CN114980937A - 用于使用了褐藻酸盐的对象的处置的组合和方法 - Google Patents
用于使用了褐藻酸盐的对象的处置的组合和方法 Download PDFInfo
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Abstract
在将含有褐藻酸的一价金属盐的具有流动性的状态的材料施用于对象时，实现其可靠的固定。一种组合物的组合，其包括含有褐藻酸的一价金属盐的第一材料组合物、以及含有具有将褐藻酸的一价金属盐交联的作用的交联剂的第二材料组合物，用于将所述第一材料组合物以具有流动性的状态施用于对象，使所述第二材料组合物与施用于所述对象的该第一材料组合物接触而使其至少一部分凝胶化，其中，所述第一材料组合物进一步含有着色成分，从而能够对施用于所述对象的该第一材料组合物表面的凝胶膜的形成状态进行评价。
Description
技术领域
本发明涉及对软骨再生等有用的、使用了褐藻酸的一价金属盐的对象的处置技术。
背景技术
由于在膝盖等关节软骨中不存在血管、神经网络，因此几乎没有自身修复能力，因此，若软骨缺损被放任不管，则会导致关节疼痛、关节功能丧失，常常会发展为骨关节炎。此外，由于年老、关节的过度使用，病状由关节软骨表面开始磨损的骨关节炎的初期阶段逐步发展，结果导致大范围的软骨缺损。
作为针对软骨损伤的治疗方法，已知自体骨软骨镶嵌移植术(mosaicusty)、用钻打孔的方法(microfracture法)、钻孔术(drilling)、用锉刀消除软骨下骨的方法(abrasion法)、以及切除损伤软骨(debridement)等外科处置。其中，microfracture法、drilling法、abrasion法被称为骨髓刺激法(Marrow stimulation technique)，促进骨髓出血，诱导骨髓来源的软骨前体细胞，期待其分化成软骨。但是，在骨髓刺激法中，存在会形成力学特性与本来的透明软骨不同的纤维软骨的问题。
另一方面，已知将溶解褐藻酸的一价金属盐而具有流动性的状态的材料施用于软骨组织的缺损部位，为了固定而添加交联剂进行凝胶化并放置规定期间，由此促进透明软骨的形成，可用作软骨再生用组合物等(专利文献1)。此外，关于椎间盘组织，已公开通过在椎间盘髓核摘除(切除)术后的空洞中填充褐藻酸的一价金属盐作为髓核填补材料，促进椎间盘髓核的再生(专利文献2)。进一步，公开了含有具有止血作用的成分和能够应用于人体的色素的局部止血用组合物，作为具有止血作用的成分，可以列举凝血酶、褐藻酸钠、血管收缩剂，色素之一可列举出蓝色1号。但是，没有公开实际使用褐藻酸钠的具体例子(专利文献3)。
[现有技术文献]
专利文献
专利文献1：日本专利第4740369号公报
专利文献2：日本专利第6487110号公报
专利文献3：日本特开2002-104996号公报
发明内容
发明要解决的课题
本发明人们认识到，在使用褐藻酸的一价金属盐时，存在难以确认以下情况的问题：是否已施用于所希望的部位、由交联剂引起的凝胶化是否充分、暂时凝胶化的部分是否产生破损、等等。即，例如在关节镜下的手术等中，作为使用者，由于固定的不确定性，必须过量使用包含褐藻酸的一价金属盐的材料、用于其凝胶化的材料、或者在施用这些后使用足够量的生理盐水等进行清洗等来进行应对。但是，如此应用的材料被期望尽量不扩展到目标部位以外的周边。此外，也期望清洗作业的省力化。
鉴于上述课题，本发明的目的在于，在将含有褐藻酸的一价金属盐的具有流动性的状态的材料施用于对象时，可以实现其可靠的固定。
此外，本发明的另一目的在于提供一种组合物，其含有着色成分和褐藻酸的一价金属盐，即使在约2～8℃的低温下保存一定期间(例如一个月等)也不会发生着色成分的析出，即，能够稳定地保存。
用于解决课题的手段
即，本发明如下所述。
[0]一种组合物的组合，其包括含有褐藻酸的一价金属盐的第一剂(材料)组合物、以及含有具有将褐藻酸的一价金属盐交联的作用的交联剂的第二剂(材料)组合物，用于将所述第一剂(材料)组合物以具有流动性的状态施用于对象，使所述第二剂(材料)组合物与施用于所述对象的该第一剂(材料)组合物接触而使其至少一部分凝胶化，其特征在于，所述第一剂(材料)组合物进一步含有着色成分，从而能够对施用于所述对象的该第一剂(材料)组合物表面的凝胶膜的形成状态进行评价。
[1]一种组合物的组合，其包括含有褐藻酸的一价金属盐的第一剂(材料)组合物、以及含有具有将褐藻酸的一价金属盐交联的作用的交联剂的第二剂(材料)组合物，用于将所述第一剂(材料)组合物以具有流动性的状态施用于对象，使所述第二剂(材料)组合物与施用于所述对象的该第一剂(材料)组合物接触而使其至少一部分凝胶化，其特征在于，所述第一剂(材料)组合物进一步含有着色成分，从而能够对施用于所述对象的该第一剂(材料)组合物表面的凝胶膜的形成状态进行评价。
[2]根据上述[1]所述的组合，其中，所述凝胶膜的形成状态的评价是对施用于所述对象的该第一剂(材料)组合物中的具有流动性的状态的组合物有无流出的评价。
[3]根据上述[1]或[2]所述的组合，其中，所述凝胶膜的形成状态的评价在(1)对施用于所述对象的该第一剂(材料)组合物的凝胶膜表面的清洗后、和/或(2)对施用于所述对象的该第一剂(材料)组合物的凝胶膜表面的加压后进行。
[4]根据上述[3]所述的组合，其中，对所述凝胶膜表面的加压通过使器具与该凝胶膜表面接触来进行。
[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的组合，其中，所述对象为选自由骨组织、软骨组织、骨软骨组织、椎间盘组织、半月板组织和韧带组成的组中的至少一种。
[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的组合，其中，所述第一材料组合物含有能够作为所述着色成分施用于生物体的蓝色～绿色的色素。
[7]根据上述[1]～[6]中任一项所述的组合，其中，所述第一材料组合物的利用分光色差计(光源：D65/2、测定模式：透过测定)测定得到的L*a*b*表色系中的色彩值为L*＝40～80、a*＝-40～0、b*＝-60～-20。
[8]根据上述[1]～[7]中任一项所述的组合，其中，以在设定温度5℃的冰箱中保存一个月后不发生析出的浓度含有所述着色成分。
[9]根据上述[1]～[8]中任一项所述的组合，其中，在设定温度5℃的冰箱中保存一个月后与保存前相比较时，所述第一材料组合物的利用分光色差计(光源：D65/2、测定模式：透过测定)测定得到的L*a*b*表色系中的色差ΔE值为35以下。
[10]根据上述[1]～[9]中任一项所述的组合，其中，所述第一材料组合物能够在2℃～8℃的条件下保存。
[11]根据上述[1]～[10]中任一项所述的组合，其中，所述第一材料组合物还含有其他一价金属盐。
[12]根据上述[1]～[11]中任一项所述的组合，其中，所述第一材料组合物在保存时是溶液状态或干燥状态。
[13]根据上述[1]～[12]中任一项所述的组合，其中，所述第一材料组合物含有褐藻酸的一价金属盐、能够施用于生物体的蓝色～绿色的色素、以及氯化钠，能够在2℃～8℃的条件下保存，且该组合物在保存时为溶液状态或干燥状态。
[14]根据上述[1]～[13]中任一项所述的组合，其中，所述着色成分为0.0005质量％～0.05质量％的蓝色1号(亮蓝FCF)。
[15]根据上述[1]～[13]中任一项所述的组合，其中，所述着色成分带来与该成分的介质环境相应的色调变化。
[16]根据上述[15]所述的组合，其中，所述介质环境为pH环境。
[17]根据上述[15]或[16]所述的组合，其中，所述第一材料组合物为pH6以上且pH8以下的溶胶或液体，所述第二材料组合物为pH4以上且小于pH6、或大于pH8且pH12以下的液体。
[18]根据上述[15]～[17]中任一项所述的组合，其中，所述着色成分是用pH敏感性色素或被溶解延迟用材料包覆的pH敏感性色素。
在本发明中，提供以下对象处置方法，例如也可以采用下述构成。
[2-1]一种对象处置方法，包括：将含有褐藻酸的一价金属盐和着色成分的第一剂(材料)组合物以具有流动性的状态施用于对象的步骤；使含有具有将褐藻酸的一价金属盐交联的作用的交联剂的第二剂(材料)组合物与施用于所述对象的该第一剂(材料)组合物接触而使其至少一部分凝胶化的步骤；以及对施用于所述对象的该第一剂(材料)组合物表面的凝胶膜的形成状态进行评价的步骤。
[2-2]根据上述[2-1]所述的方法，其中，所述凝胶膜的形成状态的评价是对施用于所述对象的该第一剂(材料)组合物中的具有流动性的状态的组合物有无流出的评价。
[2-3]根据上述[2-1]或[2-2]所述的方法，其中，所述凝胶膜的形成状态的评价在(1)对施用于所述对象的该第一剂(材料)组合物的凝胶膜表面的清洗后、和/或(2)对施用于所述对象的该第一剂(材料)组合物的凝胶膜表面的加压后进行。
[2-4]根据上述[2-3]所述的方法，其中，对所述凝胶膜表面的加压通过使器具与该凝胶膜表面接触来进行。
[2-5]根据上述[2-1]～[2-4]中任一项所述的方法，其中，所述对象为选自由骨组织、软骨组织、骨软骨组织、椎间盘组织、半月板组织和韧带组成的组中的至少一种。
[2-6]根据上述[2-1]～[2-5]中任一项所述的方法，其中，所述第一材料组合物含有能够作为所述着色成分施用于生物体的蓝色～绿色的色素。
[2-7]根据上述[2-1]～[2-6]中任一项所述的方法，其中，所述第一材料组合物的利用分光色差计(光源：D65/2、测定模式：透过测定)测定得到的L*a*b*表色系中的色彩值为L*＝40～80、a*＝-40～0、b*＝-60～-20。
[2-8]根据上述[2-1]～[2-7]中任一项所述的方法，其中，以在设定温度5℃的冰箱中保存一个月后不发生析出的浓度含有所述着色成分。
[2-9]根据上述[2-1]～[2-8]中任一项所述的方法，其中，在设定温度5℃的冰箱中保存一个月后与保存前相比较时，所述第一材料组合物的利用分光色差计(光源：D65/2、测定模式：透过测定)测定得到的L*a*b*表色系中的色差ΔE值为35以下。
[2-10]根据上述[2-1]～[2-9]中任一项所述的方法，其中，所述第一材料组合物能够在2℃～8℃的条件下保存。
[2-11]根据上述[2-1]～[2-10]中任一项所述的方法，其中，所述第一材料组合物还含有其他一价金属盐。
[2-12]根据上述[2-1]～[2-11]中任一项所述的方法，其中，所述第一材料组合物在保存时是溶液状态或干燥状态。
[2-13]根据上述[2-1]～[2-12]中任一项所述的方法，其中，所述第一材料组合物含有褐藻酸的一价金属盐、能够施用于生物体的蓝色～绿色的色素、以及氯化钠，能够在2℃～8℃的条件下保存，且该组合物在保存时为溶液状态或干燥状态。
[2-14]根据上述[2-1]～[2-13]中任一项所述的方法，其中，所述着色成分为0.0005质量％～0.05质量％的蓝色1号(亮蓝FCF)。
在本发明中，提供用于在以下的对象的处置中使用的褐藻酸的一价金属盐，例如也可以采用下述构成。
[3-1]一种用于对象处置的第一剂(材料)和第二剂(材料)组合物的组合，包括：将含有褐藻酸的一价金属盐和着色成分的第一剂(材料)组合物以具有流动性的状态施用于对象的步骤；使含有具有将褐藻酸的一价金属盐交联的作用的交联剂的第二剂(材料)组合物与施用于所述对象的该第一剂(材料)组合物接触而使其至少一部分凝胶化的步骤；以及对施用于所述对象的该第一剂(材料)组合物表面的凝胶膜的形成状态进行评价的步骤。
在本发明中，提供以下生物体适用组合物，例如也可以采用下述构成。
[4-1]一种生物体适用组合物，其含有褐藻酸的一价金属盐，用于在具有流动性的状态下施用于对象，其特征在于，含有能够作为着色成分施用于生物体的蓝色～绿色的色素。
[4-2]根据[4-1]所述的生物体适用组合物，其中，所述对象为选自由骨组织、软骨组织、骨软骨组织、椎间盘组织、半月板组织和韧带组成的组中的至少一种。
[4-3]根据上述[4-1]或[4-2]所述的生物体适用组合物，其中，所述生物体适用组合物的利用分光色差计(光源：D65/2、测定模式：透过测定)测定得到的L*a*b*表色系中的色彩值为L*＝40～80、a*＝-40～0、b*＝-60～-20。
[4-4]根据上述[4-1]～[4-3]中任一项所述的生物体适用组合物，其中，以在设定温度5℃的冰箱中保存一个月后不发生析出的浓度含有所述着色成分。
[4-5]根据上述[4-1]～[4-4]中任一项所述的生物体适用组合物，其中，在设定温度5℃的冰箱中保存一个月后与保存前的组合物相比较时，所述生物体适用组合物的利用分光色差计(光源：D65/2、测定模式：透过测定)测定得到的L*a*b*表色系中的色差ΔE值为35以下。
[4-6]根据[4-1]～[4-5]中任一项所述的生物体适用组合物，其中，所述生物体适用组合物能够在2℃-8℃的条件下保存。
[4-7]根据上述[4-1]～[4-6]中任一项所述的生物体适用组合物，其中，所述褐藻酸的一价金属盐通过GPC-MALS法测定的重均分子量(绝对分子量)为1万～100万。
[4-8]根据上述[4-1]～[4-7]中任一项所述的生物体适用组合物，其中，所述褐藻酸的一价金属盐为低内毒素褐藻酸的一价金属盐。
[4-9]根据[4-1]～[4-8]中任一项所述的生物体适用组合物，其中，所述生物体适用组合物还含有其他一价金属盐。
[4-10]根据[4-1]～[4-9]中任一项所述的生物体适用组合物，其中，所述生物体适用组合物在保存时是溶液状态或干燥状态。
[4-11]根据[4-1]～[4-10]中任一项所述的生物体适用组合物，其中，所述生物体适用组合物含有褐藻酸的一价金属盐、能够施用于生物体的蓝色～绿色的色素、以及氯化钠，能够在2℃～8℃的条件下保存，且该组合物在保存时为溶液状态或干燥状态。
[4-12]根据[4-1]～[4-11]中任一项所述的生物体适用组合物，其中，所述生物体适用组合物是用于在施用于对象时至少一部分凝胶化的组合物。
[4-13]根据上述[4-1]～[4-12]中任一项所述的生物体适用组合物，其中，所述着色成分为0.0005质量％～0.05质量％的蓝色1号(亮蓝FCF)。
[发明效果]
根据本发明，在将溶解有褐藻酸的一价金属盐而具有流动性的状态的材料施用于对象时，通过含有着色成分，可以简便地确认其后通过具有将褐藻酸的一价金属盐交联的作用的交联剂进行凝胶化并固定的处理是否充分。由此，能够实现其可靠的固定。
此外，作为提供可视性的着色成分，通过使用根据国家等的规定允许向生物体使用的色素、即能够施用于生物体的色素，能够安全地使用于人等。
进一步，能够提供含有能够在约2℃～8℃的低温条件下稳定地保存一定期间的着色成分和褐藻酸的一价金属盐的组合物，因此安全性也高，使用方便性良好。
本发明的组合、处置方法和生物体适用组合物具有上述中的任意一个以上效果。
附图说明
图1是表示本发明的一个实施方式的简要说明图，是对将含有褐藻酸的一价金属盐的第一剂(材料)组合物和含有具有将褐藻酸的一价金属盐交联的作用的交联剂的第二剂(材料)组合物施用于对象的操作进行说明的简要说明图。
图2是表示在试验例2中以规定浓度向褐藻酸钠溶液(2w/w％)添加能够施用于生物体的色素即蓝色1号(亮蓝FCF)进行着色、并调查在设定为5℃的冰箱中保存时的色调与外观的经时变化的结果的图表。。
具体实施方式
本发明涉及褐藻酸的一价金属盐的利用。具体而言，例如，已报告如下技术：通过将褐藻酸的一价金属盐施用于软骨的损伤部位或缺损部位，促进该部位的软骨组织的再生(日本专利第4740369号公报)。此外，例如，已报告如下技术：通过在椎间盘髓核摘除(切除)术后的空洞中施用褐藻酸的一价金属盐作为髓核填补材料，促进椎间盘髓核的再生，也抑制椎间盘组织整体的变性(日本专利第6487110号公报)。这样，褐藻酸的一价金属盐可用于对损伤或缺损的组织进行再生、修复或保护的用途。本发明的组合、方法或生物体适用组合物例如优选用于骨组织、软骨组织、骨软骨组织、椎间盘组织、半月板组织、韧带等的损伤部位、缺损部位。在本说明书中，“损伤”也包括“缺损”、“断裂”、“病变”等。另外，生物的范围并不限定于人。也可列举出人以外的生物，例如狗、猫、猪、兔、羊、马、牛、猴、鸟、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠等。
在本发明中，为了利用褐藻酸的一价金属盐，作为第一剂(材料)，使用含有褐藻酸的一价金属盐的组合物。此外，作为第二剂(材料)，使用含有具有将褐藻酸的一价金属盐交联的作用的交联剂的组合物。并且，将上述第一剂(材料)组合物以具有流动性的状态施用于对象，使上述第二剂(材料)组合物与施用于对象的该第一剂(材料)组合物接触而使其至少一部分凝胶化。由此，能够将施用于对象的上述第一剂(材料)组合物固定，防止从应用的位置偏移或漏出。
在本发明中，除了上述构成以外，上述第一材料组合物还含有着色成分。并且，通过以其着色成分为指标进行观察，能够对施用于对象的上述第一材料组合物表面的凝胶膜的形成状态进行评价。在此，“凝胶膜”是指使含有交联剂的第二材料组合物与第一材料组合物接触而形成于第一材料组合物表面的凝胶。“能够进行评价”意味着包括能够通过目视确认上述第一材料组合物表面的凝胶膜的形成状态的情况，还意味着不仅包括通过直接目视的情况，还包括能够经由显微镜、内窥镜(特别应用于关节的情况下为关节镜)进行确认。
上述凝胶膜的形成状态的评价可以通过以上述第一材料组合物中含有的着色成分为指标观察施用于对象的上述第一材料组合物中的具有流动性的状态的组合物是否流出来进行。例如，在一些非限定性的典型的实施方式中，可以通过在利用生理盐水等对凝胶膜表面进行清洗后观察在施用于对象的上述第一材料组合物中的具有流动性的状态的组合物是否流出来进行评价。或者，例如，也可以在通过使探头(探针)、钳子、镊子、注射器等注入器的前端部等器具接触上述凝胶膜表面而进行加压后，观察施用于对象的上述第一材料组合物中的具有流动性的状态的组合物是否流出。
作为本发明中使用的着色成分，优选在对骨组织、软骨组织、骨软骨组织、椎间盘组织、半月板组织、韧带等施用第一材料组合物时容易对凝胶膜的形成状态进行评价的着色成分。例如，如果是呈中间色系(例如绿色)、冷色系(例如蓝色)等色调的色素，则在手术等中，即使在视野中包含周边组织、血液(红黄色系的色调)、软骨(白色系的色调)、影子(黑色系的色调)等的环境下，也容易从它们中进一步判别，因此是优选的。作为这样的色素，例如可列举出：绿色3号(孔雀石绿FCF)、叶绿素铜、叶绿素铜钠、溴磺酞钠、吲哚菁绿、氟醋酸钠、亚甲基蓝、蓝色1号(亮蓝FCF)、蓝色2号(靛蓝胭脂红)、甲苯胺蓝、脓单宁蓝、磷酸锰铵等。
此外，在一些实施方式中，本发明中使用的着色成分优选为根据国家等的规定允许对生物体使用的色素、即能够施用于生物体的色素，关于这一点将在后面叙述。
此外，在其他实施方式中，本发明中使用的着色成分优选为，在根据本说明书的记载制备第一材料组合物或生物体适用组合物时，能够在约2～8℃的低温条件下稳定地保存一定期间的着色成分。
在本发明的一些非限定性的实施方式中，上述着色成分也可以带来与介质环境相应的色调变化。由此，在施用于对象的上述第一材料组合物流出的情况下，其着色成分会暴露于介质环境的变化中，随之色调也发生变化，因此，容易更可靠地掌握是否流出。此外，上述凝胶膜随着含有交联剂的第二材料组合物在施用于对象的第一材料组合物的表面附近扩散并与第一材料组合物接触而形成。因此，通过掌握着色成分引起色调变化的状况，该色调变化反映了施用于对象的上述第一材料组合物的表面附近的凝胶化的状况，进而由此更容易掌握凝胶膜的形成状态。
作为在上述实施方式中使用的、带来与介质环境对应的色调变化的着色成分，优选为带来与pH环境对应的色调变化的pH敏感性色素。一般来说，pH敏感性色素包括在酸性侧具有变色区域的色素和在碱性侧具有变色区域的色素，因此可以根据需要适当使用具有适当变色区域的色素。表1、2表示代表性的pH敏感性色素。
[表1]
表1代表性pH敏感性色素(pH4～6)
[表2]
表2代表性pH敏感性色素(pH8～12)
例如，在一些非限定性的典型的实施方式中，在第二材料组合物的pH为pH4以上且小于pH6的情况下，通过在使第一材料组合物的pH为pH6以上且pH8以下并使用甲基红等重氮系色素，能够发挥上述那样的凝胶膜的可视化的效果。此外，也可以使用溴甲酚绿等磺内酯系的色素。在上述第二材料组合物的pH为大于pH8且pH12以下的情况下，通过在使上述第一材料组合物的pH为pH6以上且pH8以下并使用酚酞等内酯系色素，能够发挥上述那样的凝胶膜的可视化的效果。此外，也可以使用花色素等花青素系的色素。
作为着色成分的含量，可以根据需要适当地设定适当的含量，如果典型地例示，则优选为第一材料组合物整体的0.0005w/v％～1.0w/v％，更优选为0.001w/v％～1.0w/v％，进一步优选为0.01w/v％～1.0w/v％。此外，在其他实施方式中，着色成分的含量可以为第一材料组合物整体的0.0005w/w％～1.0w/w％，优选为0.0005w/w％～0.1w/w％。另外，在本说明书中，使用“～”表示的数值范围表示分别包括“～”前后记载的数值作为最小值和最大值的范围。
上述pH敏感性色素可以用溶解延迟用材料包覆。由此，不会发生由着色成分引起的色调变化，直到经过一定时间后其材料溶解，因此能够将与从上述第二材料组合物与上述第一材料组合物接触起经过了一定时间的情况相关的信息一并可视化。作为能够用于这样的实施方式的溶解延迟用材料，可以列举出CMEC(羧甲基乙基纤维素)、甲基丙烯酸共聚物S、甲基丙烯酸共聚物L、或者通过将它们以适当的比例混合而使溶解的pH范围在pH8～12的范围内适当调节的材料等。此外，作为包覆色素的方法，可以通过使用溶解延迟用材料进行微胶囊化的方法、与溶解延迟用材料混炼后通过粉碎、挤出造粒进行颗粒化的方法、利用喷雾干燥法形成微粒的方法等这样的公知的方法来制备。
在图1中，作为本发明的一个实施方式，以将上述两种剂(材料)应用于软骨缺损部位的情况为例，进一步详细说明其操作。
首先，将含有褐藻酸的一价金属盐的第一剂(材料)组合物1调制成具有流动性的溶胶或液体的状态的组合物，用未图示的注射器等注入器填充到软骨缺损部位2(图1a)。在软骨缺损部位2例如也可以进行骨髓刺激法(Marrow stimulation technique)手术，促进骨髓出血，诱导骨髓来源的软骨前体细胞，期待其分化成软骨。在骨髓刺激法中，具体而言，也可以使用钻、动力钻头等，形成直径1.5mm左右且达到软骨下骨的一个或多个孔。此外，在软骨损伤部位处残留着骨髓来源的软骨前体细胞的情况下，也可以同样地形成直径1.5mm左右且未达到软骨下骨的一个或多个孔。
接着，将含有具有将褐藻酸的一价金属盐交联的作用的交联剂的第二剂(材料)组合物3从注射器等注入器滴到填充于软骨缺损部位2的第一剂(材料)组合物1的表面上(图1b)。第二剂(材料)组合物3中所含的交联剂随着第二剂(材料)组合物3的扩散而一起扩散到第一剂(材料)组合物1的整个表面附近(图1中，用符号“1a”指示的部分)，发挥对褐藻酸的一价金属盐的交联作用，由此在填充于软骨缺损部位2的第一剂(材料)组合物1的表面上形成凝胶膜，以在软骨缺损部位2的开口部上形成盖(图1c)。如此，在向软骨缺损部位2填充时，处于具有流动性的状态的第一剂(材料)组合物1固定于软骨缺损部位2，可防止其应用位置偏移、或从软骨缺损部位2漏出。另外，对于第一剂(材料)组合物1的表面附近以外的内部(图1中，用符号“1b”指示的部分)，也可以不必凝胶化。反而如果没有凝胶化，可能有利于作为组织基础的前体细胞的移动、组织化。
在本发明中，作为将含有褐藻酸的一价金属盐的上述第一材料组合物施用于对象、或者此后使含有具有将褐藻酸的一价金属盐交联的作用的交联剂的上述第二材料组合物起作用的方式，没有特别限制，例如作为对生物体的典型的手术方式，可以列举出通过切开患部而在直视下进行的手术等。此外，也可以为经皮手术方式(切开约5mm)。或者，作为创伤性更低的手术方式的选择，也可以在显微镜下(切开约3～4cm)或内窥镜(特别应用于关节的情况下为关节镜)下(切开约1～2cm)进行手术。根据本发明，应用上述第一材料组合物时的可视性提高，因此在采用显微镜下、内窥镜(特别应用于关节的情况下为关节镜)下的手术那样的视野有限的手术方式的情况下，优点特别显著。例如，在关节镜观察下的狭窄的关节空间中，当将第一材料组合物1注入到软骨缺损部位2中，直到与周边组织相同的高度时，如果组合物是透明的，则不知道是否已适当地填充，手术比较困难。通过对组合物进行着色，可以看到填充的情况，因此可以适当地进行填充。
在本发明的一些非限定性的实施方式中，也可以预先通过体外试验来评价上述第一材料组合物对上述第二材料组合物的作用性。即，使用与实际使用时同样的使用比率，例如在直径6mm的试管中加入上述第一材料组合物500μL，从其上填充以规定的使用比率制备了交联剂的上述第二材料组合物并静置1小时后，试管内的组合物的表面部分凝胶化，另一方面，试管内的组合物的容量的至少五成没有凝胶化，未凝胶化的部分能够通过用带有21G的注射针的注射器对试管内的组合物的容量的至少五成进行吸引等，来预先进行评价。
以下，进一步对本发明进行详细说明。
1.褐藻酸的一价金属盐
褐藻酸是一种可生物降解的高分子多糖类，是将D-甘露糖醛酸(M)和L-古罗糖醛酸(G)这两种糖醛酸以直链状聚合而成的聚合物。更具体而言，是将D-甘露糖醛酸的均聚物级分(MM级分)、L-古罗糖醛酸的均聚物级分(GG级分)、以及D-甘露糖醛酸和L-古罗糖醛酸无规排列而成的级分(MG级分)任意地结合而成的嵌段共聚物。褐藻酸的D-甘露糖醛酸与L-葡萄糖醛酸的构成比(M/G比)主要根据海藻等来源的生物的种类而不同，此外，受到该生物的生长场所、季节的影响，遍及M/G比为约0.4的高G型到M/G比约为5的高M型的高范围。
褐藻酸可以是天然来源的物质，也可以是合成物，例如可以使用来源于褐藻类等的天然来源的物质。含有褐藻酸的褐藻类在全世界的沿海区域都较为繁茂，但实际上，能够作为原料使用的褐藻类有限，以南美的褐藻、北美的巨藻、欧洲的海带、泡叶藻、澳大利亚的丛梗藻等为代表。例如，可以列举出褐藻(Lessonia)属、巨藻(Macrocystis)属、海带(Laminaria)属(昆布属)、泡叶藻(Ascophyllum)属、丛梗藻(Durvillea)属、羽叶藻(Eisenia)属、昆布(Ecklonia)属等。
在本发明中，使用褐藻酸的一价金属盐。由此，褐藻酸的一价金属盐的溶解性、溶解稳定性良好，是适于在溶解于水等溶剂中而具有流动性的状态下施用于生物体组织等对象的实施方式。褐藻酸的一价金属盐可以使用上述褐藻类，通过酸法、钙法等公知的方法或以其为基准的方法来制备。具体而言，例如可以通过使用碳酸钠水溶液等碱水溶液从褐藻类中萃取，用酸(例如盐酸、硫酸等)中和后进行离子交换处理等而得到。作为褐藻酸的一价金属盐，具体而言，可以举出褐藻酸钠、褐藻酸钾等，特别优选能够由市售品获得的褐藻酸钠。
本发明中使用的褐藻酸的一价金属盐之类的高分子多糖类通常难以准确地确定其分子量，如果分子量过低，则溶解于水等时的表观粘度变低，对所应用的生物体组织等对象的密合性有可能变弱，此外，分子量过高的物质难以制备，并且会产生溶解性降低、溶解于水等时表观粘度过高而可处理性变差、长期保存时难以维持物性等问题，因此，一般以重均分子量计为1万～1000万、优选为2万～800万、更优选为5万～500万的范围。
本发明中使用的褐藻酸的一价金属盐的分子量可以按照常规方法进行测定。作为一例，例如在分子量测定中使用凝胶渗透色谱的情况下的代表性条件下，作为色谱柱，例如可以使用GMPW-XL×2+G2500PW-XL(7.8mm I.D.×300mm)，作为洗脱液，例如可以使用200mM硝酸钠水溶液，作为分子量标准，例如可以使用普鲁兰。此外，作为另一例，在分子量测定中使用GPC-MALS时的代表性条件下，作为检测器，例如可以使用RI检测器和光散射检测器(MALS)。
一般来说，已知在天然物质来源的高分子物质的分子量测定中，根据测定方法，值可能产生差异。因此，关于本发明中使用的褐藻酸的一价金属盐的分子量，例如，通过凝胶渗透色谱(GPC)或凝胶过滤色谱法(将它们总称为尺寸排阻色谱法)测定的重均分子量优选为10万以上，更优选为50万以上，此外，优选为500万以下，更优选为300万以下。其优选的范围为10万～500万，更优选为50万～350万。
此外，例如，根据组合了凝胶渗透色谱(GPC)和多角度光散射检测器(Multi AngleLight Scattering：MALS)的GPC-MALS法，可以测定绝对重均分子量。关于本发明中使用的褐藻酸的一价金属盐的分子量，通过这样的GPC-MALS法测定的重均分子量(绝对分子量)优选为1万以上，更优选为8万以上，进一步优选为9万以上，此外，优选为100万以下，更优选为80万以下，进一步优选为70万以下，特别优选为50万以下。其优选的范围为1万～100万，更优选为8万～80万，更进一步优选为9万～70万，特别优选为9万～50万。
另外，通常在通过上述那样的方法算出高分子多糖类的分子量的情况下，可能产生10～20％以上的测定误差，例如，如果为40万则在32～48万、如果为50万则在40～60万、如果为100万则在80～120万左右的范围内产生值的变动。
褐藻酸的一价金属盐在刚从褐藻类中萃取出来时，具有分子量大、表观粘度高的倾向，经过加热来干燥、纯化等过程，分子量变小，表观粘度变低。通过制造工序的温度等条件管理、作为原料的褐藻类的选择、制备工序中的分子量的分级等方法，能够制造分子量不同的褐藻酸的一价金属盐。进一步，通过与具有不同分子量或粘度的其他批次的褐藻酸的一价金属盐混合，也可以制成具有目标分子量的褐藻酸的一价金属盐。
因此，本发明中使用的褐藻酸的一价金属盐的品质可以与上述分子量一起根据粘度特性进行检定。在这一点上，例如，溶解于Milli-Q水中而制成1w/w％浓度的溶液，使用锥板型粘度计在20℃的条件下进行粘度测定时的粘度优选为40mPa·s～800mPa·s，更优选为50mPa·s～600mPa·s。
本发明中使用的褐藻酸的一价金属盐优选进行了低内毒素处理。由此，不会引起发热等，在应用于生物体组织等对象的情况下能够更安全地施用。内毒素水平可以通过公知的方法进行确认，例如，可以通过使用鲎试剂(LAL)的方法、使用Endospecy(注册商标)ES-24S组(生化学工业株式会社)的方法等进行测定。
对天然物质来源的高分子材料，低内毒素处理可以通过已知的公知的方法或以其为基准的方法来进行。例如，可以通过菅等人的纯化透明质酸钠的方法(例如，参照日本特开平9-324001号公报等)、吉田等人的纯化β-1，3-葡聚糖的方法(例如参照日本特开平8-269102号公报等)、William等人的纯化褐藻酸盐、结冷胶(gellan gum)等高分子盐的方法(例如参照日本特表2002-530440号公报等)、James等人(例如参照国际公开第93/13136号小册子等)或Lewis等人(例如参照美国专利第5589591号说明书等)的纯化多糖的方法；Hermanfranck等人的纯化褐藻酸盐的方法(例如参照Appl Microbiol Biotechnol(1994)40：638-643等)等、或者以这些为基准的方法来实施。本发明的低内毒素处理并不限于这些，可以通过清洗、利用过滤器(内毒素去除过滤器、带电的过滤器等)的过滤、超滤、使用柱(内毒素吸附亲和柱、凝胶过滤柱、利用离子交换树脂的柱等)的纯化、向疏水性物质、树脂或活性炭等的吸附、有机溶剂处理(通过有机溶剂进行的萃取，通过添加有机溶剂进行的析出、沉淀等)、表面活性剂处理(例如参照日本特开2005-036036号公报等)等公知的方法或者将它们适当组合来实施。在这些处理步骤中，也可以适当组合离心分离等公知的方法。优选根据褐藻酸的一价金属盐的种类进行适当选择。
低内毒素处理的方法没有特别限定，作为其结果，在利用鲎试剂(LAL)进行内毒素测定的情况下，内毒素含量优选为500内毒素单位(EU)/g以下，更优选为100EU/g以下，进一步更优选为50EU/g以下，特别优选为30EU/g以下。经低内毒素处理的褐藻酸钠例如可以通过Sea Matrix(注册商标)(持田制药株式会社)、PRONOVATMUP LVG(FMC BioPolymer)等市售品获得。
2.交联剂
在本发明中，使用具有将褐藻酸的一价金属盐交联的作用的交联剂。具体而言，例如可举出Ca2+、Mg2+、Ba2+、Sr2+等二价以上的金属离子化合物等。更具体而言，作为二价以上的金属离子化合物，可以列举出CaCl2、MgCl2、CaSO4、BaCl2等，基于容易获得、凝胶强度等理由，特别优选CaCl2溶液。
3.第一剂(材料)组合物
本发明中的第一剂(材料)组合物只要含有上述褐藻酸的一价金属盐和本说明书中记载的着色成分即可，对其制剂形态没有特别限制。例如，也可以暂时制备成溶液后进行冷冻干燥等而以干燥状态提供。但是，在施用于生物体组织等对象时，需要具备一定的流动性和粘度特性。因此，在应用时，优选为溶胶或液体的状态(在本说明书中，将它们一并称为“溶液状态”)。用于此目的的溶剂没有特别限制，例如可以列举出纯化水、蒸馏水、离子交换水、Milli-Q水、生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)等。其优选进行了灭菌，优选进行了低内毒素处理。例如，可以对Milli-Q水进行过滤灭菌后使用。即，第一材料组合物在其保存时(或提供时)优选为溶液状态或干燥状态。
此外，如下所述，本发明中的第一材料组合物中可以含有上述褐藻酸的一价金属盐以外的成分，其混合操作等用于得到上述第一材料组合物的操作优选在低内毒素水平和细菌水平的环境下进行。例如，操作优选在净化台上使用灭菌器具进行，也可以使用市售的内毒素除去剂对使用的器具进行处理。
作为施用于生物体组织等对象时的性状，本发明中的第一材料组合物优选具有例如将组合物在20℃下静置1小时后能够用21G的注射针注入的流动性。此时，如果粘度过低，则对所应用的部位的周边组织的密合性有可能变弱，因此，表观粘度没有特别限定，优选为10mPa·s以上，更优选为100mPa·s以上，进一步优选为200mPa·s以上，特别优选为500mPa·s以上。如果表观粘度过高，则可处理性有可能变差，因此优选为50000mPa·s以下，更优选为20000mPa·s以下，进一步优选为10000mPa·s以下。在表观粘度为20000mPa·s以下时，能够更容易地应用于注射器等。但是，即使表观粘度为20000mPa·s以上，也可以使用加压式、电动式的填充器具、其他手段来应用。本发明的组合物的优选范围为10mPa·s～50000mPa·s，更优选为10mPa·s～30000mPa·s，进一步优选为200mPa·s～20000mPa·s，进一步优选为500mPa·s～20000mPa·s，特别优选为700mPa·s～20000mPa·s。在其他优选实施方式中，也可以为500mPa·s～10000mPa·s或2000mPa·s～10000mPa·s。本发明的一些非限定性的实施方式的组合物是也可以用注射器等应用于对象的粘度。
上述第一材料组合物的表观粘度的测定可以按照常规方法进行测定。例如，可以使用基于旋转粘度计法的共轴双重圆筒型旋转粘度计、单圆筒形旋转粘度计(布鲁克菲尔德型粘度计)、圆锥平板型旋转粘度计(锥板型粘度计)等进行测定。优选按照日本药典(第16版)的粘度测定法进行测定。粘度测定优选在20℃的条件下进行。另外，如下所述，在本发明中的第一材料组合物含有细胞等不溶于溶剂的物质的情况下，为了准确地进行粘度测定，优选为在细胞等不溶于溶剂的状态的表观粘度。
上述第一材料组合物的表观粘度的测定，更优选使用锥板型粘度计、传感器35/1(锥体的直径35mm，1°)进行测定。例如，优选在以下的测定条件下进行测定。样品溶液的制备使用Milli-Q水进行。测定温度设定为20℃。锥板型粘度计的转速在褐藻酸的一价金属盐的1％溶液测定时为1rpm，在2％溶液测定时为0.5rpm，以此为标准进行确定。读取时间为，在褐藻酸的一价金属盐的1％溶液测定的情况下测定2分钟，设为从开始1分钟到2分钟的平均值。在2％溶液测定的情况下测定2.5分钟，设为开始0.5分钟至2.5分钟的平均值。试验值设为3次测定的平均值。
上述第一材料组合物的表观粘度的调整例如可以通过组合物中的褐藻酸的一价金属盐的浓度、所使用的褐藻酸的一价金属盐的分子量或M/G比等来进行。或者也可以通过并用具有不同分子量或粘度的性状的其他批次的褐藻酸的一价金属盐的两种以上来进行调整。
在上述第一材料组合物的表观粘度的调整中，在组合物中的褐藻酸的一价金属盐的浓度高的情况下，存在表观粘度变高的倾向，在浓度低的情况下，存在表观粘度降低的倾向。此外，在褐藻酸的一价金属盐的分子量大的情况下，存在表观粘度变高的倾向，在分子量小的情况下，存在表观粘度降低的倾向。此外，表观粘度会受到所使用的褐藻酸的一价金属盐的M/G比的影响。在这一点上，作为本发明中使用的褐藻酸的一价金属盐的M/G比，优选为0.1～5.0，更优选为0.1～4.0，进一步更优选为0.2～3.5。
一般而言，由于M/G比主要由海藻的种类决定等原因，作为原料使用的褐藻类的种类会对得到的褐藻酸的一价金属盐的粘度特性产生影响。在这一点上，作为本发明中使用的褐藻酸的一价金属盐的来源，优选为来源于属于褐藻属、巨藻属、海带属、泡叶藻属、丛梗藻属等的褐藻类，更优选为来源于属于褐藻属的褐藻类，特别优选为来源于淡黑巨海藻(Lessonia nigrescens)。
作为褐藻酸的一价金属盐的含量，为了具备一定的粘度的性状，会受到分子量的影响，因此不能一概而论，优选为本发明中的第一材料组合物整体的0.1w/v％以上，更优选为0.5w/v％以上，进一步优选为1w/v％以上。进一步具体而言，褐藻酸的一价金属盐的浓度优选为0.5w/v％～5w/v％，更优选为1w/v％～5w/v％，进一步优选为1w/v％～3w/v％，特别优选为1.5w/v％～2.5w/v％。此外，在其他实施方式中，也可以为，褐藻酸的一价金属盐的浓度优选为0.5w/w％～5w/w％，更优选为1w/w％～5w/w％，进一步优选为1w/w％～3w/w％，特别优选为1.5w/w％～2.5w/w％。
从不会引起发热等，在应用于生物体组织等对象的情况下更安全地施用的观点出发，本发明中的第一材料组合物使用实施了上述低内毒素处理的褐藻酸的一价金属盐，在利用鲎试剂(LAL)进行内毒素测定的情况下，组合物的内毒素含量优选为500内毒素单位(EU)/g以下，更优选为300EU/g以下，进一步更优选为150EU/g以下，特别优选为100EU/g以下。
在本发明中，上述第一材料组合物不一定需要为了组织再生等目的而含有细胞。但是，这并不完全排除这种细胞的使用。即，在本发明的一些非限定性的实施方式中，也可以在上述第一材料组合物中含有细胞。作为细胞，例如可以举出髓核细胞、干细胞、间质细胞、间充质干细胞、骨髓间质细胞等，来源没有特别限定，可以举出椎间盘髓核、骨髓、脂肪组织、脐带血等。此外，作为细胞，也可以列举ES细胞和iPS细胞。
具体而言，所使用的细胞可以使用如下制备的细胞：根据需要从椎间盘髓核、骨髓、脂肪组织、脐带血等中回收，进行浓缩目标细胞的处理、培养而增加细胞数的处理。而且，虽然根据细胞的种类而不同，但典型地，可以在上述第一材料组合物中含有例如1×104个/ml以上、或1×105个/ml以上、优选1×104个/ml～1×107个/ml的细胞。细胞可以获得市售品并使用。
在本发明的一些非限定性的实施方式中，上述第一材料组合物中也可以含有促进细胞生长的因子。作为这样的因子，例如可以列举出BMP(Bone morphogenetic protein)、FGF(Fibroblast growth factor)、VEGF(Vascular endothelial growth factor)、HGF(Hepatocyte growth factor)、TGF-β(Transforming growth factor-β)、IGF-1(Insulin-like growth factor-1)、PDGF(Platelet-derived growth factor)、CDMP(Cartilage-derived-morphogenetic protein)、CSF(Colony stimulating factor)、EPO(Erythropoietin)、IL(Interleukin)、PRP(Platelet rich plasma)、SOX(转录因子)、lF(Interferon)等。这些因子可以通过重组法制备，或者也可以由蛋白组合物纯化。另外，在本发明的其他非限定性的实施方式中，上述第一材料组合物不含这些因子。即使在不含有生长因子的情况下，利用褐藻酸的一价金属盐进行软骨组织的再生等的作用效果也非常良好，与积极抑制细胞死亡的情况相比，安全性也更高。
在本发明的一些非限定性的实施方式中，上述第一材料组合物中也可以含有抑制细胞死亡的因子。作为引起细胞死亡的因子，例如可以列举出Caspase、TNFα等，作为抑制它们的因子，可以列举出抗体、siRNA等。这些抑制细胞死亡的因子可以通过重组法来制备，也可以由蛋白组合物纯化。另外，在本发明的其他非限定性的实施方式中，上述第一材料组合物不含这些因子。即使在不含有抑制细胞死亡的因子的情况下，利用褐藻酸的一价金属盐进行软骨组织的再生等的作用效果也非常良好，与积极抑制细胞死亡的情况相比，安全性也更高。
在本发明的一些非限定性的实施方式中，在上述第一材料组合物中，也可以根据需要进一步含有其他的药物活性成分、稳定剂、乳化剂、渗透压调节剂、缓冲剂、等渗剂、保存剂、镇痛剂等惯用成分等通常用于药物的成分。具体而言，例如，第一材料组合物可以含有氯化钠、氯化钾等一价金属盐、或者氯化铵等铵盐等，优选为一价金属盐，更优选为氯化钠。
在本发明中，在上述第一材料组合物中，基本上不一定需要使组合物凝胶化的交联剂。但是，在本发明的一些非限定性的实施方式中，上述第一材料组合物也可以含有经过一定时间后才使组合物凝胶化的程度的量的交联剂。这里的一定时间没有特别限定，优选为30分钟～12小时左右。不含有使组合物凝胶化的量的交联剂，例如，也可以通过将组合物在20℃静置1小时后，用带有21G的注射针的注射器注入来表示。另一方面，在本发明的另一些非限定性的实施方式中，上述第1材料组合物中不含有交联剂。
4.第二剂(材料)组合物
本发明中的第二剂(材料)组合物只要含有上述交联剂即可，对其制剂形态没有特别限制。例如，也可以暂时制备成溶液后进行冷冻干燥等而以干燥状态提供。但是，在使用时使用注射器等注入器，操作性好，方便。因此，在应用时优选以液体的状态使用。用于此目的的溶剂没有特别限制，例如可以列举出纯化水、蒸馏水、离子交换水、Milli-Q水、生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)等。其优选进行了灭菌，优选进行了低内毒素处理。例如，可以对Milli-Q水进行过滤灭菌后使用。
此外，本发明中的第二材料组合物中也可以含有上述交联剂以外的成分，其混合操作等用于得到上述第二材料组合物的操作，与上述第一材料组合物相同，优选在低内毒素水平和细菌水平的环境下进行。例如，优选在净化台上使用灭菌器具进行操作，也可以使用市售的内毒素除去剂对使用的器具进行处理。
上述第二材料组合物中的交联剂的浓度等根据所使用的交联剂的种类等适当设定即可。在本发明的一些非限定性的实施方式中，例如，在使用CaCl2作为交联剂的情况下，其浓度根据所应用的上述第一材料组合物的褐藻酸的一价金属盐的浓度、分子量等而不同，不能一概而论，但优选为10mM～1000mM，更优选为25mM～200mM，特别优选为50mM～150mM。
5.生物体适用组合物
在本发明的另一观点中，本发明还提供一种生物体适用组合物。在本说明书中，“生物体适用组合物”是指，作为上述说明的组合物的组合或处置方法中的第一材料组合物中的着色成分，使用根据国家等的规定允许向生物体使用的色素、即能够施用于生物体的色素。因此，“生物体适用组合物”是“第一材料组合物”的一种形式，“第一材料组合物”一词用于包含“生物体适用组合物”的意思，除非另有说明，“第一材料组合物”可以替换为“生物体适用组合物”来使用。即，该生物体适用组合物含有着色成分和褐藻酸的一价金属盐，在具有流动性的状态下施用于对象，优选用于在施用于对象时至少一部分凝胶化。并且，通过含有着色成分，能够可靠地视觉辨认施用于对象时的凝胶化的情况，进一步，作为着色成分，通过使用根据国家等的规定允许使用于生物体的色素、即能够施用于生物体的色素，能够安全地使用于人等。作为根据国家等的规定能够施用于生物体的色素，例如可以列举出：在日本由厚生劳动省许可使用于药品、准药品、化妆品中的色素；以及在美国由FDA许可使用于药品、医疗器械、化妆品等中的色素等。此外，着色成分优选在将生物体适用组合物施用于骨组织、软骨组织、骨软骨组织、椎间盘组织、半月板组织、韧带等时容易对凝胶膜的形成状态进行评价的色素，从辨别性的观点出发，优选为蓝色～绿色的色素。作为这样的着色成分，例如可列举出绿色3号(孔雀石绿FCF)、蓝色1号(亮蓝FCF)、蓝色2号(靛蓝胭脂红)、绿色201号(茜素菁绿F)、绿色202号(醌茜绿SS)、蓝色201号(靛蓝)、蓝色202号(专利蓝NA)、蓝色203号(专利蓝CA)等，更优选为绿色3号(孔雀石绿FCF)、蓝色1号(亮蓝FCF)。
在由本发明提供的第一材料组合物或生物体适用组合物中，优选以利用该色素赋予可视性且在冷藏保存时不发生析出的浓度含有上述色素。由此，即使在作为赋予可视性的着色成分包含在组合物中的色素在施用于对象之前进行冷藏保存的情况下，也能够稳定地保持其分散性或均匀性，更可靠地视觉辨认施用于对象时的凝胶化的情况。
关于上述组合物中的色素的浓度是否为赋予可视性的浓度，可以通过视觉辨认来确认，也可以通过颜色的测定来进行评价。例如，用于表示物体的颜色的L*a*b*颜色空间已在1976年由国际照明委员会(CIE)进行了标准化，在日本也是在日本工业标准(JISZ 8781-4)中采用的表色系。L*表示颜色的明度，L*＝0是黑色，L*＝100是白的扩散色，用0～100的数值表示。色度(色相和彩度)用a*和b*的数值表示，a*和b*表示颜色的方向，a*表示红色方向，-a*表示绿色方向，b*表示黄色方向，-b*表示蓝色方向，随着数值变大，颜色变得鲜亮，随着数值变小，颜色变暗。
在本说明书的试验例1中，对于以浓度0.001～0.01w/w％含有蓝色1号的2w/w％褐藻酸钠溶液的L*a*b*表色系的范围，使用将光源设为D65/2、将测定模式设为透过测定的分光色差计(SE-6000)(日本电色工业株式会社制)在常温(15～25℃)环境下进行测定时，L*(明度)为40～80，a*为-40～-5(绿色方向)，b*为-60～-20(蓝色方向)。若为该范围的颜色，则可容易进行与软骨、周边组织的辨别，容易评价凝胶膜的形成状态。特别是，如果L*(明度)的数值过低(接近0)，则组合物的黑色倾向变强，难以通过施用时的阴影进行辨别。此外，如果L*过高(接近100时)，组合物的白色倾向变强，难以进行白色的软骨等的辨别。实际上，确认了以浓度0.1w/w％含有蓝色1号的2w/w％褐藻酸钠溶液的黑色倾向强，不适合用于本发明。因此，本发明的第一材料组合物或生物体适用组合物的优选L*a*b*表色系中的色彩值的范围为，L*(明度)为40～80，a*为-40～0，b*为-60～-20。
在这样的L*a*b*颜色空间中，通过将下述式(1)所示的色差ΔE的值等作为指标，能够更客观地进行评价。在此，人们明确地具有其他颜色名称的图像的色差作为由下述式(1)表示的色差ΔE的值被认为是13～25左右。软骨组织、椎间盘组织、它们的周边组织等的大部分是白色、红色(a*是正的数值)～黄色(b*是正的数值)的色调，a*，b*值分别为正值的情况很多。可知本发明的第一材料组合物或生物体适用组合物的a*为-40～0，b*为-60～-20，可得到充分的色调的差。
[数1]
(式(1)中，L1*、a1*、b1*是比较对照的L*a*b*颜色空间的各值，L2*、a2*、b2*是测定对象样本时的L*a*b*颜色空间的各值。)
L*、a*、b*值例如可以使用分光色差计(“SE-6000”，日本电色工业株式会社制)等进行测定。另外，分光色差计有时也被称为分光色度计等。
另一方面，关于上述组合物中的色素的浓度是否为冷藏保存时不发生析出的浓度，例如可以将上述组合物在一定期间(例如，一天、一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、一年、两年、三年等)保存于冰箱(例如，设定温度：2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、或8℃等)后，通过目视观察有无析出，或者在利用过滤器(0.45μm孔)等进行过滤后，测定其过滤前后的色差来进行判断。在本发明中，除非另有说明，将组合物保存在设定温度为5℃的冰箱中一个月进行评价。在这种情况下，可以将不能视觉辨认色调的状态检测为由上述式(1)表示的色差的值的降低。即，如果发生色素的析出，则溶解的色素量减少，进而色调的程度降低。或者，也可以着眼于a*值、b*值等特定色度的值进行评价。因此，作为上述组合物中的着色成分的浓度，例如，如果着色成分为蓝色，则着眼于b*值，优选在设定为5℃的冰箱中保存一个月后的b*值与保存前的b*值的差异保持在25以下的范围内的浓度。
此外，本发明的第一材料组合物或生物体适用组合物优选为即使通过如上所述的一定期间内的保存颜色也是稳定的。在本发明的一些实施方式中，在设定温度5℃的冰箱中保存一个月后的组合物与保存前的组合物的色差ΔE的值优选为35以下，更优选为30以下。
此外，本发明的第一材料组合物或生物体适用组合物例如优选为在约2℃～8℃的低温条件下(例如，设定为5℃的冰箱)，即使通过如上所述的一定期间(例如一个月)的保存，也不会发生着色成分的析出、即可以稳定保存的组合物。
作为本发明中使用的能够施用于生物体的色素，典型地，例如可列举出蓝色1号(亮蓝FCF)、蓝色2号(靛蓝胭脂红)、绿色3号(孔雀石绿FCF)等。特别优选使用蓝色1号(亮蓝FCF)，其浓度范围可以为0.0005质量％以上0.05质量％以下，也可以为0.001质量％以上0.01质量％以下。
6.组合
在本说明书中，“组合”是指在施用于对象时，所述第一剂(材料)组合物和第二剂(材料)组合物为了用于本发明而存在即可，对第一剂(材料)组合物和第二剂(材料)组合物的提供方法没有特别限定。例如可以将第一材料组合物和第二材料组合物作为试剂盒提供，也可以仅提供第一材料组合物，第二材料组合物另行从市售品中制备使用。
第一材料组合物在保存时(或提供时)可以为溶液状态或干燥状态，在干燥状态的情况下，优选包含褐藻酸的一价金属盐的冷冻干燥体。第一材料组合物可以被封入小瓶或预充式注射器中。
在将第一材料组合物和第二材料组合物作为试剂盒的情况下，例如可以为将以下装置等放入一个包装中的试剂盒：(1)作为第一材料组合物封入了褐藻酸钠、蓝色1号等能够施用于生物体的蓝色～绿色的色素、以及氯化钠等含有一价金属盐的溶液的预充式注射器；(2)作为第二材料组合物封入氯化钙溶液等二价以上的金属离子化合物的溶液的安瓿；(3)注射器；(4)注射针。此外，例如也可以在能够分别封入两种溶液的双注射器中分别封入第一材料组合物的溶液和(2)第二材料组合物的溶液来提供。
7.组合的使用方法
本发明的组合用于将第一剂(材料)组合物以具有流动性的状态施用于对象，使第二剂(材料)组合物与施用于所述对象的第一剂(材料)组合物接触而使其至少一部分凝胶化。第一材料组合物向对象的施用、第一材料组合物的凝胶化、凝胶膜的形成状态的评价等的详细情况如具体实施方式等所述。
8.对象的处置方法
在本发明中，提供一种对象处置方法，包括：将含有褐藻酸的一价金属盐和着色成分的第一剂(材料)组合物以具有流动性的状态施用于对象的步骤；使含有具有将褐藻酸的一价金属盐交联的作用的交联剂的第二剂(材料)组合物与施用于所述对象的该第一剂(材料)组合物接触而使其至少一部分凝胶化的步骤；以及对施用于所述对象的该第一剂(材料)组合物表面的凝胶膜的形成状态进行评价的步骤。第一材料组合物、向其对象的施用、第二材料组合物、第一材料组合物的凝胶化、凝胶膜的形成状态的评价等的详细情况如上所述。
(实施例1)
在关节镜观察下，将着色的褐藻酸钠溶液(2w/w％)填充到关节软骨缺损部位。使100mM氯化钙水溶液与包括填充的褐藻酸钠溶液的液面的周边接触，使其表面凝胶化(凝胶膜的形成)。在约5分钟后，用生理盐水清洗包含凝胶膜表面的软骨缺损部位周边。清洗后，当凝胶膜的形成不充分时，观察到溶胶状的着色的褐藻酸盐的流出。
(实施例2)
在关节镜观察下，将着色的褐藻酸钠溶液(2w/w％)填充到关节软骨缺损部位。使100mM氯化钙水溶液与包括填充的褐藻酸钠溶液的液面的周边接触，使其表面凝胶化(凝胶膜的形成)。在约4分钟后，用注射器的前端与凝胶膜表面接触，确认凝胶膜的形成。也可以用探头(探针)与凝胶膜表面接触。当凝胶膜的形成不充分时，观察到溶胶状的着色的褐藻酸盐的流出。
(实施例3)
在关节镜观察下，用pH敏感性色素花青素进行着色，将pH6.5的紫色的褐藻酸钠溶液(2w/w％)填充到关节软骨缺损部位。使调整为pH9.0的100mM氯化钙水溶液与包括填充的褐藻酸钠溶液的液面的周边接触，使其表面凝胶化(凝胶膜的形成)。与氯化钙水溶液接触的凝胶膜表面从紫色变为蓝色，能够对凝胶膜的形成状态进行评价。
(实施例4)
基于下述表所示的配方，可制备第一材料组合物(生物体适用组合物)。表中的数值表示质量％。制备方法可按照试验例1进行。此外，一般可通过在药品或医疗器械中使用的方法来制备。第二材料组合物可以为0.1mol/L的氯化钙溶液。
[表3]
制材例1(单位：质量份)
[表4]
制材例2(单位：质量份)
[表5]
制材例3(单位：质量份)
[试验例1]
在褐藻酸钠溶液(2w/w％)中，以浓度0.001w/w％、0.004w/w％、0.007w/w％、或0.01w/w％添加作为能够施用于生物体的色素的蓝色1号(亮蓝FCF)进行着色，向三个玻璃小瓶中各注入5g。将其在设定为5℃的冰箱中保存，经过一周、两周和一个月后进行采样，观察该试样确认有无色素析出。此外，使用分光色差计(“SE-6000”，日本电色工业株式会社制)测定各样品的L*、a*、b*值。测定在常温(15～25℃)的室内进行。光源设为D65/2，测定模式设为透过测定。分光色差计在样品测定前将作为标准品的标准白色板(型号SE-38724，日本电色株式会社制)的测定值调整为L*＝100、a*＝0、b*＝0。
结果，如图2所示，蓝色1号(亮蓝FCF)在浓度0.001w/w％～0.01w/w％的范围内呈现鲜艳的蓝色，从制备时起至冷藏保存一个月后未确认到色素的析出，稳定地维持其色调。此外，可知包含蓝色1号的褐藻酸钠溶液的表色系中的色彩值的范围为L*(明度)为约40～80、a*为约-40～-5(绿色方向)、b*为约-60～-20(蓝色方向)。
[试验例2]
在褐藻酸钠溶液(2w/w％)中，以浓度0.004w/w％添加能够施用于生物体的色素的蓝色2号(靛蓝胭脂红)进行着色，向注射器中各分注2g。将该填充完毕的注射器放入插槽(注射器固定用的带网格的容器)中并固定，将该插槽保存于设定为5℃的冰箱中，在经过一夜和19天后，观察注射器内的样品，确认有无色素析出。
结果表明，蓝色2号(靛蓝胭脂红)的浓度为0.004w/w％，呈鲜艳的蓝色，冷藏保存一夜后未发现色素析出。但是，在经过19天后的观察中发现色素的析出，其析出在室温下放置时会消失。
从试验例1和试验例2的结果显而易见，能够施用于生物体的色素的蓝色1号(亮蓝FCF)和蓝色2号(靛蓝胭脂红)，对褐藻酸钠溶液均可赋予鲜艳的蓝色色调。此外，显而易见，蓝色1号(亮蓝FCF)与蓝色2号(靛蓝胭脂红)相比，能够更稳定地赋予蓝色色调。
[发明内容]
1：第一剂(材料)组合物；
1a：第一剂(材料)组合物的表面附近；
1b：第一剂(材料)组合物的表面附近以外的内部；
2：软骨缺损部位；
3：第二剂(材料)组合物。
Claims (14)
1.一种组合物的组合，其包括含有褐藻酸的一价金属盐的第一材料组合物、以及含有具有将褐藻酸的一价金属盐交联的作用的交联剂的第二材料组合物，用于将所述第一材料组合物以具有流动性的状态施用于对象，将所述第二材料组合物与施用于所述对象的该第一材料组合物接触而使其至少一部分凝胶化，其特征在于，
所述第一材料组合物进一步含有着色成分，从而能够对施用于所述对象的该第一材料组合物表面的凝胶膜的形成状态进行评价。
2.根据权利要求1所述的组合，其中，
所述凝胶膜的形成状态的评价是对施用于所述对象的该第一材料组合物中的具有流动性的状态的组合物有无流出的评价。
3.根据权利要求1或2所述的组合，其中，
所述凝胶膜的形成状态的评价在（1）对施用于所述对象的该第一材料组合物的凝胶膜表面的清洗后、和/或（2）对施用于所述对象的该第一材料组合物的凝胶膜表面的加压后进行。
4.根据权利要求3所述的组合，其中，
对所述凝胶膜表面的加压通过使器具与该凝胶膜表面接触来进行。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的组合，其中，
所述对象为选自由骨组织、软骨组织、骨软骨组织、椎间盘组织、半月板组织和韧带组成的组中的至少一种。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的组合，其中，
所述第一材料组合物含有能够作为所述着色成分施用于生物体的蓝色~绿色的色素。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的组合，其中，
所述第一材料组合物的利用分光色差计（光源：D65/2、测定模式：透过测定）测定得到的L*a*b*表色系中的色彩值为L*=40~80、a*=-40~0、b*=-60~-20。
8.根据权利要求1~7中任一项所述的组合，其中，
以在设定温度5℃的冰箱中保存一个月后不发生析出的浓度含有所述着色成分。
9.根据权利要求1~8中任一项所述的组合，其中，
在设定温度5℃的冰箱中保存一个月后与保存前相比较时，所述第一材料组合物的利用分光色差计（光源：D65/2、测定模式：透过测定）测定得到的L*a*b*表色系中的色差∆E值为35以下。
10.根据权利要求1~9中任一项所述的组合，其中，
所述第一材料组合物能够在2℃~8℃的条件下保存。
11.根据权利要求1~10中任一项所述的组合，其中，
所述第一材料组合物还含有其他一价金属盐。
12.根据权利要求1~11中任一项所述的组合，其中，
所述第一材料组合物在保存时是溶液状态或干燥状态。
13.根据权利要求1~12中任一项所述的组合，其中，
所述第一材料组合物含有褐藻酸的一价金属盐、能够施用于生物体的蓝色~绿色的色素、以及氯化钠，能够在2℃~8℃的条件下保存，且该组合物在保存时为溶液状态或干燥状态。
14.根据权利要求1~13中任一项所述的组合，其中，
所述着色成分为0.0005质量%~0.05质量%的蓝色1号（亮蓝FCF）。
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