり、十分な色調の差が得られることが分かる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
 （式（１）中、Ｌ１＊、ａ１＊、ｂ１＊は、比較対照のＬ＊ａ＊ｂ＊色空間の各値であり、Ｌ２＊、ａ２＊、ｂ２＊は、対象サンプルを測定したときのＬ＊ａ＊ｂ＊色空間の各値である。）
　Ｌ＊、ａ＊、ｂ＊値は、例えば、分光色差計（「ＳＥ－６０００」、日本電色工業株式会社製）等を用いて測定することができる。なお、分光色差計は、分光色彩計などとも呼ばれる場合がある。
　一方、上記組成物中の色素の濃度が冷蔵保存時に析出が生じない濃度であるかどうかについては、例えば、上記組成物を一定期間（例えば、１日間、１週間、２週間、３週間、１ヵ月間、２ヶ月間、３ヵ月間、４ヵ月間、５ヵ月間、６ヵ月間、１年間、２年間、３年間など）、冷蔵庫（例えば、設定温度：２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、又は８℃など）に保存したうえ、目視により析出の有無を観察したり、あるいはフィルター（０．４５μｍ孔）等による濾過後に、その濾過前後の色差を測定したりして、判断することができる。本発明において、特に断りのない限り、組成物を設定温度５℃の冷蔵庫に１か月間保存し評価を行う。この場合、色調が視認し得なくなる状態を上記式（１）で表される色差の値の低下として検出し得る。すなわち、色素の析出が生じると、溶解している色素量が減少し、ひいては、色調の度合いが低下するからである。あるいは、ａ＊値、ｂ＊値など特定の色度の値に着目して評価してもよい。よって、上記組成物中の着色成分の濃度としては、例えば、着色成分が青色であれば、ｂ＊値に着目し、５℃に設定された冷蔵庫で１か月保存後のｂ＊値と保存前のｂ＊値との差異が２５以下の範囲に保たれるような濃度が好ましい。
　また、本発明の第１材組成物又は生体適用組成物は、前述のような一定期間の保存によっても色が安定していることが好ましい。本発明のいくつかの態様では、設定温度５℃の冷蔵庫に１か月間保存した後の組成物と、保存前の組成物との色差ΔＥの値は３５以下であることが好ましく、より好ましくは３０以下である。
　また、本発明の第１材組成物又は生体適用組成物は、例えば、約２℃～８℃の低温条件下で（例えば、５℃に設定された冷蔵庫で）、前述のような一定期間（例えば１か月間）の保存によっても着色成分の析出が生じない、すなわち、安定に保存可能な組成物であることが好ましい。
　本発明に用いる生体に施与可能な色素としては、典型的に、例えば、青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）、青色２号（インジゴカルミン）、緑色３号（ファストグリーンＦＣＦ）などが挙げられる。特に、青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）を用いることが好ましく、その濃度範囲としては、０．０００５質量％以上０．０５質量％以下であってよく、０．００１質量％以上０．０１質量％以下であってよい。
　６．組合せ物
　本明細書において「組合せ物」とは、対象に施与するときに、前記の第１剤（材）組成物及び第２剤（材）組成物が本発明に用いられるために存在していればよく、第１剤（材）組成物と第２剤（材）組成物の提供方法は特に限定されない。例えば、第１材組成物と第２材組成物はキットとして提供されてもいいし、あるいは、第１材組成物のみ提供され、第２材組成物は別途市販品から調製して用いられてもよい。
　第１材組成物は、保存時（又は提供時）には、溶液状態又は乾燥状態であってよく、乾燥状態の場合には、アルギン酸１価金属塩の凍結乾燥体を含むことが好ましい。第１材組成物は、バイアル、あるいは、プレフィルドシリンジに封入されてもよい。
　第１材組成物と第２材組成物とをキットとする場合、例えば、（１）第１材組成物としてアルギン酸ナトリウム、青色１号などの生体に施与可能な青色～緑色の色素、及び、塩化ナトリウムなどの１価金属塩を含む溶液を封入したプレフィルドシリンジ、（２）第２材組成物として塩化カルシウム溶液など２価以上の金属イオン化合物の溶液を封入したアンプル、（３）シリンジ、（４）注射針等を一つのパッケージに入れたキットとすることができる。また例えば、２種の溶液を別々に封入可能なダブルシリンジに（１）第１材組成物の溶液と（２）第２材組成物の溶液をそれぞれ封入して提供されてもよい。
　７．組合せ物の使用方法
　本発明の組合せ物は、第１剤（材）組成物を、流動性がある状態で対象に施与し、第２剤（材）組成物を、前記対象に施与した第１剤（材）組成物に接触させてその少なくとも一部分をゲル化させるようにして用いられる。第１材組成物の対象への施与、第１材組成物のゲル化、ゲル膜の形成状態の評価などの詳細は、前記発明を実施するための形態等に記載のとおりである。
　８．対象の処置方法
　本発明において、アルギン酸１価金属塩及び着色成分を含有する第１剤（材）組成物を、流動性がある状態で対象に施与する工程と、アルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤を含有する第２剤（材）組成物を、前記対象に施与した第１剤（材）組成物に接触させてその少なくとも一部分をゲル化させる工程と、前記対象に施与した該第１剤（材）組成物の表面のゲル膜の形成状態を評価する工程とを含む、該対象の処置方法が提供される。第１材組成物、その対象への施与、第２材組成物、第１材組成物のゲル化、ゲル膜の形成状態の評価等の詳細は、前記に記載のとおりである。
　（実施例１）
　関節鏡視下、着色したアルギン酸ナトリウム溶液（２ｗ／ｗ％）を関節軟骨欠損部に充填した。充填したアルギン酸ナトリウム溶液の液面を含む周辺に１００ｍＭ塩化カルシウム水溶液を接触させて、その表面をゲル化させた（ゲル膜の形成）。約５分後に、ゲル膜表面を含む軟骨欠損部周辺を生理食塩水で洗浄した。洗浄後、ゲル膜の形成が不十分なときは、ゾル状の着色したアルギン酸塩の流出が観察される。
　（実施例２）
　関節鏡視下、着色したアルギン酸ナトリウム溶液（２ｗ／ｗ％）を関節軟骨欠損部に充填した。充填したアルギン酸ナトリウム溶液の液面を含む周辺に１００ｍＭ塩化カルシウム水溶液を接触させて、その表面をゲル化させた（ゲル膜の形成）。約４分後に、注射器の先端でゲル膜表面に触れて、ゲル膜の形成を確認した。ゾンデ（消息子）でゲル膜表面に触れてもよい。ゲル膜の形成が不十分なときは、ゾル状の着色したアルギン酸塩の流出が観察される。
　（実施例３）
　関節鏡視下、ｐＨ感受性色素アントシアニンで着色し、ｐＨ６．５、紫色のアルギン酸ナトリウム溶液（２ｗ／ｗ％）を関節軟骨欠損部に充填した。充填したアルギン酸ナトリウム溶液の液面を含む周辺に、ｐＨ９．０に調整した１００ｍＭ塩化カルシウム水溶液を接触させて、その表面をゲル化させた（ゲル膜の形成）。塩化カルシウム水溶液が接触したゲル膜表面は、紫色から青色に変化し、ゲル膜の形成状態を評価することができる。
　（実施例４）
　下記表に示す処方に基づいて、第１材組成物（生体適用組成物）を調製し得る。表中の数値は質量％を意味する。調製方法は試験例１に準じて行うことができる。また、一般的に医薬品や医療機器で用いられる方法で調製し得る。第２材組成物は、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム溶液であり得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　[試験例１]
　アルギン酸ナトリウム溶液（２ｗ／ｗ％）に、生体に施与可能な色素である青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）を濃度０．００１ｗ／ｗ％、０．００４ｗ／ｗ％、０．００７ｗ／ｗ％、又は０．０１ｗ／ｗ％となるように添加して、着色し、ガラスバイアル３本に５gずつ分注した。これを５℃に設定した冷蔵庫で保存して、１週間、２週間、及び１ヵ月間経過後にサンプリングし、その試料を観察して色素析出の有無を確認した。また、分光色差計（「ＳＥ－６０００」、日本電色工業株式会社製）を用いて各試料のＬ＊、ａ＊、ｂ＊値を測定した。測定は常温（１５～２５℃）の室内で行った。光源はＤ６５／２とし、測定モードは透過測定とした。分光色差計は、サンプル測定前に、標品としての標準白色板（型番ＳＥ－３８７２４，日本電色株式会社製）の測定値を、Ｌ＊＝１００、ａ＊＝０，ｂ＊＝０に調整した。
　その結果、図２に示されるように、青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）は濃度０．００１ｗ／ｗ％～０．０１ｗ／ｗ％の範囲で鮮やかな青色を呈し、調製時から冷蔵保存１ヶ月後までにわたり色素の析出が認められずに、安定してその色調を維持していた。また、青色１号を含むアルギン酸ナトリウム溶液の表色系における色彩値の範囲は、Ｌ＊（明度）は約４０～８０、ａ＊は約－４０～－５（緑方向）、ｂ＊は約－６０～－２０（青方向）であることが分かった。
　[試験例２]
　アルギン酸ナトリウム溶液（２ｗ／ｗ％）に、生体に施与可能な色素である青色２号（インジゴカルミン）を濃度０．００４ｗ／ｗ％となるように添加して、着色し、シリンジに２gずつ分注した。この充填済みシリンジをネスト（シリンジ固定用グリッド付き容器）に入れ固定して、そのネストごと５℃に設定した冷蔵庫に保存し、一晩及び１９日後経過後に、シリンジ内の試料を観察して色素析出の有無を確認した。
　その結果、青色２号（インジゴカルミン）は濃度０．００４ｗ／ｗ％で鮮やかな青色を呈し、一晩の冷蔵保存後に色素の析出は認められなかった。ただし、１９日経過後の観察では色素の析出がみられ、その析出は室温に放置すると解消した。
　試験例１及び試験例２の結果から、生体に施与可能な色素である青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）及び青色２号（インジゴカルミン）は、アルギン酸ナトリウム溶液に対していずれも鮮やかな青色の色調を付与することができることが明らかとなった。また、青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）のほうが、青色２号（インジゴカルミン）に比べて、より安定に青色の色調を付与できることが明らかとなった。
１　第１剤（材）組成物
１ａ　第１剤（材）組成物の表面付近
１ｂ　第１剤（材）組成物の表面付近以外の内部
２　軟骨欠損部
３　第２剤（材）組成物

Claims (14)

  1. 　アルギン酸１価金属塩を含有する第１材組成物と、アルギン酸１価金属塩を架橋する作用を有する架橋剤を含有する第２材組成物とを含み、前記第１材組成物を、流動性がある状態で対象に施与し、前記第２材組成物を、前記対象に施与した該第１材組成物に接触させてその少なくとも一部分をゲル化させるようにして用いるための、該組成物の組合せ物であって、前記第１材組成物が、更に着色成分を含有することにより、前記対象に施与した該第１材組成物の表面のゲル膜の形成状態を評価することができるようにしたことを特徴とする、該組合せ物。
  2. 　前記ゲル膜の形成状態の評価が、前記対象に施与した該第１材組成物のうちの流動性がある状態の組成物の流出の有無の評価である、請求項１記載の組合せ物。
  3. 　前記ゲル膜の形成状態の評価が、（１）前記対象に施与した該第１材組成物のゲル膜表面の洗浄後、及び／又は、（２）前記対象に施与した該第１材組成物のゲル膜表面への加圧後に行われる、請求項１又は２記載の組合せ物。
  4. 　前記ゲル膜表面への加圧が、該ゲル膜表面に器具を接触させることにより行われる、請求項３記載の組合せ物。
  5. 　前記対象は、骨組織、軟骨組織、骨軟骨組織、椎間板組織、半月板組織、靭帯からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１～４のいずれか１項に記載の組合せ物。
  6. 　前記第１材組成物が、前記着色成分として生体に施与可能な青色～緑色の色素を含有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の組合せ物。
  7. 　前記第１材組成物の、分光色差計（光源：Ｄ６５／２、測定モード：透過測定）での測定によるＬ＊ａ＊ｂ＊表色系における色彩値が、Ｌ＊＝４０～８０、ａ＊＝－４０～０、ｂ＊＝－６０～－２０である、請求項１～６のいずれか１項に記載の組合せ物。
  8. 　前記着色成分が、設定温度５℃の冷蔵庫で１か月間の保存後に析出が生じない濃度で含有されている、請求項１～７のいずれか１項に記載の組合せ物。
  9. 　前記第１材組成物の、設定温度５℃の冷蔵庫で１か月間保存後と保存前とを比べたときの、分光色差計（光源：Ｄ６５／２、測定モード：透過測定）での測定によるＬ＊ａ＊ｂ＊表色系における色差ΔＥ値が３５以下である、請求項１～８のいずれか１項に記載の組合せ物。
  10. 　前記第１材組成物が、２℃～８℃の条件下で保存可能である、請求項１～９のいずれか１項に記載の組合せ物。
  11. 　前記第１材組成物が、更に他の１価金属塩を含有する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組合せ物。
  12. 　前記第１材組成物が、保存時に、溶液状態又は乾燥状態である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組合せ物。
  13. 　前記第１材組成物が、アルギン酸１価金属塩、生体に施与可能な青色～緑色の色素、及び、塩化ナトリウムを含有し、２℃～８℃の条件下で保存可能な組成物であって、該組成物は保存時に溶液状態又は乾燥状態である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組合せ物。
  14. 　前記着色成分は、０．０００５質量％～０．０５質量％の青色１号（ブリリアントブルーＦＣＦ）である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組合せ物。
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