KR20230029706A - 더말 필러들 - Google Patents
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Abstract
조직의 세포 물질들 및 핵산들이 제거된 탈세포화 식물 또는 균류 조직을 포함하는 더말 필러들뿐만 아니라 화장료 및/또는 재건 적용들을 위한 방법들과 그 용도들이 여기에 제공된다. 또한, 이러한 더말 필러들을 제거하기 위한 방법들과 더말 필러 키트들이 제공된다.
Description
본 발명은 대체로 더말 필러들에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 탈세포화 식물 또는 균류 조직을 포함하는 더말 필러들에 관한 것이다.
본 출원은 2020년 6월 8일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제63/036,126호를 우선권으로 수반하는 출원이며, 그 전체적인 개시 사항들은 야기에 참조로 포함된다.
다양한 더말 필러 제품들이 주로 화장료 적용들을 위한 피부 밑의 주사를 위해 개발되어 왔다. 상기 주사의 위치는 특정한 화장료 적용에 따라 달라질 수 있으며, 표피상의 주름들은 피내 주사들로 치료되는 반면, 체적 증가 과정들은 흔히 깊은 피부 내로의 주사들을 수반한다. 일반적으로, 피하 지방 내로의 주사들은 통상적으로 회피된다.
더말 필러 제품들은 일반적으로 일시 및 영구의 두 가지의 구별되는 범주들로 나누어질 수 있다. 일시적 더말 필러들은 흔히 콜라겐 또는 히알루론산과 같은 히드로겔들로 구성되며, 시간에 걸쳐 신체 내로 서러히 재흡수된다. 반면에, 현재 유일하게 FDA 승인된 영구적 더말 필러는 벨라필(BellaFill)TM이다. 벨라필TM은 80%(v/v)의 3.5% 소의 콜라겐 I(w/v) 및 20%(v/v)의 30㎛-40㎛ 폴리(메틸 메타크릴레이트)[poly(methyl methacrylate): PMMA] 미세구들로 구성된다. 상기 미세구들은 석유 화학 폴리머로 구성된 경질인 비재흡수성 입자들이다. 상기 미세구들의 목적은 조직 내의 물리적 공간을 채우는 것이며, 세포들이 상부에 성장되도록 영구적 지지 구조를 제공할 뿐만 아니라 상기 재흡수되는 소의 콜라겐을 점차적으로 대체하는 자연 세포외 기질 단백질들을 침착시킨다. 벨라필TM은 장시간 지속되고 통상적으로 추적 검사가 적거나 없이 1회-2회의 치료들만을 요구하기 때문에 환자들에게 인기 있는 선택 사항이 되고 있다.
불행하게도, 현장에서 영구적 더말 필러들은 종종 신체 내에 후에 영구적으로 남을 수 있는 합성 물질을 포함하며, 잠재적인 알레르기 반응들, 잠재성 육아종(granulomas) 및/또는 이물 신체 반응들과 같은 특정한 위험을 수반할 수 있다.
선택적으로 또는 추가적으로, 개선된 더말 필러들, 방법들 및 이의 용도들과 이의 생산을 위한 방법들이 바람직하다.
조직의 세포 물질들 및 핵산들이 제거된 탈세포화 식물 또는 균류 조직을 포함하는 더말 필러(dermal filler)들뿐만 아니라 화장료 및/또는 재건 적용들을 위한 방법들 및 그 용도들이 여기에 제공된다. 또한, 이러한 더말 필러들을 제조하기 위한 방법들 및 더말 필러 키트들이 제공된다.
여기에 설명하는 바와 같이, 본 발명자들은 현재 탈세포화 식물 또는 균류 조직을 포함하는 더말 필러 제품들을 개발하였다. 여기서의 데이터는 더말 필러들이 우수한 생체 적합성을 가졌고, 실질적으로 비재흡수성이었던 것을 나타낸다. 이러한 더말 필러 제품들을 제조하기 위한 방법들이 설명되며, 20㎛ 아래 크기의 작은 바람직하기 않는 입자들의 회피를 포함하여 크기에 대한 제어 및 다양한 다른 유익한 특성들을 가능하게 할 수 있다. 작은 게이지의 바늘들을 통한 양호한 주사기 적응성(syringability)/주사 가능성(injectability)을 가지는 제조물들뿐만 아니라 히드로겔(hydrogel)들과 같은 운반체 유체들과 양립될 수 있고, 마취제들과 양립할 수 있는 제조물들이 기술된다. 멸균 기술들 및 멸균 제품들도 기재된다. 더말 필러 제품들을 위한 입자들은 대상들 내에서 세포 침입/성장을 고무하거나 및/또는 양호한 자연 조직 대 더말 필러의 비율을 제공하기 위해 바람직한 형상들과 표면적/체적/포장 특성들을 가지는 것으로 설명된다.
일 실시예에서, 조직의 세포 물질들 및 핵산들이 제거된 탈세포화(decellularized) 식물 또는 균류 조직을 포함하는 비재흡수성 더말 필러가 여기에 제공된다.
앞서의 더말 필러의 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 키틴(chitin)계, 키토산(chitosan)계, 리그노셀룰로오스(lignocellulosic)계, 또는 셀룰로오스계가 될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 식물의 잎 구조, 뿌리, 과육(flesh), 하이판시움(hypanthium) 또는 펄프(pulp) 구조들로부터 유래될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 상추, 당근, 사과, 배, 또는 이들의 임의의 결합으로부터 유래될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 균질화될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 건조되고, 분쇄가 수행될 수 있으며, 선택적으로 재구성되거나 재수화될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 단일의 구조 세포들의 크기 또는 보다 작은 입자들로 분해될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서들, 상기 더말 필러는 히드로겔(hydrogel), 기질, 또는 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직을 위한 운반체 유체를 더 포함할 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체는 PBS, 식염수, 히알루론산(hyaluronic acid)(교차 결합되거나 교차 결합되지 않음), 알긴산염(alginate), 콜라겐(collagen), 플루론산(pluronic acid)(예를 들어, 플루로닉(Pluronic) F 127), 한천(agar), 아가로오스(agarose), 피브린(fibrin), 칼슘 히드록시아파타이트(calcium hydroxyapatite), 폴리(Poly)-L-젖산(lactic acid), 자가 지방(autologous fat), 실리콘(silicone), 덱스트란(dextran), 메틸셀룰로오스(methylcellulose), 용해되고 재생된 셀룰로오스, 또는 이들의 임의의 결합들을 포함할 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 더말 필러는 건조되거나, 수화될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 더말 필러는 리도카인(lidocaine) 또는 다른 마취제를 포함할 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 불규칙한 3D 형상들 및/또는 구형이 아닌 얇은 플레이크(flake)와 같은 구조들을 가지는 입자들로 분해될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 플레이크와 같은 구조들은 약 0.01㎛ 내지 약 100㎛, 예를 들면 약 0.1㎛의 두께를 가질 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 세포 또는 세포들에 의해 포식되지 않기 위해 충분히 큰 크기를 가지는 입자들로 분해될 수 있으며, 바람직하게는 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 적어도 약 20㎛의 크기, 직경, 또는 최소 페렛(feret) 직경을 가지는 입자들로 분해될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 20㎛ 내지 약 1000㎛ 이내의 크기, 직경, 또는 페렛 직경을 가지는 입자들로 분해될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 200㎛ 보다 작은 크기, 직경, 또는 최대 페렛 직경을 가지는 입자들로 분해될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 20㎛ 내지 약 200㎛의 범위 이내의 크기, 직경, 또는 페렛 직경 분포를 가지는 입자들로 분해될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 30㎛ 내지 약 100㎛ 이내의 피크를 갖는 입자 크기, 직경, 또는 페렛 직경을 가지는 입자들로 분해될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 30㎛ 내지 약 100㎛의 범위 이내의 평균 입자 크기, 직경, 또는 페렛 직경을 가지는 입자들로 분해될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 300㎛ 보다 작은 크기, 직경, 또는 최대 페렛 직경을 가지는 입자들로 분해될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 100㎛ 내지 약 300㎛의 범위 이내의 크기, 직경, 또는 페렛 직경 분포를 가지는 입자들로 분해될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 100㎛ 내지 약 300㎛ 이내의 피크를 갖는 입자 크기, 직경, 또는 페렛 직경 분포를 가지는 입자들로 분해될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 100㎛ 내지 약 300㎛의 범위 이내의 평균 입자 크기, 직경, 또는 페렛 직경을 가지는 입자들로 분해될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 200㎛2 내지 약 3000㎛2의 범위 이내, 또는 약 200㎛2 내지 약 300㎛2의 범위 이내의 평균 투영 입자 면적을 가지는 입자들로 분해될 수 있거나, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 0.1㎛-1 내지 100㎛-1의 체적 비율까지의 표면적을 가지는 입자들로 분해되거나, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 4 x 105입자들/㎖ 내지 약 7 x 109입자들/㎖의 충전 밀도를 가지는 입자들로 분해되거나, 이들의 임의의 결합들로 분해될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 더말 필러 또는 더말 필러들은 약 500,000cp 보다 작은 점도를 가질 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 더말 필러 또는 더말 필러들은 약 100,000cp 내지 약 200,000cp의 범위 이내의 점도를 가질 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 살균될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 더말 필러는 살균될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 살균은 감마 살균(gamma sterilization)에 의해 이루어질 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 살균은 고압 살균(autoclaving)에 의해 이루어질 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 머서리화(mercerized)될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 머서리화(mercerization)는 수산화나트륨 및 과산화수소를 가열하여 이루어질 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 더말 필러는 피부 아래 주사, 깊은 피부 주사, 피하 주사(예를 들어, 피하 지방 주사), 또는 이들의 임의의 결합들을 위해 조제될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 더말 필러는 주사기 또는 주사 장치 내에 제공될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 연조직 필러로서나 재건 수술을 위해 또는 이들 모두를 위한 여기에 설명하는 바와 같은 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 용도가 여기에 제공된다.
다른 실시예에서, 필요로 하는 대상의 미용 외관(cosmetic appearance)을 개선하기 위해 여기에 설명하는 바와 같은 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 용도가 여기에 제공된다.
또 다른 실시예에서, 필요로 하는 대상에서 조직 체적을 증가시키거나, 주름들을 펴거나, 또는 이들 모두를 위해 여기에 설명하는 바와 같은 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 용도가 여기에 제공된다.
또 다른 실시예에서, 필요로 하는 대상에서 미용 외관을 개선하거나, 조직 체적을 증가시키거나, 주름들을 펴거나, 또는 이들의 임의의 결합들을 위한 방법이 여기에 제공되며, 상기 방법은,
여기에 설명하는 바와 같은 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것을 필요로 하는 영역에 투여하거나 주사하는 단계를 포함하며,
이에 따라 상기 대상의 미용 외관을 개선하거나, 조직 체적을 증가시키거나, 주름들을 펴거나, 또는 이들의 임의의 결합들을 수행한다.
앞서의 용도나 용도들 또는 방법이나 방법들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 대상의 고유 세포들은 상기 더말 필러에 침윤될 수 있다.
앞서의 용도나 용도들 또는 방법이나 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 더말 필러는 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직이 상기 대상 내에 실질적으로 온전하게 남도록 비재흡수성이 될 수 있다.
앞서의 용도나 용도들 또는 방법이나 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 더말 필러는 이에 대한 하나 또는 그 이상의 효소들의 첨가를 통해 분해될 수 있다.
앞서의 용도나 용도들 또는 방법이나 방법들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 식물 또는 균류 조직은 셀룰로오스계가 될 수 있으며, 상기 하나 또는 그 이상의 효소들은 셀룰라아제(cellulase)를 포함할 수 있다.
앞서의 용도나 용도들 또는 방법이나 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 셀룰라아제는 트리코데르마 종(Trichoderma sp.)으로부터의 셀룰라아제가 될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 비재흡수성 더말 필러를 제조하기 위한 방법이 여기에 제공되며, 상기 방법은,
식물 또는 균류 조직을 제공하는 단계;
조직의 세포 물질들 및 핵산들이 제거된 입자들을 제공하도록 상기 식물 또는 균류 조직을 탈세포화하고, 크기를 감소시키는 단계; 및
선택적으로 상기 입자들을 살균하는 단계를 포함하며,
이에 따라 상기 비재흡수성 더말 필러를 제공한다.
앞서의 방법의 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 키틴계, 키토산계, 리그노셀룰로오스계, 또는 셀룰로오스계가 될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 식물의 잎 구조, 뿌리, 과육, 하이판시움 또는 펄프 구조들로부터 유래될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 상추, 당근, 사과, 배, 또는 이들의 임의의 결합으로부터 유래될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 상기 입자들을 제공하기 위한 기계적 크기 감소를 포함할 수 있으며, 선택적으로 상기 기계적 크기 감소는 건조되거나, 냉동 건조되거나, 또는 동결 건조된 물질들에 대해 수행된다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 기계적 크기 감소는 상기 입자들을 제공하도록 탈세포화 단계 이전 또는 이후에 상기 식물 또는 균류 조직을 압쇄(crushing), 압출(extrusion), 분쇄(grinding), 제분(milling), 초음파처리(ultrasonication), 전기방사(electrospinning), 화학적 용해(chemical dissolution), 효소 파괴(enzymatic breakdown), 또는 전단(shearing)하는 단계를 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 상기 탈세포화 단계 이전 또는 이후에 상기 식물 또는 균류 조직을 건조시키는 단계, 상기 입자들을 제공하도록 상기 건조된 식물 또는 균류 조직에 기계적 크기 감소를 수행하는 단계, 그리고 선택적으로, 상기 입자들을 재구성(reconstituting)하는 단계, 재현탁(resuspending)하는 단계, 또는 재수화(rehydrating)하는 단계를 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 단일의 구조 세포들, 또는 보다 작은 크기의 입자들을 제공할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체로 상기 입자들을 조제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체는 PBS, 식염수, 히알루론산(교차 결합되거나 교차 결합되지 않음), 알긴산염, 콜라겐, 플루론산(예를 들어, 플루로닉 F 127), 한천, 아가로오스, 피브린, 칼슘 히드록시아파타이트, 폴리-L-젖산, 자가 지방, 실리콘, 덱스트란, 메틸셀룰로오스, 재생된 셀룰로오스, 또는 이들의 임의의 결합들을 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 더말 필러는 건조되거나, 수화된 형태로 제공될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 리도카인 또는 다른 마취제로 조제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 불규칙한 3D 형상들 및/또는 구형이 아닌 얇은 플레이크와 같은 구조들을 가지는 입자들을 제공할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 플레이크와 같은 구조들은 약 0.01㎛ 내지 약 100㎛, 예를 들면 약 0.1㎛의 두께를 가질 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 목표 크기를 가지는 입자들, 목표 크기 범위 이내의 입자들, 또는 목표 크기 분포를 가지는 입자들을 얻기 위해 압출, 여과, 원심 분리, 또는 다른 크기 분리를 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 약 20㎛ 내지 약 1000㎛의 범위 이내의 크기, 직경, 또는 페렛 직경을 가지는 입자들을 제공할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 세포 또는 세포들에 의해 포식되지 않기 위해 충분히 큰 크기를 가지는 입자들을 제공할 수 있으며, 바람직하게는 상기 크기를 감소시키는 단계는 적어도 약 20㎛의 크기, 직경, 또는 최소 페렛 직경을 가지는 입자들을 제공할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 약 200㎛ 보다 작은 크기, 직경, 또는 최대 페렛 직경을 가지는 입자들을 제공할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 약 20㎛ 내지 약 200㎛의 범위 이내의 크기, 직경, 또는 페렛 직경 분포를 가지는 입자들을 제공할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 약 30㎛ 내지 약 100㎛ 이내의 피크를 갖는 입자 크기, 직경, 또는 페렛 직경 분포를 가지는 입자들을 제공할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 약 30㎛ 내지 약 100㎛의 범위 이내의 평균 입자 크기, 직경, 또는 페렛 직경을 가지는 입자들을 제공할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 약 300㎛ 보다 작은 크기, 직경, 또는 최대 페렛 직경을 가지는 입자들을 제공할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 약 100㎛ 내지 약 300㎛의 범위 이내의 크기, 직경, 또는 페렛 직경 분포를 가지는 입자들을 제공할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 약 100㎛ 내지 약 300㎛ 이내의 피크를 갖는 입자 크기, 직경, 또는 페렛 직경 분포를 가지는 입자들을 제공할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 약 100㎛ 내지 약 300㎛의 범위 이내의 평균 입자 크기, 직경, 또는 페렛 직경을 가지는 입자들을 제공할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 약 200㎛2 내지 약 3000㎛2의 범위 이내, 또는 약 200㎛2 내지 약 300㎛2의 범위 이내의 평균 투영 입자 면적을 가지는 입자들을 제공할 수 있으며, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 0.1㎛-1 내지 100㎛-1의 표면적 대 체적 비율을 가지는 입자들로 분해되거나, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 4 x 105입자들/㎖ 내지 약 7 x 109입자들/㎖의 충전 밀도를 가지는 입자들로 분해되거나, 또는 이들의 임의의 결합들로 분해된다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 상위 임계값 크기 아래의 입자들을 얻기 위해 동시에 필터를 통해 결과적인 입자들을 통과시키면서 분쇄하는 단계를 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 방법은 하위 임계값 크기보다 작은 입자들을 제거하고, 상기 하위 임계값 크기보다 큰 입자들을 얻기 위해 여과, 분별 또는 평형 원심 분리, 또는 체가름(sieving)하는 단계를 더 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 여과 또는 체가름하는 단계는 자동화된 습식 체를 이용하여 수행될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 목표 크기를 가지는 입자들, 목표 크기 범위 이내의 입자들, 또는 목표 크기 분포를 가지는 입자들을 얻기 위해 분별 또는 평형 원심 분리를 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 방법은 제1 주사기 또는 용기(vessel)에 물 또는 완충액(예를 들어, 식염수)과 같은 유체 내의 입자들을 적재하고, 제2 주사기 또는 용기에 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체를 적재하여 상기 입자들을 상기 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체로 조제하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 제1 및 제2 주사기들 또는 용기들은 유체 연통되고, 상기 주사기들 또는 용기들의 내용물들을 상기 제1 및 제2 주사기들 또는 용기들 사이에서 전후로 통과시켜 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 방법은 크기 배제 혼합기(size exclusion mixer)를 이용하여 상기 입자들을 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체와 혼합시켜 상기 입자들을 상기 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체로 조제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 크기 배제 혼합기는 정적 혼합기(static mixer)가 될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 상기 탈세포화하는 단계 이전 또는 이후에 상기 식물 또는 균류 조직을 살균하는 단계를 더 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 상기 더말 필러를 살균하는 단계를 더 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 살균은 감마 살균에 의해 이루어질 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 살균은 고압 살균에 의해 이루어질 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 살균은 복수의 살균 단계들을 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 첫 번째 살균 단계는 열처리를 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 상기 식물 또는 균류 조직을 머서리화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 머서리화하는 단계는 상기 탈세포화하는 단계 이후에 수행될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 머서리화하는 단계는 염기 및 과산화물로의 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직의 처리를 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 염기는 수산화물(hydroxide) 염기가 될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 과산화물은 과산화수소가 될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 머서리화하는 단계는 가열하면서 수성 수산화나트륨 용액 및 과산화수소로의 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직의 처리를 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 상기 과산화수소가 반응에 첨가되기 이전에 제1 기간 동안 상기 수성 수산화나트륨 용액으로 처리될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 과산화물은 30% 내지 50% 수성 과산화수소 보존 용액이 될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 수성 과산화수소 보존 용액은 500g의 탈세포화 식물 또는 균류 조직 당 적어도 약 75㎖의 양으로 사용될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 수성 과산화수소 보존 용액의 첨가 이후에 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직, 상기 염기 및 상기 수성 과산화수소 보존 용액의 혼합물의 과산화물의 농도는 약 1% 내지 약 5%가 될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 염기는 1M 수산화나트륨 용액이 될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 1M 수산화나트륨 용액은 500g의 탈세포화 식물 또는 균류 조직 당 약 2500㎖의 양으로 사용될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 중화(neutralization) 처리들로 pH를 중화시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 하나 또는 그 이상의 중화 단계들은 수성 HCl 용액으로의 처리를 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 머서리화하는 단계는 약 80℃까지의 가열로 수행될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 머서리화하는 단계는 적어도 약 30분 동안 수행될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 상기 방법은 피부 아래 주사, 깊은 피부 주사, 피하 주사(예를 들어, 피하 지방 주사), 또는 이들의 임의의 결합들을 위해 상기 더말 필러를 조제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 여기에 설명되는 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것에 의해 제조되는 더말 필러가 여기에 제공된다.
앞서의 더말 필러의 다른 실시예에서, 상기 더말 필러는 여기에 설명하는 바와 같은 더말 필러 또는 더말 필러들 중에서 임의의 것이 될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 더말 필러의 약 0.1% 내지 약 5% 또는 그 보다 적은 입자들은 약 20㎛ 보다 작은 페렛 직경 또는 최소 페렛 직경을 가질 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 더말 필러의 약 0.5% 보다 적은 입자들은 약 20㎛ 보다 작은 페렛 직경 또는 최소 페렛 직경을 가질 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 더말 필러의 약 0.1% 내지 약 5% 보다 적은(약 0.5%보다 적은 것과 같이), 또는 그 보다 적은 입자들은 대상의 세포 또는 세포들에 의해 포식되기 위해 충분히 작은 크기를 가질 수 있다.
다른 실시예에서, 키트가 여기에 제공되며, 상기 키트는,
여기에 설명하는 바와 같은 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것;
히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체;
PBS, 식염수, 히알루론산(교차 결합되거나 교차 결합되지 않음), 알긴산염, 콜라겐, 플루론산(예를 들어, 플루로닉 F 127), 한천, 아가로오스, 피브린, 칼슘 히드록시아파타이트, 폴리-L-젖산, 자가 지방, 실리콘, 덱스트란, 메틸셀룰로오스, 용해되고 재생된 셀룰로오스, 또는 이들의 임의의 결합들;
리도카인 또는 다른 마취제;
하나 또는 그 이상의 주사기들, 또는 다른 주사 장치;
둘 또는 그 이상의 주사기들을 위한 루어락(leur-lock) 접합 또는 연결기;
여기에 설명하는 바와 같은 용도나 용도들 또는 방법이나 방법들을 수행하기 위한 지시들;
하나 또는 그 이상의 탈세포화 시약들;
하나 또는 그 이상의 컨테이너들, 패키지들, 또는 용기들;
주사를 위한 하나 또는 그 이상의 완충제들, 물, 또는 식염수;
바람직한 영역 또는 위치에 더말 필러를 용해시키기 위한 시약 또는 효소(예를 들어, 셀룰라아제); 또는
이들의 임의의 결합들 중에서 어느 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다.
상술한 특징들 및 다른 특징들은 다음의 도면들과 관련하여 더 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 실험예 1에서 설명되는 바와 같이 압출된 탈세포화 셀룰로오스 페이스트(좌측 패널) 및 18G 바늘로 상기 페이스트를 적재한 이후의 1㎖ 주사기(우측 패널)도 도시한다.
도 2는 실험예 1에서 설명되는 바와 같이 3의 다른 부위들 내로 피하로 주사되었던 셀룰로오스계 더말 필러 페이스트를 도시하며, 여기서 도 2A는 측면도를 도시하고, 도 2B는 확대도를 도시한다. 혈관화가 4주에서 이식물 주위에 존재하였고(도 2C), 절제 후에 상기 이식은 그 형상을 유지하였다(도 2D).
도 3은 실험예 1에서 설명되는 바와 같이 세포 침윤 및 기질 침착이 8주 후에 동물 내부에서 관찰되었던 것을 도시한다. 셀룰로오스 필러는 생체에 적합한 것으로 나타났고, 시간에 걸쳐 구상 형상을 유지하였다. 8주의 피하 주사에 걸쳐, 메이슨 트리크롬(도 3A, 도 3C에 도시됨)과 헤마톡실린 및 에오신(도 3B, 도 3D에 도시됨)이 도시된다(A, B에 대해 축척 바＝2㎜; C, D에 대해 축척 바＝200㎛).
도 4는 실험예 1에서 설명되는 바와 같이 캘리퍼스를 활용한 동물의 외부로부터의 이식 부위들의 수동 측정들의 결과들을 도시한다. 8주의 연구 기간에 걸쳐, 이식 면적이 증가되는 것으로 관찰되었다. 그러나 종횡비(x 및 y 방향으로의 그 폭의 비)는 크게 변화하지 않았다.
도 5는 실험예 1에서 설명되는 바와 같이 이식물의 높이가 캘리퍼스로 동물의 외부에 대해 측정된 경우에 8주의 연구 기간에 걸쳐 ~75%까지 상당히 감소된 것을 도시한다. 이는 앞서 관찰된 주사 부위의 면적의 감소와 서로 관련된다.
도 6은 분쇄되고 건조된 생체재료(좌측 패널) 및 재수화되고 압출된 더말 필러(우측 패널)를 도시한다.
도 7은 실험예 2에서 설명되는 바늘 방법으로 생체재료가 완전하게 형성된 것으로 나타나고 붕괴되지 않는 적어도 일부의 단일의 온전한 구조 물질(예를 들어, 분리된 세포벽 포켓들)을 얻도록 전단되었던 것을 도시한다.
도 8은 실험예 2에서 설명되는 바와 같이 시간의 함수로서 이식물들의 높이를 도시한다. 다양한 제형들 사이에서 통계적으로 의미 있는 차이는 관찰되지 않았다. 그러나 이들이 약 10의 인자에 의해 HA 및 콜라겐의 농도의 측면들에서 상업 제품들과 상당히 달랐던 점에 유의한다. 콜라겐/HA 히드로겔의 낮은 w/v 농도와 부합하여, 결과들은 식염수계 필러의 경우와 유사하게 나타났고, 높이에서 ~50%의 감소를 가져왔다.
도 9는 실험예 2에서 설명되는 바와 같이 시간의 함수로서 캘리퍼스로 동물의 외부로부터 측정된 상기 이식물의 계산된 체적을 도시한다. 상기 높이, x 및 y 폭들을 이용하고 반 타원형으로 상정하여, 상기 이식물 체적이 계산되었다. 다양한 제형들 사이에서 통계적으로 의미 있는 차이는 관찰되지 않았으며, 높이의 감소와 부합되는 경향을 따랐다.
도 10은 이식 후의 3개월에서 30㎛-50㎛ PMMA 미세구들(백색 원들)을 도시한다. 천연 조직이 이식물 주위에 성장하고 있는 반면, 조직 내의 PMMA의 체적 비율은 매우 높다. 이는 상기 조직이 천연 세포들 및 단백질들보다는 주로 합성 물질들로 구성되는 것을 나타낸다.
도 11은 멸균 샘플 처리를 도시한다. 실험예 3에서 설명되는 바와 같이, 탈세포화 프로세스의 GLP 버전은 멸균 물질들 및 무균 기술로 수행되었다.
도 12는 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 사과 유래 탈세포화 셀룰로오스 골격들을 동결 건조하는 프로세스를 도시한다. 도 12A는 탈세포화 물질이 수집되었고, 팔콘 튜브들 내에 배치되었으며, 채널이 이탈되도록 수증기를 증발/승화시키기 위해 상기 물질 내로 가압되었던 것을 도시한다. 도 12B는 상기 물질이 동결 전조기에 부착되었던 것을 도시하며, 도 12C는 동결 건조가 48시간 동안 -46C 및 0.05mbar에서 수행되었던 것을 도시한다. 도 12D는 상기 동결 건조된 물질의 최종 생성물을 도시한다.
도 13은 실험예 3에서 설명하는 바와 같이 건조된 셀룰로오스 생체재료가 동시에 80㎛ 필터로 통과되면서 18000rpm, 12000rpm 및 6000rpm로 분말도 분쇄되었던 것을 도시한다. 수집 트레이가 상기 프로세스 이후에 도시된다. 가장 높은 RPM 설정이 처리 시간을 감소시키기 위해 이용되었다. 입자 크기들의 분포에 대해 관찰되었던 관찰 가능한 분쇄 속도의 영향은 없었다(실험예 3 도시된 데이터).
도 14는 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 여과 프로세스를 도시한다. 도 14A는 80㎛ 필터를 통해 물질을 분쇄하는 것으로부터 얻어진 분말을 도시하고, 도 14B는 45㎛ 및 25㎛ 체들을 통한 습식 체가름으로부터 얻어진 분말을 도시하며, 도 14C는 상기 분말의 크기 범위를 제한하는 것을 도시한다. 가장 좁은 크기 범위의 입자들이 원심 분리를 통해 농축되었다(도 14D). 자동화된 습식 체는 처리 시간과 효율을 크게 향상시켰으며, 이제 통상적으로 사용되었다.
도 15는 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 콩고 레드로 염색된 입자들을 도시한다. 상기 입자들은 0.1% 콩고 레드로 염색되었고, 2.5X(도 15A, 도 15B) 및 10X(도 15C, 도 15D)로 영상화되었다. 도 15A, 도 15C：여과되지 않은 입자들. 도 15B, 도 15D：여과된 입자들. 이들과 같은 영상들은 상기 입자 크기 분포를 정량화하기 위해 수집되었다. 통상적으로, 2.5X로 10의 영상들은 통계적으로 의미 있는 샘플 크기인 ~1000의 입자들을 산출한다.
도 16은 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 입자 크기 분석을 도시한다. 입자들은 피지(이미지제이)를 이용하여 경계가 정해졌고, 분할되었다. 도 16A 및 도 16B는 여과된 입자들을 도시하며, 도 16C 및 도 16D는 여과되지 않은 입자들을 도시한다. 도 16A 및 도 16C는 임계화된 영상을 도시하며, 도 16B 및 도 16D는 상기 크기 분석으로부터의 입자들의 윤곽들을 도시한다.
도 17은 여과된 및 여과되지 않은 탈세포화 사과 입자들에 대한 입자 크기 분석을 도시한다. 페렛 직경이 입자 크기를 정량화 하는 데 이용되었다. 각 조건들에 대해 N＝15 영상들이 상기 콩고 레드로 염색된 입자들의 형광 현미경 영상들로부터 분석되었다. 여과되지 않은 N＝2292이고, 여과된 N＝1595이다. 상기 평균들은 통계적으로 유의미하게 달랐다(P＝7.4 x 10-55).
도 18은 증가되는 배율(도 18A-도 18D)로 탈세포화 사과 분말의 SEM 현미경 사진들을 도시한다.
도 19는 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 플레이크 직경을 결정하기 위한 수동 영상 처리를 도시한다. 플레이크들은 불규칙하게 성형되며, 단일의 길이 표지들은 이러한 복잡성을 포착하는 데 실패한다(소스：탈세포화 사과).
도 20은 탈세포화 사과에 대한 SEM으로부터의 입자 크기 분포를 도시한다. 상기 분포는 47.11±1.11㎛에서 피크를 보여주었다(N＝133 플레이크들). SEM 영상 분석으로부터 얻어진 분포는 광학적 방법들 보다 훨씬 좁았다. 그러나 차례로 작은 N 값들, 입자 각도 배향의 영향 및 에지들을 확실하게 검출하는 능력을 가져오는 입자들을 측정하는 수동 접근 방식과 같은 이러한 방법에 대한 결점들이 존재한다. 이들 문제들은 이러한 방법론이 입자 크기를 특성화하기 위해서 바람직하지 않게 만든다.
도 21은 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 자동화된 습식 체 여과 이전에 측정된 다른 속도들에서 탈세포화 사과를 분쇄한 이후의 입자 크기 분포를 도시한다. 입자들은 체가름 이전에 6000RPM(흑색) 및 18000(회색)에서의 분쇄에 의해 생성되었다. 두 가지 분산들은 유사하였다. 평균 입자 크기들은 6000RPM 및 18000RPM 에 대해 각기 73.07±0.58㎛ 및 73.50±0.56㎛이었다. 값들은 평균 및 s.e.m.이다. 6000RPM에 대해 N＝2579이고, 18000RPM에 대해 N＝2354이다. 상기 평균 입자 크기에 유의차는 존재하지 않았던 것으로 발견되었다(P＝0.58).
도 22는 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 표지 스티커가 있는 감마 조사를 위해 밀봉된 날겐 보틀 내의 입자 서스펜션의 샘플을 도시한다.
도 23은 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 키엔스 디지털 현미경으로부터 얻어진 샘플 영상을 도시한다. 밝은 적색 중첩들은 분석을 위해 이용되었던 입자들을 나타낸다.
도 24는 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 감마 조사된 입자들(N＝3800) 및 조사되지 않은 입자들(N＝4692)에 대한 입자 면적들을 도시한다.
도 25는 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 감마 조사된 입자들(N＝3800) 및 조사되지 않은 입자들(N＝4692)에 대한 입자 최대 직경 막대그래프를 도시한다.
도 26은 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 감마 조사된 입자들(N＝3800) 및 조사되지 않은 입자들(N＝4692)에 대한 입자 최소 직경 막대그래프를 도시한다.
도 27은 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 분별 원심 분리를 통해 수득된 사과 유래 입자들의 입자 크기 분포를 도시한다. 도 27A는 수동 체가름(45㎛)으로 초기의 큰 입자 크기 배제 이후의 여과되지 않은 입자들의 크기 분포를 도시하며, 도 27B는 1000rpm으로 1분 동안의 원심 분리의 5회 반복 이후의 분포를 도시한다. 상기 물질 모두를 수집하기 위해, 7분 동안 5000rpm으로의 원심 분리가 이용되었다.
도 28은 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 AA(사과) 입자들로의 체외 세포 배양 테스트를 도시한다. 청색＝3T3 세포핵들. 일부 경우들에서, 큰 입자 플레이크들도 훽스트 33342 염색의 결과로 볼 수 있다. 적색＝느슨한 입자들을 세척 제거한 이후에 남아 있던 0.01% 콩고 레드 염료로 염색된 입자들. 도 28A 및 도 28B는 대조군을 도시한다. 도 28C 및 도 28D＝대조군 및 염료. 도 28E 및 도 28F＝여과됨：25㎛-45㎛. 도 28G 및 도 28H＝여과됨：25㎛-45㎛ 및 염료. 도 28I 및 도 28J＝여과되지 않음. 도 28K 및 도 28L＝여과되지 않음 및 염료. 척도＝250㎛.
도 29는 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 알긴산염을 포함하는 주사 가능한 더말 필러 제형을 도시한다. 입자들 20%의 체적까지 만들어졌다. 두 가지 혼합 방법들이 테스트되었다. 도 29A는 상기 분말을 물 및 알긴산염 용액 내로 혼합하는 것을 도시한다. 도 29B는 상기 분말을 먼저 물 성분 내로 혼합하고, 이후에 상기 알긴산염을 서서히 첨가하는 것을 도시한다. 첫 번째 방법은 잘 혼합시키지 못하였으며, 상기 바늘을 막히게 하였다. 두 번째 방법은 잘 혼합시켰지만, 여과되지 않은 입자들은 상기 바늘을 막히게 하였다. 상기 여과되지 않은 입자들이 여과된 것들로 대체되었을 때, 상기 혼합물이 압출하기 쉬워졌다.
도 30은 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 주사기 루어-락 커넥터로의 더말 필러 구성 성분들의 혼합을 도시한다. 도 30A는 개개의 주사기들 내에 적재된 두 구성 성분들을 도시한다. 깨끗한 액체는 1% 알긴산염이며, 적색의 액체는 0.9% 식염수 및 리도카인 내에 현탁된 입자들이다(최종 농도＝0.3%). 콩고 레드(0.1%의 최종 농도)가 가시화를 위해 첨가되었다. 도 30B는 상기 루어-락 커넥터를 도시한다. 도 30C는 상기 구성 성분들을 혼합하는 것을 도시한다(전체 60회 통과들이 수행되었다). 도 30D는 상기 루어-락을 연결 해제하고, 이를 압출을 위한 바늘로 대체하는 것을 도시한다. 상기 용액이 27G 바늘을 폐쇄하지 않았던 점에 유의한다.
도 31은 실험예 3에서 설명되는 바와 같은 콜라겐 필러들을 도시한다. 도 31A는 벨라필 내의 PMMA 비드들의 입자 크기 분포를 도시한다. 도 31B는 본 발명에서 개발된 더말 필러들에 사용된 콩고 레드 염색된 콜라겐이 매우 적은 이차적인 비특이적 염색을 보여주었던 것을 도시한다. 도 31C는 벨라필의 PMMA 비드들을 도시한다. 도 31D는 콩고 레드로 염색된 콜라겐 더말 필러들 내에 사용된 본 발명에서 개발된 셀룰로오스 입자들을 도시한다. 유의：상기 콜라겐의 배경 염색은 상기 셀룰로오스 입자들로부터의 신호와 비교하여 낮다. 척도＝250㎛.
도 32는 실험예 3에서 설명되는 바와 같은 더말 필러 주사 결과들을 도시한다. 도 32A는 주사 전의 상태를 도시하며, 도 32B는 윤곽이 그려진 범프 경계가 있는 주사 전의 상태를 도시한다.
도 33은 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 식염수, 히알루론산(HA) 그리고 0% 탈세포화 사과 유래의 여과된 입자들 및 0.3% 리도카인과 결합된 콜라겐계 필러들의 절제를 도시한다.
도 34는 실험예 3에서 설명되는 바와 같은 이식 부위들을 도시한다. 높이는 상기 AAS(청색), AAHA(적색), AAC(흑색) 및 벨라필(보라색) 이식물들이다. 모든 이식물들은 상기 운반체 유체/히드로겔들의 재흡수로 인해 시간에 따라 수축되고 있었다. 상기 AAS 제형은 빠르게 재흡수되었다.
도 35는 실험예 3에서 설명되는 바와 같은 이식물 체적을 도시한다. 체적은 상기 AAS(청색), AAHA(적색), AAC(흑색) 및 벨라필(보라색) 이식물들이다. 모든 이식물들은 상기 운반체 유체/히드로겔들의 재흡수로 인하여 시간에 따라 수축되고 있었다. 상기 AAS 제형은 빠르게 재흡수되었다.
도 36은 실험예 6에서 설명되는 바와 같이 얻어진 사과 유래 입자들의 입자 크기 분포를 도시한다.
도 37은 실험예 7에서 설명되는 바와 같이 20% v/v 사과 유래 입자 용액 및 C1C12 세포들을 이용한 체외 세포 배양 테스트의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 37A는 상기 대조군의 현미경 영상들을 도시하고, 도 37B는 상기 20% 여과된 입자 샘플의 세포들의 현미경 영상들을 도시하며, 도 37C는 상기 20% 여과되지 않은 입자 샘플의 세포들의 현미경 영상들을 도시한다.
도 38은 실험예 7에서 설명되는 바와 같이 20% 여과된 및 여과되지 않은 입자 샘플들에 대한 세포 농도들(세포들/㎟)을 도시한다.
도 39는 실험예 7에서 설명되는 바와 같이 대조군과 여과된 및 여과되지 않은 보다 낮은 농도 샘플들의 세포들의 표면적 커버리지를 도시한다.
도 40은 실험예 8에서 설명되는 샘플들을 이용하여 발전된 표준 흡수도-농도 곡선을 도시한다.
도 41은 실험예 8에서 설명되는 샘플들의 450㎚, 475㎚, 500㎚ 및 525㎚의 흡수도-농도 곡선들을 도시한다.
도 42는 실험예 8에서 설명되는 바와 같이 20% 배 유래 입자 보존 용액 및 2M 수크로오스 대조군 용액에 대한 파장 소거를 도시한다.
도 43은 실험예 8에서 설명되는 샘플들의 320㎚에서의 흡수도-농도 곡선을 도시한다.
도 44는 실험예 10에서 설명되는 바와 같이 사과 유래 입자(HAAA) 샘플로 하이시스템 HA에 대한 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 45는 실험예 10에서 설명되는 바와 같이 벨라필 더말 필러에 대한 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 46은 실험예 10에서 설명되는 바와 같이 희석된 HAAA 샘플에 대한 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 47은 실험예 10에서 설명되는 바와 같이 젤라틴(GE; 입자들이 없음) 샘플에 대한 힘-변위 곡선들을 도시하며, 여기서 도 47A는 상기 27G 바늘을 통한 상기 GE 압출력을 도시하고, 도 47B는 상기 30G 바늘을 통한 상기 GE 압출력을 도시한다.
도 48은 실험예 10에서 설명되는 바와 같이 젤라틴 및 사과 유래 입자(GEAA) 샘플에 대한 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 49는 실험예 10에서 설명되는 바와 같이 희석된 GE 샘플에 대한 힘-변위 곡선들을 도시하며, 여기서 도 49A는 압출 이전에 데워진 상기 희석된 GE에 대한 힘-변위 곡선들을 도시하고, 도 49B는 압출 이전에 실온에서 유지된 상기 희석된 GE에 대한 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 50은 실험예 10에서 설명되는 바와 같이 알긴산염(AL; 입자들이 없음) 샘플에 대한 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 51은 실험예 13에서 설명되는 바와 같이 물 또는 PBS 내에서의 원심 분리 후의 머서리화 사과(AA) 샘플의 건조 질량 %를 도시한다.
도 52는 실험예 13에서 설명되는 샘플들의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 52A는 1：5의 AA：NaOH이고, 도 52B는 1：2의 AA：NaOH이며, 도 52C는 1：1의 AA：NaOH이다.
도 53은 실험예 13에서 설명되고 도 52에 영상화된 샘플들의 입자 크기 분포들을 도시한다.
도 54는 실험예 13에서 설명되는 바와 같이 머서리화 AA 및 배 분말 혼합물(원심 분리 이전)의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 54A는 500㎛의 척도로 현미경 영상을 도시하고, 도 54B는 100㎛의 척도로 현미경 영상을 도시한다.
도 55는 실험예 15에서 설명되는 바와 같이 머서리화 AA 및 배 분말 혼합물의 원심 분리 이후에 수집된 상층액의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 55A는 500㎛의 척도로 현미경 영상을 도시하고, 도 55B는 100㎛의 척도로 현미경 영상을 도시한다.
도 56은 실험예 15에서 설명되는 바와 같이 머서리화 AA 및 배 분말 혼합물 이후에 형성된 펠릿의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 56A는 500㎛의 척도로 현미경 영상을 도시하고, 도 56B는 100㎛의 척도로 현미경 영상을 도시한다.
도 57은 실험예 15에서 설명되는 바와 같이 체가름 이후의 머서리화 AA 및 배 분말 펠릿의 샘플의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 57A는 500㎛의 척도로 현미경 영상을 도시하고, 도 57B는 100㎛의 척도로 현미경 영상을 도시한다.
도 58은 실험예 15에서 설명되는 바와 같이 최종 원심 분리 이후의 머서리화 AA 및 배 분말 펠릿의 샘플의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 58A는 500㎛의 척도로 현미경 영상을 도시하고, 도 58B는 100㎛의 척도로 현미경 영상을 도시한다.
도 59는 도 54 내지 도 58에 도시된 2.5X로 취해진 각각의 현미경 영상들의 특정 입자 직경들의 상대 주파수들을 도시한다.
도 60은 도 54 내지 도 58에 도시된 2.5X로 취해진 각각의 현미경 영상들의 입자 분포들을 도시하며, 여기서 도 60A는 최종 원심 분리 이후의 상기 펠릿의 입자 크기 분포를 도시하고, 도 60B는 체로 걸러진 펠릿의 입자 크기 분포를 도시하며, 도 60C는 첫 번째 원심 분리 이후의 펠릿의 입자 크기 분포를 도시하고, 도 60D는 상층액의 입자 크기 분포를 도시하며, 도 60E는 초기 혼합물의 입자 크기 분포를 도시한다.
도 61은 도 54 내지 도 58에 도시된 10X로 취해진 각각의 현미경 영상들의 특정한 입자 직경들의 상대 주파수들을 도시한다.
도 62는 도 54 내지 도 58에 도시된 10X로 취해진 각각의 현미경 영상들의 입자 분포들을 도시하며, 여기서 도 62A는 최종 원심 분리 이후의 펠릿의 입자 크기 분포를 도시하고, 도 62B는 체로 걸러진 펠릿의 입자 크기 분포를 도시하며, 도 62C는 첫 번째 원심 분리 이후의 상기 펠릿의 입자 크기 분포를 도시하고, 도 62D는 상층액의 입자 크기 분포를 도시하며, 도 62E는 초기 혼합물의 입자 크기 분포를 도시한다.
도 63은 실험예 16에서 설명되는 바와 같은 압출 이전 및 이후의 머서리화 AA 샘플의 입자 크기 분포들을 도시한다.
도 64는 실험예 17에서 설명되는 바와 같은 물 샘플, 20%(v/v) 머서리화, 0.9% 식염수로 희석된 탈세포화 AA(Mer20Sal80) 제형 그리고 머서리화 AA(Mer100) 제형의 압출력들의 힘-변위 곡선들을 도시하며. 여기서 도 64A는 상기 물 샘플의 힘-변위 곡선들을 도시하고, 도 64B는 상기 Mer20Sal80 제형의 힘-변위 곡선들을 도시하며, 도 64C는 상기 Mer100 제형 제형의 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 65는 도 64에 도시된 힘-변위 곡선들의 최대 압출력들을 도시한다.
도 66은 도 64에 도시된 힘-변위 곡선들의 평균(정점지속) 압출력들을 도시한다.
도 67은 실험예 17에서 설명되는 바와 같이 27G 바늘 및 30G 바늘을 통해 압출되는 Mer100 제형의 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 68은 표준 1cc 주사기 및 벨라필 주사기로부터 27G 바늘을 통해 압출되는 Mer100 제형의 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 69는 도 67 및 도 68에 도시된 힘-변위 곡선들의 최대 압출력들을 도시한다.
도 70은 실험예 17에서 설명되는 바와 같이 1㎜/s, 2.5㎜/s 및 5.0㎜/s의 크로스-헤드 속도로 27G 바늘을 통해 압출되는 Mer100 제형의 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 71은 도 70에 도시된 힘-변위 곡선들의 최대 압출력들을 도시한다.
도 72는 실험예 18에서 설명되는 바와 같이 GE 및 머서리화 AA 제형들에 대한 힘-변위 곡선들을 도시하며, 여기서 도 72A는 5% GE 제형의 힘-변위 곡선들을 도시하고, 도 72B는 2.5% GE 제형의 힘-변위 곡선들을 도시하며, 도 72C는 1% GE 제형의 힘-변위 곡선들을 도시하고, 도 72D는 0.5% GE 제형의 힘-변위 곡선들을 도시하며, 도 72E는 0.25% GE 제형의 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 73은 도 72에 도시된 힘-변위 곡선들의 최대 압출력들을 도시한다.
도 74는 실험예 18에서 설명되는 바와 같이 머서리화 AA 샘플들에 대한 응력과 변형 대 시간의 도표를 도시하며, 여기서 도 74A는 희석되지 않은 머서리화 AA 샘플의 응력과 변형 대 시간의 도표를 도시하고, 도 74B는 희석된 머서리화 AA 샘플의 응력과 변형 대 시간의 도표를 도시한다.
도 75는 실험예 18에서 설명되는 바와 같이 머서리화 AA 샘플들에 대한 보존 탄성률들, 손실 탄성률들 및 손실 인자 곡선들을 도시하며, 여기서 도 75A는 희석되지 않은 머서리화 AA 샘플에 대한 보존 탄성률들(E') 및 손실 탄성률들(E")을 도시하고, 도 75B는 상기 희석되지 않은 머서리화 AA 샘플에 대한 손실 인자 곡선을 도시하며, 도 75C는 희석된 머서리화 AA 샘플에 대한 보존 탄성률들(E') 및 손실 탄성률들(E")을 도시하고, 도 75D는 상기 희석된 머서리화 AA 샘플에 대한 손실 인자 곡선을 도시한다.
도 76은 실험예 20에서 설명되는 머서리화 AA 샘플들의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 76A는 4℃에서 저장된 샘플의 현미경 영상을 도시하고, 도 76B는 상기 진탕 배양기 내에 유지된 샘플의 현미경 영상을 도시한다.
도 77은 실험예 20에서 설명되는 머서리화 AA 샘플들의 입자 크기 분포들을 도시한다.
도 78은 실험예 20에서 설명되고 도 76에서 영상화된 머서리화 AA 샘플들의 입자들의 환상성 및 진원도 분포들을 도시하며, 여기서 도 78A는 상기 머서리화 AA 샘플들의 환상성 분포들을 도시하고, 도 78B는 상기 머서리화 AA 샘플들의 진원도 분포들을 도시한다.
도 79는 실험예 26에서 설명되는 바와 같이 셀룰로오스계 더말 필러들에 대한 효소 활성으로부터 생성된 D-글루코오스에 대한 540㎚ 및 570㎚의 파장들에서의 표준 흡수도-농도 곡선들을 도시한다.
도 80은 실험예 26에서 설명되는 바와 같이 37℃에서 다른 완충액들 내의 희석된 효소 용액들을 사용하여 생성된 D-글루코오스의 농도들을 도시한다.
도 81은 실험예 26에서 설명되는 바와 같이 37℃에서 다른 완충액들 내의 희석된 펙티나아제：셀룰라아제 비율들을 이용하여 생성된 D-글루코오스의 농도들을 도시한다.
도 82는 실험예 26에서 설명되는 바와 같이 37℃에서 다른 효소 농도들을 이용하여 생성된 D-글루코오스의 농도들을 도시한다.
도 83은 실험예 26에서 설명되는 바와 같이 48시간의 배양 이후의 다른 효소 농도들로 셀룰로오스 유래 입자들의 현미경 영상들을 도시한다.
도 84는 실험예 26에서 설명되는 바와 같이 37℃에서 펙티나아제：셀룰라아제 비율들의 다른 농도들을 이용하여 생성된 D-글루코오스의 농도들을 도시한다.
도 85는 실험예 26에서 설명되는 바와 같이 48시간의 배양 이후의 다른 펙티나아제：셀룰라아제 비율들로 셀룰로오스 유래 입자들의 현미경 영상들을 도시한다.
도 86은 실험예 26에서 설명되는 바와 같이 신선한 효소 용액들의 다른 농도들을 이용하여 생성된 D-글루코오스의 농도들을 도시한다.
도 87은 실험예 26에서 설명되는 바와 같이 48시간의 배양 이후의 다른 신선한 효소 용액들 내의 셀룰로오스 유래 입자들의 현미경 영상들을 도시한다.
도 88은 실험예 26에서 설명되는 바와 같이 미리 만들어진 효소 용액들의 다른 농도들을 이용하여 생성된 D-글루코오스의 농도들을 도시한다.
도 89는 실험예 27에서 설명되는 바와 같이 본 발명의 일부 실시예들에 따른 더말 필러들로 주사된 랫들로부터 취해진 절제들의 사진들을 도시하며, 여기서 도 89A는 식염수 제형으로 주사된 랫으로부터 취해진 절제를 도시하고, 도 89B는 히알루론산(HA) 제형으로 주사된 랫으로부터 취해진 절제이며, 도 89C는 콜라겐 제형으로 주사된 랫으로부터 취해진 절제를 도시한다.
도 90은 실험예 27에서 설명되는 바와 같이 12주 이후의 주사된 식염수 더말 필러 제형의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 90A는 1X의 배율로 헤마톡실린(MT)로 염색된 주사된 식염수 제형의 현미경을 도시하고, 도 90B는 10X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 식염수 제형의 현미경 영상을 도시하며, 도 90C는 20X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 식염수 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 90D는 1X의 배율로 에오신(HE)으로 염색된 상기 주사된 식염수 제형의 현미경 영상을 도시하며, 도 90E는 10X의 배율로 HE로 염색된 상기 주사된 식염수 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 90F는 20X의 배율로 HE로 염색된 주사된 상기 식염수 제형의 현미경 영상을 도시한다.
도 91은 실험예 27에서 설명되는 바와 같이 12주 이후의 주사된 HA 더말 필러 제형의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 91A는 1X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 HA 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 91B는 10X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 HA 제형의 현미경 영상을 도시하며, 도 91C는 20X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 HA 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 91D는 1X의 배율로 HE로 염색된 상기 주사된 HA 제형의 현미경 영상을 도시하며, 도 91E는 10X의 배율로 HE로 염색된 상기 주사된 HA 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 91F는 20X의 배율로 HE로 염색된 상기 주사된 HA 제형의 현미경 영상을 도시한다.
도 92는 실험예 27에서 설명되는 바와 같이 12주 이후의 주사된 콜라겐 더말 필러 제형의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 92A는 1X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 콜라겐 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 92B는 10X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 콜라겐 제형의 현미경 영상을 도시하며, 도 92C는 20X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 콜라겐 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 92D는 1X의 배율로 HE로 염색된 상기 주사된 콜라겐 제형의 현미경 영상을 도시하며, 도 92E는 10X의 배율로 HE로 염색된 상기 주사된 콜라겐 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 92F는 20X의 배율로 HE로 염색된 상기 주사된 콜라겐 제형의 현미경 영상을 도시한다.
도 93은 실험예 27에서 설명되는 바와 같이 주사된 더말 필러 제형들의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 93A는 10X의 배율로 주사된 식염수 제형을 도시하고, 도 93B는 10X의 배율로 주사된 HA 제형을 도시하며, 도 93C는 주사된 콜라겐 제형을 도시한다.
도 94는 실험예 27에서 설명되는 바와 같이 1주 이후의 CD31, CD45, 또는 a 베르회프-반 기엔슨(베르회프) 염색으로 염색된 주사된 더말 필러 제형들의 현미경 영상들을 도시한다.
도 95는 시간에 대한 실험예 27에서 설명되는 더말 필러 제형들의 주사에 의해 형성된 범프들의 높이의 변화들을 도시한다.
도 96은 시간에 대한 실험예 27 및 실험예 28에서 설명되는 더말 필러 제형들의 주사에 의해 형성된 범프들의 높이의 변화들을 도시한다.
도 97은 12주 이후의 CD31, CD45, 또는 베르회프 염색으로 염색된 실험예 28에서 설명되는 주사된 더말 필러 제형들의 현미경 영상들을 도시한다.
도 1은 실험예 1에서 설명되는 바와 같이 압출된 탈세포화 셀룰로오스 페이스트(좌측 패널) 및 18G 바늘로 상기 페이스트를 적재한 이후의 1㎖ 주사기(우측 패널)도 도시한다.
도 2는 실험예 1에서 설명되는 바와 같이 3의 다른 부위들 내로 피하로 주사되었던 셀룰로오스계 더말 필러 페이스트를 도시하며, 여기서 도 2A는 측면도를 도시하고, 도 2B는 확대도를 도시한다. 혈관화가 4주에서 이식물 주위에 존재하였고(도 2C), 절제 후에 상기 이식은 그 형상을 유지하였다(도 2D).
도 3은 실험예 1에서 설명되는 바와 같이 세포 침윤 및 기질 침착이 8주 후에 동물 내부에서 관찰되었던 것을 도시한다. 셀룰로오스 필러는 생체에 적합한 것으로 나타났고, 시간에 걸쳐 구상 형상을 유지하였다. 8주의 피하 주사에 걸쳐, 메이슨 트리크롬(도 3A, 도 3C에 도시됨)과 헤마톡실린 및 에오신(도 3B, 도 3D에 도시됨)이 도시된다(A, B에 대해 축척 바＝2㎜; C, D에 대해 축척 바＝200㎛).
도 4는 실험예 1에서 설명되는 바와 같이 캘리퍼스를 활용한 동물의 외부로부터의 이식 부위들의 수동 측정들의 결과들을 도시한다. 8주의 연구 기간에 걸쳐, 이식 면적이 증가되는 것으로 관찰되었다. 그러나 종횡비(x 및 y 방향으로의 그 폭의 비)는 크게 변화하지 않았다.
도 5는 실험예 1에서 설명되는 바와 같이 이식물의 높이가 캘리퍼스로 동물의 외부에 대해 측정된 경우에 8주의 연구 기간에 걸쳐 ~75%까지 상당히 감소된 것을 도시한다. 이는 앞서 관찰된 주사 부위의 면적의 감소와 서로 관련된다.
도 6은 분쇄되고 건조된 생체재료(좌측 패널) 및 재수화되고 압출된 더말 필러(우측 패널)를 도시한다.
도 7은 실험예 2에서 설명되는 바늘 방법으로 생체재료가 완전하게 형성된 것으로 나타나고 붕괴되지 않는 적어도 일부의 단일의 온전한 구조 물질(예를 들어, 분리된 세포벽 포켓들)을 얻도록 전단되었던 것을 도시한다.
도 8은 실험예 2에서 설명되는 바와 같이 시간의 함수로서 이식물들의 높이를 도시한다. 다양한 제형들 사이에서 통계적으로 의미 있는 차이는 관찰되지 않았다. 그러나 이들이 약 10의 인자에 의해 HA 및 콜라겐의 농도의 측면들에서 상업 제품들과 상당히 달랐던 점에 유의한다. 콜라겐/HA 히드로겔의 낮은 w/v 농도와 부합하여, 결과들은 식염수계 필러의 경우와 유사하게 나타났고, 높이에서 ~50%의 감소를 가져왔다.
도 9는 실험예 2에서 설명되는 바와 같이 시간의 함수로서 캘리퍼스로 동물의 외부로부터 측정된 상기 이식물의 계산된 체적을 도시한다. 상기 높이, x 및 y 폭들을 이용하고 반 타원형으로 상정하여, 상기 이식물 체적이 계산되었다. 다양한 제형들 사이에서 통계적으로 의미 있는 차이는 관찰되지 않았으며, 높이의 감소와 부합되는 경향을 따랐다.
도 10은 이식 후의 3개월에서 30㎛-50㎛ PMMA 미세구들(백색 원들)을 도시한다. 천연 조직이 이식물 주위에 성장하고 있는 반면, 조직 내의 PMMA의 체적 비율은 매우 높다. 이는 상기 조직이 천연 세포들 및 단백질들보다는 주로 합성 물질들로 구성되는 것을 나타낸다.
도 11은 멸균 샘플 처리를 도시한다. 실험예 3에서 설명되는 바와 같이, 탈세포화 프로세스의 GLP 버전은 멸균 물질들 및 무균 기술로 수행되었다.
도 12는 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 사과 유래 탈세포화 셀룰로오스 골격들을 동결 건조하는 프로세스를 도시한다. 도 12A는 탈세포화 물질이 수집되었고, 팔콘 튜브들 내에 배치되었으며, 채널이 이탈되도록 수증기를 증발/승화시키기 위해 상기 물질 내로 가압되었던 것을 도시한다. 도 12B는 상기 물질이 동결 전조기에 부착되었던 것을 도시하며, 도 12C는 동결 건조가 48시간 동안 -46C 및 0.05mbar에서 수행되었던 것을 도시한다. 도 12D는 상기 동결 건조된 물질의 최종 생성물을 도시한다.
도 13은 실험예 3에서 설명하는 바와 같이 건조된 셀룰로오스 생체재료가 동시에 80㎛ 필터로 통과되면서 18000rpm, 12000rpm 및 6000rpm로 분말도 분쇄되었던 것을 도시한다. 수집 트레이가 상기 프로세스 이후에 도시된다. 가장 높은 RPM 설정이 처리 시간을 감소시키기 위해 이용되었다. 입자 크기들의 분포에 대해 관찰되었던 관찰 가능한 분쇄 속도의 영향은 없었다(실험예 3 도시된 데이터).
도 14는 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 여과 프로세스를 도시한다. 도 14A는 80㎛ 필터를 통해 물질을 분쇄하는 것으로부터 얻어진 분말을 도시하고, 도 14B는 45㎛ 및 25㎛ 체들을 통한 습식 체가름으로부터 얻어진 분말을 도시하며, 도 14C는 상기 분말의 크기 범위를 제한하는 것을 도시한다. 가장 좁은 크기 범위의 입자들이 원심 분리를 통해 농축되었다(도 14D). 자동화된 습식 체는 처리 시간과 효율을 크게 향상시켰으며, 이제 통상적으로 사용되었다.
도 15는 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 콩고 레드로 염색된 입자들을 도시한다. 상기 입자들은 0.1% 콩고 레드로 염색되었고, 2.5X(도 15A, 도 15B) 및 10X(도 15C, 도 15D)로 영상화되었다. 도 15A, 도 15C：여과되지 않은 입자들. 도 15B, 도 15D：여과된 입자들. 이들과 같은 영상들은 상기 입자 크기 분포를 정량화하기 위해 수집되었다. 통상적으로, 2.5X로 10의 영상들은 통계적으로 의미 있는 샘플 크기인 ~1000의 입자들을 산출한다.
도 16은 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 입자 크기 분석을 도시한다. 입자들은 피지(이미지제이)를 이용하여 경계가 정해졌고, 분할되었다. 도 16A 및 도 16B는 여과된 입자들을 도시하며, 도 16C 및 도 16D는 여과되지 않은 입자들을 도시한다. 도 16A 및 도 16C는 임계화된 영상을 도시하며, 도 16B 및 도 16D는 상기 크기 분석으로부터의 입자들의 윤곽들을 도시한다.
도 17은 여과된 및 여과되지 않은 탈세포화 사과 입자들에 대한 입자 크기 분석을 도시한다. 페렛 직경이 입자 크기를 정량화 하는 데 이용되었다. 각 조건들에 대해 N＝15 영상들이 상기 콩고 레드로 염색된 입자들의 형광 현미경 영상들로부터 분석되었다. 여과되지 않은 N＝2292이고, 여과된 N＝1595이다. 상기 평균들은 통계적으로 유의미하게 달랐다(P＝7.4 x 10-55).
도 18은 증가되는 배율(도 18A-도 18D)로 탈세포화 사과 분말의 SEM 현미경 사진들을 도시한다.
도 19는 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 플레이크 직경을 결정하기 위한 수동 영상 처리를 도시한다. 플레이크들은 불규칙하게 성형되며, 단일의 길이 표지들은 이러한 복잡성을 포착하는 데 실패한다(소스：탈세포화 사과).
도 20은 탈세포화 사과에 대한 SEM으로부터의 입자 크기 분포를 도시한다. 상기 분포는 47.11±1.11㎛에서 피크를 보여주었다(N＝133 플레이크들). SEM 영상 분석으로부터 얻어진 분포는 광학적 방법들 보다 훨씬 좁았다. 그러나 차례로 작은 N 값들, 입자 각도 배향의 영향 및 에지들을 확실하게 검출하는 능력을 가져오는 입자들을 측정하는 수동 접근 방식과 같은 이러한 방법에 대한 결점들이 존재한다. 이들 문제들은 이러한 방법론이 입자 크기를 특성화하기 위해서 바람직하지 않게 만든다.
도 21은 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 자동화된 습식 체 여과 이전에 측정된 다른 속도들에서 탈세포화 사과를 분쇄한 이후의 입자 크기 분포를 도시한다. 입자들은 체가름 이전에 6000RPM(흑색) 및 18000(회색)에서의 분쇄에 의해 생성되었다. 두 가지 분산들은 유사하였다. 평균 입자 크기들은 6000RPM 및 18000RPM 에 대해 각기 73.07±0.58㎛ 및 73.50±0.56㎛이었다. 값들은 평균 및 s.e.m.이다. 6000RPM에 대해 N＝2579이고, 18000RPM에 대해 N＝2354이다. 상기 평균 입자 크기에 유의차는 존재하지 않았던 것으로 발견되었다(P＝0.58).
도 22는 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 표지 스티커가 있는 감마 조사를 위해 밀봉된 날겐 보틀 내의 입자 서스펜션의 샘플을 도시한다.
도 23은 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 키엔스 디지털 현미경으로부터 얻어진 샘플 영상을 도시한다. 밝은 적색 중첩들은 분석을 위해 이용되었던 입자들을 나타낸다.
도 24는 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 감마 조사된 입자들(N＝3800) 및 조사되지 않은 입자들(N＝4692)에 대한 입자 면적들을 도시한다.
도 25는 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 감마 조사된 입자들(N＝3800) 및 조사되지 않은 입자들(N＝4692)에 대한 입자 최대 직경 막대그래프를 도시한다.
도 26은 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 감마 조사된 입자들(N＝3800) 및 조사되지 않은 입자들(N＝4692)에 대한 입자 최소 직경 막대그래프를 도시한다.
도 27은 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 분별 원심 분리를 통해 수득된 사과 유래 입자들의 입자 크기 분포를 도시한다. 도 27A는 수동 체가름(45㎛)으로 초기의 큰 입자 크기 배제 이후의 여과되지 않은 입자들의 크기 분포를 도시하며, 도 27B는 1000rpm으로 1분 동안의 원심 분리의 5회 반복 이후의 분포를 도시한다. 상기 물질 모두를 수집하기 위해, 7분 동안 5000rpm으로의 원심 분리가 이용되었다.
도 28은 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 AA(사과) 입자들로의 체외 세포 배양 테스트를 도시한다. 청색＝3T3 세포핵들. 일부 경우들에서, 큰 입자 플레이크들도 훽스트 33342 염색의 결과로 볼 수 있다. 적색＝느슨한 입자들을 세척 제거한 이후에 남아 있던 0.01% 콩고 레드 염료로 염색된 입자들. 도 28A 및 도 28B는 대조군을 도시한다. 도 28C 및 도 28D＝대조군 및 염료. 도 28E 및 도 28F＝여과됨：25㎛-45㎛. 도 28G 및 도 28H＝여과됨：25㎛-45㎛ 및 염료. 도 28I 및 도 28J＝여과되지 않음. 도 28K 및 도 28L＝여과되지 않음 및 염료. 척도＝250㎛.
도 29는 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 알긴산염을 포함하는 주사 가능한 더말 필러 제형을 도시한다. 입자들 20%의 체적까지 만들어졌다. 두 가지 혼합 방법들이 테스트되었다. 도 29A는 상기 분말을 물 및 알긴산염 용액 내로 혼합하는 것을 도시한다. 도 29B는 상기 분말을 먼저 물 성분 내로 혼합하고, 이후에 상기 알긴산염을 서서히 첨가하는 것을 도시한다. 첫 번째 방법은 잘 혼합시키지 못하였으며, 상기 바늘을 막히게 하였다. 두 번째 방법은 잘 혼합시켰지만, 여과되지 않은 입자들은 상기 바늘을 막히게 하였다. 상기 여과되지 않은 입자들이 여과된 것들로 대체되었을 때, 상기 혼합물이 압출하기 쉬워졌다.
도 30은 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 주사기 루어-락 커넥터로의 더말 필러 구성 성분들의 혼합을 도시한다. 도 30A는 개개의 주사기들 내에 적재된 두 구성 성분들을 도시한다. 깨끗한 액체는 1% 알긴산염이며, 적색의 액체는 0.9% 식염수 및 리도카인 내에 현탁된 입자들이다(최종 농도＝0.3%). 콩고 레드(0.1%의 최종 농도)가 가시화를 위해 첨가되었다. 도 30B는 상기 루어-락 커넥터를 도시한다. 도 30C는 상기 구성 성분들을 혼합하는 것을 도시한다(전체 60회 통과들이 수행되었다). 도 30D는 상기 루어-락을 연결 해제하고, 이를 압출을 위한 바늘로 대체하는 것을 도시한다. 상기 용액이 27G 바늘을 폐쇄하지 않았던 점에 유의한다.
도 31은 실험예 3에서 설명되는 바와 같은 콜라겐 필러들을 도시한다. 도 31A는 벨라필 내의 PMMA 비드들의 입자 크기 분포를 도시한다. 도 31B는 본 발명에서 개발된 더말 필러들에 사용된 콩고 레드 염색된 콜라겐이 매우 적은 이차적인 비특이적 염색을 보여주었던 것을 도시한다. 도 31C는 벨라필의 PMMA 비드들을 도시한다. 도 31D는 콩고 레드로 염색된 콜라겐 더말 필러들 내에 사용된 본 발명에서 개발된 셀룰로오스 입자들을 도시한다. 유의：상기 콜라겐의 배경 염색은 상기 셀룰로오스 입자들로부터의 신호와 비교하여 낮다. 척도＝250㎛.
도 32는 실험예 3에서 설명되는 바와 같은 더말 필러 주사 결과들을 도시한다. 도 32A는 주사 전의 상태를 도시하며, 도 32B는 윤곽이 그려진 범프 경계가 있는 주사 전의 상태를 도시한다.
도 33은 실험예 3에서 설명되는 바와 같이 식염수, 히알루론산(HA) 그리고 0% 탈세포화 사과 유래의 여과된 입자들 및 0.3% 리도카인과 결합된 콜라겐계 필러들의 절제를 도시한다.
도 34는 실험예 3에서 설명되는 바와 같은 이식 부위들을 도시한다. 높이는 상기 AAS(청색), AAHA(적색), AAC(흑색) 및 벨라필(보라색) 이식물들이다. 모든 이식물들은 상기 운반체 유체/히드로겔들의 재흡수로 인해 시간에 따라 수축되고 있었다. 상기 AAS 제형은 빠르게 재흡수되었다.
도 35는 실험예 3에서 설명되는 바와 같은 이식물 체적을 도시한다. 체적은 상기 AAS(청색), AAHA(적색), AAC(흑색) 및 벨라필(보라색) 이식물들이다. 모든 이식물들은 상기 운반체 유체/히드로겔들의 재흡수로 인하여 시간에 따라 수축되고 있었다. 상기 AAS 제형은 빠르게 재흡수되었다.
도 36은 실험예 6에서 설명되는 바와 같이 얻어진 사과 유래 입자들의 입자 크기 분포를 도시한다.
도 37은 실험예 7에서 설명되는 바와 같이 20% v/v 사과 유래 입자 용액 및 C1C12 세포들을 이용한 체외 세포 배양 테스트의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 37A는 상기 대조군의 현미경 영상들을 도시하고, 도 37B는 상기 20% 여과된 입자 샘플의 세포들의 현미경 영상들을 도시하며, 도 37C는 상기 20% 여과되지 않은 입자 샘플의 세포들의 현미경 영상들을 도시한다.
도 38은 실험예 7에서 설명되는 바와 같이 20% 여과된 및 여과되지 않은 입자 샘플들에 대한 세포 농도들(세포들/㎟)을 도시한다.
도 39는 실험예 7에서 설명되는 바와 같이 대조군과 여과된 및 여과되지 않은 보다 낮은 농도 샘플들의 세포들의 표면적 커버리지를 도시한다.
도 40은 실험예 8에서 설명되는 샘플들을 이용하여 발전된 표준 흡수도-농도 곡선을 도시한다.
도 41은 실험예 8에서 설명되는 샘플들의 450㎚, 475㎚, 500㎚ 및 525㎚의 흡수도-농도 곡선들을 도시한다.
도 42는 실험예 8에서 설명되는 바와 같이 20% 배 유래 입자 보존 용액 및 2M 수크로오스 대조군 용액에 대한 파장 소거를 도시한다.
도 43은 실험예 8에서 설명되는 샘플들의 320㎚에서의 흡수도-농도 곡선을 도시한다.
도 44는 실험예 10에서 설명되는 바와 같이 사과 유래 입자(HAAA) 샘플로 하이시스템 HA에 대한 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 45는 실험예 10에서 설명되는 바와 같이 벨라필 더말 필러에 대한 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 46은 실험예 10에서 설명되는 바와 같이 희석된 HAAA 샘플에 대한 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 47은 실험예 10에서 설명되는 바와 같이 젤라틴(GE; 입자들이 없음) 샘플에 대한 힘-변위 곡선들을 도시하며, 여기서 도 47A는 상기 27G 바늘을 통한 상기 GE 압출력을 도시하고, 도 47B는 상기 30G 바늘을 통한 상기 GE 압출력을 도시한다.
도 48은 실험예 10에서 설명되는 바와 같이 젤라틴 및 사과 유래 입자(GEAA) 샘플에 대한 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 49는 실험예 10에서 설명되는 바와 같이 희석된 GE 샘플에 대한 힘-변위 곡선들을 도시하며, 여기서 도 49A는 압출 이전에 데워진 상기 희석된 GE에 대한 힘-변위 곡선들을 도시하고, 도 49B는 압출 이전에 실온에서 유지된 상기 희석된 GE에 대한 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 50은 실험예 10에서 설명되는 바와 같이 알긴산염(AL; 입자들이 없음) 샘플에 대한 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 51은 실험예 13에서 설명되는 바와 같이 물 또는 PBS 내에서의 원심 분리 후의 머서리화 사과(AA) 샘플의 건조 질량 %를 도시한다.
도 52는 실험예 13에서 설명되는 샘플들의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 52A는 1：5의 AA：NaOH이고, 도 52B는 1：2의 AA：NaOH이며, 도 52C는 1：1의 AA：NaOH이다.
도 53은 실험예 13에서 설명되고 도 52에 영상화된 샘플들의 입자 크기 분포들을 도시한다.
도 54는 실험예 13에서 설명되는 바와 같이 머서리화 AA 및 배 분말 혼합물(원심 분리 이전)의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 54A는 500㎛의 척도로 현미경 영상을 도시하고, 도 54B는 100㎛의 척도로 현미경 영상을 도시한다.
도 55는 실험예 15에서 설명되는 바와 같이 머서리화 AA 및 배 분말 혼합물의 원심 분리 이후에 수집된 상층액의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 55A는 500㎛의 척도로 현미경 영상을 도시하고, 도 55B는 100㎛의 척도로 현미경 영상을 도시한다.
도 56은 실험예 15에서 설명되는 바와 같이 머서리화 AA 및 배 분말 혼합물 이후에 형성된 펠릿의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 56A는 500㎛의 척도로 현미경 영상을 도시하고, 도 56B는 100㎛의 척도로 현미경 영상을 도시한다.
도 57은 실험예 15에서 설명되는 바와 같이 체가름 이후의 머서리화 AA 및 배 분말 펠릿의 샘플의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 57A는 500㎛의 척도로 현미경 영상을 도시하고, 도 57B는 100㎛의 척도로 현미경 영상을 도시한다.
도 58은 실험예 15에서 설명되는 바와 같이 최종 원심 분리 이후의 머서리화 AA 및 배 분말 펠릿의 샘플의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 58A는 500㎛의 척도로 현미경 영상을 도시하고, 도 58B는 100㎛의 척도로 현미경 영상을 도시한다.
도 59는 도 54 내지 도 58에 도시된 2.5X로 취해진 각각의 현미경 영상들의 특정 입자 직경들의 상대 주파수들을 도시한다.
도 60은 도 54 내지 도 58에 도시된 2.5X로 취해진 각각의 현미경 영상들의 입자 분포들을 도시하며, 여기서 도 60A는 최종 원심 분리 이후의 상기 펠릿의 입자 크기 분포를 도시하고, 도 60B는 체로 걸러진 펠릿의 입자 크기 분포를 도시하며, 도 60C는 첫 번째 원심 분리 이후의 펠릿의 입자 크기 분포를 도시하고, 도 60D는 상층액의 입자 크기 분포를 도시하며, 도 60E는 초기 혼합물의 입자 크기 분포를 도시한다.
도 61은 도 54 내지 도 58에 도시된 10X로 취해진 각각의 현미경 영상들의 특정한 입자 직경들의 상대 주파수들을 도시한다.
도 62는 도 54 내지 도 58에 도시된 10X로 취해진 각각의 현미경 영상들의 입자 분포들을 도시하며, 여기서 도 62A는 최종 원심 분리 이후의 펠릿의 입자 크기 분포를 도시하고, 도 62B는 체로 걸러진 펠릿의 입자 크기 분포를 도시하며, 도 62C는 첫 번째 원심 분리 이후의 상기 펠릿의 입자 크기 분포를 도시하고, 도 62D는 상층액의 입자 크기 분포를 도시하며, 도 62E는 초기 혼합물의 입자 크기 분포를 도시한다.
도 63은 실험예 16에서 설명되는 바와 같은 압출 이전 및 이후의 머서리화 AA 샘플의 입자 크기 분포들을 도시한다.
도 64는 실험예 17에서 설명되는 바와 같은 물 샘플, 20%(v/v) 머서리화, 0.9% 식염수로 희석된 탈세포화 AA(Mer20Sal80) 제형 그리고 머서리화 AA(Mer100) 제형의 압출력들의 힘-변위 곡선들을 도시하며. 여기서 도 64A는 상기 물 샘플의 힘-변위 곡선들을 도시하고, 도 64B는 상기 Mer20Sal80 제형의 힘-변위 곡선들을 도시하며, 도 64C는 상기 Mer100 제형 제형의 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 65는 도 64에 도시된 힘-변위 곡선들의 최대 압출력들을 도시한다.
도 66은 도 64에 도시된 힘-변위 곡선들의 평균(정점지속) 압출력들을 도시한다.
도 67은 실험예 17에서 설명되는 바와 같이 27G 바늘 및 30G 바늘을 통해 압출되는 Mer100 제형의 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 68은 표준 1cc 주사기 및 벨라필 주사기로부터 27G 바늘을 통해 압출되는 Mer100 제형의 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 69는 도 67 및 도 68에 도시된 힘-변위 곡선들의 최대 압출력들을 도시한다.
도 70은 실험예 17에서 설명되는 바와 같이 1㎜/s, 2.5㎜/s 및 5.0㎜/s의 크로스-헤드 속도로 27G 바늘을 통해 압출되는 Mer100 제형의 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 71은 도 70에 도시된 힘-변위 곡선들의 최대 압출력들을 도시한다.
도 72는 실험예 18에서 설명되는 바와 같이 GE 및 머서리화 AA 제형들에 대한 힘-변위 곡선들을 도시하며, 여기서 도 72A는 5% GE 제형의 힘-변위 곡선들을 도시하고, 도 72B는 2.5% GE 제형의 힘-변위 곡선들을 도시하며, 도 72C는 1% GE 제형의 힘-변위 곡선들을 도시하고, 도 72D는 0.5% GE 제형의 힘-변위 곡선들을 도시하며, 도 72E는 0.25% GE 제형의 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 73은 도 72에 도시된 힘-변위 곡선들의 최대 압출력들을 도시한다.
도 74는 실험예 18에서 설명되는 바와 같이 머서리화 AA 샘플들에 대한 응력과 변형 대 시간의 도표를 도시하며, 여기서 도 74A는 희석되지 않은 머서리화 AA 샘플의 응력과 변형 대 시간의 도표를 도시하고, 도 74B는 희석된 머서리화 AA 샘플의 응력과 변형 대 시간의 도표를 도시한다.
도 75는 실험예 18에서 설명되는 바와 같이 머서리화 AA 샘플들에 대한 보존 탄성률들, 손실 탄성률들 및 손실 인자 곡선들을 도시하며, 여기서 도 75A는 희석되지 않은 머서리화 AA 샘플에 대한 보존 탄성률들(E') 및 손실 탄성률들(E")을 도시하고, 도 75B는 상기 희석되지 않은 머서리화 AA 샘플에 대한 손실 인자 곡선을 도시하며, 도 75C는 희석된 머서리화 AA 샘플에 대한 보존 탄성률들(E') 및 손실 탄성률들(E")을 도시하고, 도 75D는 상기 희석된 머서리화 AA 샘플에 대한 손실 인자 곡선을 도시한다.
도 76은 실험예 20에서 설명되는 머서리화 AA 샘플들의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 76A는 4℃에서 저장된 샘플의 현미경 영상을 도시하고, 도 76B는 상기 진탕 배양기 내에 유지된 샘플의 현미경 영상을 도시한다.
도 77은 실험예 20에서 설명되는 머서리화 AA 샘플들의 입자 크기 분포들을 도시한다.
도 78은 실험예 20에서 설명되고 도 76에서 영상화된 머서리화 AA 샘플들의 입자들의 환상성 및 진원도 분포들을 도시하며, 여기서 도 78A는 상기 머서리화 AA 샘플들의 환상성 분포들을 도시하고, 도 78B는 상기 머서리화 AA 샘플들의 진원도 분포들을 도시한다.
도 79는 실험예 26에서 설명되는 바와 같이 셀룰로오스계 더말 필러들에 대한 효소 활성으로부터 생성된 D-글루코오스에 대한 540㎚ 및 570㎚의 파장들에서의 표준 흡수도-농도 곡선들을 도시한다.
도 80은 실험예 26에서 설명되는 바와 같이 37℃에서 다른 완충액들 내의 희석된 효소 용액들을 사용하여 생성된 D-글루코오스의 농도들을 도시한다.
도 81은 실험예 26에서 설명되는 바와 같이 37℃에서 다른 완충액들 내의 희석된 펙티나아제：셀룰라아제 비율들을 이용하여 생성된 D-글루코오스의 농도들을 도시한다.
도 82는 실험예 26에서 설명되는 바와 같이 37℃에서 다른 효소 농도들을 이용하여 생성된 D-글루코오스의 농도들을 도시한다.
도 83은 실험예 26에서 설명되는 바와 같이 48시간의 배양 이후의 다른 효소 농도들로 셀룰로오스 유래 입자들의 현미경 영상들을 도시한다.
도 84는 실험예 26에서 설명되는 바와 같이 37℃에서 펙티나아제：셀룰라아제 비율들의 다른 농도들을 이용하여 생성된 D-글루코오스의 농도들을 도시한다.
도 85는 실험예 26에서 설명되는 바와 같이 48시간의 배양 이후의 다른 펙티나아제：셀룰라아제 비율들로 셀룰로오스 유래 입자들의 현미경 영상들을 도시한다.
도 86은 실험예 26에서 설명되는 바와 같이 신선한 효소 용액들의 다른 농도들을 이용하여 생성된 D-글루코오스의 농도들을 도시한다.
도 87은 실험예 26에서 설명되는 바와 같이 48시간의 배양 이후의 다른 신선한 효소 용액들 내의 셀룰로오스 유래 입자들의 현미경 영상들을 도시한다.
도 88은 실험예 26에서 설명되는 바와 같이 미리 만들어진 효소 용액들의 다른 농도들을 이용하여 생성된 D-글루코오스의 농도들을 도시한다.
도 89는 실험예 27에서 설명되는 바와 같이 본 발명의 일부 실시예들에 따른 더말 필러들로 주사된 랫들로부터 취해진 절제들의 사진들을 도시하며, 여기서 도 89A는 식염수 제형으로 주사된 랫으로부터 취해진 절제를 도시하고, 도 89B는 히알루론산(HA) 제형으로 주사된 랫으로부터 취해진 절제이며, 도 89C는 콜라겐 제형으로 주사된 랫으로부터 취해진 절제를 도시한다.
도 90은 실험예 27에서 설명되는 바와 같이 12주 이후의 주사된 식염수 더말 필러 제형의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 90A는 1X의 배율로 헤마톡실린(MT)로 염색된 주사된 식염수 제형의 현미경을 도시하고, 도 90B는 10X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 식염수 제형의 현미경 영상을 도시하며, 도 90C는 20X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 식염수 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 90D는 1X의 배율로 에오신(HE)으로 염색된 상기 주사된 식염수 제형의 현미경 영상을 도시하며, 도 90E는 10X의 배율로 HE로 염색된 상기 주사된 식염수 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 90F는 20X의 배율로 HE로 염색된 주사된 상기 식염수 제형의 현미경 영상을 도시한다.
도 91은 실험예 27에서 설명되는 바와 같이 12주 이후의 주사된 HA 더말 필러 제형의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 91A는 1X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 HA 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 91B는 10X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 HA 제형의 현미경 영상을 도시하며, 도 91C는 20X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 HA 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 91D는 1X의 배율로 HE로 염색된 상기 주사된 HA 제형의 현미경 영상을 도시하며, 도 91E는 10X의 배율로 HE로 염색된 상기 주사된 HA 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 91F는 20X의 배율로 HE로 염색된 상기 주사된 HA 제형의 현미경 영상을 도시한다.
도 92는 실험예 27에서 설명되는 바와 같이 12주 이후의 주사된 콜라겐 더말 필러 제형의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 92A는 1X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 콜라겐 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 92B는 10X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 콜라겐 제형의 현미경 영상을 도시하며, 도 92C는 20X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 콜라겐 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 92D는 1X의 배율로 HE로 염색된 상기 주사된 콜라겐 제형의 현미경 영상을 도시하며, 도 92E는 10X의 배율로 HE로 염색된 상기 주사된 콜라겐 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 92F는 20X의 배율로 HE로 염색된 상기 주사된 콜라겐 제형의 현미경 영상을 도시한다.
도 93은 실험예 27에서 설명되는 바와 같이 주사된 더말 필러 제형들의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 93A는 10X의 배율로 주사된 식염수 제형을 도시하고, 도 93B는 10X의 배율로 주사된 HA 제형을 도시하며, 도 93C는 주사된 콜라겐 제형을 도시한다.
도 94는 실험예 27에서 설명되는 바와 같이 1주 이후의 CD31, CD45, 또는 a 베르회프-반 기엔슨(베르회프) 염색으로 염색된 주사된 더말 필러 제형들의 현미경 영상들을 도시한다.
도 95는 시간에 대한 실험예 27에서 설명되는 더말 필러 제형들의 주사에 의해 형성된 범프들의 높이의 변화들을 도시한다.
도 96은 시간에 대한 실험예 27 및 실험예 28에서 설명되는 더말 필러 제형들의 주사에 의해 형성된 범프들의 높이의 변화들을 도시한다.
도 97은 12주 이후의 CD31, CD45, 또는 베르회프 염색으로 염색된 실험예 28에서 설명되는 주사된 더말 필러 제형들의 현미경 영상들을 도시한다.
더말 필러(dermal filler)들, 화장료(cosmetic) 및/또는 재건(reconstructive) 적용들을 위한 방법들 및 그 용도들뿐만 아니라 이와 관련되는 이러한 더말 필러들 및 더말 필러 키트들을 제조하기 위한 방법들이 여기에 개시된다. 실시예들 및 실험예들이 해당 기술 분야의 숙련자를 위해 의도되는 예시적인 목적들을 제공하며, 어떠한 방식으로도 제한하려는 의미는 아닌 점이 이해될 것이다.
조직의 세포 물질들 및 핵산들이 제거된 탈세포화(decellularized) 식물 또는 균류 조직을 포함하는 더말 필러들뿐만 아니라 화장료 및/또는 재건 적용들을 위한 방법들과 그 용도들이 여기에 제공된다. 또한, 이러한 더말 필러들 및 더말 필러 키트(kit)들을 제조하기 위한 방법들이 제공된다.
여기에 설명하는 바와 같이, 본 발명자들은 탈세포화 식물 또는 균류 조직을 포함하는 더말 필러 제품들을 새롭게 개발하였다. 여기에 제공되는 데이터는 더말 필러들이 우수한 생체 적합성을 가졌고, 실질적으로 비재흡수성(non-resorbable)-즉, "영구적"이었던 점을 나타낸다. 이러한 더말 필러 제품들을 제조하기 위한 방법들이 설명되며, 이는 20㎛ 아래의 크기의 작은 바람직하지 않은 입자들의 회프를 포함하여 크기 및 다양한 다른 유익한 성질들에 대한 제어를 가능하게 할 수 있다. 작은 게이지(gauge)의 바늘들을 통한 양호한 주사기 적응성(syringability)/주사 가능성을 가지는 제조물들이 개발될 뿐만 아니라 히드로겔(hydrogel)들과 같은 운반체(carrier) 유체들과 양립 가능하고, 마취제(anesthetic)들과 양립할 수 있는 제조물들이 개발된다. 살균 기술들과 살균 제품들도 설명된다. 더말 필러 제품들을 위한 입자들은 세포 침입/성장을 고무하거나 및/또는 대상들에서 천연 조직 대 더말 필러의 우수한 비율들을 제공하기 위해 바람직한 형상들 및 표면적/체적/포장 성질들을 가지는 것으로 설명된다.
더말 필러들은 통상적으로 주름을 채우는 것, 외관(appearance)을 변경하는 것, 또는 질병 또는 손상으로 인한 연조직 손상을 처리하는 것과 같이 화장료 및/또는 마취제 적용들을 위한 물질들을 채용한다. 특정 실시예들에서, 여기에 설명하는 바와 같은 더말 필러 제품들은 이들이 장기간이고, 천연이며, 이러한 적용들을 위한 생체 적합성 용액들인 측면에서 "영구적"으로 간주될 수 있다. 종래 기술에서의 많은 더말 필러들은 일시적이다. 특정한 기간 후, 종래의 더말 필러들은 신체로 다시 흡수된다. 다른 것들은 장기간의 용액들을 제공하도록 PMMA와 같은 합성 입자들을 사용할 수 있다. 특정 실시예들에서, 본 발명에서 설명되는 접근 방식은 더말 필러들을 위한 목표 크기 범위로 처리되는 셀룰로오스계(cellulose-based) 물질들을 제공할 수 있다. 이들은 천연 식물성 고분자들로부터 생성될 수 있으며, 인간들은 셀룰로오스를 파괴하는 효소들을 가지고 있지 않은 사실로 인하여 영구적이 될 수 있다. 여기에 상세하게 설명되는 바와 같이, 이러한 입자들이 성공적으로 생성되었으며, 상기 입자들은 바람직한 목표 크기 범위 내에 있었다. 입자들은 다른 더말 필러 제형(제형)들에 사용되었으며, 랫 모델(rat model) 내로 주사되었다. 상기 입자들은 바람직한 SA：V 비율을 가지며, 혈관신생(vascularization)을 증진시킬 수 있고, 생체 적합성일 수 있으며, 합성 물질들 보다는 더 환자 자신의 조직들인 조직으로 구성되는 조직을 제공할 수 있다.
일 실시예에서, 조직의 세포 물질들 및 핵산들이 제거된 탈세포화 식물 또는 균류 조직을 포함하는 비재흡수성 더말 필러가 여기에 제공된다.
이해될 수 있는 바와 같이, 더말 필러는 대상 내의 이식에 후속하여 실질적으로 비재흡수성이거나, 장기간 지속성(예를 들어, 분해에 대한 저항성)인 적어도 하나의 필러 또는 입자 성분을 포함할 때에 비재흡수성으로 간주될 수 있다. 실험예에 의하여, 특정 실시예들에서, 더말 필러들 여기에 설명하는 바와 같이 셀룰로오스계 또는 셀룰로오스를 포함하는 입자들의 형태로 탈세포화 식물 조직을 포함할 수 있으며, 사람의 신체는 셀룰로오스를 분해하기 위한 효소들이 결핍되기 때문에 실질적으로 비재흡수성으로 간주될 수 있다. 특정 실시예들에서, 비재흡수성 더말 필러들은, 예를 들면, 주사 또는 이식에 후속하여 신체 내에서 영구적이거나, 반영구적이거나, 장기간 지속되는 하나 또는 그 이상의 필러 또는 입자 성분들을 포함할 수 있다.
이해될 수 있는 바와 같이, 다르게 기재되지 않는 한, 여기에 이용되는 식물 및 균류계의 의미/정의는 카발리에-스미스 분류(Cavalier-Smith classification)(1998)를 기초로 한다.
특정 실시예들에서, 상기 식물 또는 균류 조직은 대체로 임의의 적합한 식물 또는 균류 조직이나 특정한 적용을 위해 적절한 적합 골격(scaffold) 구조를 포함하는 부분을 포함할 수 있다.
특정 실시예들에서, 상기 식물 또는 균류 조직은 사과 하이판시움(hypanthium)(말루스 푸밀라(Malus pumila)) 조직, 양치류(모닐로피테스(Monilophytes)) 조직, 순무(브라시카 라파(Brassica rapa)) 뿌리 조직, 은행나무 가지 조직, 쇠뜨기(에퀴세툼(equisetum)) 조직, 헤르모칼리스(hermocallis) 혼성 잎 조직, 케일(브라시카 올레라세아(Brassica oleracea)) 줄기 조직, 침엽수 더글러스 전나무(슈도트수가 멘지에시이(Pseudotsuga menziesii)) 조직, 선인장 실과(피타야(pitaya)) 과육 조직, 마쿨라타 빙카(Maculata Vinca) 조직, 수생 연(넬룸보 누시페라(Nelumbo nucifera)) 조직, 튤립(툴리파 게스네리아나(Tulipa gesneriana)) 꽃잎 조직, 플랜틴(Plantain)(무사 파라디시아카(Musa paradisiaca)) 조직, 브로콜리(브라시카 올레라세아(Brassica oleracea)) 줄기 조직, 단풍잎(아세르 슈도플라타누스(Acer psuedoplatanus)) 줄기 조직, 비트(베타 불가리스(Beta vulgaris)) 주근 조직, 파(알리움 세파(Allium cepa)) 조직, 난초(오르치다세아에(Orchidaceae)) 조직, 순무(브라시카 라파(Brassica rapa)) 줄기 조직, 리크(알리움 암펠로프라숨(Allium ampeloprasum)) 조직, 단풍(아세르(Acer)) 나무 가지 조직, 셀러리(아피움 그라베올렌스(Apium graveolens)) 조직, 파(알리움 세파(Allium cepa)) 줄기 조직, 소나무 조직, 알로에 베라 조직, 수박(시트룰루스 라나투스 변종 라나투스(Citrullus lanatus var. lanatus)) 조직, 좀가시풀(리시마키아 눔물라리아(Lysimachia nummularia)) 조직, 칵타에(cactae) 조직, 리츠니스 알피나(Lychnis Alpina) 조직, 대황(레움 라바르바룸(Rheum rhabarbarum)) 조직, 호박 과육(쿠쿠르비타 페포(Cucurbita pepo)) 조직, 드라세나(아스파라가세아에(Asparagaceae)) 줄기 조직, 자주달개비(트라데스칸티아 비르기니아나(Tradescantia virginiana)) 줄기 조직, 아스파라거스(아스파라거스 오피시날리스(Asparagus officinalis)) 줄기 조직, 버섯(균류) 조직, 펜넬(포에니쿨룸 불가레(Foeniculum vulgare)) 조직, 장미(로사(Rosa)) 조직, 당근(다쿠스 카로타(Daucus carota)) 조직, 또는 배(포마세오우스(Pomaceous)) 조직을 포함할 수 있다. 식물 및 균류 조직들의 추가적인 실험예들은 여기에 전체적으로 참조로 포함되는 WO2017/136950(발명의 명칭: "식물들 및 균류들로부터의 탈세포화 세포벽 구조들 및 골격 물질들로서의 그 이용 (Decellularised Cell Wall Structures from Plants and Fungus and Use Thereof as Scaffold 물질들)")의 실험예 18에 기재되어 있다.
특정 실시예들에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 셀룰로오스계, 키틴(chitin)계, 키토산(chitosan)계, 리그닌(lignin)계, 리그난(lignan)계, 헤미셀룰로오스(hemicellulose)계, 펙틴(pectin)계, 또는 이들의 임의의 결합이 될 수 있다. 특정 실시예들에서, 상기 식물 또는 균류 조직은 사과 하이판시움(말루스 푸밀라) 조직, 양치류(모닐로피테스) 조직, 순무(브라시카 라파) 뿌리 조직, 은행나무 가지 조직, 쇠뜨기(에퀴세툼) 조직, 헤르모칼리스 혼성 잎 조직, 케일(브라시카 올레라세아) 줄기 조직, 침엽수 더글러스 전나무(슈도트수가 멘지에시이) 조직, 선인장 실과(피타야) 과육 조직, 마쿨라타 빙카 조직, 수생 연(넬룸보 누시페라) 조직, 튤립(툴리파 게스네리아나) 꽃잎조직, 플랜틴(무사 파라디시아카) 조직, 브로콜리(브라시카 올레라세아) 줄기 조직, 단풍잎(아세르 슈도플라타누스) 줄기 조직, 비트(베타 불가리스) 주근 조직, 파(알리움 세파) 조직, 난초(오르치다세아에) 조직, 순무(브라시카 라파) 줄기 조직, 리크(알리움 암펠로프라숨) 조직, 단풍(아세르) 나무 가지 조직, 셀러리(아피움 그라베올렌스) 조직, 파(알리움 세파) 줄기 조직, 소나무 조직, 알로에 베라 조직, 수박(시트룰루스 라나투스 변종 라나투스) 조직, 좀가시풀(리시마키아 눔물라리아) 조직, 칵타에 조직, 리츠니스 알피나 조직, 대황(레움 라바르바룸) 조직, 호박 과육(쿠쿠르비타 페포) 조직, 드라세나(아스파라가세아에) 줄기 조직, 자주달개비(트라데스칸티아 비르기니아나) 줄기 조직, 아스파라거스(아스파라거스 오피시날리스) 줄기 조직, 버섯(균류) 조직, 펜넬(포에니쿨룸 불가레) 조직, 장미(로사) 조직, 당근(다쿠스 카로타) 조직, 배(포마세오우스) 조직, 직접 유전자 변형에 의하거나 선택적 번식을 통해 유전적으로 변형된 조직, 또는 이들의 임의의 결합들으로부터의 조직을 포함할 수 있다.
또한 이해될 것인 바와 같이, 상기 식물 또는 균류 조직의 세포 물질들과 핵산들은 세포내 세포 소기관들(예를 들어, 엽록체, 미토콘드리아), 세포핵들, 세포 핵산들 및/또는 세포 단백질들과 같은 세포내 내용물들을 포함할 수 있다. 이들은 상기 식물 또는 균류 조직으로부터 및/또는 상기 골격 생체재료로부터 실질적으로 제거될 수 있거나, 부분적으로 제거될 수 있거나, 완전히 제거될 수 있다. 미량의 이러한 구성 성분들이 여전히 여기에 설명되는 탈세포화 식물 또는 균류 조직들 내에 존재할 수 있는 점이 이해될 것이다. 또한 이해될 수 있는 바와 같이, 여기서 탈세포화 식물 또는 균류 조직에 대한 언급은 상기 조직들의 식물 또는 균류 소스 내에서 발견되는 이러한 세포 물질들이 실질적으로 제거되었던 것을 반영하도록 의도된다. 이는 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직이 특정 실시예들에서 후속하여 도입되거나, 재도입되는 동물 또는 인간 세포들과 같이 대체로 임의의 종의 세포들, 세포 물질들 및/또는 핵산들을 함유할 수 있거나 포함할 수 있는 가능성을 미리 배제하지는 않는다.
다양한 방법들이 여기에 설명하는 바와 같은 탈세포화 식물 또는 균류 조직들을 생산하기 위해 이용될 수 있다. 실험예에 의하여, 특정 실시예들에서, 상기 탈세포화된 식물 또는 균류 조직은 열 충격, 세제로의 처리(예를 들어, SDS, 트리톤(Triton) X, EDA, 알칼리 처리, 산성, 이온성 세제, 비이온성 세제들 및 쌍성이온성 세제들), 삼투압 충격, 동결 건조, 물리적 용해(예를 들어, 정수압), 전기적 파괴(예를 들어, 비열적인 불가역성 전기천공), 또는 효소 소화, 또는 이들의 임의의 결합에 의해 탈세포화되었던 식물 또는 균류 조직(들)을 포함할 수 있다. 특정 실시예들에서, 생체재료들은 여기에 설명하는 바와 같이, 이에 한정되는 것은 아니지만, 열 충격(예를 들면, 급속 동결 융해), 화학적 처리(예를 들면, 세제들), 삼투압 충격(예를 들면, 증류수), 동결 건조, 물리적 용해(예를 들면, 가압 처리), 전기적 파괴 및/또는 효소 소화를 포함하는 몇 가지 접근 방식들(개별적으로 또는 결합으로) 중에서 임의의 것을 포함할 수 있는 탈세포화(탈세포화) 프로세스들을 채용하여 식물들 및/또는 균류들로부터 얻어질 수 있다.
특정 실시예들에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 세제 또는 계면활성제로의 처리에 의해 탈세포화되었던 식물 또는 균류 조직을 포함할 수 있다. 세제들의 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 도데실 황산나트륨(sodium dodecyl sulphate: SDS), 트리톤 X, EDA, 알칼리 처리, 산성, 이온성 세제들, 비이온성 세제들, 그리고 쌍성이온성 세제들을 포함할 수 있다.
또 다른 실시예들에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 SDS로의 처리에 의해 탈세포화되었던 식물 또는 균류 조직을 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 잔여 SDS는 수성 2가 염 용액으로의 세척에 의해 상기 식물 또는 균류 조직으로부터 제거될 수 있다. 상기 수성 2가 염 용액은 용액/골격 외부의 SDS 미셀(micelle)들을 포함하는 염 잔여물을 침전/압쇄시키는 데 사용될 수 있으며, dH2O, 아세트산 또는 디메틸(dimethylsulfoxide: DMSO) 처리, 또는 초음파 처리가 상기 염 잔여물이나 SDS 미셀들을 제거하는 데 이용될 수 있다. 특정 실시예들에서, 상기 수성 2가 염 용액의 2가 염은, 예를 들면, MgCl2 또는 CaCl2를 포함할 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 식물 또는 균류 조직은 물, 에탄올, 또는 다른 적합한 유기 용매 내의 0.01 내지 10%, 예를 들면, 약 0.1% 내지 약 1%, 또는, 예를 들면, 약 0.1% SDS 혹은 약 1% SDS의 SDS 용액으로의 처리에 의해 탈세포화될 수 있으며, 잔여 SDS는 dH2O 내의 배양이 수반되는 약 100mM 의 농도로 수성 CaCl2 용액을 이용하여 제거될 수 있었다. 특정 실시예들에서, 상기 SDS 용액은 탈세포화(decellularization)를 가능하게 할 수 있는 0.1% 보다 높은 농도가 될 수 있으며, 잔여 SDS를 제거하기 위해 증가된 세척에 의해 구현될 수 있다. 특정한 실시예들에서, 상기 식물 또는 균류 조직은 물 내의 약 0.1% SDS의 SDS 용액으로의 처리에 의해 탈세포화될 수 있으며, 상기 잔여 SDS는 dH2O 내에서의 배양이 수반되어 약 100mM의 농도로 수성 CaCl2 용액을 사용하여 제거될 수 있었다
여기에 설명하는 바와 같은 탈세포화 식물 또는 균류 조직을 생성하기 위해 적용될 수 있는 탈세포화 연구 계획들의 다른 실험예들은 여기에 전체적으로 참조로 포함되는 WO2017/136950(발명의 명칭: "식물들 및 균류들로부터의 탈세포화 세포벽 구조들 및 골격 물질들로서의 그 이용(Decellularised Cell Wall Structures from Plants and Fungus and Use Thereof as Scaffold Materials)")에서 찾아볼 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 키틴계, 키토산계, 리그노셀룰로오스계, 또는 셀룰로오스계가 될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 식물의 잎 조직, 뿌리, 과육, 하이판시움 또는 펄프 구조들로부터 유래될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 상추, 당근, 사과, 또는 배, 또는 이들의 임의의 결합으로부터 유래될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중에서 임의의 것은 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 균질화될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 건조되고, 분쇄가 수행되며, 선택적으로 재구성되거나 재수화(rehydrate)될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 단일의 구조 세포들의 크기 또는 보다 작은 입자들로 분해될 수 있다. 특정 실시예들에서, 단일 구조 세포들은 상기 식물 또는 균류 조직의 확장된 3D 구조로부터 유래될 수 있고, 단리된 구조 세포들을 포함할 수 있으며, 상기 구조 세포들은 도 7에 도시한 바와 같이 통상적으로 중공형 셀 또는 포켓을 모방하는 3차원 구조를 가진다. 이해될 수 있는 바와 같이, 이러한 구조들은 통상적으로 셀룰로오스 및/또는 리그닌계 구조들과 같이 리그노셀룰로오스 물질들을 포함할 수 있다. 특정 실시예들에서, 이러한 구조들이, 예를 들면, 키틴 및/또는 펙틴과 같은 다른 기본 구조 블록들을 포함할 수 있는 점이 이해될 것이다. 특정 실시예들에서, 상기 단일의 구조 세포들은 도 18 및 도 19에 도시한 바와 같이 플레이크(flake)들과 같은 보다 작은 입자들로 분해(예를 들면, 분쇄)될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중에서 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 더말 필러는 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직을 위한 히드로겔, 기질(matrix), 또는 운반체 유체를 더 포함할 수 있다. 특정 실시예들에서, 상기 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체는 PBS(식염수(saline)), 히알루론산(hyaluronic acid)(교차 결합(cross-link)되거나 교차 결합되지 않음), 알긴산염(alginate), 콜라겐(collagen), 플루론산(pluronic acid)(예를 들어, 플루로닉(Pluronic) F 127), 한천(agar), 아가로오스(agarose), 피브린(fibrin), 칼슘 히드록시아파타이트(calcium hydroxyapatite), 폴리(Poly)-L-젖산(lactic acid), 자가 지방(autologous fat), 실리콘(silicone), 덱스트란(dextran), 메틸셀룰로오스(methylcellulose), 용해되고 재생된 셀룰로오스, 또는 이들의 임의의 결합들을 포함할 수 있다.
여기에 사용되는 바에 있어서, "용해되고 재생된 셀룰로오스(dissolved regenerated cellulose)"라는 표현이 용해되었고, 후속하여 용매 교환 및 상기 식물 또는 균류 조직과의 혼합을 통해 "재생되었던" 셀룰로오스를 지칭하는 점에 유의한다. 임의의 적합한 용매가 상기 셀룰로오스를 용해시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 일 실시예에서, 상기 셀룰로오스는 LiCl 및 디메틸 아세트아미드(dimethyl acetamide: DMAc) 용액을 이용하여 용해될 수 있다.
특정 실시예들에서, 이와 같은 히드로겔(들), 기질(들), 또는 운반체 유체(들)는, 예를 들면, 생물학적 기원(예를 들어, 천연 단백질들), 합성 폴리머들, 또는 자연적 발생적으로 생성되는 폴리머들 합성 유사체들이 될 수 있다.
히드로겔(들), 기질(들) 및/또는 운반체 유체(들)의 추가적인 논의들과 실험예들은 각기 전체적으로 여기에 참조로 포함되는 Nguyen 등의 "Cosmetic Medicine: Facial Resurfacing and Injectables"(Plast Reconstr Surg. 129, 142e(2012)) 및 Luebberding 등의 "Critical Appraisal of the Safety of Demal Fillers: A Primer for Clinicians"(Curr Derm Rep. 2, 150(2013))에서 찾아볼 수 있다.
특정 실시예들에서, 히드로겔(들), 기질(들), 또는 운반체 유체(들)는, 예를 들면, 실질적으로 균일한 분산뿐만 아니라 작은 게이지의 바늘을 통한 주사를 가능하게 하기 위하여 상기 더말 필러 입자들을 재현탁시키도록 이용될 수 있다.
특정 실시예들에서, 상기 더말 필러의 점성은 원하는 경우에 조절될 수 있다. 특정 실시예들에서, 예를 들면, 낮은 점도는 보다 용이한 주사를 가능하게 할 수 있는 반면, 높은 점도는 균일한 입자 배치를 유지할 수 있거나 및/또는 보다 긴 기간 동안 체적을 유지할 수 있다. 특정 실시예들에서, 점도 값들은 범위 내에 잇을 수 있거나 변화될 수 있다. 예를 들면, 특정 실험예들에서, 식염수 운반체는 약 1cP를 제공할 수 있는 반면, 보다 점성의 운반체 유체들은 약 3 x 106cP(벨라필(Bellafill)과 같은 상업 제품들에서와 같은), 또는 그 이상과 같이 보다 큰 점도를 제공할 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 더말 필러는 약 500,000cp 보다 작은 점도를 가질 수 있다. 특정 실시예들에서, 상기 더말 필러는 약 100,000cp 내지 약 500,000cp의 범위 이내의 점도를 가질 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 더말 필러는 건조되거나, 수화될 수 있다. 특정 실시예들에서, 상기 더말 필러는 건조되거나 수화된 형태를 제공될 수 있으며, 이는, 예를 들면, 사용 이전에 물, 히드로겔, 또는 다른 운반체 유체 내의 재구성을 위한 것이 될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중에서 임의의 것의 실시예에서, 상기 더말 필러는 리도카인(lidocaine) 또는 다른 마취제(anesthetic)를 포함할 수 있다.
여기에 설명되는 더말 필러들의 특정 실시예들에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은, 예를 들면, 규칙적이거나 불규칙적인 3D 또는 2D 형상, 예를 들어 불규칙하거나, 정방형이거나, 원형의 형상을 가질 수 있는 플레이크와 같은 구조와 같은 대체로 임의의 적합한 형상을 가질 수 있는 입자들로 분해될 수 있다. 비록 일부 경우들(원형의 구조를 위한 것과 같은)에서 이들이 균등하거나 균등에 가까울 수 있지만, 정해진 형상은 통상적으로 최소 및 최대 직경 또는 페렛(feret) 직경을 가질 수 있다. 바람직하게는, 특정 실시예들에서, 상기 입자들, 또는 적어도 대두분의 상기 입자들은 세포 흡수 또는 세포들에 의한 포식 작용(phagocytosis)을 회피하거나 방지하기 위해 충분히 크게 크기/형상이 조절될 수 있다. 이에 따라, 특정 실시예들에서, 직경이 20㎛ 아래인 입자들의 분포(규칙적인 직경, 최소 페렛 직경 및/또는 최대 페렛 직경의 관점이 될 수 있던지)는 세포 흡수 및/또는 포식 작용이 바람직하지 않은 경우에서 회피될 수 있다.
여기에 설명되는 더말 필러들의 특정 실시예들에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 불규칙적인 3D 형상들을 가지거나 및/또는 구형이 아닌 얇은 플레이크와 같은 구조들인 입자들로 분해될 수 있다. 특정 실시예들에서, 상기 플레이크와 같은 구조들은 약 0.01㎛ 내지 약 100㎛, 예를 들면, 약 0.1㎛의 두께를 가질 수 있다.
여기에 설명되는 더말 필러들의 일부 실시예들에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 20㎛ 내지 약 500㎛위 범위 이내의 크기, 직경, 또는 페렛 직경을 가지는 입자들로 분해될 수 있다.
특정 실시예들에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 세포나 세포들에 의해 포식되지 않도록 하기 위해 충분하게 큰 크기를 가지는 입자들로 분해될 수 있거나(바람직하게는, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 적어도 약 20㎛의 크기, 직경, 또는 최소 페렛 직경을 가지는 입자들로 분해될 수 있음), 약 200㎛ 보다 작은 크기, 직경, 또는 최대 페렛 직경을 가지는 입자들로 분해될 수 있거나, 약 20㎛ 내지 약 200㎛의 범위 이내의 크기, 직경 또는 페렛 직경을 가지는 입자들로 분해될 수 있거나, 약 30㎛ 내지 약 100㎛ 이내의 피크를 가지는 입자 크기, 직경 또는 페렛 직경 분포를 가지는 입자들로 분해될 수 있거나, 약 30㎛ 내지 약 100㎛의 범위 이내의 평균 입자 크기, 직경, 또는 페렛 직경을 가지는 입자들로 분해될 수 있거나, 이들의 임의의 결합들로 분해될 수 있다.
다른 실시예, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 300㎛ 보다 작은 크기, 직경, 또는 최대 페렛 직경을 가지는 입자들로 분해될 수 있거나, 약 100㎛ 내지 약 300㎛의 범위 이내의 크기, 직경, 또는 페렛 직경을 가지는 입자들로 분해될 수 있거나, 약 100㎛ 내지 약 300㎛ 이내의 피크(peak)를 가지는 입자 크기, 직경 또는 페렛 직경 분포를 가지는 입자들로 분해될 수 있거나, 약 100㎛ 내지 약 300㎛의 범위 이내의 평균 입자 크기, 직경, 또는 페렛 직경을 가지는 입자들로 분해될 수 있거나, 이들의 임의의 결합들로 분해될 수 있다.
여기에 설명되는 더말 필러들의 또 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 200㎛2 내지 약 3000㎛2의 범위 이내, 또는 약 200㎛2 내지 약 300㎛2의 범위 이내의 평균 투영(projected) 입자 면적을 가지는 입자들로 분해될 수 있거나, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 0.1㎛-1 내지 100㎛-1의 표면적 대 체적 비율을 가지는 입자들로 분해될 수 있거나, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 4 x 105입자들/㎖ 내지 약 7 x 109입자들/㎖의 충전 밀도(packing density)를 가지는 입자들로 분해될 수 있거나, 이들의 임의의 결합들로 분해될 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 살균될 수 있다. 앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 더말 필러는 살균될 수 있다. 특정 실시예들에서, 상기 살균은 감마 살균(gamma sterilization)에 의한 것과 같이 방사선에 의해 이루어질 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 식물 또는 균류 조직은 머서리화될 수 있다. 이해될 수 있는 바와 같이, 상기 식물 또는 균류 조직의 머서리화(mercerization)는 상기 식물 또는 균류 조직을 조직/세포 구성 성분들(단일의 구조 세포들, 구조 세포들의 그룹들, 또는 이들 모두를 포함)로 분해한다. 특정 실시예들에서, 상기 머서리화는 알칼리성/염기성 용액 및 과산화물(peroxide)을 채용할 수 있다. 특정 실시예들에서, 하나 이상의 처리 또는 용액이 동시에 또는 순차적으로 이용될 수 있다.
특정 실시예들에서, 머서리화는 염기 용액으로의 적어도 하나의 처리를 포함할 수 있다. 이해될 수 있는 바와 같이, 상기 염기 용액은 대체로 온전한 조직 구조들을 추출하기 위해 삼투압 충격(osmotic shock) 및/또는 수소 결합의 파괴 및/또는 폴리머 결정 구조가 가능한 임의의 적합한 염기와 같이 임의의 적합한 염기를 포함할 수 있다. 이해될 수 있는 바와 같이, 특히 더말 필러 적용들을 위해, 상기 염기는 원하는 경우에, 예를 들면, 생리학적으로 발생되거나, 용이하게 세척 제거되거나, 유해하지 않거나, 이들의 결합이 되도록 선택될 수 있다. 특정 실시예들에서, 상기 염기는 NaOH, KOH, 또는 이들의 결합을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 염기는 상기 염기 용액을 형성하도록 적합한 용매 내에 용해/혼합 될 수 있다. 통상적으로, 비록 다른 용매들, 또는 영매들의 결합들(예를 들면, 물 및 에탄올의 혼합물과 같은)도 고려될 수 있지만, 상기 용매는 물을 포함할 수 있다. 상기 염기 용액은 약 0.1M 내지 10M, 또는 그 사이의 임의의 농도(선택적으로, 0.1에 가장 가까운 수치인), 또는 이들 농도들 중에서 임의의 둘 사이에 걸치는 임의의 하위 범위의 염기 농도를 포함할 수 있다. 특정 실시예들에서, 상기 염기 농도는 약 0.5M 내지 3M, 또는 이들 사이의 임의의 값(선택적으로, 0.1에 가장 가까운 수치임), 또는 이들 농도들 중에서 임의의 둘 사이에 걸치는 임의의 하위 범위가 될 수 있다. 실험예에 의해, 특정 실시예들에서, 상기 염기 용액은 약 0.5M-3M의 농도를 가지는 NaOH의 수성 용액을 포함할 수 있다. 이해될 수 있는 바와 같이, 상기 염기 용액뿐만 아니라 상기 처리 조건들(즉, 가열, 교반)은 원할 경우에 추출되고, 사용되는 등의 식물 또는 균류 조직이 되도록 조정될 수 있다.
특정 실시예들에서, 염기들은 탄산염(carbonate)들, 질산염(nitrate)들, 인산염(phosphate)들, 황산염(sulfate)들, 암모니아, 수산화나트륨, 수산화칼슘, 수산화마그네슘, 수산화칼륨, 수산화리튬, 수산화아연, 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 부틸 리튬(butyl lithium), 아지드화나트륨(sodium azide), 나트륨아미드(sodium aminde), 수소화나트륨(sodium hydride), 수소화붕소나트륨(sodium borohydride), 또는 리튬 디이소프로필아민(lithium diisopropylamine)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 염기를 포함할 수 있다. 상기 염기에 따라, 중화(neutralization) 및/또는 세척이, 예를 들면, 원하지 않는 오염을 방지하기 위해 잔여 염기 및 다른 시약들을 제거하도록 수행될 수 있다.
바람직한 실시예들에서, 상기 머서리화는 가열과 함께 수산화나트륨 및 과산화수소를 사용하는 상기 식물 또는 균류 조직(바람직하게는, 탈세포화 식물 또는 균류 조직)의 처리를 포함할 수 있다.
그러나, 다른 추출 기술들이 이용될 수 있고, 고려될 수 있는 점에 유의한다. 예를 들면, 다른 실시예에서, 상기 식물 및/또는 균류 조직은 불리어질 수 있다. 이해될 수 있는 바와 같이, 머서리화와 마찬가지로 상기 식물 또는 균류 조직의 온침(maceration)은 상기 식물 또는 균류 조직을 into 조직/세포 구성 성분들(단일 구조 세포들, 구조 세포들의 그룹들, 또는 이들 모두를 포함)로 분해한다. 그러나 머서리화와는 달리, 온침은 대체로 염기성 용액보다는 산성 용액의 사용을 수반한다. 따라서 온침은 염기 용해성 리그닌 구성 성분들 보다는 특정한 산 용해성 리그닌 구성 성분들을 제거할 수 있으며, 이에 따라, 예를 들면, 다른 리그닌 함량을 가지는 구조 세포들을 제공할 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중에서 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 더말 필러는 피부 아래 주사, 깊은 피부 주사, 피하 주사(예를 들어, 피하 지방 주사), 또는 이들의 임의의 결합들을 위해 조제될 수 있다. 또 다른 실시예, 상기 더말 필러는 주사기 또는 주사 장치 내에 또는 이들과 함께 제공될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 연조직 필러로서나 재건 수술을 위해 또는 이들 모두를 위해, 필요로 하는 대상의 미용 외관(cosmetic appearance)을 개선하기 위해, 필요로 하는 대상에서 조직 체적을 증가시키거나, 주름들을 펴거나, 또는 이들 모두를 위해, 또는 이들의 임의의 결합들을 위해 여기에 설명하는 바와 같은 더말 필러 또는 더말 필러들 중에서 임의의 것의 용도가 여기에 제공된다.
또 다른 실시예에서, 필요로 하는 대상에서 미용 외관을 개선하거나, 조직 체적을 증가시키거나, 주름들을 펴거나, 또는 이들의 임의의 결합들을 위한 방법이 여기에 제공되며, 상기 방법은,
여기에 설명하는 바와 같은 더말 필러 또는 더말 필러들 중에서 임의의 것을 필요로 하는 영역에 투여하거나 주사하는 단계를 포함하며,
이에 따라 상기 대상의 미용 외관을 개선하거나, 조직 체적을 증가시키거나, 주름들을 펴거나, 또는 이들의 임의의 결합들을 수행한다.
특정 실시예들에서, 상기 대상의 고유 세포들은 투여/주사/이식에 후속하여 상기 더말 필러에 침윤될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 상기 더말 필러는 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직이, 예를 들면, 적어도 약 3개월, 적어도 약 4개월, 적어도 약 5개월, 또는 적어도 약 6개월에 걸쳐 상기 대상 내에 실질적으로 온전하게 남을 수 있도록 비재흡수성이 될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 상기 더말 필러는 이에 대한 하나 또는 그 이상의 효소들의 첨가를 통해 분해될 수 있다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 더말 필러들은 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직이 기간 동안에 상기 대상 내에 실질적으로 온전하게 남을 수 있고, 일부 경우들에서, 영구적으로 간주될 수 있도록 비재흡수성이 될 수 있다. 그러나 일부 환경들에서, 상기 더말 필러들을 제거하는 것이 바람직할 수 있는 점이 이해될 것이다. 따라서 이러한 실시예들에서, 상기 더말 필러들은 상기 더말 필러들이 투여되거나 주사되는 대상에 의해 생성되지 않는 하나 또는 그 이상의 효소들을 이용하여 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직들을 분해함으로써 제거될 수 있다.
특정 실시예들에서, 상기 더말 필러를 분해하는 데 사용되는 상기 하나 또는 그 이상의 효소들은 그 탈세포화 식물 또는 균류 조직에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들면, 여기서 앞서 설명한 바와 같이, 상기 더말 필러들은 키틴계, 키토산계, 리그노셀룰로오스계, 또는 셀룰로오스계인 탈세포화 식물 또는 균류 조직을 포함할 수 있다. 상기 하나 또는 그 이상의 효소들이 이에 따라 키틴, 키토산, 리그노셀룰로오스, 또는 셀룰로오스를 분해하기 위해 선택될 수 있다. 추가 실험예와 같이, 상기 식물 또는 균류 조직이 셀룰로오스계일 경우, 상기 하나 또는 그 이상의 효소들은 셀룰라아제(cellulase)를 포함할 수 있다.
특정 실시예들에서, 상기 하나 또는 그 이상의 효소들은 다른 소스들로부터의 동일한 유형의 효소가 될 수 있다. 예를 들면, 상기 하나 또는 그 이상의 효소들은 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger)로부터의 셀룰라아제 및 트리코데르마 종(Trichoderma sp.)으로부터의 셀룰라아제를 포함할 수 있다. 특정 실시예들에서, 상기 하나 또는 그 이상의 효소들은 다른 효소들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 하나 또는 그 이상의 효소들은 셀룰라아제 및 펙티나아제(pectinase)(예를 들어, 아스페르길루스 니게르로부터)를 포함할 수 있다. 다른 유형의 효소들이 상기 더말 필러에 사용된 탈세포화 식물 또는 균류 조직을 기초로 하여 선택될 수 있다. 또한, 상기 더말 필러에 사용된 탈세포화 식물 또는 균류 조직의 유형은 다른 소스들로부터 유래된 효소들 및/또는 이의 분해를 위한 다른 유형의 효소들의 비율에 영향을 미칠 수 있다. 다른 소스들로부터 유래된 둘의 효소들 및/또는 다른 유형의 효소들이 선택되는 특정 실시예들에서, 예를 들면, 상기 효소들은 약 25：75 내지 약 50：50의 비율로 사용될 수 있다.
특정 실시예들에서, 상기 하나 또는 그 이상의 효소들은 완충 용액과 같은 용액 내에 제공될 수 있다. 상기 완충 용액은 PBS 완충 용액, 아세트산나트륨 완충 용액, 시트르산나트륨 완충 용액, 또는 임의의 다른 적합한 완충 용액이 될 수 있다. 상기 하나 또는 그 이상의 효소들은 효소(들)：완충액의 약 25：75 내지 약 75：25의 비율로 상기 완충 용액 내에 제공될 수 있다.
상기 하나 또는 그 이상의 효소들은 임의의 적합한 기술을 이용하여 상기 더말 필러들을 분해하도록 투여될 수 있다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 효소들의 용액이 대상에 이전에 투여되었던 더말 필러 내로 주사될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 비재흡수성 더말 필러를 제조하기 위한 방법이 여기에 제공되며, 상기 방법은,
식물 또는 균류 조직을 제공하는 단계;
조직의 세포 물질들 및 핵산들이 제거된 입자들을 제공하도록 상기 식물 또는 균류 조직을 탈세포화하고, 크기를 감소시키는 단계; 및
선택적으로 상기 입자들을 살균하는 단계를 포함하며,
이에 따라 상기 비재흡수성 더말 필러를 제공한다.
특정 실시예들에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 키틴계, 키토산계, 리그노셀룰로오스계, 또는 셀룰로오스계가 될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 식물의 잎 조직, 뿌리, 과육, 하이판시움 또는 펄프 구조들로부터 유래될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 상추, 당근, 사과, 배, 또는 이들의 임의의 결합으로부터 유래될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 상기 입자들을 제공하기 위한 기계적 크기 감소를 포함할 수 있으며, 선택적으로 상기 기계적 크기 감소는 건조되거나, 냉동 건조되거나, 또는 동결 건조된 물질들에 대해 수행될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 기계적 크기 감소는 상기 입자들을 제공하도록 탈세포화하는 단계 이전 또는 이후에 상기 식물 또는 균류 조직을 압쇄(crushing), 압출(extrusion), 분쇄(grinding), 제분(milling), 초음파처리(ultrasonication), 전기방사(electrospinning), 화학적 용해(chemical dissolution), 효소 파괴(enzymatic breakdown), 또는 전단(shearing)하는 단계를 포함할 수 있다.
특정 실시예들에서, 상기 기계적 크기 감소는 재구성/재생될 수 있는 용해된 물질로부터 입자들을 몰딩 및 성형하는 단계(예를 들면, 구체화 및/또는 에멀션(emulsion)들)를 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 상기 식물 또는 균류 조직을 건조시키는 단계, 상기 입자들을 제공하도록 상기 건조된 식물 또는 균류 조직에 기계적 크기 감소를 수행하는 단계, 그리고 선택적으로, 상기 입자들을 재구성하는 단계, 재현탁하는 단계, 또는 재수화하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 실시예들에서, 상기 재구성하는 단계, 재현탁하는 단계 또는 재수화하는 단계는 물, 식염수, 히드로겔, 또는 다른 운반체 유체를 도입하는 단계 또는 이들과 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 단일의 구조 세포들, 또는 보다 작은 크기의 입자들을 제공할 수 있다.
특정 실시예들에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 상기 입자들을 제공하거나, 상기 입자들을 제공하도록 다른 처리가 선택적으로 수행될 수 있는 단일의 구조 세포들을 제공하기 위해 화학적 온침과 같은 온침을 포함할 수 있다. 머서리화 접근 방법들의 실험예들은 여기에 전체적으로 참조로 포함되는 2020년 5월 14일에 출원된 PCT 국제 특허 출원 PCT/CA2020/050655호(발명의 명칭："복합 생체재료들(Composite Biomaterials)")에 기재되어 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 상기 입자들을 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체로 조제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 특정 실시예들에서, 상기 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체는 PBS, 식염수, 히알루론산(교차 결합되거나 교차 결합되지 않음), 알긴산염, 콜라겐, 플루론산(예를 들어, 플루로닉 F 127), 한천, 아가로오스, 피브린, 칼슘 히드록시아파타이트, 폴리-L-젖산, 자가 지방, 실리콘, 덱스트란, 메틸셀룰로오스, 용해되고 재생된 셀룰로오스, 또는 이들의 임의의 결합들을 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 더말 필러 건조되거나 수화된 형태로 제공될 수 있다. 앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 리도카인 또는 다른 마취제로 조제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 불규칙한 3D 형상들 및/또는 구형이 아닌 얇은 플레이크와 같은 구조들을 가지는 입자들을 제공할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 플레이크와 같은 구조들은 약 0.01㎛ 내지 약 100㎛, 예를 들면 약 0.1㎛의 두께를 가질 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 목표 크기를 가지는 입자들, 목표 크기 범위 이내의 입자들, 또는 목표 크기 분포를 가지는 입자들을 얻기 위해 압출, 여과, 원심 분리, 또는 다른 크기 분리를 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시예들에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 약 20㎛ 내지 약 1000㎛의 범위 이내의 크기, 직경, 또는 페렛 직경을 가지는 입자들을 제공할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 세포 또는 세포들에 의해 포식되지 않기 위해 충분히 큰 크기를 가지는 입자들을 제공할 수 있거나(바람직하게는, 상기 크기를 감소시키는 단계는 적어도 약 20㎛의 크기, 직경, 또는 최소 페렛 직경을 가지는 입자들을 제공함 수 있거나), 약 200 보다 작은 크기, 직경, 또는 최대 페렛 직경을 가지는 입자들을 제공할 수 있거나, 약 20㎛ 내지 약 1000㎛의 범위 이내의 크기, 직경, 또는 페렛 직경을 가지는 입자들을 제공할 수 있거나, 약 30㎛ 내지 약 100㎛ 이내의 피크를 갖는 입자 크기, 직경, 또는 페렛 직경 분포를 가지는 입자들을 제공할 수 있거나, 약 30㎛ 내지 약 100㎛의 범위 이내의 평균 입자 크기, 직경, 또는 페렛 직경을 가지는 입자들을 제공할 수 있거나, 이들의 임의의 결합들을 제공할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 약 300㎛ 보다 작은 크기, 직경, 또는 최대 페렛 직경을 가지는 입자들을 제공할 수 있거나, 약 100㎛ 내지 약 300㎛의 범위 이내의 크기, 직경, 또는 페렛 직경 분포를 가지는 입자들을 제공할 수 있거나, 약 100㎛ 내지 약 300㎛ 이내의 피크를 갖는 입자 크기, 직경, 또는 페렛 직경 분포를 가지는 입자들을 제공할 수 있거나, 약 100㎛ 내지 약 300㎛의 범위 이내의 평균 입자 크기, 직경, 또는 페렛 직경을 가지는 입자들을 제공할 수 있거나, 이들의 임의의 결합들을 제공할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 약 200㎛2 내지 약 3000㎛2의 범위 이내, 또는 약 200㎛2 내지 약 300㎛2의 범위 이내의 평균 투영 입자 면적을 가지는 입자들을 제공할 수 있으며, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 0.1㎛-1 내지 100㎛-1의 표면적 대 체적 비율을 가지는 입자들로 분해될 수 있거나, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 4 x 105입자들/㎖ 내지 약 7 x 109입자들/㎖의 충전 밀도를 가지는 입자들로 분해될 수 있거나, 이들의 임의의 결합들로 분해될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 상위 임계값 크기(upper threshold size) 아래의 입자들을 얻기 위해 동시에 필터를 통해 결과적인 입자들을 통과시키면서 분쇄하는 단계를 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 방법은 하위 임계값 크기(lower threshold size)보다 작은 입자들을 제거하고, 상기 하위 임계값 크기보다 큰 입자들을 얻기 위해 여과, 분별 또는 평형 원심 분리, 또는 체가름(sieving)하는 단계를 더 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 여과 또는 체가름하는 단계는 자동화된 습식 체를 이용하여 수행될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 목표 크기를 가지는 입자들, 목표 크기 범위 이내의 입자들, 또는 목표 크기 분포를 가지는 입자들을 얻기 위해 분별 또는 평형 원심 분리를 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 방법은 제1 주사기 또는 용기(vessel)에 물 또는 완충액(예를 들어, 식염수)과 같은 유체 내의 입자들을 적재하고, 제2 주사기 또는 용기에 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체를 적재하여 상기 입자들을 상기 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체로 조제하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 제1 및 제2 주사기들 또는 용기들은 유체 연통되고, 상기 주사기들 또는 용기들의 내용물들을 상기 제1 및 제2 주사기들 또는 용기들 사이에서 전후로 통과시켜 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 입자들을 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체로 조제하는 단계는 유성 혼합기(planetary mixer), 디스펜서(disperser), 고속 전단 혼합기(high-shear mixer), 니더(kneader), 다축 혼합기(multi-shaft mixer), 리본 패들 분쇄기(ribbon-paddle blender), 정적 혼합기(static mixer), 몰 밀(roll mill), 균질기(homogenizer), 응집(agglomeration), 이들과 유사한 것들, 또는 이들의 임의의 결합을 이용하여 상기 입자들을 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체와 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시예들에서, 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체와 혼합하는 단계 이전, 그 동안, 또는 이후에 응집된 물질을 제거하는 것이 유용할 수 있다. 예를 들면, 일 실시예에서, 상기 입자들은 정적(static 크로스-해치 혼합기(cross-hatch mixer) 또는 메시(mesh)와 같은 크기 배제 혼합기(size exclusion mixer)로 상기 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체와 혼합될 수 있다. 이러한 실시예들은 응집된 물질(예를 들어, 응집된 입자들)을 제거, 배제, 또는 파괴하면서 상기 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체와 상기 입자들의 혼합을 가능하게 할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 상기 탈세포화하는 단계 이전 또는 이후에 상기 식물 또는 균류 조직을 살균하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 상기 더말 필러를 살균하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 실시예들에서, 상기 살균은 감마 살균에 의해 이루어질 수 있다. 다른 실시예들에서, 상기 살균은 고압 살균(autoclaving)에 의해 이루어질 수 있다.
일부 실시예들에서, 복수의 살균들이 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 살균은 제1 살균 및 제2 살균을 포함할 수 있다. 첫 번째 살균은 열처리(예를 들어, 고압 살균)가 될 수 있고, 두 번째 살균은 감마 방사선, 고압 살균 및 이들과 유사한 것들에 의한 살균이 될 수 있다. 복수의 살균들은 상기 물질들의 생물학적 부담(bioburden)을 감소시키기 위해 유용할 수 있다. 또한, 열처리인 첫 번째 살균을 채용하는 것은 상기 물질들의 수화 정점지속(hydration plateau) 레벨들을 조절할 수 있다. 인지될 수 있는 바와 같이, 상기 수화 정점지속 레벨들의 조절은 본 발명의 더말 필러들의 입자들에 의해 유지되는 양의 용매가 조절되거나 및/또는 살균되게 할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 상기 식물 또는 균류 조직을 머서리화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기에 설명하는 바와 같이, 상기 식물 또는 균류 조직(바람직하게는 탈세포화 식물 또는 균류 조직)의 머서리화는 상기 식물 또는 균류 조직을 조직/세포 구성 성분들(단일의 구조 세포들, 구조 세포들의 그룹들, 또는 이들 모두를 포함)로 분해한다. 특정 실시예들에서, 상기 머서리화는 알칼리성/염기성 용액 및 과산화물을 적용할 수 있다. 특정 실시예들에서, 하나 이상의 처리 또는 용액이 동시에 또는 순차적으로 사용될 수 있다. 특정 실시예들에서, 머서리화가 식물 또는 균류 조직에 수행될 수 있고 탈세포화가 그 이후에 수행될 수 있거나, 머서리화가 식물 또는 균류 조직에 수행될 수 있고 탈세포화를 동시에 제공하기 위해 머서리화 조건들이 선택될 수 있는 점이 고려된다. 그러나 여기에 설명하는 바와 같이, 이미 이전에 탈세포화되었던 식물 또는 균류 조직에 수행되는 머서리화가 바람직하다.
특정 실시예들에서, 머서리화는 염기 용액으로의 적어도 하나의 처리를 포함할 수 있다. 이해될 수 있는 바와 같이, 상기 염기 용액은 대체로 온전한 조직 구조들을 추출하기 위해 삼투압 충격 및/또는 수소 결합의 파괴 및/또는 폴리머 결정 구조가 가능한 임의의 적합한 염기와 같은 임의의 적합한 염기를 포함할 수 있다. 이해될 수 있는 바와 같이, 특히 더말 필러 적용들을 위해 상기 염기는 원할 경우에, 예를 들면, 생리학적으로 발생되거나, 용이하게 세척 제거되거나, 유해하지 않거나, 이들의 임의의 결합으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시예들에서, 상기 염기는 NaOH, KOH, 또는 이들의 결합을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 염기는 상기 염기 용액을 형성하도록 적합한 용해 내에 용해/혼합될 수 있다. 비록 다른 용매들 또는 용매들의 결합들(예를 들면, 물 및 에탄올의 혼합물과 같은)도 고려될 수 있지만 상기 용매는 통상적으로 물을 포함할 수 있다. 통상적으로, 상기 염기 용액은 약 0.1M 내지 10M, 또는 그 사이의 임의의 농도(선택적으로, 0.1에 가장 가까운 수치인), 또는 이들 농도들 중에서 임의의 둘 사이에 걸치는 임의의 하위 범위의 염기 농도를 포함할 수 있다. 특정 실시예들에서, 상기 염기 농도는 약 0.5M 내지 3M, 또는 이들 사이의 임의의 값(선택적으로, 0.1에 가장 가까운 수치임), 또는 이들 농도들 중에서 임의의 둘 사이에 걸치는 임의의 하위 범위가 될 수 있다. 실험예에 의해, 특정 실시예들에서, 상기 염기 용액은 약 0.5M-3M의 농도를 가지는 NaOH의 수성 용액을 포함할 수 있다. 이해될 수 있는 바와 같이, 상기 염기 용액뿐만 아니라 상기 처리 조건들(즉, 가열, 교반)은 원할 경우에 추출되고, 사용되는 등의 식물 또는 균류 조직이 되도록 조정될 수 있다.
특정 실시예들에서, 염기들은 탄산염들, 질산염들, 인산염들, 황산염들, 암모니아, 수산화나트륨, 수산화칼슘, 수산화마그네슘, 수산화칼륨, 수산화리튬, 수산화아연, 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 부틸 리튬, 아지드화나트륨, 나트륨아미드, 수소화나트륨, 수소화붕소나트륨, 또는 리튬 디이소프로필아민으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 염기를 포함할 수 있다. 상기 염기에 따라, 중화 및/또는 세척이, 예를 들면, 원하지 않는 오염을 방지하기 위해 잔여 염기 및 다른 시약들을 제거하도록 수행될 수 있다.
바람직한 실시예들에서, 상기 머서리화는 가열과 함께 수산화나트륨 및 과산화수소를 사용하는 식물 또는 균류 조직(바람직하게는 탈세포화 식물 또는 균류 조직)의 처리를 포함할 수 있다.
앞서의 방법의 특정 실시예들에서, 상기 머서리화는 염기 및 과산화물, 바람직하게는 염기로서 수산화나트륨 또는 다른 수산화물 및 과산화물로서 과산화수소로의 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직의 처리를 포함할 수 있다. 머서리화는 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직을 이의 리그노셀룰로오스(lignocellulose) 구조들을 파괴하지 않고 단일의 구조 세포들, 구조 세포들의 그룹들, 또는 이들 모두로 화학적으로 분해할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 머서리화는 가열하면서 수성 수산화나트륨 용액 및 과산화수소로의 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직의 처리를 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 머서리화는 약 80℃까지 가열하는 단계와 함께 수행될 수 있다. 특정 실시예들에서, 이러한 가열은, 예를 들면, 특히 수산화나트륨을 사용할 때에 감소된 반응 시간을 가능하게 할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 상기 과산화수소가 반응에 첨가되지 이전에 제1 기간 동안에 상기 수성 수산화나트륨 용액으로 처리될 수 있다. 특정 실시예들에서, 상기 제1 기간은 약 1분 내지 약 24시간, 또는 그 사이의 임의의 시점, 또는 임의의 둘의 이러한 시점들 사이에 걸치는 임의의 하위 범위가 될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 과산화수소는 30% 내지 50% 수성 과산화수소 보존 용액으로 첨가될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 머서리화를 위해 상기 과산화수소는,
약 20㎖의 30% 과산화수소 용액：약 100g의 탈세포화 식물 또는 균류 조직：약 500㎖의 1M NaOH 용액;
약 10㎖의 30% 과산화수소 용액：약 100g 탈세포화 식물 또는 균류 조직：약 500㎖의 1M NaOH 용액; 또는
약 5㎖의 30% 과산화수소 용액：약 100g의 탈세포화 식물 또는 균류 조직：약 500㎖의 1M NaOH 용액과 같이,
약 20㎖ 내지 약 5㎖의 30% 과산화수소 용액：약 100g의 탈세포화 식물 또는 균류 조직：약 500㎖의 1M NaOH 용액의 비율로 사용될 수 있다.
이해될 수 있는 바와 같이, 이들 비율들은 원하는 언급된 양들이 절대적인 비율들이 아닌 상대적인 비율들을 나타내기 위해 제공되기 때문에 특정한 구성 성분들에 적합하도록 확장되거나 축소될 수 있다. 예를 들면, 특정 실시예들에서, 30% 수성 과산화수소 용액이 500g의 탈세포화 식물 또는 균류 조직 당 적어도 약 75㎖의 양으로 사용된다. 특정 실시예들에서, 1M 수산화나트륨 용액은 500g의 탈세포화 식물 또는 균류 조직 당 약 2500㎖의 양으로 사용된다. 대체로, 상기 수성 과산화수소 용액은 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직, 상기 수산화나트륨 용액 및 상기 수성 과산화수소 용액 혼합물의 전체 체적의 약 1% 내지 약 5%의 최종 과산화수소 농도까지 첨가될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 하나 또는 그 이상의 중화 처리들로 pH를 중화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 앞서의 방법 또는 방법들 중의 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 중화 처리는 산성 용액, 바람직하게는 수성 HCl 용액으로의 처리를 포함할 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 머서리화는 1M 수성 수산화나트륨 용액에 대해 약 1：5의 탈세포화 식물 또는 균류 조직：수성 수산화나트륨 용액의 비율(m：v, g：ℓ로), 또는 다른 수성 수산화나트륨 용액 농도에 대해 동등한 비율을 이용하여 수행될 수 있다. 이해될 수 있는 바와 같이, 이들 비율들은 원하는 언급된 양들이 절대적인 비율들이 아닌 상대적인 비율들을 나타내기 위해 제공되기 때문에 특정한 구성 성분들에 적합하도록 확장되거나 축소될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 머서리화는 적어도 약 30분 동안, 바람직하게는 약 1시간 동안 수행될 수 있다.
앞서의 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 피부 아래 주사, 깊은 피부 주사, 피하 주사(예를 들어, 피하 지방 주사), 또는 이들의 임의의 결합들을 위해 상기 더말 필러를 조제하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다른 실시예에서, 여기에 설명되는 방법 또는 방법들 중에서 임의의 것에 의해 제조되는 더말 필러가 여기에 제공된다.
여기에 설명되는 더말 필러 또는 더말 필러들 중에서 임의의 것의 다른 실시예에서, 상기 더말 필러의 약 0.1% 내지 약 5% 또는 그 보다 적은 입자들은 약 20㎛ 보다 작은 페렛 직경 또는 최소 페렛 직경을 가질 수 있다. 여기에 설명되는 더말 필러 또는 더말 필러들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 더말 필러의 약 0.5% 보다 적은 입자들은 약 20㎛ 보다 작은 페렛 직경 또는 최소 페렛 직경을 가질 수 있다.
앞서의 더말 필러 또는 더말 필러들 중에서 임의의 것의 또 다른 실시예에서, 상기 더말 필러의 약 0.1% 내지 약 5% 보다 적은(약 0.5%보다 적은 것과 같이), 또는 그 보다 적은 입자들은 대상의 세포 또는 세포들에 의해 포식되기 위해 충분히 작은 크기를 가질 수 있다.
다른 실시예에서, 키트가 여기에 제공되며, 상기 키트는.
여기에 설명되는 바와 같은 더말 필러 또는 더말 필러들 중의 임의의 것;
히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체;
PBS, 식염수, 히알루론산(교차 결합되거나 교차 결합되지 않음), 알긴산염, 콜라겐, 플루론산(예를 들어, 플루로닉 F 127), 한천, 아가로오스, 피브린, 칼슘 히드록시아파타이트, 폴리-L-젖산, 자가 지방, 실리콘, 덱스트란, 메틸셀룰로오스, 용해되고 재생된 셀룰로오스, 또는 이들의 임의의 결합들;
리도카인 또는 다른 마취제;
하나 또는 그 이상의 주사기들, 또는 다른 주사 장치;
둘 또는 그 이상의 주사기들을 위한 루어락(leur-lock) 접합 또는 연결기;
여기에 설명하는 바와 같은 용도나 용도들 또는 방법이나 방법들을 수행하기 위한 지시들;
하나 또는 그 이상의 탈세포화 시약들;
하나 또는 그 이상의 컨테이너들, 패키지들, 또는 용기들;
주사를 위한 하나 또는 그 이상의 완충제들, 물, 또는 식염수;
바람직한 영역 또는 위치에 더말 필러를 용해시키기 위한 시약 또는 효소(예를 들어, 셀룰라아제); 또는
이들의 임의의 결합들 중에서 어느 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다.
특정 실시예들에서, 여기에 설명하는 바와 같은 더말 필러들은 주름들, 여드름 흉터들을 개선하는 화장료 적용들에서의 사용을 위하거나, 재건 수술을 위한 것이 될 수 있는 점이 고려된다.
특정 실시예들에서, 더말 필러들은, 여기에 설명되는 바와 같이, 성형되거나(기계적으로나 화학적으로, 선택적으로는 구체들로), 기능적으로 되거나 및/또는, 예를 들면, 원할 경우에 셀룰로오스 유래 겔 제형들 또는 셀룰로오스계 히드로겔과 같은 전달 운반체(선택적으로, 일시성 전달 운반체)와 결합될 수 있다.
특정 실시예들에서, 더말 필러 입자들이 구체들 또는 특정한 크기들/형상들로 재구성되는 용해된 물질로부터 제조될 수 있는 점이 고려된다. 실험예에 의해, 특정 실시예들에서, 탈세포화 식물 또는 균류 조직과 같은 셀룰로오스계 생체재료들이 DMAc 및 LiCl 또는 셀룰라아제(및/또는 엔도글루카나아제(endoglucanase)(EG, 엔도(endo)-1,4-D-글루카노히드롤라아제(glucanohydrolase), 혹은 EC 3.2.1.4.), 엑소글루카나아제(exoglucanase), 혹은 셀로바이오히드롤라아제(cellobiohydrolase)(CBH, 1,4-β-D-글루칸셀로바이오히드롤라아제(glucan cellobiohydrolase), 또는 EC 3.2.1.91.), 베티(beta)-글루코시다아제(glucosidase)(EC 3.2.1.21))와 같은 유사한 이러한 효소들)로 용해될 수 있으며, 이후에, 예를 들면, 상기 셀룰로오스의 재생 동안에 구체화가 수행될 수 있는 점이 고려된다.
특정 실시예들에서, 여기에 설명하는 바와 같은 더말 필러들이, 예를 들면, 골 재건을 위한 골 충전제 페이스트로서, 또는 식품 적용들(예를 들어, 식품 공학을 위한 감촉 및/또는 구강 촉감을 위해 골격을 제공하도록)이나 폼(foam)(예를 들어, 뼈를 위한 연골, 연조직 재건, 식품, 격리, 포장 등)에서 필러 물질로서 사용을 위해 적용될 수 있는 점이 고려된다.
특정 실시예들에서, 셀룰로오스가, 예를 들면, 바람직하지 않은 위치 또는 혈관 내로 부주의로 주사되는 물질과 같은 원치 않는 물질을 분해하도록 이식에 후속하는 입자들의 용해를 위해 제공될 수 있거나 사용될 수 있는 점이 고려된다.
다음의 실험예들에서, 비재흡수성인 자연에서 유래되는 식물계 폴리머들이 개발되었고, PMMA 미세구(microsphere)들과 같은 합성 입자들에 대한 매력적인 대체물들로서 테스트되었다.
실험예 1-사과계 더말 필러 페이스트
이러한 실험예에서, 셀룰로오스계 더말 필러를 개발하기 위해, 사과 하이판시움 조직이 먼저 여기에 전체적으로 참조로 포함되는 WO2017/136950(발명의 명칭: "식물들 및 균류들로부터의 탈세포화 세포벽 구조들 및 골격 물질들로서의 그 이용(Decellularised Cell Wall Structures from Plants and Fungus and Use Thereof as Scaffold Materials)")에 기재되어 있는 바와 같은 탈세포화 연구 계획을 이용하여 탈세포화되었다. 요약하면, 사과 조직은 만돌린 슬라이서(mandolin slicer) 상에서 1.2㎜의 두께로 절단되었다. 사과 조직들의 실린더 형상의 디스크들이 생검 펀치(biopsy punch)를 이용하여 생성되었다. 상기 디스크들은 0.1% SDS(WO2017/136950에 기재되어 있는 바와 같이) 내에서 탈세포화되었다.
탈세포화된 10㎜ 사과 디스크들을 수득한 후, 주가 가능한 페이스트가 생성되었다. 몇몇 디스크들은 50㎖의 팔콘 튜브(Falcon 튜브) 내에 하강되었고, 모든 나머지 유체들은 제거되었다. 무균 조건들 하에서, 1㎖ 주사기의 플런저(plunger)가 이후에 상기 디스크들을 두꺼운 페이스트로 압쇄하고 균질화하는 데 사용되었다. 상기 페이스트는 이후에 새로운 1㎖ 주사기(바늘이 없음) 내로 흡입되었다. 멸균 18G 바늘을 상기 주사기 상에 위치시킨 후에 상기 페이스트가 추출될 수 있는 것이 발견되었다. 상기 페이스트를 보다 높은 게이지의 바늘들인 사용된 가장 작은 내측 직경의 바늘이었던 18G를 통해 압출하려고 시도할 때에 어려움에 직면하였다. 18G는 실제로 특정한 더말 필러 적용들을 위해 허용 가능하였지만, 26G-27G의 크기들이, 예를 들면, 종종 화장료 분야에서의 특정한 적용들에 대해 바람직하다.
도 1은 본 실험예에서 설명되는 바와 같이 압출된 탈세포화 셀룰로오스 페이스트(좌측 패널)를 도시하며, 18G 바늘로 상기 페이스트를 적재한 이후의 1㎖ 주사기(우측 패널)도 도시된다.
생체 적합성에 대해 테스트하기 위해, 예비 동물 연구가 수행되었다. 요약하면, 1㎖의 더말 필러 페이스트가 18G 주사기를 통해 암컷 스프라그-돌리 랫(sprague-Dawley rat)들(400-700g)의 등내의 셋의 부위들(3 x 1㎖)에 피하로 주사되었다. 상기 셀룰로오스는 3개의 다른 부위들(측면도 A 및 확대도 B에 대해 도 2 참조) 내로 피하로 주사되었다. 혈관화(vascularisation)가 4주에서 이식물 주위에 존재하였고(도 2C 참조), 절제 후에 상기 이식물은 그 형상을 유지하였다(도 2D 참조).
상기 주사된 물질은 주위 조직과 통합되어 나타났으며, 상기 주사된 물질 주위의 세포 침윤(cell infiltration) 및 기질 침착을 입증하였다. 상기 주사 부위들을 용이하게 볼 수 있었고, 상기 이식물이 시간에 걸쳐 얼마나 잘 그 형상을 유지하였는지의 측정을 수득하기 위해 캘리퍼스로 매주 측정(높이, x 및 y 폭들)되었다. 동물들은 모니터되었고, 주사 이후의 4주 및 8주에서 희생되었다. 도 3은 세포 침윤 및 기질 침착이 8주 후에 상기 동물 내부에서 관찰되었던 것을 도시한다. 상기 셀룰로오스 필러는 생체에 적합한 것으로 나타났고, 시간에 걸쳐 구상 형상(bulbous shape)을 유지하였다. 8주의 피하 주사에 걸쳐, 메이슨 트리크롬(Masson trichrome)(도 3A, 도 3C에 도시됨)과 헤마톡실린 및 에오신(Hematoxylin & Eosin)(도 3B, 도 3D에 도시됨)이 도시되고(A, B에 대해 축척 바(scale bar)＝2㎜; C, D에 대해 축척 바＝200㎛). 도 4는 캘리퍼스를 활용한 동물의 외부로부터의 상기 이식 부위들의 수동 측정들의 결과들을 도시한다. 8주의 연구 기간에 걸쳐, 이식 면적이 증가되는 것으로 관찰되었다. 그러나 종횡비(x 및 y 방향으로의 그 폭의 비)는 크게 변화하지 않았다. 도 5는 상기 이식물의 높이가 캘리퍼스로 동물의 외부에 대해 측정된 경우에 8주의 연구 기간에 걸쳐 ~75%까지 상당히 감소된 것을 도시한다. 이는 앞서 관찰된 주사 부위의 면적의 감소와 서로 관련된다.
본 연구는 유망한 데이터(주사 가능하고 생체 적합성인 셀룰로오스의 생성)를 보여주었다. 그러나 이러한 실험예에서, 그 생성의 성질로 인하여 상기 셀룰로오스 필러는 비정형이었고, 입자들 및 압쇄된 셀룰로오스 구조들의 가변적이며 분명하지 않은 집합으로 구성될 가능성이 있었다. 이는 특히 특정한 화장료 적용들을 위해 바람직한 26G-27G 바늘을 통해 압출하는 시도에 어려움을 가져올 수 있다. 가장 상업적인 더말 필러 제품들은 본 실험예에서는 사용되지 않았던 운반체 히드로겔(HA 또는 콜라겐이 가장 통상적임) 내의 물질들로 구성된다. 제어 가능한 크기 특성들을 가지는 분쇄된 셀룰로오스의 다른 정제된 입자들의 생성 및 운반체 히드로겔들과 제어 가능하게 혼합되는 능력이 다음에 보다 상세하게 설명된다.
실험예 2-제어된 크기의 더말 필러
위의 실험예 1에서의 결과들을 근간으로 하여, 더말 필러로서 사용을 위해 셀룰로오스 입자들을 생성하는 보다 제어된 방법이 본 실험예에서 개발되었다. 탈세포화 접근 방식들을 이용하여, 상기 생체재료를 압쇄 또는 분쇄하는 몇 가지 방법들이 보다 작은 게이지 바늘들을 통해 주사되는 것과 양립 가능한 더말 필러들을 개발하고, 고도로 제어 가능하고 재현성 있는 방식으로 상기 더말 필러의 생산을 위한 방법들을 개발하기 위해 테스트되었다.
이러한 실험예에서, 연구 계획이 다음의 방법들에 따라 건조 분말을 생성하기 위해 개발되고 설명된다. 사과 셀룰로오스 생체재료들이 먼저 앞서 설명한 바와 같이 탈세포화되었다(여기에 전체적으로 참조로 포함되는 WO2017/136950(발명의 명칭: "식물들 및 균류들로부터의 탈세포화 세포벽 구조들 및 골격 물질들로서의 그 이용(Decellularised Cell Wall Structures from Plants and Fungus and Use Thereof as Scaffold Materials)") 참조). 상기 탈세포화 사과 생체재료를 얻은 후, 이는 공기 중에서 24시간 동안 건조대 상에서 건조되게 두어졌다. 건조되면, 조절 가능한 버 그라인더(burr grinder)가 상기 물질을 미세한 입자들로 파괴하는 데 활용되었고, 이들 입자들은 입자들의 집단을 생성하기 위해 수 회 반복적으로 분쇄되었으며, 이후에 원하는 크기와 형상을 위해 체로 걸러질 수 있었다(분쇄되고 건조된 생체재료(좌측 패널) 및 재수화되고 압출된 더말 필러(우측 패널)를 도시하는 도 6 참조). 건조 분말이 얻어지면, 상기 입자들은 페이스트 또는 필러 물질이 생성되도록 상기 건조된 생체재료에 따라 10회-15회로 다량의 DPBS 내에 다시 현탁되었다.
상기 분쇄된 입자들의 크기를 정제하는(그리고 감소시키는) 우수한 방식이 이들을 과도하게 희석하고, 여러 차례 보다 작은 바늘 크기들을 계속적으로 통과시키는 것이었던 점이 발견되었다. 이러한 방법론으로, 상기 필러를 압출하는 데 이용될 수 있었던 가장 작은 게이지 바늘은 본 연구에서 22.5G 바늘이었다. 특정한 적용들에 대해, 예를 들면, 더말 필러들이 바람직하게는 게이지 26-31 크기의 바늘들로 주사되기 때문에 이는 여전히 특정한 적용들에 대해서는 원하는 경우보다 크다.
현미경 관찰 하에서, 이러한 분말을 생성하기 위한 방법이 큰 덩어리의 물질뿐만 아니라 단일의 온전한 구조 세포들을 가져왔던 점이 발견되었다. 이들 세포들은 통상적으로 직경이 ＞200㎛이며, 이는 상기 필러 물질을 미세한 바늘들을 통과시키는 데 제한 인자가 된다. 중요한 점은, 이용되었던 상기 분쇄 방법도 1㎛-20㎛ 영액 내에 나타났던 매우 미세한 입자들을 생성하였던 것이다. 이러한 크기의 입자들은 특정한 적용들에서 이식 후에 잠재적으로 염증, 육아종(granulomas) 및/또는 만성/지속성 이물 신체 반응들로 진행되는 부작용들을 가져올 수 있다.
도 7은 앞서 설명한 바늘 방법으로 생체재료가 완전하게 형성된 것으로 나타나고 붕괴되지 않는 적어도 일부의 단일의 온전한 구조 물질(예를 들어, 분리된 세포벽 포켓들)을 얻도록 전단되었던 것을 도시한다.
이러한 실험예에서 제조된 보다 작은 분말 크기로 인하여, 더말 필러들의 셋의 제형들이 생성되었다. 모든 경우들에서, 상기 더말 필러들은 식염수, 히알루론산 또는 소의 콜라겐의 운반체 유체 내에 4%의 셀룰로오스 입자들(w/v) 및 0.3%의 리도카인(w/v)을 포함하였다. 상기 제형들은 다음과 같이 생성되었다.
PBS 더말 필러 내에 현탁된 셀룰로오스：
0.2943㎎의 셀룰로오스 분말이 다음과 같이 용해되었다.
● 6.54㎖의 dH2O
● 0.73㎖의 10X PBS
● 0.145㎖의 15% 리도카인(w/v, dH2O 내에 용해됨)
히알루론산 더말 필러 내에 현탁된 셀룰로오스：
0.2031㎎의 셀룰로오스 분말이 다음과 같이 용해되었다.
● 5.078㎖의 0.2% 교차 결합되지 않은 히알루론산(m/v, PBS 내에 용해됨)
● 0.102㎖의 15% 리도카인(w/v, dH2O 내에 용해됨)
콜라겐 더말 필러 내에 현탁된 셀룰로오스：
0.1835㎎의 셀룰로오스 분말이 다음과 같이 용해되었다.
● 3.6㎖의 0.3%(m/v) 코닝®(Corning®) 콜라겐 I, 소
● 0.45㎖의 10X PBS
● 0.36㎖의 0.1N NaOH
● 0.09㎖의 15% 리도카인(w/v, dH2O 내에 용해됨)
위와 같이, 생체 적합성을 테스트하기 위해, 작은 동물 연구가 수행되었다. 요약하면, 0.4㎖의 각 더말 필러가 22.5G 주사기를 통해 암컷 스프라그-돌리 랫들(300g-700g)의 등내의 셋의 부위들(3 x 0.4㎖)에 피하로 주사되었다. 모든 경우들에서, 이식 후의 4주에서 동물들은 희생되었고, 조직 단면들이 수집되었다.
4주의 연구의 과정 동안, 상기 주사 부위들을 쉽게 볼 수 있었고, 상기 이식물이 시간에 걸쳐 얼마나 잘 그 형상을 유지하였는지의 측정을 얻기 위해 캘리퍼스로 매주 측정(높이, x 및 y 폭들)되었다(도 8 참조).
도 8은 시간의 함수로서 이식들의 높이를 도시한다. 다양한 제형들 사이에서 통계적으로 의미 있는 차이는 관찰되지 않았다. 그러나 이들이 약 10의 인자에 의해 HA 및 콜라겐의 농도의 측면들에서 상업 제품들과 상당히 달랐던 점에 유의한다. 콜라겐/HA 히드로겔의 낮은 w/v 농도와 부합하여, 결과들은 식염수계 필러의 경우와 유사하게 나타났고, 높이에서 ~50%의 감소를 가져왔다.
도 9는 시간의 함수로서 캘리퍼스로 동물의 외부로부터 측정된 상기 이식물의 계산된 체적을 도시한다. 상기 높이, x 및 y 폭들을 이용하고 반 타원형으로 상정하여, 상기 이식물 체적이 계산되었다. 다양한 제형들 사이에서 통계적으로 의미 있는 차이는 관찰되지 않았으며, 높이의 감소와 부합되는 경향을 따랐다.
실험예 1과 유사하게, 이러한 접근 방식은 랫 동물 모델에서 피하로 주사될 수 있는 셀룰로오스 분말들을 제공하였다. 그러나 입자 기하 구조에 대한 미세한 제어 없이는, 크기들의 넓은 분포가 야기될 수 있고, 이는 바람직하지 않은 효과들을 생성할 수 있거나 바람직하지 않은 작은 입자들(＜20㎛)을 포함할 수 있거나 및/또는 바늘의 막힘을 가져올 수 있는 입자들의 큰 덩어리(＞200㎛)를 포함할 수 있다. 이에 따라, 다음에 설명하는 바와 같이 향상된 입자 크기 제어를 위해 다른 연구들 및 개발이 수행되었다.
실험예 3-고도로 제어된 입자 크기를 가지는 더말 필러들
본 실험예에서 설명되는 개발과 연구들은 다음 사항들을 제공하도록 수행되었다.
1. 탈세포화 식물들로부터, 예를 들면, ＜100㎛의 평균 직경과 같이 제어 가능한 평균 직경을 가지는 셀룰로오스 분말을 제조하고;
2. 결과적인 입자들이 15kGy에서의 감마 방사선(gamma radiation)으로 살균될 수 있는지를 결정하며;
3. 다른 더말 필러 제품들의 제형들과의 비교를 위해 20% 입자들(v/v), 0.3% 리도카인(v/v) 및 79.3% 운반체 유체(식염수, 3.5% 소 콜라겐(w/v) 또는 1% 교차 결합된 히알루론산(w/v))로 이루어진 셋의 더말 필러 제형들을 생성하고;
4. 수많은 동물들에서 동물 생체 적합성 연구를 수행하며;
5. 체외(in vitro) 세포 배양 분석을 수행한다.
입자 기하 구조
PMMA 입자들은 영구적 더말 필러들에서 금 표준(gold standard)으로 되었다. 이들은 용이하게 생산되며, 이들의 크기는 정확하게 제어될 수 있다. 그러나 구체들이 단단하고 불침투성인 것으로 주어질 경우, 신체 내의 통합 이후의 결과적인 조직 은 인간 조직과 반대되게 주로 합성 미세구들로 구성되어 남아 있게 된다. 도 10은 이식 후의 3개월에서 30㎛-50㎛ PMMA 미세구들(백색 원들)을 도시한다. 천연 조직이 상기 이식물 주위에 성장하고 있는 반면, 조직 내의 PMMA의 체적 비율은 매우 높다. 이는 상기 조직이 천연 세포들 및 단백질들보다는 주로 합성 물질들로 구성되는 것을 나타낸다.
30㎛ 직경의 구체를 고려하면, 이 경우에 상기 구체는 2827㎛2의 표면적과 14137㎛3의 체적을 가진다. 상기 체적은 상기 주사를 수용하였던 영역 내에 성장될 수 있는 천연 조직의 전체 배제 체적을 나타낸다. 상기 표면적 대 체적(SA：V) 비율은 0.2이다. 이는 세포들과 기질 단백질들이 상기 구체의 표면상에 침착될 수 있는 반면, 상기 단단한 입자 자체에 의해 배제되는 전체 체적에 비하여 매우 작은 양인 것을 의미한다.
반면에, 얇고(~0.1㎛), 60㎛의 직경, 또는 30㎛의 반경을 가지는 대략적으로 원형인 입자, 또는 플레이크가 고려된다. 이 경우, 2846㎛2의 표면적(상기 30㎛ 구체와 거의 동일함) 및 283㎛3의 배제 체적이 된다. 이에 따라, 상기 SA：V는 10까지가 된다. 이는 배제된 체적에 대해 이용 가능한 표면적의 50X 증가를 나타낸다. 다시 말하면, 60㎛ 직경의 플레이크는 세포 성장 및 기질 침착을 지지하기 위해 유사한 양의 표면적을 제공하지만, 성장하는 천연 조직들에 대해 훨씬 작은 상대 체적을 배제한다.
본 발명자들이 수많은 연구들에서 관찰한 바와 같이, 상기 식물 조직의 얇은 벽들(~0.1㎛)은 상부에 세포들 및 조직들이 성장되고 침윤될 수 있는 우수한 지지 구조를 제공하지만, 혈관들, 기질 침착 및 조직 통합을 위한 많은 공간도 남긴다.
이에 따라, 이러한 실험예는 다른 더말 필러 제품들에 비하여 영구적인 필러 입자들에 대해 천연 조직의 우수한 SA：V 비율을 가지는 영구적 더말 필러를 생성하기 위해 수행되었다. 이에 따라, 다음에 설명되는 효과들은 구형의 입자들 보다는 천연의 식물 유래의 플레이크들을 개발하는 것을 목표로 하였다. 또한, ＜100㎛의 직경을 가지는 플레이크들은 앞서 설명한 이전의 제형들과는 반대로 26G-27G 주사기들을 통해 주사될 수 있다. 이는 그 결과로 이점들-천연 제품, 비재흡수성의 영구적 구조, 높은 생체 적합성 및 상당히 증가된 천연 조직을 제공할 수 있다. 더말 필러 절차들에서 환자 자신의 신체를 가능한 한 많은 천연 조직을 가지는 결손으로 대체하는 것이 바람직하다. 본 발명의 계획은 이들 목표들을 염두에 두고 설계되었다.
셀룰로오스 플레이크 제조
본 실험예에서 천연 입자 대체물을 생성하는 첫 번째 단계는 식물 물질을 탈세포화하는 것이었다. 이러한 프로세스는 여기에 전체적으로 참조로 포함되는 Hickey, R. 등의 "Customizing the Shape and Microenvironment Biochemistry of Biocompatible Macroscopic Plant-Derived Cellulose Scaffolds"(ACS Biomater. Sci. Eng., 4, 3726(2018))에 개괄되어 있는 확립된 연구 계획을 이용하여 이루어졌다. 최종 제품이 환자들에서 사용 가능한 것을 의도하였기 때문에, 표준화된 GLP 및 GMP 방법들을 확립하였던 것이 중요하였다. 여기서, 상기 물질들은 GLP를 따른 방식으로 생성되었다. 도 11은 멸균 샘플 처리를 도시하며, 탈세포화 프로세스의 GLP 버전이 멸균 물질들 및 무균 기술로 수행되었다.
상기 연질의 물질들을 처리하고, 셀룰로오스 플레이크들을 생성하기 위해, 골격(scaffold)들이 동결 건조기(lyophilizer) 내에서 동결 건조되었다(48h, -46C, 0.05mbar). 상기 물질들이 건조되면, 이들은 즉시 렛치 분쇄기(Retsch grinder) 내에 두어졌다. 덩이 분쇄가 18000rpm, 12000rpm 및 6000rpm으로 수행되었다. 빠른 속도는 처리 시간을 감소시켰다. 80㎛ 필터가 분말의 크기를 80㎛ 아래로 제한하기 위해 이용되었다. 제 위치의 상기 필터로써, 본 발명자들은 최종 입자 크기, 기하 구조 또는 수율에 대한 분쇄 속도의 어떠한 의존성도 관찰하지 못하였다. 이에 따라, 고속 분쇄가 처리 시간을 감소시키기 위해 활용되었다.
도 12는 상술한 바와 같은 사과 유래 탈세포화 셀룰로오스 골격들을 동결 건조하는 프로세스를 도시한다. 도 12A는 상기 탈세포화 물질이 수집되었고, 팔콘 튜브들 내에 배치되었으며, 채널이 이탈되도록 수증기를 증발/승화시키기 위해 상기 물질 내로 가압되었던 것을 도시한다. 도 12B는 상기 물질이 동결 전조기에 부착되었던 것을 도시하며, 도 12C는 동결 건조가 48시간 동안 -46C 및 0.05mbar에서 수행되었던 것을 도시한다. 도 12D는 상기 동결 건조된 물질의 최종 생성물을 도시한다. 도 13은 상술한 바와 같이 상기 건조된 셀룰로오스 생체재료가 동시에 80㎛ 필터로 통과되면서 18000rpm, 12000rpm 및 6000rpm로 분말도 분쇄되었던 것을 도시한다. 수집 트레이(collection tray)가 상기 프로세스 이후에 도시된다. 가장 높은 RPM 설정이 처리 시간을 감소시키기 위해 이용되었다. 입자 크기들의 분포에 대해 관찰되었던 관찰 가능한 분쇄 속도의 영향은 없었다(다음에 도시되는 데이터).
도 14는 여과 프로세스를 보다 상세하게 도시한다. 도 14A는 상기 80㎛ 필터를 통해 상기 물질을 분쇄하는 것으로부터 얻어진 분말을 도시하고, 도 14B는 45㎛ 및 25㎛ 체(sieve)들을 통한 습식 체가름으로부터 얻어진 분말을 도시하며, 도 14C는 상기 분말의 크기 범위를 제한하는 것을 도시한다. 가장 좁은 크기 범위의 입자들이 원심 분리를 통해 농축되었다(도 14D 참조). 자동화된 습식 체는 처리 시간과 효율을 크게 향상시켰으며, 후속하여 통상적으로 사용되었다.
상기 프로세스는 먼저 다음과 같이 수행되었다. 5㎖의 느슨하게 포장된 분말이 45㎖의 최종 부피까지 dH2O 내에 재현탁되었고, 상기 체 상으로 부어졌다. 상기 입자들은 연속적으로 3분 동안 세척되었다. 3분 후, 상부 체(45㎛)는 제거되었고, 제2의 체(25㎛)는 요동되었으며, 추가로 3분 동안 세척되었다. 상기 물질은 팔콘 튜브들 내에 수집되었고, 원심 분리되었다. 수율은 대략 20%였다(5㎖ 부피의 습윤 분말이 25㎖ 부피의 건조 분말로부터 분리되었다).
자동화된 습식 체가름(wet-sieving)이 ISO 565 BS 410 ISO 3310-1 25㎛ 및 50㎛ 스테인리스 스틸 8인치 체들 및 톱니 수집 버킷을 구비한 길슨(Gilson) SS 23 습식/건식 체 진동기로 수행되었다. 5㎖의 건조 분말이 45㎖의 dH2O 내에 희석되었다. 상기 체들은 상부에 보다 큰 메시와 함께 상기 진동기 상에 두어졌다. 상기 진동기가 켜졌으며, 상기 입자들이 50㎛ 메시 상으로 부어졌다. 상기 입자들은 3분의 과정에 걸쳐 세 번 150㎖의 dH2O로 세정되었다. 상기 진동기는 이후에 꺼졌고, 상기 상부 체는 제거되었다. 상기 진동기가 재가동되었고, 상기 하부 체는 50㎖의 부분 표본(aliquot)들 내에서 3분 동안 세 번 dH2O로 세척되었다. 다음에, 상기 여과된 물질이 dH2O로 상기 메시의 표면을 경사로 세척하여 수집되었다. 상기 체로 걸러진 물질은 원심 분리를 통해 농축되었다. 수율은 대략 20%였다(5㎖ 부피의 습윤 분말이 25㎖ 부피의 건조 분말로부터 분리되었다).
상기 분말의 수율을 평가하기 위해, 질량이 상지 프로세스의 주요 단계들에서 기록되었다 초기 질량은 임의의 조작이 상기 사과들에 대래 이루어지기 이전에 기록되었다. 상기 질량이 사과에서 사과에 걸쳐 변화되기 때문에, 사과들의 숫자는 출발 물질 함량의 충분한 계량이 되지 못하였다. 이와 함께, 사과들의 숫자와 사과들의 세트의 전체 질량이 수율 결정을 위한 기준점을 제공한다. 상기 탈세포화 이후, 상기 물질은 앞서 개괄된 바와 같이 건조 탈세포화 질량을 얻기 위해 동결 건도되었다. 상기 건조 물질은 이후에 미립자 형태로 분쇄되었다. 처리 동안에 일부 샘플 손실이 있었으며, 이에 따라 상기 분쇄 프로세스 동안의 손실을 평가하기 위해 분쇄 질량이 계산되었다. 다음의 단계는 50㎛ 및 25㎛ 체들을 이용하는 자동 체가름으로 크기 분포를 제한하기 위해 상기 입자들을 여과하는 것을 수반하였다. 최종 수율을 정량화하기 위해, 상기 체로 걸러진 입자들은 물 내용물을 제거하기 위해 냉동 건조되었다.
| 시험 | 사과들의 숫자 | 출발 질량(g) | 건조 탈세포화 질량(g) | 분쇄 분발 질량(g) | 건조 여과 질량(g) |
| 1(AA124) | 16 | 1927.58 | 22.01 | 19.67 | 2.68 |
| 2(AA125) | 15 | 1902.36 | 15.08 | 14.15 | 2.56 |
| 3(AA126) | 15 | 1885.11 | 12.79 | 11.45 | 1.59 |
상기 분말을 상기 렛치 트레이로부터 상기 튜브들로 옮기는 것은 장갑들, 튜브들 및 공기로 인한 정전기 하전을 회피하기 위해 스쿠풀라(scoopula)로 흄 후드(fume hood) 내에서 용이하게 이루어졌다. 시판되는 특정한 현재의 제품들은 20㎛ 보다 작은 입자 크기가 포식 작용 및/또는 증가된 면역 반응을 가져올 수 있는 것을 보여주었다. 이에 따라, 상기 입자들의 크기를 제한하는 것이 수행되었다. 상기 입자들은 습식 체가름 프로세스에서 둘의 체들(45㎛ 및 25㎛)로 통과되었다.
입자 크기 특성화
입자 크기 특성화는 형광 현미경 및 주사 전자 현미경(SEM)을 이용하여 이루어졌다. 상기 형광 현미경을 위해, 상기 입자들은 0.22㎛의 여과된 0.1% 콩고 레드(Congo Red) 염색으로 염색되었다. 이들은 2.5X 및 10X로 영상화되었다. SEM 샘플들은 동결 건조를 이용하여 건조된 시편들로서 영상화되었다. 전도가 일어나게 하기 위해, 금 박막 증착이 5㎚-10㎚의 금의 층으로 상기 입자들을 코팅하도록 수행되었다. 도 15는 콩고 레드로 염색된 입자들을 도시한다. 상기 입자들은 0.1% 콩고 레드로 염색되었고, 2.5X(도 15A, 도 15B) 및 10X(도 15C, 도 15D)로 영상화되었다. 도 15A, 도 15C：여과되지 않은 입자들. 도 15B, 도 15D：여과된 입자들. 이들과 같은 영상들은 상기 입자 크기 분포를 정량화하기 위해 수집되었다. 통상적으로, 2.5X로 10의 영상들은 통계적으로 의미 있는 샘플 크기인 ~1000의 입자들을 산출한다.
상기 현미경 영상들은 상기 입자 크기 분포들을 분석하는 데 이용되었다. 피지(Fiji)(이미지제이(ImageJ))가 상기 영상화 처리에 이용되었고, 오리진(Origin) 2020이 결과들을 분석하는 데 이용되었다. 상기 영상들을 일관 처리하기 위해, 원료 영상들이 피지(이미지제이) 내에 스택으로 모아졌다. 상기 영상들은 먼저 그래이 스케일(gray scale)로 변환되었고, 이후에 이들은 자동 임계화(thresholding) 기능을 이용하여 경계가 정해졌다. 상기 임계화는 적절한 한계들이 적용되었는지를 보장하기 위해 시각적으로 조사되었다. 다음으로, 분석 입자 기능이 면적, 형상 표지들, 중심, 타원 피트(fit ellipse) 및 페렛 직경을 계산하기 위해 적용되었다. 크기 제한들 또는 형상 한계들이 상기 입자 분석에 부과되지는 않았다. 모든 입자들은 상기 분포를 왜곡하는 것을 회피하기 위해 시야의 에지들 상의 경우들을 제외하고 분석되었다. 상기 분석된 입자 윤곽의 출력 영상 파일은 적절한 분할을 확보하도록 최초 영상과 비교되었다.
도 16은 앞서 설명한 바와 같은 입자 크기 분석을 도시한다. 상기 입자들은 피지(이미지제이)를 이용하여 경계가 정해졌고, 분할되었다. 도 16A 및 도 16B는 여과된 입자들을 도시하며, 도 16C 및 도 16D는 여과되지 않은 입자들을 도시한다. 도 16A 및 도 16C는 임계화된 영상을 도시하며, 도 16B 및 도 16D는 상기 크기 분석으로부터의 입자들의 윤곽들을 도시한다.
광학 및 형관 현미경 분석은 상기 분쇄된 셀룰로오스 분말이 구형의 입자들 보다는 플레이크들을 형성하는 것으로 나타난 것을 보여준다. 진원도, 환상성, 종횡비, 최소 및 최대 페렛 직경 등과 같은 불규칙하게 형성된 물체들을 조사하기 위해 계산될 수 있는 많은 다른 정량적 표지들이 존재한다. 상기 물질이 불규칙한 플레이크들의 집단이었기 때문에, 가장 유용한 형상 표지들은 상기 입자 형태론들을 기술하기 위한 상기 최소 및 최대 페렛 직경, 두께 및 투영 2D 면적이다.
상기 분말들에 대해 이들 분석적 접근 방식들을 적용하는 것은 체가름 이전에 상기 샘플들은 크기들의 매우 큰 분포를 나타내었던 반면, 체가름 이후에는 상기 샘플들은 보다 좁은 크기 분포를 가졌던 것을 보여주었다. 특히, 상기 작은 입자들이 여과 제거되었다. 여과되지 않은 입자들의 넓은 크기 분포는 투영 입자 면적에서도 분명하다. 상기 여과되지 않은 샘플에 대한 평균 투영 입자 면적은 2036.42±242.53㎛2이었던 반면, 상기 여과된 입자들은 236.92±38.18㎛2의 평균 면적을 가졌다. 평균 최대 페렛 직경들은 상당히 달랐다(P＝7.4 x 10-55)(여과되지 않음＝47.34±1.04㎛ 및 여과됨＝68.84±0.63㎛). 상기 최대 페렛 직경을 이용하여, ＜20㎛의 입자들의 퍼센티지는 상기 여과된 경우에 대해 1.6%였고, 상기 여과되지 않은 경우에 대해 29.5%였다. 마찬가지로, 평균 최소 페렛 직경도 유의미하게 달랐다(P＝6.67 x 10-56). 상기 여과되지 않은 입자들은 31.73±0.72㎛의 평균 최소 페렛 직경을 가졌고, 상기 여과된 입자들은 46.51±0.37㎛의 크기를 가졌다. 모든 값들은 평균 및 s.e.m.이다. 여과되지 않은 N＝2292이고, 여과된 N＝1595이다.
도 17은 여과된 및 여과되지 않은 탈세포화 사과 입자들에 대한 입자 크기 분석을 도시한다. 상기 페렛 직경이 입자 크기를 정량화 하는 데 이용되었다. 각 조건들에 대해 N＝15 영상들이 상기 콩고 레드로 염색된 입자들의 형광 현미경 영상들로부터 분석되었다. 여과되지 않은 N＝2292이고, 여과된 N＝1595이다. 상기 평균들은 통계적으로 유의미하게 상이하였다(P＝7.4 x 10-55).
상기 광학 현미경 결과들을 확인하고, 상기 셀룰로오스 분말 내의 상기 입자들의 형태의 보다 나은 이해를 얻기 위해, 주사 전자 현미경(SEM)이 채용되었다. 비록 효과적인 영상화 기술이지만, SEM을 위한 분말의 제조는 추가 건조, 분쇄 및 금 코팅을 요구하였다. 이는 플레이트들이 영상화 방향, 인공물들의 크기의 잠재적 변화들 및 잠재적 도입에 대해 다양한 각도들로 배향되게 할 수 있다.
도 18은 증가되는 배율(도 18A-도 18D)로 상기 탈세포화 사과 분말의 SEM 현미경 사진들을 도시한다. 도 19는 플레이크 직경을 결정하기 위한 수동 영상 처리를 도시한다. 상기 플레이크들은 불규칙하게 성형되며, 단일의 길이 표지들은 이러한 복잡성을 포착하는 데 실패한다(소스：탈세포화 사과). 도 20은 탈세포화 사과에 대한 SEM으로부터의 입자 크기 분포를 도시한다. 상기 분포는 47.11±1.11㎛에서 피크를 보여주었다(N＝133 플레이크들). SEM 영상 분석으로부터 얻어진 분포는 광학적 방법들 보다 훨씬 좁았다. 그러나 차례로 작은 N 값들, 입자 각도 배향의 영향 및 에지들을 확실하게 검출하는 능력을 가져오는 입자들을 측정하는 수동 접근 방식과 같은 이러한 방법에 대한 결점들이 존재한다. 이들 문제들은 이러한 방법론이 입자 크기를 특성화하기 위해서 바람직하지 않게 만든다.
다른 입자 제형들에 대한 분쇄 속도들의 효과들
분쇄 속도는 상기 셀룰로오스 플레이크들의 제조 동안에 중요한 변수였다. 본 연구에서 상기 속도는 상기 입자 크기 특성들(자동화된 광학적 분석으로부터 결정됨)에 영향을 미지치 않았으며, 상기 식물 종 유형(사과와 배가 비교되었음)에 의해 변화되지 않았음을 입증하는 데이터가 다음에 제시된다.
도 21은 자동화된 습식 체 여과 이전에 측정된 다른 속도들에서 탈세포화 사과를 분쇄한 이후의 입자 크기 분포를 도시한다. 상기 입자들은 체가름 이전에 6000RPM(흑색) 및 18000(회색)에서의 분쇄에 의해 생성되었다. 두 가지 분산들은 유사하였다. 평균 입자 크기들은 6000RPM 및 18000RPM 에 대해 각기 73.07±0.58㎛ 및 73.50±0.56㎛이었다. 값들은 평균 및 s.e.m.이다. 6000RPM에 대해 N＝2579이고, 18000RPM에 대해 N＝2354이다. 상기 평균 입자 크기에 유의차는 존재하지 않았던 것으로 발견되었다(P＝0.58).
| 파라미터 | 6000RPM(N＝810) | 18000RPM(N＝790) | 유의차(P＝0.05) |
| 최대 페렛 직경(㎛) | 65.94±1.01 | 67.07±1.16 | 없음(P＝0.4619) |
| 최소 페렛 직경(㎛) | 46.47±0.68 | 45.86±0.71 | 없음(P＝0.5349) |
| 면적(㎛2) | 2370.29±57.97 | 2455.54±81.55 | 없음(P＝0.3924) |
| 파라미터 | 사과(N＝1595) | 배(N＝790) | 유의차(P＝0.05) |
| 최대 페렛 직경(㎛) | 68.83±0.63 | 67.07±1.16 | 없음(P＝0.1464) |
| 최소 페렛 직경(㎛) | 46.51±0.37 | 45.86±0.71 | 없음(P＝0.3702) |
| 면적(㎛2) | 2366.92±38.18 | 2455.54±81.55 | 없음(P＝0.2619) |
감마 살균
감마 방사선은 임상 설정들에서의 사용을 위해 생체재료들을 살균하기 위한 중요한 단계이다. 15kGy의 레벨에서의 감마-조사가 멸균 식물계 생체재료들을 생성하기에 충분한 것으로 결정되었다. 다음에 제시되는 발견들은 감마-조사된 및 조사되지 않은 샘플들이 입자 크기의 상당한 변화를 나타내지 않는 것을 보여준다.
앞서와 같이, 캐나다 팬시(Canada Fancy)의 매킨토시(McIntosh) 사과들이 지역 슈퍼마켓들에서 구매되었고, 다음 날 사용되었다. 탈세포화 원료 물질을 제조하기 위해, SOP들을 따랐다. 요약하면, 상기 사과들은 껍질이 벗겨졌고, 이후에 만돌린 슬라이서 상에서 1㎜의 두께로 슬라이스로 되었다. 슬라이스들은 이후에 0.1% SDS 용액으로 옮겨졌고, 120RPM에서 3일 동안 교반기 상에 두어졌다. 상기 용액은 매일 한 번 변경되었다. 다음에, 상기 슬라이스들은 멸균 dH2O로 3회 세척되었고, 100mM CaCl2 용액으로 옮겨졌으며, 24시간 동안 상기 교반기로 다시 돌아갔다. 상기 생체재료들은 멸균 dH2O로 3회 세척되었고, 70% 에탄올로 30분 동안 살균되었다. 상기 이후에 샘플들은 멸균 dH2O로 3회 세척되었고, 다음 날까지 멸균 dH2O 내에 저장되었다. 물은 이후에 제거되었고, 상기 샘플들은 2일 동안 -46℃ 및 0.050mbar에서 냉동 건조되었다. 건조되면, 상기 탈세포화 물질들은 80㎛의 필터를 구비하여 18000RPM의 속도로 설정된 렛치 분쇄기(Retsch grinder) 내에서 분쇄되었다.
셀룰로오스 분발의 크기는 습식 체가름을 이용하여 45㎛ 및 25㎛ 체들로 더 제한되었다. 상기 분말은 3분의 지속 기간 동안 1000RPM의 속도에서 원심 분리로 농축되었다. 상기 입자들은 이후에 10㎖의 멸균 dH2O 내의 1㎖의 입자들의 농도로 날겐 병(Nalgene bottle)들 내에 저장되었다. 셋의 샘플들이 출발 물질들의 별도의 배치들로부터 각 조건으로부터 제조되었다.
도 22는 표지 스티커가 있는 감마 조사를 위해 밀봉된 날겐 보틀 내의 입자 서스펜션의 샘플을 도시한다.
상기 날겐 병들은 간섭이 없는 환경들을 제공하도록 수축 포장(shrink-wrap)으로 밀봉되었다. 상기 병들은 감마 조사를 위해 컬러 표지로 표기되었고, 컬러는 감마 조사에 노출된 후에 오렌지색으로부터 적색으로 변화된다. 상기 샘플들은 최소 15kGy로 조사되었다. 상기 샘플들은 이후에 시험까지 4℃에서 저장되었다.
조사된 및 조사되지 않은 샘플들이 분석되었다. 키엔스 디지털 현미경(Keyence Digital Microscopy)이 상기 입자 크기를 평가하는 데 이용되었다. 기록된 파라미터들은 입자 면적, 최대 면적, 최소 면적 및 둘레였다. 상기 입자들은 상기 입자들의 가시화를 가능하게 하도록 콩고 레드로 염색되었다. 자동화 마이크로피펫(automated micropipette)이 500㎕의 샘플들 및 150㎕의 0.2% 삼중 여과된(0.22㎛) 콩고 레드를 1㎖ 바이알(vial)들에 첨가하는 데 이용되었다. 상기 바이알들은 혼합되었고, 냉장고 내에 하룻밤 동안 저장되었다. 상기 염색된 서스펜션의 작은 부분 표본들은 유리 슬라이드들 및 커버 슬립(cover slip)들 사이에 침착되었다. 각 시편은 증발로 인한 간섭을 회피하도록 영상화 직전에 제조되었다. 앞서 설명한 바와 같이 제조된 상기 시편들은 SGS PSI 방법 ID 27940 개정(Revision) 3에 따라 Z20T 렌즈가 부착된 키엔스 VHX-5000 디지털 현미경 시스템을 이용하여 테스트되었다. 영상화는 200x의 고유 배율에서 편광 투과광으로 수행되었다. 2차원 스티칭 특성(stitching feature)이 각 샘플 서스펜션으로부터 제조된 시편들을 영상화하는 데 이용되었다. 시편들의 면적들은 입자들의 보다 무작위인 분산으로 선택되었고, 농축된 단면들 또는 공기 거품들은 회피되었다. 키엔스 소프트웨어의 자동 면적 기능이 각 영상 내의 "입도 크기(grain size)"들을 측정하는 데 이용되었다. 상기 입자들에 대한 염색의 우선적 결합의 색상을 선택한 후, 측정된 물체들의 표가 접촉하거나 중첩되는 입자들의 덩어리들로부터 개개의 입자들까지의 전이에서 적절한 최대 직경에 대해 조사되었다. 배제가 이후에 보다 큰 입도들 및 상기 영상의 에지들에서 간섭된 것들에 대해 적용되었다. 상기 분석은 샘플 당 최소 1,000의 입자들이 측정되었을 때까지 반복되었다. 도 23은 키엔스 디지털 현미경으로부터 얻어진 샘플 영상을 도시한다. 밝은 적색의 중첩들은 분석에 이용되었던 입자들을 나타낸다.
상기 입자들의 평균 면적은 상기 감마 조사된 및 조사되지 않은 입자들(P＝0.91, N＝3 샘플들)에 대해 유의미한 차이는 없었다. 평균 입자 면적들은 각기 1885.3±1144.6㎛2 및 1705.4±984.9㎛2이었다. 상기 면적들의 막대그래프가 도 24에 표시된다. 분석된 입자들의 전체 숫자는 상기 조사된 샘플들에 대해 3800 입자들 및 상기 조사되지 않은 샘플들에 대해 4692 입자들이었다. 도 24는 감마 조사된(N＝3800) 및 조사되지 않은(N＝4692) 입자들에 대한 입자 면적들을 도시한다.
상기 입자들이 순수하게 구형은 아니기 때문에, 최대 페렛 직경(또는 최대 직경)이 불규칙하게 성형된 입자들의 크기를 평가하는 데 유용한 양이 되었다. 이러한 측정은 분말 및 입자 분석에서 통상적인 실행이다. 상기 입자들의 최대 직경은 상기 감마 조사된 및 조사되지 않은 입자들(P＝0.97, N＝3 샘플들)에 대해 상당한 차이는 없었다. 평균 입자 직경들은 각기 62.0±20.1㎛ 및 61.0±18.4㎛이었다. 상기 직경들의 막대그래프가 도 25에 도시된다. 도 25는 상기 감마 조사된 입자들(N＝3800) 및 조사되지 않은 입자들(N＝4692)에 대한 입자 최대 직경 막대그래프를 도시한다.
상기 최대 직경에 비하여, 최소 입자 직경을 평가하는 것도 중요하다. 최소 직경도 상기 감마 조사된 및 조사되지 않은 입자들(P＝0.90, N＝3 샘플들)에 대해 상당한 차이는 없었다. 상기 평균 최소 입자 직경들은 각기 46.5±15.0㎛ 및 44.4±13.2㎛이었다. 상기 직경들의 막대그래프를 도 26에 나타낸다. 분석된 입자들의 전체 숫자는 상기 조사된 샘플들에 대해 3800 입자들 및 상기 조사되지 않은 샘플들에 대해 4692 입자들이었다. 도 26은 상기 감마 조사된 입자들(N＝3800) 및 조사되지 않은 입자들(N＝4692)에 대한 입자 최소 직경 막대그래프를 도시한다.
함께 고려하면, 결과들은 상기 입자 크기가 감마 조사에 의해 상당히 변경되지는 않았던 것을 보여준다. 데이터에 대한 다른 조사는 습식 체가름을 활용하는 현재의 제조 방법으로 ＜0.32%의 입자들이 20㎛ 보다 작은 최대 직경을 가졌던 것을 보여주었다. 20㎛ 아래의 입자들은 포식될 수 있거나 및/또는 면역 반응들을 촉발시킬 수 있으므로 이러한 결과는 특히 체내(in vivo) 사용을 위해 흥미롭다. 이에 비하여, 시판되는 벨라필(BellaFill) 더말 필러 입자들은 ＜1%의 이들 물질들이 ＜20㎛의 직경을 가지는 것으로 보고된다.
상기 입자들은 특성 상 구형이 아니며, 이에 따라, 앞서 제시한 바와 같이 몇 가지 형상의 표현들이 이들의 기하 구조를 설명하는 데 채용될 수 있다. 중요한 것은 이들 특성들이 15kGy로의 감마 조사에 노출된 후에 변화되지 않았던 점이다.
크기 제한에 대한 선택적인 접근 방법
습식 체가름 이외에도, 분별 원심 분리가 상기 입자들을 분리하는 데 이용될 수 있다. 분별 원심 분리도 처리 시간 및 물 사용을 감소시킬 수 있는 폐쇄 생산 프로세스가 될 수 있다. 분별 원심 분리는 입자들을 이들의 크기에 기초하여 분리하는 데 이용될 수 있는 기술이다. 원심 분리는 침강 프로세스를 촉진시키는 데 이용된다. 분리의 속도는 유효 중력, 상기 유체의 점도, 경로 길이 및 시간에 의존한다. 다음의 식들은 앞서 언급한 변수들 사이의 관계를 요약한 것들이다. 이들 식들은 상기 입자들이 균일하고 구형인 것을 상정하며, 본 발명의 입자들에는 해당되지 않지만-그럼에도 불구하고, 이들 고려 사항들은 가변적인 구성을 위한 출발점을 제공한다.
도 27은 분별 원심 분리를 통해 수득된 사과 유래 입자들의 입자 크기 분포를 도시한다. 도 27A는 수동 체가름(45㎛)으로 초기의 큰 입자 크기 배제 이후의 여과되지 않은 입자들의 크기 분포를 도시하며, 도 27B는 1000rpm으로 1분 동안의 원심 분리의 5회 반복 이후의 분포를 도시한다. 상기 물질 모두를 수집하기 위해, 7분 동안 5000rpm에서 원심 분리가 이용되었다.
체외 생체 적합성
세포 생존성에 대한 상기 분말의 영향을 평가하기 위해, 체외 생체 적합성 분석이 수행되었다. 이러한 테스트는 모델 라인으로 종종 이용되는 NIH3T3 마우스 세포들에 대한 여과된 및 여과되지 않은 입자들의 영향을 비교하기 위해 수행되었다. 멸균 분말이 상기 분석을 위해 사용되었다. DMEM 배지 내에 3T3 세포들을 함유하는 여섯의 플레이트들이 다음의 조건들로 사용되었다.
● 대조군-입자들 또는 염료 없음, 세포들만 존재함;
● CR로 미리 염색된 여과된 입자들;
● 여과된 입자들-염료 없음;
● CR로 미리 염색된 여과되지 않은 입자들;
● 여과되지 않은 입자들-염료 없음;
● 염료 대조군-염료가 있는 세포들만 존재함.
상기 여과된 입자들을 가지는 샘플들을 제조하기 위해, 상기 여과된 생체재료(습식 체가름이 수반되는 분쇄를 통해 앞서와 같이 생성된 사과 입자들)가 사용되었다. 20㎖의 체적(2㎖의 입자들을 포함)이 둘 튜브들 내로 분할되었고, 7분 동안 5000RPM으로 원심 분리되었다. 펠릿(pellet)들은 3.5㎖의 최종 체적을 위해 증류수 내에 재현탁되었다. 175㎕의 0.2% CR이 상기 샘플들 중에서 하나(상기 튜브 내의 0.01% CR 농도)에 첨가되었다. 상기 입자들은 10분 동안 염색되었다. 상기 튜브들의 내용물들은 대응되는 플레이트들 내로 피펫으로 옮겨졌다(각 플레이트는 동등한 1㎖의 습윤 입자들을 수용하였다).
여과되지 않은 입자들을 가지는 샘플들을 제조하기 위해, 상기 여과되지 않은 생체재료(습식 체가름이 수반되는 분쇄를 통해 앞서와 같이 생성된 사과 입자들)가 사용되었다. 2㎖의 분말이 7㎖의 최종 채적을 위해 증류수 내에 재현탁되었다. 이러한 용액은 둘의 튜브들 내로 분할되었고, 175㎕의 0.2% CR이 상기 샘플들 중에서 하나(상기 튜브 내의 0.01% CR 농도)에 첨가되었다. 상기 튜브들의 내용물들은 대응되는 플레이트들 내로 피펫으로 옮겨졌다(각 플레이트는 동등한 1㎖의 습윤 입자들을 수용하였다).
염료 대조군을 제조하기 위해, 175㎕의 0.2% CR이 입자들이 없이 3T3을 포함하는 플레이트에 첨가되었다.
상기 플레이트들은 모두 관찰 이전에 37℃ 및 5% CO2에서 48시간 동안 배양되었다.
도 28은 AA(사과) 입자들로의 체외 세포 배양 테스트를 도시한다. 청색＝3T3 세포핵들. 일부 경우들에서, 큰 입자 플레이크들도 훽스트(Hoechst) 33342 염색의 결과로 볼 수 있다. 적색＝느슨한 입자들을 세척 제거한 이후에 남아 있던 0.01% 콩고 레드 염료로 염색된 입자들. 도 28A 및 도 28B는 대조군을 도시한다. 도 28C 및 도 28D＝대조군 및 염료. 도 28E 및 도 28F＝여과됨：25㎛-45㎛. 도 28G 및 도 28H＝여과됨：25㎛-45㎛ 및 염료. 도 28I 및 도 28J＝여과되지 않음. 도 28K 및 도 28L＝여과되지 않음 및 염료. 척도＝250㎛.
결과들은 상기 여과되지 않은 분말이 세포 생존성에 유해한 영향을 미치는 것을 입증한다. 상당한 숫자의 세포들이 48시간 후에 사멸되었고, 분명하게 괴사되었거나 및/또는 상기 배양 플레이트 내에 부유하였다. 이에 비하여, 상기 여과된 입자들을 가지는 플레이트 내에서, 세포 밀도는 대조군들과 비교하여 높았다. 세포들은 정상적이고 생존 가능하게 나타난다. 비록 분말 유도 세포 사멸의 정확한 기전이 상세하게 연구되지는 않았지만, 결과들은 직경이 세포 독성을 가지는 ＜20㎛인 입자들과 부합된다. 이 경우, 상기 여과되지 않은 용액들은 20㎛ 임계값 아래의 수많은 입자들을 함유하며, 증가된 세포 사멸의 원인이 될 수 있다. 세포 사멸에 대한 원인은 상세하게 조사되지는 않았지만, 삼투 효과들 및 작은 입자들의 포식 작용으로부터 야기되는 세포자멸사(apoptosis) 모두가 가정되었다. 상기 삼투압 충격의 심각성을 변경시키는 입자 서스펜션의 보다 낮은 농도로의 결과들은 관찰된 세포 사멸에 대한 주요 제공자를 제시한다. 50X 희석에서 여과되지 않은 및 여과된 입자들 모두로 배양된 세포들은 예비 연구들에서 생존 가능하였다.
우수한 결과들이 여과된 입자들로 얻어졌으며, 여과된 입자들로써 대조군들과 비교하여 세포 밀도가 높았던 것을 나타낸다. 세포들은 정상적이고 생존 가능하게 나타난다.
더말 필러의 제형들 및 제조
상기 입자들이 더말 필러들 및 더말 필러 적용들에서 사용될 수 있기 때문에, 주사기 및 바늘 전달에 대한 이들의 적용 가능성이 테스트되었다. 알긴산염이 상기 입자들의 점성 혼합을 위해 사용되었다.
상기 제형들은 0.5체적% 알긴산염 및 20체적% 입자들을 함유하였다. 상기 제형을 생성하기 위한 첫 번째 시도에서, 액체 성분이 5㎖의 1% 알긴산염을 5㎖의 물속으로 혼합하여 생성되었다. 상기 용액은 약간 점성이었지만, 종래의 피펫팅(pipetting) 기술로 쉽게 혼합되었다. 다음에, 2㎖의 여과되지 않은 분말이 상기 액체 성분(앞서 설명한 바와 같이 제조됨)에 첨가되었다. 종래의 피펫팅과 교반은 입자들의 균일한 용액을 산출하지 못하였다. 마찬가지로, 보텍싱(vortexing)은 균일한 서스펜션을 생성하지 못하였다.
다른 접근 방식에서, 상기 2㎖의 여과되지 않은 분말이 초기에 5㎖의 물과 결합되었다. 이러한 혼합물은 500㎕ 부분 표본들 내에서 5㎖의 1% 알긴산염 내로 점차적으로 도입되었다. 이러한 접근 방식은 상기 용액을 혼합하기 훨씬 쉽게 하였고, 보다 균일한 최종 조성물을 얻었다.
이들 두 제형들은 이후에 바늘 폐색 테스트에 대해 사용되었다. 27G 바늘이 사용되었다. 두 제형들은 상기 바늘을 폐색하였고, 막히게 하였다, 상기 첫 번째 방법은 즉시 막히게 하였다.
세 번째 제형은 25㎛-45㎛ 입자들이 여과되지 않은 입자들 대신에 사용되었던 것을 제외하면 제2의 기본형과 동일하였다. 동일한 바늘 폐색 테스트가 적용되었고, 상기 입자 혼합물은 상기 바늘이 막히게 하지 않았다.
도 29는 알긴산염을 포함하는 주사 가능한 더말 필러 제형을 나타낸다. 상기 입자들 20%의 체적까지 만들어졌다. 두 가지 혼합 방법들이 테스트되었다. 도 29A는 상기 분말을 물 및 알긴산염 용액 내로 혼합하는 것을 도시한다. 도 29B는 상기 분말을 먼저 물 성분 내로 혼합하고, 이후에 상기 알긴산염을 서서히 첨가하는 것을 도시한다. 첫 번째 방법은 잘 혼합시키지 못하였으며, 상기 바늘을 막히게 하였다. 두 번째 방법은 잘 혼합시켰지만, 상기 여과되지 않은 입자들이 상기 바늘을 막히게 하였다. 상기 여과되지 않은 입자들이 여과된 것들로 대체되었을 때, 상기 혼합물이 압출하기 쉬워졌다.
이들 결과들은 기본형으로 이용된 상기 혼합 프로세스가 더 최적화될 수 있는 것을 보여준다. 하나의 구성 성분을 다른 것에 서서히 첨가하는 것은 시간이 소요되며, 보다 많은 수반된 물질 전달은 오염에 대한 위험뿐만 아니라 오차 전파를 증가시킨다.
이에 따라, 루어-락(Luer-Lock)(F/F) 주사기 커넥터들이 상기 필러의 구성 성분들을 혼합하는 데 이용되었다. 하나의 주사기에는 상기 혼합 프로세스를 가시화하기 위해 0.9% 식염수 및 0.1% 콩고 레드 염료 내에 혼합된 상기 입자들이 적재되었다. 제2의 주사기에는 1% 알긴산염이 적재되었다. 상기 두 주사기들은 루어-락(F/F)으로 연결되었다. 상기 용액들은 상기 물질을 하나의 주사기로부터 다른 하나로 60X 통과시켜 혼합되었다. 상기 혼합이 완료된 후, 상기 물질은 상기 주사기들 중에서 하나로 옮겨졌다. 빈 주사기는 연결 해제되었고, 1cc 주사기가 제 위치에 부착되었다. 원하는 체적(이 경우에는 400㎕)이 상기 주사기 내로 적재되었다. 상기 1cc 주사기는 연결 해제되었고, 적절하게 크기가 조절된 바늘이 장착되었다.
도 30은 상기 주사기 루어-락 커넥터로의 더말 필러 구성 성분들의 혼합을 도시한다. 도 30A는 개개의 주사기들 내에 적재된 두 구성 성분들을 도시한다. 깨끗한 액체는 상기 1% 알긴산염이며, 적색의 액체는 0.9% 식염수 및 리도카인 내에 현탁된 상기 입자들이다(최종 농도＝0.3%). 콩고 레드(0.1%의 최종 농도)가 가시화를 위해 첨가되었다. 도 30B는 상기 루어-락 커넥터를 도시한다. 도 30C는 상기 구성 성분들을 혼합하는 것을 도시한다(전체 60회 통과들이 수행되었다). 도 30D는 상기 루어-락을 연결 해제하고, 이를 압출을 위한 바늘로 대체하는 것을 도시한다. 상기 용액이 27G 바늘을 폐쇄하지 않았던 점에 유의한다.
본 실험예에서 이용된 더말 필러 제형들의 추가 실험예들 및 그 제조를 위한 접근 방식들/절차들은 다음과 같다.
식염수 운반체 유체를 구비하는 더말 필러 제형
주요 장비
1. 생물안전 작업대(biosafety cabinet)
2. 원심분리기(50㎖의 팔콘 튜브들 및 마이크로원심분리기(microcentrifuge) 능력 모두)
3. 피펫 건(pipette gun)
4. 마이크로피펫
용액들
1. 70% 에탄올
2. 멸균수
3. 멸균 식염수(0.9%)
4. 리도카인 2%
절차
설정
1. 상기 생물안전 작업대(BSC)를 가동시킨다.
2. 상기 BSC를 액셀 와이프(Accel wipe)들로 깨끗이 닦는다.
3. 50㎖의 팔콘 튜브들 및 랙들로 분사되도록 70% 에탄올을 사용하고, 이들을 상기 BSC 내에 둔다. 하나의 팔콘 튜브는 상기 입자들을 수집하는 데 사용되었고, 다른 하나는 폐기물 컨테이너로 사용되었다.
4. 액셀 와이프를 이용하여, 상기 피펫 건을 깨끗이 닦고, 이를 상기 BSC로 옮긴다.
5. 보이는 방사선 표지 스티커가 있는 개방되지 않은 수축 포장된 병들 내의 감마 조사된 입자들의 사진들을 촬영한다.
6. 상기 입자 병들을 액셀 와이프들로 깨끗이 닦고, 이들을 상기 BSC 내로 가져온다.
7. 상기 입자들이 재현탁되도록 컨테이너들을 요동시킨다.
8. 멸균 0.9% 식염수의 새로운 병을 깨끗이 닦고, 이를 상기 BSC로 옮긴다.
입자 제조
1. 모든 물질 이동 단계들은 무균 기술을 이용하여 상기 BSC 내에서 완료되어야 했다. 멸균 장갑들이 사용되었다.
2. 감마 조사의 병의 전체 내용물들(20㎖)을 50㎖의 팔콘 튜브 내로 붓는다.
3. 1000rpm으로 3분 동안 실온에서 상기 입자들을 원심 분리한다.
4. 상기 팔콘 튜브를 액셀 와이프들로 깨끗이 닦고, 이를 상기 BSC로 복귀시킨다.
5. 상층액(supernatant)을 상기 피펫 건으로 버린다. 일부 입자들이 상기 용액 내에 재현탁될 수 있으므로 바이알을 따르거나 부딪치게 하지 않는다.
6. 상기 펠릿을 6.8㎖의 멸균 0.9% 식염수 내에 재현탁시킨다. 잘 혼합한다.
7. 1.2㎖의 2% 리도카인을 첨가한다. 잘 혼합한다.
8. 상기 용액을 500㎕ 부분 표본들 내의 멸균 고압 살균 마이크로원심분리기 튜브들로 옮긴다. 유의：상기 멸균 고압 살균 마이크로원심분리기 튜브 패키지들은 후드 내에서 개방되었다. 외부 패키지들은 상기 후드의 어떠한 표면과 접촉되지 않았고, 개방된 컨테이너들 상부를 지나가지 않았다.
주사기 적재
1. 상기 BSC 내부에서, 멸균 허크 타월(huck towel)을 상기 BSC의 일측 상에 아래로 두어 멸균 구역을 생성한다.
2. 한 명의 연구원은 개방 장갑 착용 기술을 이용하여 멸균 장갑들을 착용한다. 이러한 연구원은 멸균 연구원으로 식별된다.
3. 비멸균 연구원이 멸균 1cc 주사기들을 상기 BSC 내로 가져왔다. 패키지들은 어떤 표면도 접촉되지 않았다. 상기 패키지들이 개방되었고, 상기 멸균 구역상으로 하강되었거나, 상기 멸균 연구원에 의해 그곳에 두어졌다.
4. 단계 3이 상기 바늘들에 대해 반복되었다. 상기 바늘 게이지는 26G였다.
5. 상기 멸균 연구원이 400㎕를 상기 주사기 내로 인출하는 동안에 상기 비멸균 연구원은 45도의 각도로 상기 더말 필러를 포함하는 상기 마이크로원심분리기 튜브를 유지하였다.
6. 적재된 주사기들은 느슨하게 재포장되었다. 유의：캡은 상기 멸균 구역상에 눕혀져 있었고, 상기 바늘이 한 손으로 상기 캡 내로 삽입되었다. 두 손을 사용하는 것은 상기 바늘이 접촉되거나 상기 플라스틱 캡을 통해 밀려질 수 있는 경우에 회피되었다.
7. 상기 적재된 주사기들을 수술 영역 상의 랫에 인접하는 멸균 구역으로 옮긴다.
히알루론산 운반체 히드로겔을 가지는 더말 필러 제형
주요 장비
1. 생물안전 작업대
2. 원심 분리기(50㎖의 팔콘 튜브들 및 마이크로원심분리기 능력 모두)
3. 피펫 건
4. 마이크로피펫
히알루론산 키트
1. 하이스템 키트(HyStem Kit)-어드밴스드 바이오매트릭스(Advanced BioMatrix)-Cat GS311
용액들
1. 70% 에탄올
2. 멸균수
3. 멸균 식염수(0.9%)
4. 리도카인 2%
절차
설정
1. 상기 생물안전 작업대(BSC)를 가동시킨다.
2. 상기 BSC를 액셀 와이프들로 깨끗이 닦는다.
3. 상기 하이스템 패키지들을 냉동기/아이스 팩들로부터 제거한다. 상기 하이스템 패키지들을 개방하고, 바이알들을 실온까지 데워지게 한다.
4. 50㎖의 팔콘 튜브들 및 랙들로 분사되도록 70% 에탄올을 사용하고, 이들을 상기 BSC 내에 둔다. 하나의 팔콘 튜브는 상기 입자들을 수집하는 데 사용되었고, 다른 하나는 폐기물 컨테이너로 사용되었다.
5. 액셀 와이프를 이용하여, 상기 피펫 건을 깨끗이 닦고, 이를 상기 BSC로 옮긴다.
6. 보이는 방사선 표지 스티커가 있는 개방되지 않은 수축 포장된 병들 내의 감마 조사된 입자들의 사진들을 촬영한다.
7. 상기 입자 병들을 액셀 와이프들로 깨끗이 닦고, 이들을 상기 BSC 내로 가져온다.
8. 상기 입자들이 재현탁되도록 컨테이너들을 요동시킨다.
9. 멸균 0.9% 식염수의 새로운 병을 깨끗이 닦고, 이를 상기 BSC로 옮긴다.
입자 제조
1. 모든 물질 이동 단계들은 무균 기술을 이용하여 상기 BSC 내에서 완료되어야 했다. 멸균 장갑들이 사용되었다.
2. 감마 조사의 병의 전체 내용물들(20㎖)을 50㎖의 팔콘 튜브 내로 붓는다.
3. 1000rpm으로 3분 동안 실온에서 상기 입자들을 원심 분리한다.
4. 상기 팔콘 튜브를 액셀 와이프들로 깨끗이 닦고, 이를 상기 BSC로 복귀시킨다.
5. 상층액을 상기 피펫 건으로 버린다. 일부 입자들이 상기 용액 내에 재현탁될 수 있으므로 바이알을 따르거나 부딪치게 하지 않는다.
6. 상기 펠릿을 6.8㎖의 멸균 0.9% 식염수 내에 재현탁시킨다. 잘 혼합한다.
7. 상기 용액을 500㎕ 부분 표본들 내의 멸균 고압 살균 마이크로원심분리기 튜브들로 옮긴다. 유의：상기 멸균 고압 살균 마이크로원심분리기 튜브 패키지들은 후드 내에서 개방되었다. 외부 패키지들은 상기 후드의 어떠한 표면과 접촉되지 않았고, 개방된 컨테이너들 상부를 지나가지 않았다.
8. 상기 마이크로원심분리기 튜브들을 1000rpm으로 3분 동안 실온에서 원심 분리한다.
9. 바이알들을 액셀 와이프들로 깨끗이 닦고, 이들을 상기 BSC 내로 복귀시킨다.
10. 상기 상층액을 마이크로피펫을 이용하여 버린다.
히알루론산 제조
1. 모든 상기 바이알들을 액셀 와이프들로 깨끗이 닦는다. 무균 기술이 제조 프로세스 전체에 걸쳐 이용되었다.
2. 주사기 및 바늘을 사용하여, 1㎖의 탈가스(degassed: DG) 물을 글리코실(Glycosil) 바이알에 첨가한다. 유의：산소의 존재 하에서의 글리코실 교차 결합; 캡을 제거하지 않는다.
3. 고체가 완전히 용해될 때까지 수평 위치에서 상기 바이알을 요동시킨다.
4. 주사기 및 바늘을 사용하여, 0.5㎖의 DG 물을 엑스트라링크-라이트(Extralink-Lite) 바이알에 첨가한다. 용해시키기 위해 수 회 반전시킨다.
5. 상기 글리코실이 용해되었으면, 주사기 및 바늘을 사용하여 입자들의 펠릿을 260㎕의 상기 글리코실 용액 내에 재현탁시킨다.
6. 65㎕의 상기 엑스트라링크-라이트 용액을 상기 입자-글리코실 혼합물에 첨가한다.
7. 75㎕의 2% 리도카인 용액을 상기 혼합물에 첨가하고, 멸균의 1㎖의 피펫으로 잘 혼합한다.
주사기 적재
1. 상기 BSC 내부에서, 멸균 허크 타월을 상기 BSC의 일측 상에 아래로 두어 멸균 구역을 생성한다.
2. 한 명의 연구원은 개방 장갑 착용 기술을 이용하여 멸균 장갑들을 착용한다. 이러한 연구원은 멸균 연구원으로 식별된다.
3. 비멸균 연구원이 멸균 1cc 주사기들을 상기 BSC 내로 가져왔다. 패키지들은 어떤 표면도 접촉되지 않았다. 상기 패키지들이 개방되었고, 상기 멸균 구역상으로 하강되었거나, 상기 멸균 연구원에 의해 그곳에 두어졌다.
4. 단계 3이 상기 바늘들에 대해 반복되었다. 상기 바늘 게이지는 26G였다.
5. 상기 멸균 연구원이 400㎕를 상기 주사기 내로 인출하는 동안에 상기 비멸균 연구원은 45도의 각도로 상기 더말 필러를 포함하는 상기 마이크로원심분리기 튜브를 유지하였다.
6. 적재된 주사기들은 느슨하게 재충전되었다. 유의：상기 캡은 상기 멸균 구역상에 눕혀져 있었고, 상기 바늘이 한 손으로 상기 캡 내로 삽입되었다. 두 손을 사용하는 것은 상기 바늘이 접촉되거나 상기 플라스틱 캡을 통해 밀려질 수 있는 경우에 회피되었다.
7. 상기 적재된 주사기들을 수술 영역 상의 랫에 인접하는 멸균 구역으로 옮긴다.
8. 주사는 상기 엑스트라링크-라이트 용액의 첨가의 30분 이내에 수행되었다. 상기 글루코실이 제조될 수 있었고, 상기 엑스트라링크-라이트 용액의 첨가 이전에 4시간까지 상기 마이크로원심분리기 튜브들 내에 두어졌다.
콜라겐 운반체 히드로겔을 가지는 더말 필러 제형
주요 장비
1. 생물안전 작업대
2. 원심 분리기(50㎖의 팔콘 튜브들 및 마이크로원심분리기 능력 모두)
3. 피펫 건
4. 마이크로피펫
5. 루어-락 주사기 커넥터들
콜라겐
1. 65㎎/㎖ 섬유성 아텔로콜라겐(atelocollagen)
용액들
1. 70% 에탄올
2. 멸균수
3. 멸균 식염수(0.9%)
4. 리도카인 2%-CDMV 캣(Cat)：123683
절차
설정
1. 생물안전 작업대(BSC)를 가동시킨다.
2. 상기 BSC를 액셀 와이프들로 깨끗이 닦는다.
3. 상기 하이스템 패키지들을 상기 냉동기/아이스 팩들로부터 제거한다. 상기 하이스템 패키지들을 개방하고, 바이알들을 실온까지 데워지게 한다.
4. 50㎖의 팔콘 튜브들 및 랙들로 분사되도록 70% 에탄올을 사용하고, 이들을 상기 BSC 내에 둔다. 하나의 팔콘 튜브는 상기 입자들을 수집하는 데 사용되었고, 다른 하나는 폐기물 컨테이너로 사용되었다.
5. 액셀 와이프를 이용하여, 상기 피펫 건을 깨끗이 닦고, 이를 상기 BSC로 옮긴다.
6. 보이는 방사선 표지 스티커가 있는 개방되지 않은 수축 포장된 병들 내의 감마 조사된 입자들의 사진들을 촬영한다.
7. 상기 입자 병들을 액셀 와이프들로 깨끗이 닦고, 이들을 상기 BSC 내로 가져온다.
8. 상기 입자들이 재현탁되도록 컨테이너들을 요동시킨다.
9. 멸균 0.9% 식염수의 새로운 병을 깨끗이 닦고, 이를 상기 BSC로 옮긴다.
입자 제조
1. 모든 물질 이동 단계들은 무균 기술을 이용하여 상기 BSC 내에서 완료되었다. 멸균 장갑들이 사용되었다.
2. 감마 조사의 병의 전체 내용물들(20㎖)을 50㎖의 팔콘 튜브 내로 붓는다.
3. 상기 입자들을 1000rpm으로 3분 동안 실온에서 원심 분리한다.
4. 상기 팔콘 튜브를 액셀 와이프들로 깨끗이 닦고, 이를 상기 BSC로 복귀시킨다.
5. 상기 상층액을 상기 피펫 건으로 버린다. 일부 입자들이 상기 용액 내에 재현탁될 수 있으므로 바이알을 따르거나 부딪치게 하지 않는다.
6. 상기 펠릿들을 6.8㎖의 멸균 0.9% 식염수 내에 재현탁시키고 결합시킨다. 잘 혼합한다.
7. 상기 용액을 1000㎕ 부분 표본들 내의 멸균 고압 살균 마이크로원심분리기 튜브들로 옮긴다. 유의：상기 멸균 고압 살균 마이크로원심분리기 튜브 패키지들은 후드 내에서 개방되었다. 외측 포장들이 상기 후드의 어떠한 표면과 접촉되지 않았고, 개방된 컨테이너들 상부를 지나가지 않았다.
8. 상기 마이크로원심분리기 튜브들을 1000rpm으로 3분 동안 실온에서 원심 분리한다.
9. 상기 바이알들을 액셀 와이프들로 깨끗이 닦고, 이들을 상기 BSC 내로 복귀시킨다.
10. 상기 상층액을 마이크로피펫을 이용하여 버린다.
입자 및 콜라겐 혼합
1. 상기 BSC 내부에서, 멸균 허크 타월을 상기 BSC의 일측 상에 아래로 두어 멸균 구역을 생성한다.
2. 한 명의 연구원은 개방 장갑 착용 기술을 이용하여 멸균 장갑들을 착용한다. 이러한 연구원은 멸균 연구원으로 식별된다.
3. 비멸균 연구원이 멸균 3cc 주사기들을 상기 BSC 내로 가져왔다. 패키지들은 어떤 표면도 접촉되지 않았다. 상기 패키지들이 개방되었고, 상기 멸균 구역상으로 하강되었거나, 상기 멸균 연구원에 의해 그곳에 두어졌다.
4. 상기 비멸균 연구원이 멸균 루어-락(F/F) 주사기 커넥터들을 상기 BSC 내로 가져왔다. 상기 패키지들은 어떠한 표면과 접촉되지 않았다. 상기 패키지들이 개방되었고, 상기 멸균 구역상으로 하강되었거나, 상기 멸균 연구원에 의해 그곳에 두어졌다.
5. 상기 비멸균 연구원이 냉장고로부터 콜라겐 주사기들을 제거하였고, 이들을 액셀 와이프들로 깨끗이 닦았다. 상기 콜라겐 주사기들은 상기 멸균 구역으로 옮겨졌다.
6. 멸균 주사기 및 바늘을 사용하여, 0.58㎖의 식염수를 상기 입자들을 포함하는 마이크로원심분리기 튜브에 첨가한다.
7. 멸균 주사기 및 바늘을 사용하여, 0.28㎖의 2% 리도카인을 첨가한다.
8. 상기 멸균 연구원이 3cc 주사기 및 바늘로 입자 용액을 인출하였다.
9. 상기 입자 용액 주사기를 1㎖의 65㎎/㎖ 콜라겐을 포함하는 3cc 콜라겐 주사기에 연결한다. 기포 형성을 회피한다. 상기 루어-락으로 연결을 구현하기 이전에 가능한 한 많은 공기를 배출한다. 이는 상기 멸균 연구원에 의해 이루어졌다.
10. 하나의 주사기의 내용물들을 다른 하나에 주사하여 상기 내용물들을 40회 혼합한다. 상기 입자들을 상기 콜라겐 주사기에 첨가하여 개시된다.
주사기 적재
1. 상기 비멸균 연구원이 멸균 1cc 주사기들을 상기 BSC 내로 가져왔다. 패키지들은 어떤 표면도 접촉되지 않았다. 상기 패키지들이 개방되었고, 상기 멸균 구역상으로 하강되었거나, 상기 멸균 연구원에 의해 그곳에 두어졌다. 이들 주사기들은 최종 주사들을 위한 것이었다.
2. 단계 1이 상기 바늘들에 대해 반복되었다. 상기 바늘 게이지는 21G였다.
3. 모든 물질들은 이러한 시점에서 상기 멸균 연구원만에 의해 취급되었다.
4. 상기 혼합 시스템 내에서 2.33㎖의 상기 더말 필러 모두를 하나의 주사기로 옮긴다, 상기 루어-락으로부터 빈 주사기를 연결 해제한다.
5. 상기 1cc 주사기를 상기 루어-락에 부착한다.
6. 400㎕의 상기 더말 필러를 상기 1cc 주사기 내로 적재한다. 주의：상기 1cc 주사기는 상기 루어-락 상에 잠기지 않으며, 적재될 때에 상기 루어-락에 대해 압력을 유지하므로, 적재 압력이 상기 1cc 주사기를 밀어내지 않는다.
7. 상기 적재된 주사기들은 느슨하게 다시 캡이 씌워졌다. 유의：상기 캡은 상기 멸균 구역상에 눕혀져 있었고, 상기 바늘이 한 손으로 상기 캡 내로 삽입되었다. 두 손을 사용하는 것은 상기 바늘이 접촉되거나 상기 플라스틱 캡을 통해 밀려질 수 있는 경우에 회피되었다.
8. 상기 적재된 주사기들을 수술 영역 상의 랫에 인접하는 멸균 구역으로 옮긴다.
| 더말 필러(20% v/v 입자들 및 0.3% 리도카인 포함) | 관찰 | 주해 |
| 식염수(AAS) | - 이는 생산을 위해 가장 쉬웠고, 가장 빨랐다. - 상기 입자들은 서스펜션으로 해결되었다. - 이는 상기 동물 내부에서도 그 형상을 유지하지 않았다. |
이는 주로 상기 입자 생체 적합성에 대한 대조군 테스트로 작용했으며, 다른 구성 성분들의 부존재에서 반응을 진행시켰다. |
| 히알루론산(AAHA) | - 사용된 HA는 상기 하이스템 키트였다. 이는 용액들의 모두가 주사기들로 옮겨지기 때문에 가장 시간이 소요되는 생산 방법이었다. | - 상기 HA는 상기 식염수 용액보다 그 형상을 유지하였다. 상기 입자들은 서스펜션 내에 쉽게 혼합되었고 남아 있었다. |
| 콜라겐(AAC) | - 상기 콜라겐은 피펫팅으로 혼합하기에 어려웠다. 암-암(female-female) 루어-락 접근 방식은 혼합 능력을 급격하게 증진시켰다. 상기 콜라겐 용액은 가장 점성이었다. | - 상기 혼합 및 상기 주사기들의 적재는 상기 루어-락들에 의해 촉진되었다. |
비교를 위해, 상업적으로 입수 가능한 벨라필이 구매되었고. 상술한 바와 같이 콜라겐 내에 현탁된 본 발명에서 개발된 셀룰로오스 입자들과 비교하여 그 입자 크기 분포를 평가하는 데 사용되었다. 상기 PMMA 비드들의 측정된 입자 크기 분포는 벨라필 내의 기재된 평균 입자 크기로 확인된다. 상기 PMMA 구체들은 상기 현미경 영상들 내에서 용이하게 식별되었고, 구형으로 나타난다. 본 발명에서 개발된 셀룰로오스 입자들을 가시화하기 위해, 이들은 앞서 설명한 바와 같이 콜라겐과 혼합되기 이전에 콩고 레드(0.1%)로 염색되었다(콜라겐 by 콩고 레드에 의한 콜라겐의 비특이적 염색은 확인되지 않았다). 본 발명에서 개발된 제형에서, 상기 셀룰로오스 입자들은 상기 콜라겐 겔에 걸쳐 잘 분산되는 것으로 발견되었다.도 31은 상술한 바와 같은 콜라겐 필러들을 도시한다. 도 31A는 벨라필 내의 PMMA 비드들의 입자 크기 분포를 도시한다. 도 31B는 본 발명에서 개발된 더말 필러들에 사용된 콩고 레드 염색된 콜라겐이 매우 적은 이차적인 비특이적 염색을 보여주었던 것을 도시한다. 도 31C는 벨라필의 PMMA 비드들을 도시한다. 도 31D는 콩고 레드로 염색된 콜라겐 더말 필러들 내에 사용된 본 발명에서 개발된 셀룰로오스 입자들을 도시한다. 유의：상기 콜라겐의 배경 염색은 상기 셀룰로오스 입자들로부터의 신호와 비교하여 낮다. 척도＝250㎛.
체내 생체 적합성
본 발명에서 개발된 더말 필러 제형들의 주요 성능 특성은 피하 동물 모델로 평가될 수 있다. 각 제형(AAS, AAHA, AAC, 앞서와 같이 생성됨)은 N＝9 동물들의 등내의 4 부위들 내로 주사될 수 있다. 매주, 이식 부위들이 측정될 수 있고(높이, x 및 y 폭들), 4주에서 N＝3 동물들이 희생될 수 있으며, 이식물들이 절제될 수 있다. 12주 동안, 제형 코호트(cohort) 내의 3의 동물들 중에서 2만이 희생될 수 있고, 나머지 동물은 종단 연구(예를 들면, 6개월-12개월)를 위해 유지될 수 있다. 이는 각 제형(AAS, AAHA, AAC)에 대한 데이터가 제형 당 하나의 동물로 각기 넷의 이식물들로부터 데이터를 제공하기 위해 보다 장기간 시점에서 얻어질 수 있는 것을 의미한다. 상업적으로 입수 가능한 벨라필이 비교 연구에서 사용될 수 있다. 데이터는 3 동물들의 연구(각기 2 x 400㎕ 주사들)에서 모아질 수 있다. 이들 연구들은, 예를 들면, 유사한 제형들 및 보다 많은 숫자의 동물들로의 연구에 정보를 제공할 수 있는 GLP 데이터를 생성할 수 있다. 고려된 수술 절차들은 다음과 같다.
이식 수술
사전 수술 점검
1. 상기 절차를 개시하기 이전에 모든 물질들이 확실하게 되고, 공급물들이 이용 가능한 지를 점검한다. 다음의 항목들을 점검한다.
a. 산소 탱크 레벨
b. 아이소플루레인(isoflurane) 레벨
c. 멸균 팩
d. 봉합 물질
e. 멸균 식염수
f. 멸균수
g. 티어 겔(tear gel)
h. 부프레노르핀(buprenorphine)
I. 마취 스테이션을 위한 히터
2. 상기 동물이 계량되었고, 부프레노르핀의 상응하는 양：0.05㎎/㎏이 주어졌는지를 확보한다.
3. 투여되는 식염수의 양：5㎖/㎏을 계산한다.
4. 산소 공급기를 켬. 레벨 2로 설정한다.
5. 상기 아이소플루레인을 가동시킨다. 상기 공급기를 마취 박스에 연결한다. 레벨 3으로 설정한다.
동물 준비
1. 랫(rat)을 상기 마취 박스로 옮긴다.
2. 상기 랫이 의식이 없게 되면, 이를 준비 스테이션으로 옮긴다. 상기 아이소플루레인을 상기 준비 스테이션에 연결한다.
3. 상기 아이소플루레인 레벨을 2로 낮춘다.
4. 티어 겔을 상기 랫의 눈들에 적용한다.
5. 상기 랫의 등의 일 측부 털을 면도한다.
6. 털을 진공 흡입한다.
7. 임의의 헐거운 털을 제거하기 위해 피부를 물이 흡수된 면봉으로 닦는다.
8. 건조 면봉을 사용하여, 상기 피부로부터 물을 제거하고, 임의의 남아 있는 털을 솔로 턴다.
9. 상기 랫의 면도하지 않은 측부 내로 수화를 유지한 상기 식염수를 주사한다.
10. 상기 랫을 수술 구역으로 옮긴다.
11. 상기 피부를 클로로헥시딘(chlorhexidine)(4%) 내에 함침된 면봉들로 살균한다. 단일 방향으로 닦는다. 피부 모두가 닦였는지를 확인한다.
주사들
1. 한 명의 연구원은 가운을 입고 멸균 장갑을 착용한다. 적절한 장갑 착용 기술(폐쇄/개방)이 상기 연구원이 새로운 가운을 입었거나 그렇지 않은지에 따라 이용된다.
2. 넷의 400㎕ 주사들을 상기 동물에 인접하는 살균 구역으로 가져온다.
3. 비멸균 연구원은 주사 전에 주사 부위들을 촬영한다.
4. 멸균 연구원이 상기 주사기들의 내용물들을 상기 랫의 살균되고 면도된 등 위의 넷의 별도의 위치들 내로 주사한다.
5. 상기 비멸균 연구원이 상기 주사 부위들을 촬영한다.
6. 상기 랫은 측정 스테이션으로 옮겨진다.
7. 상기 랫은 이후에 회복 스테이션으로 옮겨지고, 동물 ID 카드가 회복 케이지 상에 두어진다.
주별 크기 측정들
상기 이식 부위들을 평가하기 위해, 다음의 절차가 모든 동물들에 대해 주사하는 날의 시작에서와 이후에 매주 적용될 수 있다.
상기 동물을 마취함
1. 상기 산소 탱크를 개방한다.
2. 상기 아이소플루레인 라인을 상기 마취 박스에 연결한다.
3. 상기 아이소플루레인을 3으로 높인다.
4. 상기 동물을 상기 마취 박스로 옮긴다.
5. 상기 동물이 의식이 없어지고, 깊게 호흡(매 3초마다 1호흡)하고 있으면, 상기 랫을 상기 측정 스테이션으로 옮긴다. 상기 아이소플루레인은 상기 측정 스테이션에 대해 2로 설정된다.
측정들
1. 측정들을 가능한 한 신뢰성 있도록 만들기 위해, 상기 이식 부위들로부터 털이 면도될 수 있다.
2. 버니어 캘리퍼스를 이용하여, 상기 더말 필러 주사에 의해 야기된 피부 아래의 범프(bump)들의 크기들을 측정한다. 상기 캘리퍼스는 각 세트의 측정들을 개시하기 전에 영으로 맞추어져야 한다.
3. 크기 측정들(예를 들어, 직경 X, 직경 Y, 높이)을 수집하고 기록한다.
4. 마감될 때에 상기 이식 부위들 주위에 원을 그린다.
5. 상기 부위들의 순서는 두개골(cranial)로부터 꼬리 방향이다. 예를 들면, 부위 1이 상기 랫의 머리에 가장 가깝다.
6. X 방향은 중앙-측방 방향인 반면, Y 방향은 꼬리-두개골 방향이다.
7. 직경 X 및 직경 Y 측정들은 상기 캘리퍼스의 전방 단부로 취해질 수 있다.
8. 높이는 상기 캘리퍼스의 하부 갈래로 측정된다.
9. 상기 측정들이 취해졌고 기록되었으면, 상기 동물은 상기 케이지 및 동물 방으로 돌아갈 수 있다.
10. 모든 물병들이 적절한 배향으로 다시 두어지는 지를 확인한다.
희생 및 조직 수집
1. 상기 동물을 상기 마취 박스로 옮긴다.
2. 둘의 랫들을 동시에 처리할(두 박스들이 연결될) 때, CO2의 초기 유량을 6으로 설정하고, 이후에 상기 랫들이 의식이 없게 될 때에 12로 증가시킨다.
3. 상기 동물의 호흡 양상을 모니터한다. 적어도 5분 대기한다.
4. 상기 호흡이 1분 동안 중단되었던 것을 확인한다.
5. 상기 CO2를 끈다.
6. 상기 마취 박스로부터 상기 랫을 제거하고, 상기 랫을 그 배면을 상부에 둔다.
7. 검상(xiphoid)을 위치시키고, 피부 내에 절개를 만든다.
8. 횡격막을 천공한다. 심장이 보여야 한다.
9. 심장을 자르고, 혈액이 흘러나오는 것을 확인한다.
10. 등이 노출되도록 상기 동물을 그 위장 상으로 뒤집는다.
11. 척추의 중심을 따라 엉덩이로부터 어깨까지 상기 피부를 자른다. 상기 피부를 벗기고, 연결 조직을 잘라낸다. 상기 피부의 판(flap)은 상기 이식물/주사된 물질을 함유해야 한다.
12. 척도를 위한 자와 함께 상기 피부 판 내의 물질을 사진 촬영한다.
13. 상기 이식물들을 개별적으로 잘라낸다. 상기 피부가 그 밑의 물질을 유지하는 것을 확인한다. 이는 상기 샘플들을 조직학 동안에 배향시키는 데 도움이 될 것이며, 천연 조직과 방향 비교를 제공할 것이다.
14. 상기 샘플들을 포르말린(formalin)(4%)으로 빠르게 옮긴다.
15. 상기 이식물의 크기 및 수행되는 염색에 따라, 포르말린 고정의 47시간 또는 72시간 이후에 상기 샘플을 70% 에탄올로 옮긴다.
조직학
샘플들은 절제가 수반되어 파라핀 블록들 내에 매립하기 위해 조직학으로 보내질 수 있다. 상기 블록들은 단면 내에서 상기 이식을 관찰하기 위하여 상기 피부의 평면에 직교하게 절개될 수 있다. 상기 이식은 그 에지로부터 ~500㎛의 하나의 레벨 및 상기 조직 내로 ~1.5㎜의 제2의 레벨로 절개될 수 있다. 이는 상기 이식물의 외측 에지 및 대략적인 중심을 모두 조사하게 할 수 있다. H&E 및 메이스 트리크롬(Masson's Trichrome) 염색들이 지시될 뿐만 아니라 몇몇은 슬라이드들은 염색되지 않는다.
다음의 체내 생체 적합성 결과들이 얻어졌다.
수집된 체내
생체 적합성 결과들
조사된 상기 더말 필러들은 식염수(AAS), 히알루론산(AAHA) 및 여기에 앞서 설명한 여과되고 감마 살균된 셀룰로오스계 입자들을 포함하는 콜라겐(AAC)계 필러들이었다. 모두 셋의 더말 필러들이 랫 모델 내로 주사되었다.
도 32는 더말 필러 주사 결과들을 도시한다. 도 32A는 주사 전의 상태를 도시하며, 도 32B는 윤곽이 그려진 범프 경계가 있는 주사 전의 상태를 도시한다. 도 33은 식염수, 히알루론산(HA) 그리고 0% 탈세포화 사과 유래의 여과된 입자들 및 0.3% 리도카인과 결합된 콜라겐계 필러들의 절제를 도시한다.
상술한 바와 같이, 동물들 및 모든 제형들에 대한 상기 이식 부위들은 매주 측정되었다. 상기 이식물 크기 특성들은 도 34 및 도 35에 도시한 바와 같았다. 도 34는 이식 부위들을 도시한다. 높이는 상기 AAS(청색), AAHA(적색), AAC(흑색) 및 벨라필(보라색) 이식물들이다. 모든 이식물들은 상기 운반체 유체/히드로겔들의 재흡수로 인해 시간에 따라 수축되고 있었다. 상기 AAS 제형은 빠르게 재흡수되었다. 도 35는 이식물 체적을 도시한다. 체적은 상기 AAS(청색), AAHA(적색), AAC(흑색) 및 벨라필(보라색) 이식물들이다. 모든 이식물들은 상기 운반체 유체/히드로겔들의 재흡수로 인하여 시간에 따라 수축되고 있었다. 상기 AAS 제형은 빠르게 재흡수되었다.
상기 데이터는 상기 AAS 필러가 동물의 몸체 내로의 식염수의 재흡수로 인하여 빠르게 수축되는 것을 뒷받침한다. 콜라겐, HA 및 벨라필의 경우, 상기 이식물들은 크기가 서서히 수축되지만, 초기 주사 이후의 몇 개월에서 보이게 남는다. 동물들의 숫자는 작았지만, 벨라필 및 본 발명에서 개발된 더말 필러들의 정량적인 이식물 크기는 대략적으로 유사하다. 잠재적으로, 본 발명에서 개발된 필러들은 상기 벨라필 제품보다 덜 빠르게 수축할 수 있지만, 이들은 유사한 베이스라인 크기에 도달하였던 것으로 나타난다.
4주, 8주 및 12주 후, 적절한 동물들이 희생되었고, 상기 이식물 조직들이 수집되었다. AAS의 경우, 상기 식염수가 동물의 몸체 내로 빠르게 재흡수되므로 상기 필러 입자들만이 피부 밑에서 볼 수 있다(측정된 크기 데이터와 일치함). 따라서 상기 더말 필러는 실제로 비재흡수성이었지만, 상기 더말 필러 제형 내에 사용된 운반체 유체는 재흡수되었다.
실험예 4-변경된 더말 필러들
변경된 더말 필러들이 본 실험예에서 고려된다. 상기 물질의 형상 및 크기 분포의 보다 높은 제어를 부여하기 위해, 상기 셀룰로오스계 물질들이 특정한 기하 구조들 및/또는 크기들로 교차 결합시키기 위해 용해될 수 있는 점이 고려되었다. 숙신산, 수산화나트륨 및 요소 처리, 그리고 알긴산염 및 염화칼슘을 가지는 복합체들과의 화학적 교차 결합과 같은 몇몇 교차 결합 방법들이 특정 실시예들에서 고려된다. 고려된 샘플 용해 연구 계획이 다음에 개괄된다.
비율：50g의 탈세포화 사과＝1.568g의 셀룰로오스 물질
용매 제조：
● DMAc：115℃에서 15분 동안
● LiCl：180℃에서 48시간 동안
연구 계획：
● 50g의 탈세포화 물질을 계량한다.
● 아세톤 내에 함침시킨다(초음파 배스 내에서 15분).
● 상기 아세톤을 제거하기 위해 원심 분리한다.
● 앞서의 두 단계들을 두 번 더 반복한다.
● DMAc 내에 함침시킨다(초음파 배스 내에서 15분).
● 상기 아세톤을 제거하기 위해 원심 분리한다.
● 앞서의 두 단계들을 두 번 더 반복한다.
● 50㎖의 DMAc 당 6g의 비율로 LiCl 첨가한다.
● 100℃에서 1시간 동안 유지한다.
● 온도를 50℃까지 72시간 동안 감소시킨다(교반하면서).
● 상기 셀룰로오스를 물 교환으로 재생한다.
실험예 5-셀룰로오스 입자 생산의 효율
본 실험예에서 기술되는 연구들은 출발 물질로서 사과들을 사용하여 셀룰로오스계 입자 생산에 대한 잠재적 수율에 대한 조사를 제공하도록 수행되었다.
사과 샘플들의 탈세포화
캐나다 팬시에서 제공된 매킨토시 사과들이 셋의 별도의 배치(batch)들 내로 분리되었고, 각각의 상기 셋의 배치들은 계량되었다. 각 배치의 중량을 다음 표 5에 나타낸다.
| 배치 | 배치 내의 사과들의 숫자 | 배치 출방 질량(g) |
| 1(AA124) | 16 | 1927.58 |
| 2(AA125) | 15 | 1902.37 |
| 3(AA126) | 15 | 1885.11 |
각 배치의 사과들은 껍질을 벗기기 이전에 70% 에탄올 및 액셀(Accel) TB 소독제로 세척되었다. 껍질을 벗긴 후, 각 배치의 샘플들은 1㎜의 두께로 슬라이스로 되었다. 상기 사과들 속심들은 제거되었고, 상기 슬라이스들은 사분되었다.상기 샘플들을 탈세포화하기 위해, 이들은 이후에 하루에 한 번의 용액 변화들과 함께 0.1% SDS 내에서 72시간 동안 두어졌다. 각 배치의 샘플들은 이후에 증류수로 세 번 세척되었고, 후속하여 100M CaCl2 용액 내에 24시간 동안 함침되었다. 상기 탈세포화 프로세스 동안, 상기 샘플들은 120RPM로 흔들어졌다.
각 배치의 샘플들은 이후에 증류수로 추가로 세 번 세척되었고, 30분 동안 70% 에탄올 내에서 살균되었다. 상기 샘플들은 이후에 다른 사용까지 증류수 내에서 4℃에서 저장되었다.
탈세포화 샘플들의 동결 건조
상기 탈세포화 샘플들은 가능한 한 많은 증류수를 제거하도록 배수되었고, 이후에 50㎖의 팔콘 테스트 튜브들 내에 두어졌다. 상기 샘플들은 이후에 -20℃에서 냉동되었고, 이어서 유리 컨테이너 당 3-4 테스트 튜브들로 유리 컨테이너 내의 랍콘코(Labconco) 동결 건조기 상에 장착되었다. 상기 샘플들은 48시간 동안 55mbar 및 -47℃에서 동결 건조되었다. 상기 샘플들은 건조 후에 계량되었고, 그 결과들을 다음의 표 6에 나타낸다.
건조된 샘플들의 분쇄
각 배치의 탈세포화되고 동결 건조된 샘플들은 렛치 밀(Retsch Mill) ZM-200으로 18,000RPM에서 80㎛ 체로 분쇄되었다. 상기 입자들은 다음 표 6에 나타낸 바와 같이 50㎖의 튜브들 내에 수집되었고 계량되었다. 상기 샘플들은 이후에 추가 사용까지 4℃에서 저장되었다.
분쇄된 샘플들의 체가름
각 배치의 분쇄된 샘플들은 연속적인 체가름을 가능하게 하는 길슨 진동 체 진탕기(SS-23) 시스템으로 체질되었다. 상부 체는 50㎛ 메시를 가졌고, 하부 체는 25㎛ 메시를 가졌다. 상기 50㎛ 체는 ＞50㎛의 입자들을 유지하였다. ＜25㎛의 입자들은 상기 25㎛ 체를 통과하였다. 여과된 입자들(25㎛ 내지 50㎛의 크기)은 상기 25㎛ 체로부터 수집되었고, 계량되었다.
분쇄 후, 각각의 배치들로부터 5㎖의 분쇄된 샘플이 증류수 내에 45㎖의 최종 부피를 위해 재현탁되었다. 재현탁물은 상기 50㎛ 체 상으로 부어졌고, 2분 후에 150㎖의 증류수가 첨가되었다. 일분 후, 다른 150㎖의 물이 상기 상부 체에 첨가되었다(이러한 단계는 두 번 반복되었다). 상기 50㎛ 체는 이후에 제거되었고, 50㎖의 증류수가 상기 25㎛ 체에 첨가되었다. 일분 후, 또 다른 50㎖의 물이 상기 체에 첨가되었다(이러한 단계가 두 번 반독되었다). 상기 25㎛ 체 상의 분쇄된 샘플들의 습윤 입자들이 수집되었고, 원심 분리 튜브 내에 두어졌다. 이러한 프로세스는 상기 분쇄된 샘플들 모두가 여과되었을 때까지 반복되었다. 상기 여과된 샘플들은 상기 입자들을 펠릿으로 만들기 위해 이후에 7분 동안 5000RPM으로 원심 분리되었으며, 이들은 이후에 4℃에서 저장되었다.
상기 여과되고 펠릿으로 된 샘플들은 다음 표 6에 나타내는 바와 같이 이후에 앞서 설명한 동일한 조건들 하에서 동결 건조되었고, 이어서 계량되었다.
| 배치 | 동결 건조된 배치 질량(g) | 분쇄된 배치 질량(g) | 건조된 25㎛-50㎛ 입자들의 질량(g) |
| 1(AA124) | 22.0118 | 19.6693 | 2.6786 |
| 2(AA125) | 15.0805 | 14.1494 | 2.5615 |
| 3(AA126) | 12.7896 | 11.4461 | 1.5875 |
상기 두 번째 동결 건조가 상기 샘플들의 건조 질량을 측정하기 위해서만 수행되었고, 더말 필러 샘플 생산에 대해서는 필수적이 아닌 점에 유의한다.
입자 수율의 결정
위의 절차들 동안에 수집된 데이터를 이용하여, 셋의 다른 입자 수율들이 계산되었다. 즉, 출발 배치 질량들(전체 사과들)로부터, 상기 동결 건조된 배치 질량들로부터, 그리고 상기 분쇄된 배치 질량들로부터 계산되었다. 결과들은 표 7에 나타낸다.
| 배치 | 배치 출발 질량으로부터의 퍼센트 수율(%) | 동결 건조된 배치 질량으로부터의 퍼센트 수율(%) | 분쇄된 배치 질량으로부터의 퍼센트 수율(%) |
| 1(AA124) | 0.139 | 12.2 | 13.6 |
| 2(AA125) | 0.135 | 17.0 | 18.1 |
| 3(AA126) | 0.0882 | 12.4 | 13.9 |
상기 수율들의 평균들이 취해졌고, 표 8에 나타난다.
표 7 : 입자 생산 수율들의 평균, 표준 편차 및 표준 오차
결과들
상기 배치 출발 질량으로부터의 수율은 상기 건조된 25㎛-50㎛ 입자들 및 상기 배치 출발 물질의 질량을 이용하여 계산되었다. 상기 배치 출발 질량으로부터의 퍼센트 수율은 0.119%±0.018%였으며, 이는 0.119g의 건조된 입자들이 100g의 출발 물질로부터 얻어지는 것, 또는 83,843.38g의 사과가 100g의 건조된 입자들을 생성하기 위해 요구되는 것을 의미한다.
상기 동결 건조된 배치 질량으로부터의 수율은 상기 건조된 25㎛-50㎛ 입자들 및 상기 동결 건조된 배치 질량을 이용하여 계산되었다. 상기 동결 건조된 배치 질량으로부터의 퍼센트 수율은 13.9%±1.6%였으며, 이는 13.9g의 건조된 입자들이 100g의 상기 동결 건조된 샘플들로부터 얻어지는 것, 또는 721.7g의 동결 건조된 배치 샘플들이 100g의 건조된 입자들을 생성하기 위해 요구되는 것을 의미한다.
상기 분쇄된 배치 질량으로부터의 수율은 상기 건조된 25㎛-50㎛ 입자들 및 상기 분쇄된 배치 질량을 이용하여 계산되었다. 배치 질량으로부터의 퍼센트 수율은 15.2%±1.5%였으며, 이는 15.2g의 건조된 입자들이 100g의 상기 분쇄된 샘플들로부터 얻어지는 것, 또는 658.0g의 분쇄된 샘플들이 100g의 건조된 입자들을 생성하기 위해 요구되는 것을 의미한다.
상기 배치들로부터의 수율들의 변화는 부분적으로 상기 샘플 제조에 기인할 수 있다. 어떠한 특정 이론에 구속되지 않고, 상기 사과의 크기, 사과 속심 상에 남아 있는 과육의 양, 분쇄 동안의 분말 손실 및 체가름 동안의 분리의 정도의 변화가 개별적으로 또는 함께 상기 수율들에 영향을 미칠 수 있는 것으로 상정된다.
이에 관계없이, 상기 연구들은 본 발명의 방법들의 규모를 증가시킬 때에 요구될 수 있는 상기 물질들에 대한 이해를 제공한다.
실험예 6-셀룰로오스 입자들의 밀도들
본 실험예에 기술된 연구들은 본 발명의 셀룰로오스 입자들의 개수 밀도(number density)(체적 당 입자들의 숫자)를 결정하기 위해 수행되었다. 일반적으로, 표준 산업 수행은 질량/체적 농도의 측면들에서 더말 필러들의 입자 농도를 설명하고 있다. 그러나 개수 밀도의 관점에서 상기 필러들의 입자 농도를 기술하는 것이 일부 경우들에서 유용할 수 있다.
밀도 결정
실험예 5에 앞서 기재된 바와 같이 생산된 탈세포화되고 살균된(여과되지 않은) 사과 입자들은 실험예 5dop서도 설명한 바와 같이 길슨 진동 체 진탕기를 이용하여 여과되었다. 상기 여과된 입자들은 15㎖의 팔콘 튜브 내에 수집되었고, 7분 동안 5000RPM으로 원심 분리하여 펠릿으로 되었다. 상기 프로세스는 2.5㎖의 습윤 25㎛-50㎛ 입자들이 얻어졌을 때까지 반복되었다.
상기 입자들은 15㎖의 물 내에 재현탁되었고, 이후에 3의 튜브들 사이에 균등하게 분할되었다(각 튜브 내에 0.833㎖의 입자들). 198㎕의 물 내에 현탁된 동등한 33㎕의 입자들(16.7% v/v 재현탁물)이 멀티사이저(Multisizer) 4를 이용한 입자 계수 분석을 위해 각 튜브로부터 제거되었다.
각 튜브 내에 남아 있던 0.800㎖의 여과된 입자들은 펠릿화되었고, 냉동되었으며, 랍콘코 동결 건조기로 55mbar와 -46℃에서 4일 동안 동결 건조되었고, 이후에 표 8에 나타낸 바와 같이 입자 질량 밀도를 계산하기 위해 계량되었다.
| 샘플 | 습윤 입자 체적(㎖) | 동결 건조된 입자들의 질량(g) | 입자 질량 밀도(g/㎖) |
| 1 | 0.800 | 0.0929 | 0.116 |
| 2 | 0.800 | 0.0935 | 0.117 |
| 3 | 0.800 | 0.0972 | 0.122 |
습윤 체적 당 건조된 입자들의 평균 밀도가 이후에 계산되었으며, 표 9에 나타낸다.
| 건조된 입자들의 밀도(g/㎖) | |
| 평균 | 0.118 |
| 표준 편차 | 0.00291 |
| 표준 오차 | 0.00168 |
건조된 입자들의 밀도는 0.118g/㎖±0.00168g/㎖이었고, 이는 1㎖의 습윤 입자들 당 0.118g의 건조된 입자들이 존재하는 것, 또는 8.47㎖의 습윤 입자들이 건조되면 1g로 계량되는 것을 의미한다.입자들에 의해 점유되는 20% 체적을 가지는 표준 400㎕ 더말 필러 주사 체적은 주사 당 80㎕의 입자들의 결과로 된다. 이에 따라, 앞서 제시된 농도 및 밀도 결과들에 기초하여 400㎕의 주사 당 입자들의 건조 질량은 9.4㎎이었다.
입자 계수 분석
둘의 샘플들이 각각의 상기 셋의 샘플들로부터 제조되었다. (4) 10㎕의 상기 16.7% v/v 입자 재현탁물이 10㎖의 이소톤(ISOTON)과 혼합되었고, (5) 20㎕의 상기 16.7% v/v 입자 재현탁물이 10㎖의 이소톤과 혼합되었다. 입자 계수 분석은 100㎛의 구경(aperture) 및 200㎕의 분석된 체적을 사용하여 멀티사이저 4 코울터 카운터(Coulter Counter)를 이용하여 각 샘플에 대해 수행되었으며, 이는 0.0336㎕의 입자들이 샘플들(4) 내에서 분석되었고, 0.0673㎕의 입자들이 샘플들(5) 내에서 분석되었던 것을 의미한다. 첫 번째 수행은 2㎛-60㎛의 입자들을 분석하였고, 두 번째 수행은 10㎛ 내지 60㎛의 입자들을 분석하였다.
각 수행 사이에서, 이소톤(블랭크(blank)) 샘플도 상기 코울터 카운터에 의해 계수된 기포들의 숫자를 정량화하기 위해 상기 기구로 동일한 설정들로 분석되었다. 이들 값들은 상기 샘플들(4) 및 상기 샘플들(5)에 대해 얻어진 경우들을 조정하는 데 이용되었다. 블랭크 값들은 표 10에 나타난다.
| 입자 크기의 간격(㎛) | 계수된 입자들의 숫자(평균) |
| 2-60 | 541 |
| 10-60 | 26 |
각각의 상기 샘플들(4) 및 상기 샘플들(5)의 입자 계수 분석으로부터의 결과들을 다음 표 11에 나타낸다.
| 간격(㎛) | 10㎖의 이소톤에 첨가된 입자 재현탁물의 체적(㎕) | 계수된 입자들의 숫자(평균) | 계수된 입자들의 조정된 숫자(평균) | 습윤하고, 펠릿으로 되며, 여과된 입자들의 ㎖ 당 입자 계수 |
| 2-60 | 10 | 4607 | 4066 | 120,915,052 |
| 20 | 9066 | 8525 | 126,753,151 | |
| 10-60 | 10 | 2549 | 2523 | 75,023,037 |
| 20 | 5244 | 5218 | 77,582,781 |
예시의 목적으로, 상기 샘플들(4)의 입자 크기 분포가 도 36에 도시된다. 각각의 상기 샘플 1-샘플 3으로부터의 샘플들(4) 및 샘플들(5)의 입자 계수들은 평균화되었고, 그 결과들을 표 12에 나타낸다.
표 12：10㎕ 및 20㎕의 샘플들로부터 평균화된 입자 계수 분석
앞서 논의한 바와 같이, 이용된 상기 구경은 100㎛이었다. 이러한 구경은 2㎛ 내지 60㎛의 직경의 입자들을 셀 수 있다. 2㎛-60㎛ 분석에 따르면, ㎖의 습윤 입자들 당 123,834,101±2,919,049 입자들이 존재하였고, 상기 10㎛-60㎛ 분석은 ㎖의 습윤 입자들 당 76,302,909±1,279,872 입자들을 보여주었다.
이는 400㎕의 더말 필러 주사 당 9,906,728의 입자들(2㎛-60㎛ 분석) 또는 6,104,233의 입자들(10㎛-60㎛ 분석)이 존재하였던 것을 의미한다.
15㎛의 반경 및 1㎛의 두께를 가지는 실린더 형상의 입자 기하 구조 상정에 기초한 상기 입자들의 개수 농도에 대한 단순화된 이론적인 산정을 다음에 나타낸다. 두께가 0.1㎛인 것으로 상정되면, 입자들의 숫자는 10의 인자로 증가될 것이다.
이론적인 값과 관찰된 값 사이의 불일치는 코울터 카운터 분석에서의 부정확성들을 포함하는 수많은 인자들(예를 들어, 기포들, 서스펜션 외부의 입자 고정들, 입자 크기 변화들 및 포장 파라미터들)(보이드 체적(void volume)은 이러한 계산에서 고려되지 않았음)에 기인할 수 있다.
이러한 불일치들에도 불구하고, 9.4㎎/400㎕ 주사의 건조 입자 질량 밀도 및 706.5㎛3의 단일 입자(또는 플레이크) 체적 추정과 함께 고려된 약 1x107입자들/400㎕ 주사의 개수 밀도는 1.33g/㎤의 단일 입자 밀도를 가져오며, 이는 셀룰로오스 밀도(1.5g/㎤)의 문헌 값의 경우와 대략적으로 동일하다.
실험예 7-셀룰로오스 입자들에 대한 체외 세포 반응들
본 연구는 본 발명의 여과된 및 여과되지 않은 셀룰로오스 입자들에 대한 체외 세포 반응을 평가하기 위해 수행되었다.
입자 제조
여과된 입자들을 제조하기 위해, 살균되고, 여과되지 않았으며, 탈세포화되고 분쇄된 사과 입자들이 멸균수를 사용하고 다음의 절차를 이용하여 상기 길슨 진동 체 진탕기(SS-23) 시스템으로 체질되었다.
5㎖의 입자들이 45㎖의 최종 체적까지 멸균 증류수 내에 재현탁되었다. 재현탁물은 상기 50㎛ 체 상으로 부어졌고, 2분 후에 150㎖의 증류수가 첨가되었다. 1분 후, 또 다른 150㎖의 물이 상기 상부 체에 첨가되었다(이러한 단계는 세 번 반복되었다). 상기 50㎛ 체가 제거되었고, 50㎖의 증류수가 상기 25㎛ 체에 첨가되었다. 1분 후, 또 다른 50㎖의 물이 상기 체에 첨가되었다(이러한 단계는 두 번 반독되었다). 상기 25㎛ 체 상의 습윤 입자들이 수집되었고, 50㎖의 팔콘 튜브 내에 두어졌다. 체가름 프로세스는 충분한 양의 여과된 입자들이 수집되었을 때까지 반복되었다.
상기 여과된 및 여과되지 않은 입자들 모두는 상기 입자들을 펠릿으로 만들기 위해 7분 동안 5000RPM에서 원심 분리되었다. 펠릿으로 되고 여과된 및 여과되지 않은 입자들의 체적들이 다른 시험들 동안에 상기 플레이트들에 첨가된 체적을 계산하는 데 이용되었다.
분석들
플레이트들에 첨가되지 이전에, 상기 입자들은 예열된 DMEM 내에 2.5㎖의 최종 체적까지 재현탁되었다. 50,000 C2C12 세포들이 상기 실험 이전의 24시간에서 6웰 플레이트(9.6㎠)의 각 웰 내에 플레이트로 되었다. 상기 세포들은 상기 입자 용액으로 37℃에서 5% CO2 하에서 48시간 동안 배양되었다. 이후에, 2.5㎖의 상기 입자 용액이 각 웰에 첨가되었다.
상기 연구들에 대해 이용된 조건들은 세포 배양 배지에 대하여 상기 입자들의 체적：체적 퍼센티지들이었다. 이용된 퍼센티지들은 1%, 2%, 3% 및 20%였다. 다시 말하면, 1% 농도는 2.5㎖의 배지의 전체 체적 내에 25㎕의 입자들을 가졌다.
상기 20% 농도들이 여기서 앞서 이용된 체내 농도를 복제하도록 선택되었다. 그러나 이해될 수 있는 바와 같이, 체외 및 체내 조건들은 다르게 변화되며, 선택되는 경우를 가졌던 농도들이 세포 형태를 방해하지 않는다. 예를 들면, 체외 시스템들은 기체 교환을 조절하는 능력이 결핍되고, 등장 조건들을 유지하며, 그 결과로 세포 형태에 영향을 미치지 않기 위해 약 1%와 같이 감소된 농도들을 요구할 수 있다 따라서 상기 체외 결과들이 체내 독성 결과들로 직접적으로 해석되지 않을 수 있다.
세포 배양, 고정, 염색 및 영상화
상기 배지 및 그 내부에 함유된 입자들은 영상화를 위해 상기 플레이트들로부터 제거되었다. 상대적으로 높은 입자 농도들은 아래에 있는 층의 세포들을 관찰하는 것을 어렵게 하였으므로, 상기 입자들을 고정 이전에 제거되었다.
상기 세포들은 5㎖의 PBS을 사용하여 세 번 세척되었다. 3㎖의 3.5% PFA가 각 플레이트에 첨가되었다. 10분의 배양 후, 세포들은 5㎖의 PBS로 다시 세척되었다. 이후에, 5㎖의 PBS가 상기 세포들에 첨가되었고, 상기 플레이트들은 파라필름(parafilm)으로 밀봉되었으며, 4℃에서 저장되었다. 5㎕의 훽스트 33342가 5㎖의 PBS를 함유하는 각 플레이트에 첨가되었다. 상기 플레이트들은 어둠 속에서 30분 동안 실온에서 배양되었으며, 이후에 파라필름으로 밀봉되었고, 4℃에서 저장되었다.
상기 플레이트들은 이후에 올림푸스(Olympus) SZX16 현미경으로 영상화되었다.
결과들
C2C12 세포들에 대한 20% v/v의 입자들의 첨가는 37℃, 5% CO2에서의 48시간의 배양 후에 상기 플레이트들 내의 세포 밀도에 분명한 영향을 미쳤다. 비록 상기 여과된 및 여과되지 않은 입자들 모두에 대해 플레이트들에 고착된 일부 세포들이 존재하였지만, 세포 형태는 이들이 쪼그라들게 나타나도록 변경되었다. 상기 입자들을 포함하는 플레이트들은 상기 대조군보다 상당히 적은 세포들을 가졌으며, 상기 대조군 세포들은 정상적인 근원세포(myoblast) 형태들을 나타내었다. 융합은 상기 여과되지 않은 입자들을 가지는 플레이트들 내에서 보다 상기 여과된 입자들을 수용한 플레이트들 내에서 높다. 어떠한 특정 이론에 구속 받지 않고, 체외 환경에서 작은 입자들이 삼투 영향, 화학적 침출로 인한 괴사 및/또는 포식 작용과 세포자멸사로 인하여 세포 사멸을 야기할 수 있는 것으로 추정된다.
상기 20% 샘플들에서, 상기 접시 내의 입자들의 높은 농도는 상기 플레이트에 부착된 세포들을 관찰하기 어렵게 하였으며, 그 결과로 부유하는 세포들만을 볼 수 있었다. 상기 입자들이 없이 세포들을 영상화하는 것은 영상화 동안에 신호를 차단하는 입자들이 존재하지 않았기 때문에 보다 정확한 세포 밀도 정량화를 가능하게 하였다.
도 37은 상기 20% 샘플들의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 37A는 상기 대조군의 현미경 영상들을 도시하고, 도 37B는 상기 20% 여과된 입자 샘플의 세포들의 현미경 영상들을 도시하며, 도 37C는 상기 20% 여과되지 않은 입자 샘플의 세포들의 현미경 영상들을 도시한다. 배율은 10X였고, 축척 바는 500㎛이다.
도 38은 상기 20% 여과된 및 여과되지 않은 입자 샘플들에 대한 세포 농도들(세포들/㎟)을 도시한다.
상술한 바와 같이, 상기 20% 샘플들이 체외 조건들 하에서 상기 세포 형태에 영향을 미칠 수 있는 점이 예측되었다. 또한 앞서 논의된 바와 같이, 체외 및 체내 조건들은 크게 다르다. 그 결과, 20% 입자 농도가 체내로 변경된 세포 형태들을 가져오지는 않을 것으로 예상된다.
상기 배지 내의 입자들의 높은 농도는 상기 용액의 삼투도를 변경시킬 수 있으며, 그 결과로 물이 엔트로피 인자들로 인해 상기 세포들 외부로 밀려날 수 있다. 또한, 상기 세포들의 상부 상의 입자들의 층은 효율적인 가체 교환을 방지하였으며, 결국 세포 사멸을 가져왔다. 체내 조건들 하에서, 기체 교환을 조절하고, 용질 농도들의 변화들 및 삼투 구배들 또는 압력들을 보상하는 자연 시스템들이 존재한다.
따라서 다음에 논의되는 보다 낮은 농도들이 정상 세포 형태가 관찰될 때에 상기 입자 농도의 영향을 평가하기 위해 선택되었다. 1%, 2% 및 3%의 보다 낮은 입자 농도들에 대해, 입자 서스펜션들이 여과된 및 여과되지 않은 샘플들 모두에 대해 사용되었다.
도 39는 상기 대조군과 상기 여과된 및 여과되지 않은 보다 낮은 농도 샘플들의 세포들의 표면적 커버리지를 도시한다. 도시한 바와 같이, 2% 농도에 대해, 상기 여과된 및 여과되지 않은 입자들 사이에 유의차가 있었다.
결과들은 입자 농도가 상기 배지 내의 입자들의 생존 증가 양들까지 세포들의 능력에 대해 영향을 미칠 수 있고, 세포 사멸의 보다 높은 비율들을 가져올 수 있는 점을 제시한다. 또한, 상기 여과도 부착된 세포들의 양에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 여과되지 않은 입자들은 대체로 적은 세포 성장/세포 면적 커버리지 및 보다 큰 세포사멸을 가져왔다.
다시 앞서 논의한 바와 같이, 삼투압 조정, 기체 교환 프로세스들, 면역 세포들 등으로 인해 정확한 입자 농도들이 체외 시스템들로부터 체내 시스템들까지 직접적으로 해석되지는 않는다.
예를 들면, 체외 및 체내 시스템들 사이의 산소 확산에서 상당한 변화들이 존재한다. 보다 상세하게는, 체외 시스템들은 상기 세포 배양 배지를 통한 산소의 확산에 의존한다. 상기 산소가 이를 통해 확산되어야 하는 거리는 대체로 포유동물 조직들 내에서 요구되는 거리보다 훨씬 크다. 또한, 표준 세포 배양 조건들 내에서 산소 소모 속도는 종종 상기 세포 배양 배지를 통한 산소의 확산 속도를 초과하며, 셀룰로오스 입자들의 존재는 상기 확산 속도를 더 감소시킬 수 있다.
체외 및 체내 시스템들 사이에서 상이한 또 다른 변수는 삼투압, 구체적으로 세포들에 대한 팽압의 유지이다. 유체 정압(hydrostatic pressure: HP)에 대한 생리학적 값들은 실질적으로 조직들에 걸쳐 변화된다(예를 들어, 약 0.5kPa로부터 약 6MPa까지). 상기 용액 내의 용질들의 숫자는 상기 삼투압에 영향을 미칠 수 있으며, 그 결과로 세포 체적에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 체외 시스템들에서, 상기 셀룰로오스 입자들의 첨가는 삼투압에 영향을 미칠 수 있고, 세포 사멸을 가져올 수 있다.
또한, 세포 배양 시스템들 내의 세포들의 유형이 체내 세포들과 구별된다. 면역 능력이 있는 동물들에서, 면역 세포들은 이물질에 반응하여 촉발된다. 그러나 체외에서는 일어날 수 있는 제한된 프로세스들(예를 들어, 포식 작용)만이 있다.
이에 관계없이, 앞서의 연구들은 대체로 세포들에 대한 입자들의 증가된 농도들의 영향을 예시할 수 있다.
실험예 8-셀룰로오스 입자 농도들을 평가하기 위한 UV-VIS 분광법의 이용
본 연구는 UV-VIS 분광법이 셀룰로오스 입자들의 농도를 측정하기 위해 눈금이 있는 실린더들, 눈금이 있는 팔콘 튜브들 및 마이크로원심분리기 튜브들에 대해 실용적인 선택 사항이었는지를 결정하기 위해 수행되었다.
보다 상세하게는, 상기 연구는 샘플을 통한 광의 흡수도 또는 투과도가 내부의 셀룰로오스 입자들의 농도를 보다 정확하게 판단하기에 적합할 수 있는 지를 결정하는 것을 목표로 하였다.
어떠한 특정 이론에 의해 구속되지 않고, 본 실험의 배경이 되는 원리는 상기 셀룰로오스 입자들이 임사 광을 산란시킬 수 있는 점 및 산란되는 양이 상기 샘플 내의 입자들의 농도를 나타낼 수 있는 점이다. 다음에 나타내는 바와 같이 흡수도는 투과도의 음의 로그로거나, 다르게 표시하면 입사된 및 투과된 방사속(radiant flux)들의 비율의 로그이다.
여기서, A＝흡수도, T＝투과도, Φi＝입사된 방사 플럭스, 및 Φt＝투과되ls 방사 플럭스이다.
샘플 제조
분쇄된 탈세포화 배 유래 입자들이 2M 수크로오스 용액 내에 현탁되었다. 상기 입자들이 물 단독 내에는 현탁되게 남지 않았기 때문에 수크로오스 용액이 사용되었다. 제조된 용액들은 다음 표 12에 개괄되어 있다.
| 입자들의 체적(㎖) | 2M 수크로오스의 체적(㎖) | 입자들의 농도(v/v%) |
| 0.5 | 9.5 | 5 |
| 1 | 9 | 10 |
| 2 | 8 | 20 |
분광법캐리(Cary) 1E 모델 및 시너지(Synergy) 모델 UV-VIS 분광 광도계들이 이용되었다. 상기 캐리 모델에 대해, 파장은 500㎚로 설정되었고, 평균 시간은 0.1초로 설정되었으며, SBW는 1.5㎚로 설정되었다. 표준 1㎝ 큐벳(cuvette)들이 사용되었다. 상기 캐리 모델은 이중 빔 모델이기 때문에, 이에 따라 둘의 2M 수크로오스 용액들이 블랭크들로 이용되었다. 상기 기계는 영으로 조정되었고, 이후에 사용자에 가장 가까운 큐벳이 샘플 판독들을 위해 변화되었다.
상기 샘플들은 도 40에 도시한 바와 같이 표준 흡수도-농도 곡선을 생성하는 데 이용되었다. 그러나 도시한 바와 같이, 높은 농도 영역(5%-20%)의 차단은 영에 가깝지 않았으며, 이는 측정이 부정확하였거나, 분석되는 곡선의 일부가 보다 낮은 농도들에서 비선형성 발생 이후인 것으로 제시된다.
상기 시너지 모델 UV-VIS 분광 광도계는 보다 낮은 농도 범위들을 테스트하는 데 이용되었다. 20% 보존 용액이 연속으로 희석되었고, 흡수도가 450㎚, 475㎚, 500㎚ 및 525㎚에서 측정되었다. 결과들은 도 41에 도시된다.
시너지 모델 UV-VIS 분광 광도계는 상기 20% 보존 용액 및 2M 수크로오스 대조군 용액 상의 파장 소거를 수행하는 데에도 이용되었다. 결과들은 도 42에 도시되며, 여기서 흑색 라인은 상기 수크로오스를 나타내고, 적색 라인은 상기 배 유래 입자들을 나타낸다. 도시한 바와 같이, 피크 흡수도가 테스트된 범위 내에서 관찰되지 않았으며, 상기 입자들 및 상기 수크로오스 모두는 보다 작은 파장들에서 보다 높은 흡수도들을 가졌다.
상기 흡수도가 320㎚에서 높았기 때문에, 상술한 연속적인 희석들의 흡수도들은 320㎚의 광으로 분석되었다. 결과들이 도 43에 도시된다. 도시한 바와 같이, 보다 점진적인 비선형 편향이 일어났다. 5%의 분말 농도까지의 선형 정합은 0.99의 R2, 0.2의 기울기 및 0.05의 y-차단을 생성하였다.
결론
이들 예비적인 결과들은 5%까지의 입자 농도들이 샘플 내의 셀룰로오스 입자들의 농도를 결정하기 위해 표준 곡선을 구성하는 데 유용할 수 있는 것을 보여준다.
실험예 9-셀룰로오스 입자들을 함유하는 다양한 운반체들의 압출력
본 연구는 본 발명의 더말 필러들의 압출력(extrusion force)에 대한 운반체들뿐만 아니라 다른 변수들의 효과를 조사하기 위해 수행되었다.
시험을 위해 넷의 제형들이 제조되었으며, 다음의 표 13에 상세하게 나타낸다. 상기 제형들에 사용된 동결 건조된 탈세포화 사과들 입자들은 렛치 분쇄기 및 80㎛ 필터로 플레이크들로 분쇄되었다. 상기 플레이크들은 이후에 45㎛ 및 25㎛의 주문 제작된 길슨 체들 및 길슨 테스트 진동기(Gilson Test Vibrator)를 이용하여 습식으로 체로 걸러졌다. 여과된 입자들은 7분 동안 5000rpm에서 원심 분리하여 농축되었다.
| 제형 | 입자들의 퍼센트(v/v) | 보존 운반체 겔의 농도(% m/v) |
최종 겔 농도
(% m/v) |
| 입자들이 없는 젤라틴(GE) | 0 | 25 | 25 |
| 사과 입자들을 가지는 젤라틴(GEAA | 20 | 25 | 20 |
| 사과 입자들을 가지는 하이스템 HA(HAAA) | 20 | 8 | 6.4 |
| 입자들이 없는 알긴산염(AL) | 0 | 5 | 5 |
상기 젤라틴 및 알긴산염 제형들이 사용되기 이전에 수조 내에서 37℃까지 가열하여 용융되었던 점에 유의한다.시험을 위해, 압출 거리는 5㎜로 선택되었다. 사용된 주사기에 대해, 최초 적재 체적은 0.3㎖로 설정되었으며, 이는 플런저 크로스-헤드((cross-head) 변위에 대한 5㎜의 거리에 대응된다. 상기 제형들이 점탄성 유체들이므로, 상기 압축 또는 압출 속도는 측정된 압출력에 영향을 미친다. 1㎜/s, 2.5㎜/s 및 5㎜/s의 압출 속도들(크로스-헤드 속도로도 언급됨)이 다른 크기들인 바늘들, 즉 27G 바늘들 및 30G 바늘들의 영향들과 함께 조사되었다.
결과들
HAAA 제형에 대한 압출력은 1㎜/s의 크로스-헤드 속도에서 측정되었다. N＝14 압출들에 대한 힘-변위 곡선이 도 44에 도시된다. 바늘 크기는 27G였다.
상기 압출 속도가 분명한 힘에 대해 영향을 미치므로, 여기에 설명되는 더말 필러들과 종래의 더말 필러들 사이의 비교를 용이하게 하기 위해 상기 압출 속도를 정의하는 것이 유용할 수 있다. 벨라필 압출 특성들이 다음 표 14에 포함된다.
| 제품 | N | 최대 힘(N) | SD | SEM |
| 벨라필 | 3 | 26.3798 | 3.8020 | 2.1953 |
0.48㎜/s에서 26G 바늘을 통한 벨라필 압출력에 대한 보상적 힘-변위 도표가 도 45에 도시된다.유사한 결과들이 상기 HAAA 제형에 대해 관찰되었다. HAAA를 사용하는 다른 수행이 도 46에 도시된다. 이러한 수행에서, 상기 HAAA는 추가적인 교차 결합기(cross-linker) 및 입자들이 첨가되었기 때문에 앞서 나타낸 경우와 달랐으며, 4.8%의 HA 농도 및 28%의 입자 농도를 가져왔다. 상기 크로스-헤드 속도는 1㎜/s(실선), 2.5㎜/s(파선) 및 5㎜/s(점선)로 설정되었다. 도시한 바와 같이, 보다 빠른 속도는 보다 큰 힘을 야기하였고, 가장 높은 속도에 대해서는 정점지속(plateau)이 관찰되지 않았다. 또한, 중간 속도에서 관찰된 초기 피크 힘은 느린 압출에서는 존재하지 않았다. 임의의 특정한 이론에 구속되지 않고, 피크의 결핍은 상기 주사기 및 바늘 내의 전단 동안에 반응 유체의 속도에 기인할 수 있다.
상기 GE 샘플에 대한 압출력은 1㎜/s의 크로스-헤드 속도에서 측정되었고, 27G 바늘들 및 30G 바늘들 사이에서 비교되었다. 결과들은 도 47에 도시되며, 여기서 도 47A는 상기 27G 바늘을 통한 상기 GE 압출력을 도시하고, 도 47B는 상기 30G 바늘을 통한 상기 GE 압출력을 도시한다. 측정된 최대 압출력들을 다음의 표 15에 나타낸다.
| 바늘 크기(G) | N | 평균 | SD | SEM |
| 27 | 10 | 5.8201 | 1.3500 | 0.1133 |
| 30 | 10 | 12.5858 | 2.4788 | 0.7838 |
보다 작은 바늘은 상당히 높은 최대 압출력을 가져왔다.상기 GEAA 샘플에 대한 압출력은 27G 바늘을 통한 1㎜/s의 압출 속도에서 측정되었다. 결과들은 도 48에 도시된다. 측정된 최대 압출력들은 다음 표 16에 도시된다. 도시한 바와 같이, 입자들의 도입은 상기 GE 제형의 압출력을 상당히 증가시켰다. 또한, 상기 GEAA 제형 결과들이 상기 HAAA 결과들과 유의미하게 다르지 않은 점에 유의한다.
상기 GE 및 GEAA 제형들의 결과들을 직접적으로 비교하기 위해, 상기 GE 제형은 20%(m/v)로 희석되었다. 상기 희석된 GE 제형은 상기 제형을 37℃ 수조 내에 유지하여 압출 이전에 따뜻하게 유지되었다. 압출 동안의 온도는 약 24.5℃이었다. 상기 희석된 GE 압출의 결과들은 도 49A에 도시된다. 도시한 바와 같이, 상기 희석된 GE는 정점지속이 수반되어 초기 피크를 가지는 "전통적인(classic)" 압출-힘 곡선을 나타내었다.
젤라틴의 겔화가 온도 의존성이므로, 상기 희석된 GE 제형의 압출력도 동일한 동작 파라미터들을 이용하여 실온(약 21℃)에서 측정되었다. 결과들은 도 49B에 도시된다. 도시한 바와 같이, 입자들을 포함하지 않았던 상기 실온 희석된 GE 제형은 상기 데워지고 희석된 GE 제형 및 상기 GEAA 제형보다 큰 압출력들을 가졌다. 최대 압출력들의 비교를 표 16에 나타낸다.
| 제형 | N | 평균 | SD | SEM |
| GE 20%(따뜻함) | 12 | 2.228 | 0.671 | 0.192 |
| GE 20%(실온) | 12 | 8.958 | 1.074 | 0.313 |
| GE AA(따뜻함) | 9 | 6.669 | 1.772 | 0.592 |
상기 AL 제형의 압출력은 27G 바늘 및 1㎜/s의 압출 속도를 이용하여 측정되었다. 결과들은 도 50에 도시된다.
이에 따라, 여기에 설명되는 더말 필러들의 압출력은 사용된 운반체, 상기 운반체의 농도 및 상기 압출 속도에 의해 영향을 받을 수 있다.
실험예 10-머서리화된 탈세포화 조직들의 습윤 질량 및 건조 질량간의 비교
머서리화 사과(AA)는 탈세포화 사과를 1：5(m/v)의 비율로 1M NaOH에 첨가하여 생성되었다. 머서리화는 80℃에서 1시간 동안 교반하면서 수행되었고, 과산화수소(보존 30%)가 색상이 밝아지도록 첨가되었다. 반응이 완료된 후, 비커는 열원으로부터 제거되었고, 용액은 HCl로 중성으로 되었다. 상기 물질은 소르발(Sorvall) ST 16 R 원심 분리기 또는 아반티(Avanti) J-26XPI 고성능 원심 분리기 내에서 원심 분리에 의해 농축되었다. 이후에, 상층액이 제거되었고, 상기 머서리화 AA 물질의 펠릿이 물속에 재현탁되었다. 중화 및 원심 분리 프로세스들은 pH가 백-투-백(back-to-back) 사이클들을 위해 6.8 내지 7.2로 남았을 때까지 반복되었다. 중화되면, 최종 원심 분리가 수행되었고, 상기 물질은 50㎖의 팔콘 튜브들 내에 수집되었고, 후속하여 냉장고 내에 저장되었다.
습윤 및 건조 질량들 간의 비교
머서리화 AA 물질의 약 1g의 셋의 다른 배치들이 계량되었다. 계량된 샘플들은 -20℃에서 냉동되었고, 이후에 랩콘코(LabConco) 동결 건조기를 이용하여 24시간 동안 55mbar 및 -46℃에서 동결 건조되었다. 상기 샘플들은 건조되었으면 다시 계량되었다. 결과들은 다음의 표 17에 요약되어 있다.
| 샘플 | 습윤 질량(g) | 건조 질량(g) | 수율(건조 질량/습윤 질량)(%) |
| 1 | 0.99 | 0.04 | 4.04 |
| 2 | 1.00 | 0.07 | 7.00 |
| 3 | 1.00 | 0.04 | 4.00 |
| 4 | 1.0059 | 0.0597 | 5.93 |
| 5 | 1.007 | 0.0398 | 3.95 |
| 6 | 1.0034 | 0.0570 | 5.68 |
| 7 | 1.0084 | 0.0558 | 5.53 |
상기 머서리화 AA 물질들에 대해 동일하였던 것에도 불구하고, 최종 건조 질량이 변화되었다. 평균 건조 질량은 0.052±0.005g이었다(평균±상기 평균의 표준 오차). 건조 질량 수율들의 변화는 상기 출발 물질들의 습도의 변화들, 다른 원심 분리기들의 사용 및/또는 상기 샘플 물질의 펠릿이 취해지지 않았던 결과가 될 수 있다.
실험예 11-머서리화 사과 밀도에 대한 원심 분리의 효과
머서리화 AA의 둘의 배치들은 두 배치들이 아반티 원심 분리기(Avanti centrifuge)(8000rpm, 15분)를 이용하여 0.75ℓ의 체적으로 1ℓ 아반티 원심 분리기 병 내에 회전 침강되었던 것을 제외하면 실험예 10에서 앞서 개괄된 동일한 프로세스를 이용하여 제조되었다. 상기 체적은 가능한 한 많은 농축 힘을 표준화하기 위해 원심 분리 동안에 일정하게 유지되었다. 이후에, 하나의 배치는 소르발 벤치톱(Sorvall Benchtop) 원심 분리기(5000rpm, 15분)를 이용하여 50㎖의 전체 부피로 50㎖의 튜브들 내에서 원심 분리되었다.
제조 후, 더 원심 분리되었던 배치(배치 1)는 물질의 약 3.5㎖-50㎖ 튜브들을 생성하였던 반면, 더 원심 분리되지 않았던 배치(배치 2)는 물질의 약 2.5㎖-50㎖ 튜브들을 생성하였다. 따라서 밀도들은 달랐다.
상기 밀도의 변화를 정량화하기 위해, 1cc 주사기들로 측정된 0.5㎖ 샘플 체적들이 미리 계량된 15㎖의 팔콘 튜브들 내로 압출되었다. 질량들이 후속하여 기록되었다(상기 습윤 질량). 상기 튜브들은 이후에 -20℃ 냉동기 내에 두어졌다. 냉동되면, 상기 샘플들은 0.1mbar 및 -55℃의 부치(Buchi) 동결 건조기 상에 장착되었고, 하룻밤 동안 두어졌다. 다음 날, 상기 건조 물질이 있는 튜브들의 질량이 기록되었다. 상기 기록되고 계산된 질량들을 다음 표 18에 나타낸다.
| 배치 |
튜브
질량 (g) |
튜브 내 습윤 질량(g) | 계산된 습윤 질량(g) | 튜브 내 건조 질량(g) | 계산된 건조 질량(g) | 건조/습윤 질량 밀도(%) | 질량/체적 밀도(%) |
| 배치 1 | 6.1838 | 6.6987 | 0.5149 | 6.1960 | 0.0122 | 2.37 | 2.44 |
| 배치 2 | 6.2498 | 6.9704 | 0.7206 | 6.2689 | 0.0191 | 2.65 | 3.82 |
이에 따라, 원심 분리 파라미터들을 변화시키는 것은 생산된 머서리화 AA 물질들의 밀도들에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 변화들은 상기 머서리화 AA 물질들의 혼합 능력들, 유동학적 성질들 및 입출력들에 영향을 미칠 수 있다.
실험예 12-설정된 원심 분리 조건들 하에서의 머서리화 사과의 질량 밀도 및 건조 질량 퍼센티지들
머서리화 AA 샘플들이 실험예 10에 개괄된 절차에 따라 제조되었다. 상기 머서리화 AA 물질이 8000RPM에서 15분 동안 아반티 원심 분리기만을 이용하여 농축(펠릿화)되었던 점에 유의한다.
상기 머서리화 AA 물질의 습윤 질량이 각 샘플에 대해 기록되었다. 상기 물질은 이후에 15㎖의 팔콘 튜브들로 이송되었다. 상기 튜브의 중량, 리드(lid) 및 머서리화 AA 물질이 기록되었다.
샘플들은 이후에 -20℃에서 냉동되었고, 0.1mbar 및 -55℃의 부치 동결 건조기 상에 장착되었다. 24시간 후, 상기 샘플들은 제거되었다. 상기 튜브들의 질량, 리드들 및 샘플들은 상기 물질 손실이 상기 튜브들로부터의 상기 건조 AA 물질의 제거 동안에 발생되었던 경우에 상기 건조 머서리화 AA 물질이 계산될 수 있는 감산 가능한 질량을 가지도록 기록되었다.
마지막으로, 상기 건조 머서리화 AA 물질이 제거되었고, 계량되었다. 질량 측정들을 다음 표 19에 나타낸다.
| 샘플 | 튜브 내 습윤 질량(g) | 튜브 내 건조 질량(g) | 튜브의 질량(g) | 습윤 질량(g) | 건조 질량(g) |
| 1 | 7.3040 | 6.4368 | 6.3960 | 0.9080 | 0.0408 |
| 2 | 7.3397 | 6.4494 | 6.4053 | 0.9344 | 0.0441 |
| 3 | 7.4154 | 6.4575 | 6.4099 | 1.0055 | 0.0476 |
| 4 | 7.4244 | 6.3962 | 6.3719 | 1.0525 | 0.0243 |
| 5 | 7.4085 | 6.4081 | 6.3810 | 1.0275 | 0.0271 |
상기 건조 질량들을 이용하여, 상시 습윤 질량들의 건조 질량 퍼센티지들이 계산되었다. 결과들을 표 20에 나타낸다.
| 샘플 | 건조 질량(%) |
| 1 | 4.49 |
| 2 | 4.72 |
| 3 | 4.73 |
| 4 | 2.31 |
| 5 | 2.64 |
평균 건조 질량 퍼센티지는 이에 따라 1.20의 표준 편차 및 0.54의 표준 오차로 3.78이었다.건조 질량 퍼센티지 이외에도, 상기 샘플들의 질량 밀도들도 계산되었다. 상기 질량 밀도들을 계산하기 위해, 각 샘플로부터 1㎖의 습윤 머서리화 AA 물질이 주사기 내로 적재되었고, 압출되었다. 결과들을 표 21에 나타낸다.
| 샘플 | 습윤 질량 밀도(g/㎖) |
| 1 | 0.93 |
| 2 | 0.87 |
| 3 | 0.94 |
| 4 | 0.94 |
따라서 평균 밀도는 0.03의 표준 편차 및 0.02의 표준 오차로 0.92였다.계산된 밀도는 상기 머서리화 AA 물질들-즉, 약 50g의 물질을 함유한 50㎖의 팔콘 튜브들의 제조 동안에 이루어진 반정량적 관찰과 부합된다. 이는 상기 습윤 머서리화 AA 물질들의 질량 밀도들이 물의 경우와 유사한 것을 의미한다. 이와 같이, 습윤 밀도 측정만으로는 상기 머서리화 AA 물질의 농도를 측정하기에는 불충분할 수 있다. 냉동 건조된 건조 질량은 상기 습윤 질량 대신에 또는 이와 결합되어 이용될 수 있다.
결론
본 실험예의 결과들은 본 발명의 방법들의 규모를 확장시킬 때에 품질 보증 목적을 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 상기 데이터는 미립자 제품 내에 존재하는 상기 머서리화 물질의 양을 표준화하는 데 이용될 수 있다.
또한, 상기 결과들은 여기에 설명되는 방법들의 규모를 확장시킬 때에 잠재적인 표준 운영 절차(standard operating procedure: SOP)들에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, SOP들은 주사기들 내의 "데드(dead)" 헤드 공간에 의하거나, 튜브들 내로, 외부로 또는 사이에서의 질량의 전달에 의해 야기되는 상기 철차들에 걸친 질량의 다양성들을 감소시키도록 실행될 수 있다.
실험예 13-머서리화 사과의 질량 밀도들 및 희석들
본 연구는 보존 물질의 질량 밀도를 계산하고, 이에 따라 희석하여 조절될 수 있는지를 결정하기 위해 수행되었다.
습윤 및 건조 머서리화 AA 샘플들이 실험예 10 및 실험예 12에 개괄된 절차에 따라 제조되었다. 상기 샘플들이 제조된 후, 이들은 희석되었다. 제조 동안 및 희석 이후의 상기 샘플들의 질량들을 다음 표 22에 나타낸다.
| 희석되지 않음 | ||||||
| 샘플 | 빈 튜브＋리드(g) | 튜브＋습윤 merAA(g) | 습윤 질량(g) | 튜브＋건조된 merAA(g) | 건조 질량(g) | 건조/습윤 질량(%) |
| 1 | 6.3891 | 7.9768 | 1.5877 | 6.4952 | 0.1061 | 6.6826 |
| 2 | 6.3499 | 7.9368 | 1.5869 | 6.4628 | 0.1129 | 7.1145 |
| 3 | 6.2721 | 7.8584 | 1.5863 | 6.3783 | 0.1062 | 6.6948 |
| 4 | 6.3523 | 7.8705 | 1.5182 | 6.5218 | 0.1695 | 11.1645 |
| 5 | 6.3691 | 7.9250 | 1.5559 | 6.4236 | 0.0545 | 3.5028 |
| 6 | 6.3520 | 7.9066 | 1.5546 | 6.4430 | 0.0910 | 5.8536 |
| 평균 | 6.3474 | 7.9124 | 1.5649 | 6.4541 | 0.1067 | 6.8355 |
| 중간 희석 | ||||||
| 1 | 6.3763 | 7.9099 | 1.5336 | 6.4370 | 0.0607 | 3.9580 |
| 2 | 6.347 | 7.9078 | 1.5608 | 6.4098 | 0.0628 | 4.0236 |
| 3 | 6.3274 | 7.8943 | 1.5669 | 6.3942 | 0.0668 | 4.2632 |
| 평균 | 6.3502 | 7.9040 | 1.5538 | 6.4137 | 0.0634 | 4.0816 |
| 희석됨 | ||||||
| 1 | 6.3412 | 7.8371 | 1.4959 | 6.3751 | 0.0339 | 2.2662 |
| 2 | 6.4169 | 7.9348 | 1.5179 | 6.4611 | 0.0442 | 2.9119 |
| 3 | 6.0841 | 7.5938 | 1.5097 | 6.1310 | 0.0469 | 3.1066 |
| 평균 | 6.2807 | 7.7886 | 1.5078 | 6.3224 | 0.0417 | 2.7616 |
이후에, 상기 샘플들의 밀도들이 표 22에 앞서 나타낸 바와 같이 최초 습윤 질량의 상기 건조 질량 %로서 계산되었다. 따라서 여기에 설명되는 머서리화 셀룰로오스 물질들의 밀도들이 희석을 통해 조절될 수 있는 점은 분명하다.또한, 앞서 나타낸 바와 같이, 증가된 물 세척 및 증류수 내의 원심 분리에 의한 희석은 원심 분리 후에 덜 치밀한 머서리화 AA 물질을 생성하였다. 그러나 상기 최종 원심 분리 이전에 PBS로의 상기 샘플들의 배양이 상기 샘플의 최초로 관찰된 밀도를 복원시킬 수 있는 점이 발견되었다. 머서리화 AA 샘플의 밀도에 대한 PBS의 효과가 도 51에 도시된다.
정성적으로, 약 4% 내지 약 5% 또는 그 이상의 밀도가 더말 필러들 내의 사용을 위해 적합한 것으로 나타났다.
실험예 14-머서리화 동안의 NaOH 및 사과 사이의 관계
본 연구는 AA 머서리화를 위한 AA 물질 대 NaOH 용액의 적합한 질량 대 체적 비율들을 조사하기 위해 수행되었다. 보다 상세하게는, 대체로 탈세포화 AA 대 1M NaOH의 1：5 비율이 머서리화 절차들에 대해 이용되었다. 이러한 연구는 더말 필러들 내의 사용을 위해 적합하도록 충분히 작은 입자 크기들로 머서리화 AA를 생산할 것인 AA 물질 대 NaOH 용액의 최소 비율을 결정하는 것을 목표로 하였다.
실험 연구 계획이 다음에 설명된다.
1. 탈세포화 AA의 세 부분들인 20g, 50g 및 100g이 계량되었다. 모든 AA 물질은 과잉의 물을 제거하기 위해 가압되었다.
2. 셋의 1ℓ 비커들이 100㎖의 1M NaOH로 채워졌고, 자기 교반 플레이트들 상에 두어졌다.
3. 모든 용액들은 80℃까지 가열되었고, 이후에, 교반 바(stir bar) 및 상기 탈세포화 AA의 부분들 중에서 하나가 각기 첨가되었고, 첨가된 AA의 중량에 대응되게 적절하게 표지되었다.
4. 5㎖의 30% 과산화수소(H2O2)가 각 비커에 첨가되었다.
5. 셋의 용액들 모두는 1시간 동안 80℃에서 교반되었다.
6. 상기 머서리화 이후, 모든 비커들은 이들 각각의 핫 플레이트들로부터 제거되었고, 실온까지 완전히 냉각되도록 두어졌다.
7. 냉각되면, 모든 셋의 용액들은 중성으로 되었고, 중성이고 안정한 pH(pH 범위：6.8-7.2)가 얻어졌을 때까지 별도로 원심 분리되었다.
8. 테스트된 셋의 상태들(즉, 100㎖ NaOH 내의 20g의 AA, 100㎖ NaOH 내의 50g의 AA 및 100㎖ NaOH 내의 100g의 AA)이 후속되는 현미경 사용을 위해 냉장고 내에서 50㎖의 팔콘 튜브들 내에 별도로 저장되었다.
9. 입자 분석을 위해, 각각의 상기 셋의 AA 내지 NaOH 조건들이 증류수 내에 재현탁되었고, 콩고 레드로 for 10분 동안 염색되었으며, 현미경 슬라이드 상에 장착되었다.
10. SZX16 올림푸스 현미경을 사용하여, 슬라이드들이 형광 현미경(BV 광 필터)을 이용해 2.5X 배율로 영상화되었다.
상기 현미경 영상들은 도 52에 도시되며, 여기서 도 52A는 1：5의 AA：NaOH이고, 도 52B는 1：2의 AA：NaOH이며, 도 52C는 1：1의 AA：NaOH이다. 도시한 바와 같이, 충분한 머서리화가 AA 대 NaOH 용액의 1：1의 비율로 구현될 수 있다. 또한, AA：NaOH의 1：1 및 1：2의 비율들은 일부 큰 입자들을 가졌지만, 보다 큰 입자들은 대체로 상기 영상들에 걸쳐 흔하지는 않았다.
상기 현미경 영상들은 피지 이미지제이(Fiji ImageJ)를 이용하여 한계가 정해졌고 구획되었다. 분수령이 이진 체계로 전환된 후에 상기 영상에 적용되었다. 페렛 직경 상기 분석 입자 플러그인으로 계산되었다. 결과들은 도 53에 도시된다. 도시한 바와 같이, 입자 크기들의 막대그래프들은 AA：NaOH의 셋의 다른 비율들에 걸쳐 유사하였다.
ANOVA 분석도 터키 사후 검정 분석(Tukey post-hoc analysis)으로 0.05의 유의 수준에서 수행되었다. 결과들을 표 23 및 표 24에 나타낸다.
|
비율
(AA：NaOH) |
N | 평균 | 표준 편차 | 평균의 SE |
| 1：5 | 2237 | 199.81148 | 106.08425 | 2.24294 |
| 1：2 | 2158 | 228.0239 | 106.3168 | 2.28863 |
| 1：1 | 1878 | 219.72194 | 109.23839 | 2.52074 |
| 비율들 |
평균
차이 |
SEM | q 값 | Prob | 알파 | Sig | LCL | UCL |
| 1：2 및 1：5 |
28.21242 | 3.23208 | 12.34451 | 3.33E-16 | 0.05 | 1 | 20.63741 | 35.78744 |
| 1：1 및 1：5 |
19.91046 | 3.35247 | 8.39907 | 8.60E-09 | 0.05 | 1 | 12.05327 | 27.76764 |
| 1：1 및 1：2 |
-8.30197 | 3.38036 | 3.47323 | 0.03739 | 0.05 | 1 | -16.2245 | -0.37942 |
따라서 상기 입자 크기 분포들은 정량적으로 유사하였지만, 셋의 분포들의 평균들은 서로 통계적으로 상이하였다. 변화들에 대한 테스트들은 유의차들을 보이지 않았으며, 그 결과로서 상기 평균들의 차이들은 실제 차이들, 제한된 샘플 크기, 보다 높은 농도의 AA 샘플들 내의 덩어리짐, 또는 상기 출발 사과 물질의 변화들의 결과가 될 수 있다.위와 같은 관점에서, 상기 AA：NaOH의 1：1 및 1：2의 비율들이 머서리화를 위해 이용되었지만, 1：5의 비율이 가장 작은 점성의 용액에 대해 적어도 부분적으로 최적이 될 수 있다. AA의 보다 높은 농도들이 유사한 결과들을 산출할 수 있지만, 혼합하기에 보다 어려울 수 있는 점에 유의한다.
실험예 15-머서리화 사과로부터 작은 입자들을 제거
본 연구는 머서리화 물질의 입자 여과 동안에 보다 작은 입자들(예를 들어, 20㎛ 보다 작은)의 제거를 조사하기 위해 수행되었다.
본 연구에서, 여과되지 않은, 분쇄된 탈세포화 배 입자들은 이러한 배 입자들이 대체로 사과 입자들보다 많은 20㎛ 보다 작은 크기를 가지는 입자들을 포함하기 때문에 머서리화된 탈세포화 AA 물질과 혼합되었다.
10㎖의 머서리화 AA가 10㎖의 여과되지 않은 탈세포화 배 분말과 결합되었다. 샘플은 750㎖의 최종 체적까지 증류수로 희석되었다.
상기 연구는 다음의 절차에 따라 수행되었다.
1. 상기 혼합물을 생성한다.
2. 염색 및 영상화를 위해 부분 표본을 선택한다.
3. 펠릿을 형성하도록 상기 물질을 아반티 원심 분리기(15분 동안 8000RPM) 상에서 원심 분리한다.
4. 염색 및 영상화를 위해 상층액으로부터 부분 표본을 선택한다.
5. 상기 상층액을 제거한다.
6. 염색 및 영상화를 위해 상기 펠릿으로부터 부분 표본을 선택한다.
7. 상기 물질을 여과하도록 체 진동기로 45㎛ 고압 살균 가능한 길슨 체(Gilson sieve) 상에서 거르고, 150㎖의 of dH2O로 세 번 세척한다.
8. 염색 및 영상화를 위해 체로 걸러진 물질의 부분 표본을 선택한다.
9. 상기 물질을 다시 원심 분리에 의해 농축시킨다.
10. 상기 상층액을 버린다.
11. 염색 및 영상화를 위해 최종 물질로부터 샘플을 선택한다.
염색은 동일한 체적의 0.2% 콩고 레드(0.5㎖)를 상기 샘플에 첨가하여 완료되었다. 농도의 변화들로 인하여, 상기 샘플들은 필요한 경우에 희석되었다. 상기 염색된 입자들은 BV 필터를 구비한 SZX16 입체 현미경(Stereo Microscope)로 2.5X 및 10X 배율로 영상화되었다. 상기 영상들은 피지 이미지제이를 이용하여 분석되었다.
상태 당 N＝20 영상들이 스택으로 조립되었다. 상기 스택은 이전 체계로 변환되었고, 휘도 및 대비 설정들이 적절하게 조정되었다. 스푸리어스 노이즈(spurious noise) 없이 상기 영상을 구획하기 위해, 가우스 필터(Gaussian filter)가 적용되었다(2.5X에 대해 2px 및 10X에 대해 5px). 분석 입자 플러그인이 이용되었다. 입자 크기 제한들은 단일의 픽셀들의 작은 크기로 인해 상기 2.5X 영상들에 적용되지 않았다. 상기 10X 영상들에 대해, 하위 경계가 단일 픽셀 노이즈에 대해 설정되었다(0.8㎛2). 상기 페렛 직경은 상기 입자 크기의 치수로 이용되었다.
결과들
도 54는 콩고 레드로 염색된 초기 머서리화 AA 및 배 분말 혼합물(원심 분리 이전)의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 54A는 500㎛의 척도로 현미경 영상을 도시하고, 도 54B는 100㎛의 척도로 현미경 영상을 도시한다. 도시한 바와 같이, 20㎛ 보다 작은 크기를 가지는 입자들이 관찰되었다. 앞서 논의된 바와 같이, 이는 상기 배 분말의 첨가 때문에 예측되었다.
도 55는 상기 혼합물의 첫 번째 원심 분리 이후에 수집된 콩고 레드로 염색된 상층액의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 55A는 500㎛의 척도로 현미경 영상을 도시하고, 도 55B는 100㎛의 척도로 현미경 영상을 도시한다. 도시한 바와 같이, 상기 상층액은 상기 펠릿 내에 농축되지 않았던 작은 입자들을 가졌다.
도 56은 콩고 레드로 염색된 혼합물의 첫 번째 원심 분리 이후에 형성된 펠릿의 현미경 영상들을 나타내며, 여기서 도 56A는 500㎛의 척도로 현미경 영상을 도시하고, 도 56B는 100㎛의 척도로 현미경 영상을 도시한다. 도시한 바와 같이, 초기 혼합물과 유사하게 20㎛ 보다 작은 크기를 가지는 입자들이 관찰되었다.
도 57은 콩고 레드로 염색된 체가름 이후의 펠릿의 샘플의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 57A는 500㎛의 척도로 현미경 영상을 도시하고, 도 57B는 100㎛의 척도로 현미경 영상을 도시한다. 도시한 바와 같이, 약간의 20㎛ 보다 작은 크기를 가지는 입자들이 관찰되었다.
도 58은 콩고 레드로 염색된 최종 원심 분리 이후의 펠릿의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 58A는 500㎛의 척도로 현미경 영상을 도시하고, 도 58B는 100㎛의 척도로 현미경 영상을 도시한다. 도시한 바와 같이, 약간의 20㎛ 보다 작은 크기를 가지는 입자들이 관찰되었다. 상기 입자들의 크기 분포가 상기 혼합물 내에 존재하는 두 가지 유형들의 물질들로 인해 큰 점에 유의한다.
도 59는 상기 입자들의 페렛 직경들의 상대 주파수들로 제시되는 2.5X로 취해진 각각의 현미경 영상들의 입자 분포들을 도시한다. 도 60은 2.5X로 취해진 각각의 상기 현미경 영상들의 입자 분포들을 도시하며, 여기서 도 60A는 최종 원심 분리 이후의 상기 펠릿의 입자 크기 분포를 도시하고, 도 60B는 체로 걸러진 펠릿의 입자 크기 분포를 도시하며, 도 60C는 첫 번째 원심 분리 이후의 펠릿의 입자 크기 분포를 도시하고, 도 60D는 상층액의 입자 크기 분포를 도시하며, 도 60E는 초기 혼합물의 입자 크기 분포를 도시한다.
도 61은 상기 입자들의 페렛 직경들의 상대 주파수들로 제시되는 10X로 취해진 각각의 현미경 영상들의 입자 분포들을 도시한다. 도 62는 10X로 취해진 각각의 상기 현미경 영상들의 입자 분포들을 도시하며, 여기서 도 62A는 최종 원심 분리 이후의 펠릿의 입자 크기 분포를 도시하고, 도 62B는 체로 걸러진 펠릿의 입자 크기 분포를 도시하며, 도 62C는 첫 번째 원심 분리 이후의 상기 펠릿의 입자 크기 분포를 도시하고, 도 62D는 상층액의 입자 크기 분포를 도시하며, 도 62E는 초기 혼합물의 입자 크기 분포를 도시한다.
또한 상술한 바와 같이, 20㎛ 보다 작은 크기를 가지는 입자들의 존재는 체가름 이후에 상당히 감소되었다. 체가름 이후의 원심 분리가 많은 작은 입자들의 생성을 가져오지 않는 것으로 나타났다. 또한, 상기 상층액 샘플은 작은 입자들을 포함하였다. 이에 따라, 상기 원심 분리는 분별 원심 분리에 의하여 작은 입자들을 제거하는 데 기여할 수 있다. 이러한 결론은 상기 10X 영상들에 의해 적어도 부분적으로 지지된다. 상기 2.5X 영상들은 보다 큰 N 값들을 가지지만, 상기 2.5X 영상에 대한 단일 픽셀 크기가 12.25㎛2이기 때문에 상기 10X 영상들의 보완이 유용하다.
또한, 상기 분포들이 순수한 물질들의 경우들과 부합되지 않는 점에 유의한다. 두 가지 모드들의 분산들은 이러한 테스트가 두 구성 성분들의 혼합물을 수반하였기 때문에 예상되었다.
20㎛ 보다 작은 크기를 가지는 입자들의 퍼센티지들도 계산되었으며, 표 24에 나타낸다.
| 초기 혼합물 | 상층액 | 첫 번째 원심 분리 후의 펠릿 | 체가름 물질 | 최종 원심 분리 후의 물질 |
| 8.04% | 36.67% | 2.91% | 1.65% | 1.42% |
따라서 본 발명의 방법들이 더말 필러들에서의 사용에 적합하지 않을 수 있는 보다 작은 크기의 입자들을 제거하는 데 효과적일 수 있는 점은 분명하다.
실험예 16-압출 후의 머서리화 물질의 입자 크기
본 연구는 주사기를 통한 압출 이전 및 이후에 머서리화 탈세포화 식물 조직의 입자 크기들을 조사하기 위해 수행되었다.
실험예 10에 개괄된 절차를 이용하여 제조된 희석되지 않은 머서리화 AA 물질이 플런저 축이 제거되었던 후에 상기 물질을 뒤채움(back-filling)하여 주사기 내로 적재되었다. 상기 물질이 옮겨지면, 상기 플런저가 삽입되었고, 27G 바늘이 상기 주사기에 부착되었다. 다음에, 제2의 주사기로부터 플런저가 제거되었고, 상기 제1의 주사기는 상기 27G 바늘을 통해 물질을 압출시키는 데 사용되었다. 이러한 단계는 상기 바늘을 막히게 할 수 있었던 임의의 큰 물질을 제거하기 위해 수행되었다.
상기 AA 물질은 0.1%의 최종 농도 콩고 레드로 염색되었다. 상기 염색을 수행하기 위해, 1㎖의 상기 AA 물질이 F/F 루어-락 커넥터로 1㎖의 0.2% 0.22㎛ 여과된 콩고 레드와 결합되었다. 상기 용액들은 앞뒤로 30회 혼합되었다. 염색된 용액은 실온에서 10분 동안 배양되도록 두어졌다. 결과적인 용액은 입자 분석 영상화를 위해서는 너무 농축되었으므로, 세척을 위한 멸균수로의 1/64 희석으로 사용되었다. 대조군 샘플에 대해, 상기 AA 물질은 임의의 시점에서 상기 27G 바늘을 통해 압출되지 않았다.
SZX16 입체 현미경이 2-픽셀 가우스 블러 필터(Gaussian blur filter)로 2.5X로 상기 샘플들을 영상화하는 데 이용되었다. 대표적인 영역들의 열 개의 별도의 영상들이 상기 대조군(이전) 및 압출 후 샘플들 모두에 대해 수집되었다.
입자 분석을 위해, 상기 영상들은 피지 이미지제이 내로 수입되었고, 스택(stack) 내로 결합되었다. 예비 휘도와 대비 설정들이 조정되었다. 상기 영상들은 8비트 파일들로 변환되었고, 이후에 이들은 상기 입자들이 포착되었던 것을 보장하도록 한계가 정해졌다. 상기 영상들은 이진제로 전환되었고, 분수령 플러그인 방식(watershed plug-in)이 적용되었다. 결과적인 스택은 분석 플러그인(Analyze plug-in)으로 분석되었다. 페렛 직경이 입자 크기 파라미터로서 이용되었다.
도 63은 압출 이전 및 이후의 상기 AA 물질에 대한 입자 크기 분포들을 도시한다. 상기 입자 크기 분포들의 기술 통계들(descriptive statistics)을 표 26에 나타낸다.
| 용액 | N | 평균(㎛) | 표준 편차(㎛) | 표준 오차(㎛) |
| 압출 이전 | 1958 | 236.136 | 81.43 | 2.06 |
| 압출 이후 | 1763 | 220.66 | 85.37 | 2.03 |
따라서, 27G 바늘을 통한 압출이 20㎛ 보다 작은 크기를 가지는 입자들의 증가를 야기하지 않는 점은 분명하다.
또한, 20㎛ 아래의 입자들의 퍼센티지들이 압출 집단들 이전 및 이후에 각기 1% 및 0.85%였던 점이 발견되었으며, 이는 종래의 더말 필러 제형들과 부합된다.
실험예 17-압출력에 대한 머서리화 입자들의 농도의 영향
본 연구는 더말 필러들의 압출력에 대한 머서리화 입자들의 농도의 효과를 조사하기 위해 수행되었다.
셋의 제형들이 테스트되었다. 상기 제형들이 5㎖의 주사기들 내에 만들어졌고, 0.3㎖의 체적에 대해 1cc 주사기들로 옮겨졌다. 인터락 커넥터(interlock connector)들이 상기 주사기들 사이에서 상기 제형들을 철저하게 혼합하는 데 이용되었다. 상기 제형들은 상기 주사기들 간에 전후로 30회 혼합되었다. 상기 테스트된 제형들이 표 27에 개괄된다.
| 제형 | 성분들 |
| 물 | 물 |
| Mer20Sa180 | 0.9% 식염수로 희석된 20%(v/v) 머서리화된 탈세포화 AA |
| Mer100 | 희석되지 않은 머서리화된 탈세포화 AA |
셀스케일 유니베르트(CellScale Univert) 장치가 상기 제형들의 압출력들을 테스트하는 데 이용되었다. 상기 제형들 중에서 하나를 포함하는 1cc 주사기들 중에서 하나가 둘의 인접하는 증류 스탠드들에 고정된 둘의 클램프들을 이용하여 상기 장치 내에 위치하였다.바늘 크기, 주사기 유형 및 압출 속도의 영향들도 조사되었다. 바늘 크기들에 대하여, 상기 1cc 주사기들은 27G 바늘들 및 30G 바늘들을 구비하였으며, 결과들이 이들 사이에서 비교되었다. 주사기 유형들 사이의 비교를 위해, 표준 1cc 주사기들 및 벨라필 주사기들을 이용하여 테스트들이 완료되었다. 압출 속도들을 위해, 상기 제형들은 상기 27G 바늘들을 구비한 1cc 주사기들로부터 1㎜/s, 2.5㎜/s 및 5㎜/s의 압출 속도들로 압출되었다. 이들 테스트들은 상기 Mer100 제형만을 사용하여 완료되었다.
결과들
도 64는 상기 압출력 테스트들의 결과들을 도시하며, 여기서 도 64A는 상기 1cc 주사기로부터 물의 N＝10 압출들에 대한 힘-변위 곡선(force-displacement curve)들을 도시하고, 도 64B는 상기 1cc 주사기로부터 Mer20Sal80 제형의 N＝10 압출들에 대한 힘-변위 곡선들을 도시하며, 도 64C는 상기 1cc 주사기로부터 Mer100 제형의 N＝10 압출들에 대한 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 65는 각각의 상기 제형들에 대해 기록된 최대 압출력들을 도시한다. 최대 압출력들의 통계들을 표 28에 나타낸다.
| 제형 | 수행들의 숫자 | 평균(N) | 표준 편차(N) | 표준 오차(N) |
| 물 | 10 | 1.55 | 0.35 | 0.11 |
| Mer100 | 10 | 6.82 | 1.77 | 0.57 |
| Mer20Sa180 | 10 | 2.04 | 0.41 | 0.15 |
ANOVA 분석이 상기 기록된 최대 압출력들에 대해 수행되었으며, 그 결과들을 다음 표 29에 나타낸다.
| 비교 |
평균
차이 |
SEM | q 값 | Prob | 알파 | Sig | LCL | UCL |
| Mer20Sa180＋물 | 0.48633 | 0.47671 | 1.44276 | 0.5708 | 0.05 | 0 | -0.69561 | 1.66827 |
| Mer100＋물 | 5.26518 | 0.47671 | 15.61984 | 0 | 0.05 | 1 | 4.08324 | 6.44713 |
| Mer100＋Mer20Sa180 | 4.77885 | 0.47671 | 14.17708 | 0 | 0.05 | 1 | 3.59691 | 5.9608 |
상기 제형들의 정점지속 압출력들도 분석되었다. 상기 정점지속 압출력들은 상기 제형들의 평균 압출력을 나타내며, 이에 따라 상기 압출이 완료된 후에 상기 압출력들의 상승뿐만 아니라 상기 압출력들의 해제로 배제된다. 기록된 힘-변위 곡선들에 대하여, 상기 정점지속 압출력들은 약 1㎜ 내지 약 8㎜의 변위 범위에 대응된다.상기 정점지속 압출력들의 비교가 도 66에 도시된다.
상기 정점지속 압출력들의 기술 통계들을 표 29에 나타내며, 여기서의 ANOVA 분석을 표 30에 나타낸다.
표 29 : 정점지속 압출력들의 기술 통계들
| 비교 |
평균
차이 |
SEM | q 값 | Prob | 알파 | Sig | LCL | UCL |
| Mer20Sa180＋물 | 0.11286 | 0.19029 | 0.83873 | 0.82498 | 0.05 | 0 | -0.35895 | 0.58466 |
| Mer100＋물 | 3.52897 | 0.19029 | 26.22704 | 0 | 0.05 | 1 | 3.05717 | 4.00077 |
| Mer100＋Mer20Sa180 | 3.41612 | 0.19029 | 25.38831 | 0 | 0.05 | 1 | 2.94432 | 3.88792 |
따라서 위와 같은 관점에서, 희석되지 않은 머서리화 물질(즉, Mer100)은 상기 Mer20Sal80 및 물 제형들보다 상당히 큰 압출력을 가진다. 또한, 상기 Mer20Sal80 및 상기 물 제형들의 압출력들 사이에 유의차는 없었다. 이는 상기 Mer20Sal80 및 상기 물 제형들의 점도들이 약간 달랐지만, 상기 차이는 본 실험예에서 개괄된 실험들에 의해 구별 가능하지는 않았던 것을 의미한다.
도 67은 1㎜/s의 크로스-헤드 속도로 27G 바늘(청색 선들)을 통하고, 30G 바늘(적색 선들)을 통해 압출되는 상기 Mer100 제형의 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 68은 표준 1cc 주사기(청색 선들) 및 벨라필 주사기(흑색 선들)로부터 1㎜/s의 크로스-헤드 속도로 27G 바늘들을 통해 압출되는 상기 Mer100 제형의 힘-변위 곡선들을 도시한다.
도 67 및 도 68에 실행된 수행들을 위한 최대 압출력들이 도 69에 도시되며, 여기서 "BD 주사기"는 상기 표준 1cc 주사기를 지칭하며, "BF 주사기"는 상기 벨라필 주사기를 나타낸다. 상기 최대 압출력들의 기술 통계들을 표 31에 나타내며, 그 ANOVA 분석은 표 32에 도시된다.
| 주사기/바늘 결합 | 수행의 숫자 | 평균(N) | 표준 편차(N) | 표준 오차(N) |
| BF 27G | 3 | 6.27 | 0.36 | 0.21 |
| BD 27G | 3 | 5.58 | 0.40 | 0.23 |
| BD 30G | 3 | 7.58 | 0.66 | 0.38 |
| 결합 | 평균차이 | SEM | q 값 | Prob | 알파 | Sig | LCL | UCL |
| 27G BD＋27G BF | -0.68991 | 0.3992 | 2.44411 | 0.27061 | 0.05 | 0 | -1.91479 | 0.53497 |
| 30G BD＋27G BF | 1.30819 | 0.3992 | 4.63445 | 0.03876 | 0.05 | 1 | 0.08331 | 2.53307 |
| 30G BD＋27G BD | 1.9981 | 0.3992 | 7.07856 | 0.00585 | 0.05 | 1 | 0.77322 | 3.22298 |
일 방향 ANOVA는 상기 최대 압출력의 유의차가 상기 두 가지 주사기 유형들 사이에서 관찰되지 않았던 것을 보여준다. 그러나 상기 30G 바늘은 상기 27G 바늘보다 상당히 높은 압출력들을 가졌다.도 70은 1㎜/s(흑색 선들), 2.5㎜/s(청색 선들) 및 5.0㎜/s(적색 선들)의 크로스-헤드 속도로 27G 바늘들을 통해 압출되는 상기 Mer100 제형의 힘-변위 곡선들을 도시한다. 각각의 상기 크로스-헤드 속도들에 대한 최대 압출력들이 도 71에 도시된다. 각각의 상기 크로스-헤드 속도들에 대한 최대 압출력들의 기술 통계들을 표 33에 나타내며, 그 ANOVA 분석을 표 34에 나타낸다.
| 크로스-헤드 속도(㎜/s) | 수행의 숫자 | 평균(N) | 표준 편차(N) | 표준 오차(N) |
| 1 | 3 | 6.27 | 0.36 | 0.21 |
| 2.5 | 3 | 6.29 | 0.16 | 0.10 |
| 5 | 3 | 7.93 | 0.17 | 0.10 |
표 33 : 크로스-헤드에 대한 최대 압출력들의 ANOVA 분석
도시한 바와 같이, 5㎜/s의 크로스-헤드 속도에서, 상기 압출력들은 1㎜/s 및 2.5㎜/s의 힘들보다 상당히 높았다.
실험예 18-더말 필러 제형들의 압출력에 대한 운반체의 효과
본 연구는 더말 필러 제형들의 압출력들에 대한 젤라틴들의 영향을 조사하기 위해 수행되었다.
머서리화 AA가 실험예 10에 개괄된 절차를 이용하여 제조되었다. 머서리화 AA 물질은 이후에 3㎖ HSW 주사기 내로 적재되었고, F/F 루어-락 커넥터를 이용하여 1cc 주사기로 옮겨졌다. 상기 머서리화 AA 물질은 이후에 30G 바늘을 통해 압출되었고, 27G 바늘을 통해 깨끗한 3㎖ 주사기 내로 압출되었다.
1g의 결정성 젤라틴(GE) 분말이 40%(m/v) 보존 용액을 제조하기 위해 1.25㎖의 살균되지 않은 물에 첨가되었다. 추가로 1.25㎖의 물이 상기 보존 저장 용액에 첨가되었다. 상기 용액은 실온에서 1시간 동안 팽윤하도록 두어졌다. 상기 용액을 팽윤되게 한 후, 온도가 60℃까지 증가되었고, 젤라틴이 몇 분 동안 용해되었다. 결과적인 젤라틴은 4℃에서 유체로 남아 있었던 반면, 표준 녹스(Knox) 젤라틴은 약 30℃ 아래의 온도들에서 겔로 되었던 점성의 용액을 생성하였다.
다양한 제형들이 상기 머서리화 AA 및 상기 젤라틴을 사용하여 제조되었다. 상기 제형들은 표 34에 개괄되어 있다. 상기 제형들은 젤라틴 용액들(피펫들을 통해 제조됨)을 사용하여 제조되었고, 3㎖ 주사기들 내로 적재되었다. 상기 머서리화 AA 물질은 루어-락 커넥터를 통해 상기 3㎖ 주사기들로 옮겨졌다. 상기 머서리화 AA 물질이 옮겨지면, 상기 주사기는 버려졌고, 새로운 3㎖ 주사기가 상기 루어-락 커넥터에 연결되었다. 상기 용액은 이후에 제형을 생성하도록 상기 3㎖ 주사기들 사이를 30회 통과하였다.
|
최종 GE
(% m/v) |
MerAA의 체적(㎖) | GE 용액의 체적(㎖) |
보존 [GE]
(% m/v) |
GE 보존의 체적(㎖) | 물의 체적(㎖) |
| 5 | 1.7 | 0.3 | 40 | 0.250 | 0.0500 |
| 2.5 | 1.7 | 0.3 | 20 | 0.250 | 0.0500 |
| 1 | 1.7 | 0.3 | 10 | 0.200 | 0.0500 |
| 0.5 | 1.7 | 0.3 | 5 | 0.200 | 0.0500 |
| 0.25 | 1.7 | 0.3 | 2.5 | 0.200 | 0.0500 |
셀스케일 유니베르트 장치가 1㎜/s의 크로스-헤드 속도로 상기 제형들의 압출력들을 테스트하는 데 이용되었다. 설정은 지지 바가 두 스탠드들 사이에 고정되었던 점을 제외하면 실험예 17에서 설명한 경우와 동일하였다. 12㎜ 압축을 이용하여 5회의 수행들이 완료되었다. 여섯 번째 수행은 15㎜ 압축을 이용하여 완료되었다.상기 벨라필 더말 필러도 대조군으로서 테스트되었다. 상기 대조군은 상기 테스트된 젤라틴 제형들과 시각적으로 및 구조적으로 비교되었다. 대체로, 벨라필 및 본 발명의 제형들 모두는 이들의 형상들을 유지하는 작은 볼을 형성하도록 조작될 수 있었다. 또한, 본 발명의 제형들은 접촉으로 수화된 것을 느낄 수 있었고 보다 반투명하였다.
결과들
도 72는 1㎜/s의 크로스-헤드 속도로 27G 바늘들을 통해 압출되는 제형들의 힘-변위 곡선들을 도시하며, 여기서 도 72A는 5% GE 제형의 힘-변위 곡선들을 도시하고, 도 72B는 2.5% GE 제형의 힘-변위 곡선들을 도시하며, 도 72C는 1% GE 제형의 힘-변위 곡선들을 도시하고, 도 72D는 0.5% GE 제형의 힘-변위 곡선들을 도시하며, 도 72E는 0.25% GE 제형의 힘-변위 곡선들을 도시한다. 각각의 상기 제형들의 최대 압출력들이 도 73에 도시된다. 4의 수행들만이 상기 2.5% GE 제형을 사용하여 수행되었던 점에 유의한다.
테스트된 벨라필 더말 필러는 상기 유니베르트 장치의 10N 로드 셀(load cell)을 배제하였다.
결론
도시한 바와 같이, 상기 젤라틴의 농도를 변화시키는 것은 상기 제형들의 압출력들에 상당한 영향을 미치지는 않았다. 또한, 제형들은 대조군으로 이용되었던 상기 벨라필 더말 필러 보다 낮은 최대 압출력들을 나타내었다.
관찰된 힘-변위 곡선들은 대체로 이전의 연구들보다 많은 노이즈를 가졌다. 어떠한 특정 이론에 구속되지 않고, 부드럽게 될 수 있었거나 줄어들 수 있었던 상기 설정의 임의의 굴곡이나 유연함이 상기 지지 바에 의해 방지되기 때문에 보다 안전한 설정(상기 지지 바의 이용으로부터 유래됨)이 상기 노이즈에 기여할 수 있는 것으로 가정된다.
실험예 19-본 발명의 더말 필러들의 유동학
본 연구는 본 발명의 더말 필러들의 유동학적 특성들을 조사하기 위해 수행되었다.
머서리화 AA 물질이 실험예 10에 개괄된 절차에 따라 제조되었다. 제조되면, 상기 머서리화 AA 물질의 일부는 물로 50% 희석되었다.
진동 기계적 시험이 1N 로드 셀을 구비한 셀스케일 유니베르트 장치를 이용하여 수행되었다. 샘플들은 클램프를 이용하여 상기 유니베르트 장치 내에 위치하였던 비커 내에 두어졌다.
실린더 압축들이 상기 머서리화 AA 샘플들의 정현 변형률(sinusoidal strain)(5%)을 적용하는 데 이용되었다. 진동 동작이 응력과 변형 사이의 위상각이 계산되게 하였다. 상기 응력이 진동 함수였기 때문에, 동적 탄성률(dynamic modulus)이 측정되었다. 영률(Young's modulus)이 상기 물질의 저장 및 손실 계수들을 계산하기 위해 위상 차이와 함께 이용되었다.
결과들
도 74는 머서리화 AA 샘플들의 응력과 변형 대 시간의 도표를 도시하며, 여기서 도 74A는 희석되지 않은 머서리화 AA 샘플의 응력과 변형 대 시간의 도표를 도시하고, 도 74B는 희석된 머서리화 AA 샘플의 응력과 변형 대 시간의 도표를 도시한다. 흑색 곡선들은 변형 측정들을 나타내고, 적색 곡선들은 응력 측정들을 나타낸다.
도시한 바와 같이, 상기 응력 및 변형 피크 오프셋(peak offset)은 상기 희석된 샘플에 대해 높았다. 또한, 상기 응력 진폭들은 상기 희석되지 않은 머서리화 AA 샘플에 대해 컸다.
상기 위상각은 두 피크들 사이의 시차를 각 사이클의 주기로 나누어 계산되었으며, 2π 라디안(radian)에 상응한다. 복합 동적 탄성률의 값(각 주파수에 대한응력 진폭)은 각기 실제 성분들(보존 또는 탄성률) 및 가상의 성분들(손실 탄성률)을 수득하기 위해 cos(δ) 또는 sin(δ)으로 곱해졌다. 손실 인자도 tan(δ)로서 위상 변이로부터 계산되었다.
도 75는 각각의 샘플들에 대한 보존 탄성률들, 손실 탄성률들 및 손실 인자 곡선들을 도시하며, 여기서 도 75A는 희석되지 않은 머서리화 AA 샘플에 대한 보존 탄성률들(E'; 흑색 라인) 및 손실 탄성률들(E"; 회색 라인)을 도시하고, 도 75B는 상기 희석되지 않은 머서리화 AA 샘플에 대한 손실 인자 곡선을 도시하며, 도 75C는 희석된 머서리화 AA 샘플에 대한 보존 탄성률들(E'; 흑색 라인) 및 손실 탄성률들(E"; 회색 라인)을 도시하고, 도 75D는 상기 희석된 머서리화 AA 샘플에 대한 손실 인자 곡선을 도시한다.
도시한 바와 같이, 상기 보존 및 손실 탄성률들은 상기 희석되지 않은 샘플 내의 낮은 주파수 영역에서 선형이었으며, 이는 상기 측정들이 선형 점탄성 상태(linear viscoelastic regime; LVR)로 취해졌던 것과 상기 물질이 주로 탄성 고체로 특성화될 수 있는 것을 나타낼 수 있다. 상기 희석된 샘플에 대하여, 보다 낮은 주파수들에서 주파수를 가지는 보존 및 손실 탄성률들의 약간의 증가들이 나타났었다.
또한, 상기 희석되지 않은 및 희석된 머서리화 AA 샘플들 모두가 주로 테스트된 주파수들 및 변형들에서 탄성이었지만, 상기 희석된 샘플은 보다 큰 유체 기여를 가졌다.
또한, 상기 샘플들의 점도들이 나선 경로 t-바 회전 점도계(t-bar spindle viscometer)를 이용하여 테스트되었다. 각각의 상기 샘플들이 약 100,000cp 내지 약 200,000cp의 범위 이내의 점도를 가졌던 것이 발견되었다.
실험예 20-머서리화 조직 물질들의 안정성
본 연구는 시간에 대한 머서리화 조직 물질들의 안정성을 조사하기 위해 수행되었다.
머서리화 탈세포화 AA는 상기 물질이 길슨 SS 23 테스트 체 진동기를 이용하여 고압 살균 가능하게 부착된 45㎛ 체 상에서의 체가름 이전에 27G 바늘을 통해 압출되었고, 증류수의 세 번 150㎖ 세척을 제외하면 실험예 10에서 앞서 개괄된 절차에 따라 제조되었다. 0.5㎖의 상기 머서리화 AA 물질이 F/F 루어-락 커넥터를 통해 연결된 두 3㎖ 주사기들 사이에서 0.5㎖의 0.2% 콩고 레드와 30회 혼합되었다. 결과적인 혼합물은 7㎖의 물로 희석되었고, 서로 연결된 20㎖ 주사기들 사이에서 30회 더 혼합되었다.
상기 혼합물의 내용물들은 이후에 둘의 15㎖의 팔콘 튜브들 내에 둘의 동일한 체적들로 분리되었다. 하나의 튜브는 4℃에서 냉장고에 저장되었고(대조군), 다른 하나의 튜브는 상기 샘플의 숙성을 촉진시키기 위해 써모피셔 사이언티픽(Thermo Scientific) 진탕 배양기(shaking incubator) 상에서 40℃에서 120RPM으로 두어졌다. 상기 둘의 튜브들은 5일 동안 방해받지 않고 두어졌다.
각 튜브 내에 포함된 샘플의 부분 표본은 제거되었고, 2.5X 및 10X 배율들로 SZX16 입체 현미경 상에서 영상화를 위해 사용되었다. 상기 영상들은 이후에 피지 이미지제이 상에서 분석되었다. 상기 2.5X 영상들은 스택 내에 그룹으로 되었고, 이후에 8비트로 변환되었다. 상기 영상들의 초기 휘도 및 대조 설정들 이 조정되었고, 2px 가우스 블러가 상기 영상들에 적용되었다. 상기 영상들은 이후에 한계가 정해졌고, 이에 적용된 분수령을 가졌다. 상기 영상들 내의 입자들은 크기 제한들이 없이 분석 입자 플러그인을 이용하여 분석되었다.
결과들
도 76은 분석된 샘플들의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 76A는 4℃에서 저장된 샘플의 현미경 영상을 도시하고, 도 76B는 상기 진탕 배양기 내에 유지된 샘플의 현미경 영상을 도시한다. 상기 샘플들의 입자 크기 분포들이 결정되었고, 도 77에 도시되며, 여기서 회색 바들은 4℃에서 저장된 샘플의 입자 크기 분포를 나타내고, 흑색 바들은 상기 진탕 배양기 내에 유지된 상기 샘플의 입자 크기 분포를 나타낸다.
도시한 바와 같이, 상기 분포들은 유사하였다. 30㎛-50㎛ 입자들의 작은 숄더 피크(shoulder peak)가 상기 진탕 배양기 내에 유지된 샘플에 대해 관찰되었지만, 20㎛ 보다 작은 입자들의 퍼센티지는 작게 남아 있었다(1.62%).
상기 입자들의 환상성(circularity)도 분석되었다. 환상성 C는 C＝4πA/P2로 정의되며, 여기서 A는 면적이고, P는 파라미터이다. 1의 A C 값은 완전한 원을 나타내는 반면, 0에 근접하는 값은 상기 형상의 증가된 신장을 나타낸다. 또한, 상기 입자들의 진원도(roundness)가 R＝4A/(πRm 2)로 계산되었으며, 여기서 Rm은 정합 타원의 주축을 나타낸다. 환상성과 마찬가지로, 상기 값들은 0부터 1까지의 범위이며, 1의 값은 완전하게 둥근 것을 나타낸다. 결과들은 도 78에 도시되며, 여기서 도 78A는 4℃에서 저장된 샘플의 입자들(회색 바들) 및 진탕 배양기 내에 유지된 샘플(흑색 바들)의 환상성 분포들을 도시하고, 도 78B는 4℃에서 저장된 샘플의 입자들(회색 바들) 및 상기 진탕 배양기 내에 유지된 샘플(흑색 바들)의 진원도 분포들을 도시한다.
도시한 바와 같이, 양 샘플들의 입자들은 모두 상당히 원형이었고, 상당히 둥글었다.
따라서 양 샘플들의 입자들은 유사한 입자 크기 및 형상 분포들을 가졌으며, 이는 상기 입자들이 시간에 대해 팽윤되지 않을 수 있거나, 형상이 변화되지 않을 수 있는 것을 의미한다.
실험예 21-본 발명의 더말 필러들의 미생물 시험
본 연구는 본 발명의 더말 필러들을 생산하는 방법들의 살균 사이클들을 조사하기 위해 수행되었다.
머서리화 탈세포화 AA 물질이 실험예 10에 개괄된 절차에 따라 제조되었다. 상기 머서리화 AA 물질의 일부는 더말 필러를 형성하기 위해 여기에 앞서 설명한 바와 같이 리도카인 및 젤라틴과 혼합되었고, 15분 동안의 탈가스 이후에 루어-락 커넥터를 이용하여 상업적으로 입수 가능한 1cc 주사기들 내로 전방 적재되었다. 상기 주사기들은 130℃ 또는 135℃에서 습식 사이클로 3분 동안 고압 살균되었다.
둘의 한천 배지들이 사용되었다. 즉 사부로드 포도당 한천(Sabouraud Dextrose Agar: SDA) 배지 및 트립틱 소이 한천(Tryptic Soy Agar: TSA) 배지가 사용되었다. 각 배치의 다섯의 플레이트들이 100㎜ x 16㎜ 접시에 대해 필요한 체적(200㎖의 최종 체적)을 위한 배지 내용물 비율들을 순환시키고 조정하여 제조되었다. 각 배지의 조성물들을 다음 표 35에 나타낸다.
| TSA 배지 | ||
| 성분 | 1ℓ에 대한 양 | 200㎖에 대한 양 |
| dH2O | 1000㎖ | 200㎖ |
| 판크레틱 다이제스트 오브 카세인(Pancreatic digest of casein) | 17g | 3.4g |
| 파파익 다이제스트 오브 소이빈(Papaic digest of soybean) | 3g | 0.6g |
| 덱스트로오스 | 2.5g | 0.5g |
| 염화나트륨 | 5g | 1g |
| 인산 이칼륨 | 2.5g | 0.5g |
| 한천 | 15g | 3g |
| 최종 질량 | 45g | 9g |
| SDA 배지 | ||
| dH2O | 1000㎖ | 200㎖ |
| 카세인의 췌장 소화 | 5g | 1g |
| 콩의 파파이 소화 | 5g | 1g |
| 덱스트로오스 | 40g | 8g |
| 한천 | 15g | 3g |
| 최종 질량 | 65g | 13g |
상기 배지는 121℃에서 1시간 동안 고압 살균되었고, 이후에 60℃에서 수조 내에서 냉각되었다. 상기 플레이트들은 생물안전 작업대 내에서 약 15㎖ 내지 약 30㎖의 배지로 주입되었다. 배지들로 채워진 상기 플레이트들은 고체화될 때까지 반 개방된 리드를 가지는 캐비닛 내에 두어졌다. 상기 배지들이 고체화되면, 상기 플레이트들 파라필름으로 밀봉되었고, 4℃의 멸균 냉장고 내에 두어졌다.상기 한천 플레이트들은 이후에 다섯의 다른 조건들 하에서, 개방되지 않은 대조군 플레이트, 130℃에서 고압 살균된 더말 필러를 가지는 줄무늬가 있는 것(streaked), 135℃에서 고압 살균된 더말 필러를 가지는 줄무늬가 있는 것, 머서리화 AA 물질(고압 살균되지 않음) 가지는 줄무늬가 있는 것, 그리고 줄무늬가 있는 대조군으로 제조되었다. 이용된 줄무늬가 있는 패턴은 표준 사분 기술이었다.
제조되면, TSA 플레이트들은 32.5℃에서 5일 동안 배양되었고, SDA 플레이트들은 22.5℃에서 7일 동안 배양되었다.
결과들
단지 집단들 및 성장이 상기 고압 살균되지 않은 머서리화 AA 물질로 줄무늬가 있는 플레이트들에 대해 관찰되었다.
따라서 130℃ 및 135℃에서의 3분 고압 살균 사이클들은 상기 주사기를 살균하는 데 충분하였다. 상기 개방되지 않은 대조군들도 주입 기술이 무균이었던 것을 입증하였다. 상기 줄무늬가 있는 대조군들은 임의의 오염이 발생되었을 경우라도 이는 환경이나 주입 기술보다는 상기 머서리화 AA 물질 또는 더말 필러들에 기인할 수 있는 것을 입증하였다.
상기 머서리화 AA 물질의 고압 살균이 상기 물질의 가벼운 황화(yellowing)를 야기하였던 것이 관찰되었다. 어떤 특정 이론에 구속되지 않고, 상기 황화는 상기 머서리화 AA 물질 내에 존재하는 당들을 감소시키는 캐러멜화(caramelization)의 결과가 될 수 있는 것으로 가정하였다.
실험예 22-본 발명의 더말 필러들에서의 SDS 정량화
본 연구는 본 발명의 더말 필러들 내의 잔류 SDS의 양을 결정하기 위해 수행되었다.
바이오 베이직 레지듀얼(Bio Basic Residual) SDS 검출 키트가 잔여 SDS 함량을 결정하는 데 이용되었다. 상기 키트는 0.002%-0.014% SDS의 동작 범위를 가진다. 분석은 분광 광도법 기반의 분석이었다.
실험 연구 계획은 다음과 같이 개괄된다.
표준 곡선
SDS의 실험값은 SDS의 알려진 농도들로부터 생성되는 표준 곡선에 참조된다.
1. 표준들의 생성을 위해 0.1% 용액을 만들도록 0.1g의 SDS 분말을 10㎖의 dH2O 내로 계량한다.
2. SDS 평가를 위해, 표 36에 나타낸 바와 같이 0.002%부터 0.014%까지 범위의 SDS의 알려진 농도들로 보정 도표를 마련한다.
| 희석 # | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| dH 2 O(㎕) | 1000 | 980 | 960 | 940 | 920 | 900 | 880 | 860 |
| SDS 1% 보존 용액(㎕) | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 | 120 | 140 |
| 최종 SDS 농도(%) | 0 | 0.002 | 0.004 | 0.006 | 0.008 | 0.010 | 0.012 | 0.014 |
3. 50㎕의 각각의 상기 SDS 용액들을 여덟의 새로운 2㎖ 마이크로원심분리기 튜브들 내로 옮긴다.
4. 단계 3으로부터의 50㎕의 용액 A(상기 키트로부터)를 상기 튜브들 내에 첨가한다. 잘 혼합한다.
5. 단계 3으로부터의 1.5㎖의 용액 B(상기 키트로부터)를 각 튜브에 첨가하고, 30s-1min으로 보텍싱에 의해 활발하게 혼합한다.
6. 상기 튜브가 실온에서 5분간 서있게 한다. 5000rpm(2000xg)에서 5분 동안 회전시킨다.
7. 150㎕의 상층액을 96-웰 플레이트로 옮긴다.
8. 마이크로플레이트 판독기를 공백으로 하고, 이후에 OD 499㎚에서 광학 밀도를 측정한다.
9. 상기 표준 곡선을 도표화하며, 여기서 X 축은 % SDS 농도이고, Y 축은 OD 499㎚ 판독이다.
샘플들 내의 SDS의 검출
1. 상기 샘플들을 희석하며, 이에 따라 산정된 SDS가 상기 표준 곡선의 범위 이내에서 벗어나게 한다.
2. 셋의 2㎖ 마이크로원심분리기 튜브들을 제조한다. 50㎕의 희석된 샘플들을 튜브 1 및 튜브 2에 첨가한다. 50㎕의 dH2O를 블랭크 대조군으로서 튜브 3에 첨가한다.
3. 50㎕의 용액 A를 단계 2로부터의 튜브들 내로 첨가한다. 잘 혼합한다.
4. 1.5㎖의 용액 B(상기 키트로부터)를 각 튜브에 첨가하고, 30s-1min 동안 보텍싱으로 활발하게 혼합한다.
5. 상기 튜브를 실온에서 5분 동안 서있게 한다. 5000rpm(2000xg)에서 5분 동안 회전시킨다.
6. 150㎕의 상층액을 96-웰 플레이트로 옮긴다.
7. 상기 마이크로플레이트 판독기를 공백으로 하며, 이후에 OD 499㎚에서 광학 밀도를 측정한다.
8. 상기 희석된 샘플 내의 SDS의 %를 얻기 위해 상기 표준 곡선을 이용한다. 상기 샘플 내의 SDS 농도를 계산하기 위해 다음의 공식을 이용한다.
상기 샘플 내의 SDS의 %＝(희석된 샘플의 %)(희석 인자)
탈세포화 물질 제조
어떤 특정한 이론에 구속되지 않고, SDS 정량화가 머서리화된 탈세포화 물질보다는 탈세포화 물질에 가장 적합할 수 있는 것으로 상정하였다.
탈세포화 AA 물질이 실험예 5에 개괄된 절차에 따라 제조되었다. SDS 함량은 상기 절차에 걸쳐 다양한 시점들에서 분석되었다.
결과들
표준 곡선이 알려진 SDS 용액들로부터 얻어진 다음의 데이터를 이용하여 계발되었다.
| 희석 # | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 판독 1 | 0.073 | 0.111 | 0.150 | 0.196 | 0.246 | 0.288 | 0.343 | 0.393 |
| 판독 2 | 0.059 | 0.1 | 0.147 | 0.194 | 0.240 | 0.280 | 0.339 | 0.402 |
| 판독 3 | 0.052 | 0.097 | 0.145 | 0.198 | 0.246 | 0.280 | 0.344 | 0.404 |
| 평균 | 0.061 | 0.103 | 0.147 | 0.196 | 0.244 | 0.283 | 0.342 | 0.400 |
| 수정된 블랭크 | 0.000 | 0.042 | 0.086 | 0.135 | 0.183 | 0.222 | 0.281 | 0.339 |
상기 표준 곡선의 선형 정합은 R2＝0.997을 가졌다. 상기 선형 정합의 식은 y＝23.952x-0.0067이었다.
상기 곡선은 상기 탈세포화 AA 샘플들 내의 SDS 함량을 검출하는 데 이용되었다.
● 1：10 희석의 SDS 용액이 탈세포화를 위해 사용됨＝0.10±0.01, N＝3 복제들 및 3 샘플들.
● CaCl2 배양 및 후속하는 세척과 72시간 배양 이후의 상기 탈세포화 AA 물질의 액상으로부터의 1：10 희석＝검출될 수 없었음.
● CaCl2 배양 및 후속하는 세척과 72시간 배양 이후의 상기 탈세포화 물질의 희석되지 않은 액상＝0.008% 또는 80ppm.
따라서 상기 탈세포화 샘플들의 SDS 함량은 충분하게 낮았다. 또한, 상기 SDS 함량은 복수의 원심 분리 및 세척 단계들로 인해 머서리화 절차들 동안에 더 감소될 것이다.
실험예 23-본 발명의 더말 필러들에서의 과산화물 정량화
본 연구는 본 발명의 더말 필러들 내에 남아있는 잔여 과산화물의 양을 결정하기 위해 수행되었다.
상기 과산화물 함량을 테스트하기 위해, 바르토베이션(Bartovation) 테스트 스트립들(0ppm-100ppm)이 실험예 10에 개괄된 절차에 따라 생성된 머서리화 사과 물질 내에 함침되었다. 대체로, 테스트 스트립은 1초 동안 상기 몰질 내도 함침되고, 과잉의 물질은 진탕 제거한다. 10초 후, 상기 스트림의 색상이 0ppm, 1ppm, 3ppm, 10ppm, 50ppm 및 100ppm의 보정된 색상 마킹들로서 테스트 패드와 비교된다.
머서리화 AA의 넷의 배치들이 생성되었고 테스트되었다. 제1 배치는 1ppm 내지 3ppm의 과산화물 함량을 가졌고, 제2 배치는 약 3ppm의 과산화물 함량을 가졌으며, 제3 배치는 약 0ppm의 과산화물 함량을 가졌고, 제4 배치는 약 0ppm의 과산화물 함량을 가졌다. 대체로, 상기 과산화물 함량이 세척 및 원심 분리 사이클들로 감소되었던 것으로 발견되었다.
스파이크(spike) 테스트들도 앞서의 결과들을 인증하기 위해 수행되었다. 상기 스파이크 테스트들은 약 10ppm의 과산화수소를 가지는 머서리화 AA의 배치들 중에서 하나를 수반하였다. 스파이크된 샘플은 약 10ppm의 과산화물 함량을 가졌던 것으로 발견되었으며, 이는 상기 테스트들이 성공적이었고, 결과들이 유효하였던 것을 나타낸다.
실험예 24-표백을 위해 적합한 과산화물의 농도들
본 연구는 탈세포화 물질을 표백(bleaching)하기 위해 적합한 과산화물 농도들의 범위를 결정하기 위해 수행되었다.
탈세포화 AA 물질이 실험예 10에 앞서 개괄된 절차를 이용하여 머서리화되었다. 과산화수소의 체적들은 본 연구를 위해 25㎖로 변화되었다.
첫 번째 시험에서, 상기 머서리화 AA를 생성할 때, 50㎖의 과산화수소가 표백을 위해 사용되었다. 상기 AA 물질은 밝아졌지만, 상기 물질은 완전히 표백되지 않았다.
두 번째 시험에서, 상기 머서리화 AA를 생성할 때, 75㎖의 과산화수소가 표백을 위해 사용되었으며, 상기 AA 물질이 성공적으로 표백되었다.
세 번째 시험에서, 상기 머서리화 AA를 생성할 때, 150㎖의 과산화수소가 표백을 위해 사용되었다. 상기 AA 물질은 충분히 표백되었지만, 추가적인 원심 분리 사이클이 상기 AA 물질의 과산화물 함량을 10ppm 아래로 낮추기 위해 요구되었다.
실험예 25-더말 필러들의 구성 성분들의 pH
본 연구는 본 발명의 더말 필러의 전체적인 pH에 대한 이들의 영향을 평가하기 위해 상기 더말 필러의 개개의 구성 성분들의 pH를 결정하도록 수행되었다.
표 38은 본 발명의 더말 필러의 구성 성분들의 pH 레벨들을 나타낸다.
| 물질 | pH |
| 2.5% 젤라틴 운반체 | 5.19 |
| 5% 젤라틴 운반체 | 4.72 |
| 리도카인 및 6.67X PBS | 6.89 |
| GMP PBS | 7.16 |
| PBS 내의 농축된 MerAA | 7.16 |
| 1주 이후의 PBS 내의 농축된 MerAA | 7.10 |
| 1개월 이후의 PBS 내의 농축된 MerAA | 7.10 |
일부 실시예들에서, 상기 더말 필러의 목표 범위는 약 6.5 내지 약 7.5이다. 어떠한 특정한 이론에 구속됨이 없이, 상기 PBS가 이와 같은 범위 이내의 상기 머서리화 AA의 pH를 유지할 수 있는 것으로 추정된다.
실험예 26-본 발명의 더말 필러들의 효소 분해
본 연구는 본 발명의 더말 필러들을 분해할 수 있는 효소들을 조사하기 위해 수행되었다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 더말 필러들은 인체가 상기 필러들을 분해할 수 있는 효소들을 자연 발생적으로 생산하지 못하는 관점에서 영구적으로 간주된다. 그러나 일부 경우들에서, 영구적 더말 필러를 제거하는 것이 바람직할 수 있는 점이 이해될 것이다. 영구적 더말 필러를 제거하기 위한 하나의 방식은 인체에서 생산되지 않는 효소들을 이용하는 효소 분해를 통하는 것이 될 수 있다.
화학 물질들 및 기구들
3,5-디니트로살리시클릭산(dinitrosalicylic Acid: DNSA) 및 D-(+)-글루코오스(glucose)는 알파 에이사르(Alfa Aesar)(캐나다)로부터 입수되었다. 아황산나트륨(sodium sulfite)은 안콤 테크놀로지즈(ANKOM technologies)(미국)로부터 입수되었다. 아세트산, 콩고 레드, 아세트산나트륨 삼수화물, 수산화나트륨 및 인산염 완충 식염수(PBS)는 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)(캐나다)으로부터 입수되었다. 타타르산 나트륨 칼륨 사수화물(potassium sodium tartrate tetrahydrate)은 아크로스 오르가닉스(Acros Organics)(캐나다)로부터 입수되었다. 사용된 효소들은 TCI 아메리카(America)(미국)의 아스페트길루스 니게르(Aspergillus niger)로부터의 셀룰라아제 및 펙티나아제, 시그마(Sigma)(캐나다)의 트리코데르마 종(Trichoderma sp.)으로부터의 셀룰라아제, 그리고 플랜트메디아(Plantmedia)(미국)의 리조푸스 종(Rhizopus sp.)으로부터의 마체로자임(Macerozyme) R-10이었다. 벤치스톱(benchtop) pH 미터(사르토리우스(Sartorius)), 시너지 Mx 분광 광도계(바이오테크), MaxQ 교반 배양기(써모피셔사이언티픽), 그리고 형광 필터들을 구비한 SZX16 입체 현미경(올림푸스)이 조사를 실행하기 위해 이용되었다.
시약들 및 용액들 제조
디니트로살리시클릭산 시약 1%(DNSA 시약)이 10g의 DNSA, 500㎎의 아황산나트륨 및 10g의 수산화나트륨(NaOH)을 1ℓ의 증류수 내에 용해시켜 제조되었고, 실온에서 저장되었다. 40% 타타르산 나트륨 칼륨 용액(로셀 염(Rochelle salt))이 40g의 타타르산 나트륨 칼륨 사수화물을 100㎖의 증류수 내에 용해시켜 제조되었으며, 실온에서 저장되었다. 시트르산나트륨 완충액(50mM)이 50㎖의 100mM의 시트르산나트륨을 증류수 내에 100㎖의 최종 체적까지 용해시키고 pH를 6으로 조절하여 제조되었으며, 실온에서 저장되었다. 아세트산나트륨 완충액(100mM)이 1.3g의 아세트산나트륨 및 5㎎의 아세트산을 100㎖의 증류수 내에 용해시키고 pH를 6으로 조절하여 제조되었으며, 실온에서 저장되었다. PBS 완충액 1X는 10㎖의 10X PBS를 증류수 내에 100㎖의 최종 체적까지 용해시켜 제조되었고, 실온에서 저장되었다. 효소 보존 용액들은 1㎎/㎖의 동일한 효소 농도로 다양한 완충액들 내에 제조되었으며, 4℃에서 저장되었다. 콩고 레드 염색 용액 0.1%가 증류수 내에 용해시켜 제조되었으며, 상기 용액은 임의의 침전물들을 제거하기 위해 0.45㎛ 주사기 필터를 이용하여 여과되었고, 상기 용액은 4℃에서 저장되었다.
글루코오스 표준 곡선
DNSA 방법은 비색 분석(colorimetric analysis)을 통해 용액 내에 생성된 글루코오스의 양을 정량화한다. 이러한 방법은 글루코오스와 같은 당들을 감소시켜 야기되는 유리 카르복실기(C＝O)의 존재를 확인하는 데 이용된다. 글루코오스 내에 존재하는 알데히드 작용기의 산화는 상기 DNSA와의 반응을 야기하며, 이는 3-아미노(amino)-5-니트로살리시클릭산(nitrosalicylic acid: ANSA)으로 환원되고, 결과적으로 상기 용액이 적갈색 색상으로 되게 한다. 증류수 내의 10㎎/㎖의 D-글루코오스의 보존 용액을 사용하여, 0㎎/㎖, 0.1㎎/㎖, 0.2㎎/㎖, 0.3㎎/㎖, 0.4㎎/㎖, 0.5㎎/㎖, 0.6㎎/㎖, 0.7㎎/㎖, 0.8㎎/㎖, 0.9㎎/㎖, 1㎎/㎖, 2㎎/㎖, 3㎎/㎖, 4㎎/㎖, 5㎎/㎖, 6㎎/㎖, 7㎎/㎖, 8㎎/㎖, 9㎎/㎖ 및 10㎎/㎖의 표준 곡선이 만들어졌다. 상기 DNSA 시약 방법들 및 HIMEDIA로부터의 연구 계획을 이용요하여, 상기 셀룰로오스계 더말 필러의 분해로부터의 글루코오스 생산의 표준 곡선이 구현될 수 있다. D-글루코오스의 보존 용액을 0.1㎎/㎖로부터 10㎎/㎖까지 범위의 농도로 희석함으로써, 200㎕의 표준이 부분 표본으로 되었다. 0.5㎖의 DNSA 시약이 상기 표준에 첨가되었고, 샘플들은 15분 동안 끓여졌다(95℃). 완료되면, 0.5㎖의 칼륨 나트륨 삼수화물(40%)이 상기 샘플들에 첨가되었고, 보텍싱으로 혼합되었다. 150㎕의 각 표준이96-웰 플레이트에 첨가되었고, 흡수도가 상기 시너지 Mx 분광 광도계를 이용하여 540㎚에서 취해졌다.
다양한 완충액들 내의 희석된 효소 분석
이러한 분석은 작은 규모로 상기 셀룰로오스계 더말 필러의 분해를 위해 최적이었던 완충액들 및 효소들을 결정하기 위해 수행되었다. 효소의 보존 용액들(1㎎/㎖)이 다른 완충액들(PBS, 아세트산나트륨, 및 시트르산나트륨) 내에 만들어졌고, 이후에 50㎕의 상기 보존 용액이 950㎕의 동일한 완충액으로 희석되었다. 1㎖의 상기 셀룰로오스계 더말 필러가 24-웰 플레이트의 웰들에 첨가되었고, 이후에 상기 희석된 효소 용액이 상기 웰들에 첨가되었다. 상기 플레이트들은 교반 없이 셋의 다른 기간들인 1시간, 24시간 및 48시간 동안 37℃ 배양기 내에 두어졌다. 200㎕ 부분 표본이 각 기간 동안 취해졌으며, DNSA 분석까지 효소 활성을 억제하도록 4℃에서 저장되었다. 글루코오스 생산 평가는 상기 DNSA 방법으로 이루어졌다.
다양한 완충액들 내의 희석 펙티나아제/셀룰라아제 비율 분석
이러한 분석은 펙티나아제 및 셀룰라아제의 다른 비율들로 상기 셀룰로오스계 더말 필러의 분해를 위해 최적인 완충액을 결정하는 데 이용되었다. 다른 완충액들(PBS, 아세트산나트륨 및 시트르산나트륨) 내의 펙티나아제(1㎎/㎖)의 보존 용액 및 셀룰라아제(1㎎/㎖)의 보존 용액을 이용하여, 100：0, 75：25, 50：50, 25：75의 펙티나아제：셀룰라아제의 비율들이 50㎕의 최종 체적으로 만들어졌다. 이러한 용액은 이후에 950㎕의 대응되는 완충액으로 희석되었다. 1㎖의 상기 셀룰로오스계 더말 필러가 24-웰 플레이트의 웰들에 첨가되었고, 펙티나아제 및 셀룰라아제의 희석된 혼합물이 상기 웰들에 첨가되었다. 상기 플레이트들 1시간, 24시간 및 48시간 동안 교반 없이 37℃ 배양기 내에 두어졌다. 200㎕ 부분 표본이 각 기간 동안 취해졌으며, 4℃에서 저장되었다. 글루코오스 생산 평가는 상기 DNSA 방법으로 이루어졌다.
다른 효소 농도 분석
본 분석은 앞서 테스트된 최적의 완충액들 내의 상기 셀룰로오스계 더말 필러를 전체적으로 분해하기 위한 최적의 농도를 결정하는 데 이용되었다. 아세트산나트륨 또는 시트르산나트륨 내의 효소들의 보존 용액(1㎎/㎖)을 이용하여, 100：0, 75：25, 50：50, 25：75 및 0：100(효소：완충액)의 비율들이 대응되는 완충액으로 1.2㎖의 최종 체적까지 희석하여 만들어졌다. 0.5㎖의 체적의 상기 셀룰로오스계 더말 필러가 24-웰 플레이트에 첨가되었고, 다른 효소 농도 용액들은 적절한 웰들에 첨가되었다. 상기 플레이트들은 교반 없이 1시간, 24시간 및 48시간 동안 37℃ 배양기 내에 두어졌다. 200㎕의 부분 표본들이 특정된 배양 시간 이후에 각 웰로부터 취해졌으며, DNSA 분석까지 효소 활성을 억제하도록 4℃에서 저장되었다. 글루코오스 생산 평가는 상기 DNSA 방법으로 이루어졌으며, 더말 필러 입자 분해는 블루 바이올렛(Blue-Violet) 필터를 구비한 SZX16 입체 현미경을 이용하여 2.5X의 배율의 형광 현미경 영상화 및 콩고 레드 염색으로 가시화되었다.
다른 펙티나아제 및 셀룰라아제 비율 농도 분석
본 분석은 상기 셀룰로오스계 더말 필러ㄹ르 전체적으로 분해하고, 임의의 변화들이 펙티나아제의 첨가로부터 유래되는 것을 가시화하기 위해 펙티나아제 및 셀룰라아제 혼합물의 최적 비율을 결정하는 데 이용되었다. 본 연구에서 사용된 완충액들의 선택은 부문 2.4로부터의 방법을 이용하여 실험들로부터의 결과들을 기초로 하였다. 아세트산나트륨 또는 시트르산나트륨 내의 펙티나아제(1㎎/㎖)의 보존 용액 및 셀룰라아제(1㎎/㎖)의 보존 용액을 사용하여, 100：0, 75：25, 50：50, 25：75 및 0：100(펙티나아제：셀룰라아제)의 비율들이 1.2㎖의 최종 체적을 위해 각 보존 용액의 필요한 양들을 결합하여 만들어졌다. 0.5㎖의 체적의 상기 셀룰로오스계 더말 필러가 24-웰 플레이트 내의 웰들에 첨가되었고, 상기 펙티나아제-셀룰라아제 용액들이 적절한 웰들에 첨가되었다. 상기 플레이트들은 교반 없이 1시간, 24시간 및 48시간 동안 37℃ 배양기 내에 두어졌다. 200㎕ 부분 표본들이 특정된 배양 시간 이후에 각 웰로부터 취해졌으며, DNSA 분석까지 효소 활성을 억제하도록 4℃에서 저장되었다. 글루코오스 생산 평가는 상기 DNSA 방법으로 이루어졌으며, 더말 필러 입자 분해는 블루 바이올렛 필터를 구비한 SZX16 입체 현미경을 이용하여 2.5X의 배율의 형광 현미경 영상화 및 콩고 레드 염색으로 가시화되었다.
다른 시간들 및 다른 농도들에서의 효소 분해 효능
본 분석은 상기 효소 용액들의 효율이 새로이 만들어진 효소들과 비교할 때에 미리 만들어지고 다른 온도들에 저장될 경우에 변화되었는지를 결정하는 데 이용되었다. 효소들의 보다 높은 농도들도 1㎎/㎖, 1.5㎎/㎖, 2㎎/㎖, 2.5㎎/㎖ 및 3㎎/㎖로 테스트되었다. 앞서의 분석들에서, 상기 용액들은 2시간의 기간 내에 만들어졌고, 상기 효소 용액을 신선하게 유지하도록 얼음 배스 내에 두어졌다. 이에 비하여, 실험은 4℃에서 일주 동안 유지되었던 용액들로 반복되었다. 사용된 효소들은 트리코데르마 종으로부터의 셀룰라아제 및 아세트산나트륨 완충액 내의 25：75(펙티나아제：셀룰라아제)의 비율인 트리코데르마 종으로부터의 셀룰라아제와 아스페르길루스 니게르로부터의 펙티나아제의 혼합물이었다. 1㎖의 체적의 상기 셀룰로오스계 더말 필러가 24-웰 플레이트의 웰들에 첨가되었고, 상기 효소 용액들은 적절한 웰에 첨가되었다. 상기 플레이트들은 교반 없이 1시간, 24시간 및 48시간 동안 37℃ 배양기 내에 두어졌다. 200㎕ 부분 표본들이 특정된 배양 시간 후에 각 웰로부터 취해졌고, DNSA 분석까지 효소 활성을 억제하도록 4℃에서 저장되었다. 글루코오스 생산 평가는 상기 DNSA 방법으로 이루어졌고, 더말 필러 입자 분해는 블루 바이올렛 필터를 구비한 SZX16 입체 현미경을 이용하여 2.5X의 배율의 형광 현미경 영상화 및 콩고 레드 염색으로 가시화되었다.
현미경 영상화
효소 소화 이후에 남아 있는 샘플들은 0.1% 콩고 레드 용액으로 염색되었고, 입자들이 분해되었는지를 평가하는 데 이용되었다. 영상 분석을 위해, 단일 입자들을 가시화하기 위한 1/64 희석이 수행되었다. 1㎖의 각 샘플이 24-웰 플레이트에 첨가되었고, 상기 바이올렛 필터를 구비한 SZX16 입체 현미경을 이용하여 2.5X의 배율로 영상화되었다.
통계적 분석
얻어진 값들의 통계적 분석이 오리진 2021 소프트웨어를 이용하여 양방향 ANOVA로 수행되었다. 제시된 모든 값들은 평균±표준 오차(SE)이다. 값들에 대해 통계적으로 유의미하게 다른 경우는 p＜0.05이다.
결과들
셀룰로오스는 함께 β-1,4-글리코시드 결합들(glycosidic linkage)에 부착되는 D-글루코오스의 다중의 서브유닛들로 구성된 선형 다당류이다. 셀룰라아제 효소는 D-글루코오스 서브유닛들이 해제되도록 이러한 결합을 파괴한다. 이러한 이유로, 상기 DNSA 방법이 상기 셀룰로오스계 더말 필러에 대한 효소 활성으로부터 생성될 것인 D-글루코오스의 표준 곡선을 획득하는 데 이용되었다. 도 79에 도시된 표준 곡선들은 D-글루코오스에 대한 셀룰로오스계 입자들의 분해를 정량화하는 데 이용되었다. 선형 곡선으로부터 얻어진 식들로써, 상기 D-글루코오스의 농도가 계산될 수 있다.
540㎚의 파장에 대해 [D-글루코오스]＝(흡수도＋0.05185)/0.36664; 및
575㎚의 파장에 대해 [D-글루코오스]＝(흡수도＋0.01969)/0.11256.
도 80을 참조하면, 트리코데르마 종으로부터의 셀룰라아제(T)는 아스페르길루스 니게르로부터의 셀룰라아제(A) 및 마체로자임 R-10(M)에 비하여 37℃의 배양 온도에서 글루코오스로의 셀룰로오스의 가장 우수한 전환을 가지는 것을 볼 수 있다. 마체로자임 R-10이 40℃ 내지 50℃의 최적 온도를 가지고, 아스페르길루스 니게르로부터의 셀룰라아제가 30℃에서 최적 온도를 가지며, 트리코데르마 종으로부터의 셀룰라아제는 40℃에서 최적 온도를 가지기 때문에, 이는 그 효소 활성을 급격하게 하강킬 수 있는 효소의 최적 온도에 의해 설명될 수 있으며, 왜 트리코데르마 종이 글루코오스의 보다 많은 생산을 가졌던 유일한 효소인지를 나타낼 수 있다. 셀룰라아제(T)는 아세트산나트륨(ACE) 및 시트르산나트륨(CIT) 완충액들 내에서 보다 우수하게 작용하였다. 도 80에 나타내는 대조군 값들은 단지 완충액 내에서 작은 양의 D-글루코오스가 상기 셀룰로오스계 더말 필러로부터 제시되었던 것을 보여준다. 이는 상기 머서리화 프로세스에 의해 야기될 수 있으며, 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스와 같은 사과 세포벽의 구성 성분들을 글루코오스로 파괴할 수 있다.
다음에, 펙티나아제 및 셀룰라아제의 다양한 비율들이 평가되었다. 도 81은 다른 완충액들 내의 다른 펙티나아제：셀룰라아제 비율들의 분석을 도시한다. 도시한 바와 같이, 100：0의 비율로 펙티나아제 단독으로는 상기 입자들의 많은 분해를 가져오지 않는다. 상기 펙티나아제가 T ACE와 함께 25：75의 비율로 셀룰라아제에 첨가되었을 때, 상기 분해가 다른 샘플들에 비하여 최적이었다. 어떤 특정한 이론에 구속되지 않고, 펙티나아제의 첨가가 셀룰로오스 미세섬유들과 연결된 상기 헤미셀룰로오스 폴리머들을 파괴하는 데 도움이 될 수 있는 것으로 여겨졌으며, 결과적으로 보다 많은 셀룰로오스가 유리되고 셀룰라아제로의 가수분해를 위해 이용 가능하게 될 수 있다.
도 82를 참조하면, 셀룰라아제(T)가 25% 농도에서도 가장 많은 글루코오스 생성을 가졌고, 최적의 완충액이 ACE이었던 것이 도시된다. 다른 효소들(A 및 M)에 대해, 다른 배양 시간들 사이에서 비교되었을 때에 생성된 어떠한 글루코오스도 거의 없었다. 도 83은 T CIT 및 T ACE에 대해 100% 내지 50%의 농도들이 상기 셀룰로오스 입자들을 전체적으로 분해시켰던 것과 25%의 농도에 대해 부분적인 분해가 존재하였던 것을 도시한다. 이는 1.2㎖의 효소 용액이 100%부터 50%까지의 범위의 농도들로부터 0.5㎖의 셀룰로오스계 더말 필러의 셀룰로오스 입자들을 완전히 분해할 수 있는 것을 의미한다.
상이한 펙티나아제：셀룰라아제 비율들의 분석의 결과들이 도 84에 도시된다. 도시한 바와 같이, 셀룰라아제(T)는 사용된 완충액에 따라 다른 최적 비율을 가졌다. T ACE에 대하여 상기 펙티나아제：셀룰라아제의 최적 비율은 25：75였고, T CIT에 대하여 상기 최적 비율 75：25였다. 도 85에 도시된 염색된 현미경 영상들은 T ACE에 대해 50：50, 25：75 및 0：100에서 펙티나아제：셀룰라아제의 비율들에 대한 전체적인 분해를 보여준다. 상기 펙티나아제와 함께 T CIT에 대한 영상들은 상기 혼합물에 첨가되지 않았기 때문에 설명되지 못하였다.
도 86에 도시한 바와 같이, 신선한 효소 용액의 다른 농도들은 48시간 후에 펙티나아제가 있고 없는 모든 다른 셀룰라아제 농도들에 대해 생성된 D-글루코오스의 12㎎/㎖ 및 16㎎/㎖의 농도들 사이의 정점지속 형성을 나타내었다. 상기 정점지속은 기질 이용 가능한 양에 대한 효소들이 충분하지 않았던 것을 나타낼 수 있다. 펙티나아제가 있고 없이 T ACE와 함께 2.5㎎/㎖ 및 3㎎/㎖의 농도들에 대해 셀룰로오스 입자들의 전체적인 분해가 관찰되었으며, 도 87에 도시된다. T ACE에 대해 1.5㎎/㎖ 및 2㎎/㎖의 농도들 및 펙티나아제가 있는 T ACE에 대해 1㎎/㎖, 1.5㎎/㎖ 및 2㎎/㎖의 농도들에서 상기 입자들의 부분적인 분해도 존재하였다.
도 88에 도시한 바와 같이, 미리 만들어진 효소 용액들의 다른 농도들은 상기 농도들이 높아지면서 점진적인 피크를 나타내었으며, 이에 비하여 신선한 효소 용액은 정점지속을 나타내었다. 상기 D-글루코오스 생산은 첨가된 펙티나아제로의 12.5㎎/㎖ 내지 15㎎/㎖에 비하여 12.520㎎/㎖로부터 20㎎/㎖까지로 출발하여 T ACE로만으로가 보다 높았다. 상기 신선한 효소 용액으로부터의 결과들과 비교하면, 상기 효소 활성이 4℃에서 1주 동안 저장되었던 이후에 영향을 받지 않았던 점이 분명해진다. 셀룰라아제는 4℃에서 7.5개월 동안 효소 활성의 저하 없이 저장될 수 있으므로, 이러한 결과가 예측되었다.
따라서 테스트된 효소들이외의 본 발명의 셀룰로오스계 더말 필러들을 분해하기 위한 최적의 효소는 여기서 평가된 다양한 결합들 이외에도 펙티나아제와 함께 또는 펙티나아제가 없는 트리코데르마 종으로부터의 셀룰라아제이다.
실험예 27-본 발명의 더말 필러들의 체내 주사
본 연구는 실험예 3에서 얻어진 결과들을 확장시키기 위해 수행되었다. 다른 체내 주사들이 본 발명의 더말 필러들을 이용하여 수행되었다.
셋의 더말 필러 제형들-식염수 운반체를 가지는 것, 히알루론산(HA) 운반체를 가지는 것 및 콜라겐 운반체를 가지는 것이 제조되었다. 상기 제형들은 실험예 3에 개괄된 절차를 이용하여 제조되었다.
각각의 상기 셋의 제형들은 셋의 랫들에 피하로 주사되었다. 실험예 3에 개괄된 주사 절차가 여기에 다시 수반되었다. 각각의 상기 랫들은 4주 및 8주에서 절제되었다. 12주 후, 각 제형에 대해 둘의 랫들이 안락사되었고, 이로부터 조직이 수집되었다. 1년 후, 나머지 랫들이 안락사되었고, 이로부터 조직이 수집되었다.
결과들
각각의 상기 제형 시험들로부터 상기 랫들 중에서 하나로부터 취해진 절제들의 실험예들이 도 89에 도시되며, 여기서 도 89A는 상기 식염수 제형으로 주사된 랫으로부터 취해진 절제이고, 도 89B는 상기 HA 제형으로 주사된 랫으로부터 취해진 절제이며, 도 89C는 상기 콜라겐 제형으로 주사된 랫으로부터 취해진 절제이다.
상기 주사된 제형들은 절제 이후에 평가되었다. 대체로, 상기 식염수 제형들은 갈색으로 색상이었다. 상기 HA 제형들은 상기 식염수 제형들과 유사한 색상이었지만, 상기 HA 주사들의 형태는 상기 식염수 제형들과 비교할 경우에 "울퉁불퉁한(bumpy)" 또는 "분열된(fragmented)" 것으로 나타났다. 상기 콜라겐 필러들은 간결한 타원형으로 남았으며, 처음 4주 동안에 백색의 색상이었고, 이후의 시점들에서는 갈색의 색상이었으며, 이는 상기 랫의 몸 내의 콜라겐 재흡수를 위한 기간에 대응될 수 있다.
샘플들은 다양한 시점들에서 각각의 상기 주사들로부터 취해졌고, 메이슨 트리크롬(MT) 또는 헤마톡실린 및 에오신(HE)으로 염색되었으며, 현미경 하에서 영상화되었다. 각각의 상기 제형들의 상기 12주의 시점에서의 현미경 영상들이 도 90 내지 도 92에 도시된다.
도 90은 상기 12주의 시점에서 식염수 제형 주사의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 90A는 1X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 식염수 제형의 현미경을 도시하고, 도 90B는 10X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 식염수 제형의 현미경 영상을 도시하며, 도 90C는 20X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 식염수 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 90D는 1X의 배율로 HE로 염색된 상기 주사된 식염수 제형의 현미경 영상을 도시하며, 도 90E는 10X의 배율로 HE로 염색된 상기 주사된 식염수 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 90F는 20X의 배율로 HE로 염색된 상기 주사된 식염수 제형의 현미경 영상을 도시한다.
도 91은 12주의 시점에서 HA 제형 주사의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 91A는 1X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 HA 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 91B는 10X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 HA 제형의 현미경 영상을 도시하며, 도 91C는 20X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 HA 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 91D는 1X의 배율로 HE로 염색된 상기 주사된 HA 제형의 현미경 영상을 도시하며, 도 91E는 10X의 배율로 HE로 염색된 상기 주사된 HA 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 91F는 20X의 배율로 HE로 염색된 상기 주사된 HA 제형의 현미경 영상을 도시한다.
도 92는 12주의 시점에서 콜라겐 제형의 현미경 영상들을 도시하며, 여기서 도 92A는 1X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 콜라겐 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 92B는 10X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 콜라겐 제형의 현미경 영상을 도시하며, 도 92C는 20X의 배율로 MT로 염색된 상기 주사된 콜라겐 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 92D는 1X의 배율로 HE로 염색된 상기 주사된 콜라겐 제형의 현미경 영상을 도시하며, 도 92E는 10X의 배율로 HE로 염색된 상기 주사된 콜라겐 제형의 현미경 영상을 도시하고, 도 92F는 20X의 배율로 HE로 염색된 상기 주사된 콜라겐 제형의 현미경 영상을 도시한다.
각각의 상기 주사된 제형들의 샘플들도 콩고 레드로 염색되었으며, 랫 세포들이 상기 더말 필러들을 침습하였던 정도를 조사하기 위해 현미경 하에서 연구되었다. 침습하는 랫 세포들은 훽스트 33342로 표기되었다. 결과들은 도 93에 도시되며, 여기서 도 93A는 10X의 배율로 주사된 식염수 제형을 도시하고, 도 93B는 10X의 배율로 주사된 HA 제형을 도시하며, 도 93C는 10X의 배율로 주사된 콜라겐 제형을 도시한다. 도시한 바와 같이, 상기 셋의 제형들은 12주의 시점에서 상당한 렛 세포 침습을 겪었다.
혈관들 및 적혈구 세포들이 각각의 상기 주사된 제형들 내에서 볼 수 있었던 것이 발견되었다. 상기 랫들과 상기 더말 필러 제형들 사이의 혈관형성 상호작용들을 조사하기 위해, CD31 염색이 상기 12주의 시점에서 상기 주사된 제형들에 대해 수행되었다. 또한, CD45 염색이 상기 랫들의 면역 반응들을 평가하기 위해 이용되었고, 베르회프-반 기엔슨(Verhoeff-Van Gienson)(베르회프) 염색이 엘라스틴(elastin) 확인을 위해 사용되었다. 각각의 상기 염색들의 결과들은 도 94에 도시된다. 도시한 바와 같이, 상기 CD31 염색은 혈관 벽들의 형성(갈색 루프 구조들)을 확인하였고, 상기 CD45 염색은 상기 주사된 이물에 대해 예상된 면역 반응(갈색 세포질 및 청색 핵들)을 보여주었다. 상기 베르회프 염색은 엘라스틴 섬유들(흑색)의 상당한 양은 보여주지 않았지만, 예측한 대로 콜라겐 섬유들(적색/분홍색)을 보여주었다.
조직학적 분석
조직학적 분석도 상기 12주의 시점에서 상기 주사된 더말 필러 제형들 및 상업적으로 입수 가능한 벨라필 더말 필러에 대해 수행되었다. 상기 주사된 제형들은 다음 표 39에 나타내는 ISO 10993-6 가이드라인들에 따라 평가되었다.
| 반응 | 점수 (*/hpf＝고출력(x400) 구역) |
||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 다핵형 세포들 | 0 | 희귀, 1-5hpf* | 6-10hpf | 심한 침윤물 | 농축됨 |
| 림프구들 | 0 | 희귀, 1-5hpf | 6-10hpf | 심한 침윤물 | 농축됨 |
| 혈장 세포들 | 0 | 희귀, 1-5hpf | 6-10hpf | 심한 침윤물 | 농축됨 |
| 대식 세포들 | 0 | 희귀, 1-5hpf | 6-10hpf | 심한 침윤물 | 농축됨 |
| 거대 세포들 | 0 | 희귀, 1-2hpf | 3-5hpf | 심한 침윤물 | 농축됨 |
| 괴사 | 0 | 최소 | 약함 | 보통 | 뚜렷함 |
| 혈관신생 | 0 | 최소 모세 혈관 증식 국소, 1-3 버드들 | 지지 섬유모세포 구조들과 함께 4-7 모세 혈관들의 그룹들 | 지지 구조들과 함께 모세 혈관들의 넓은 띠 | 지지 섬유모세포 구조들과 함께 모세 혈관들의 광범위한 띠 |
| 콜라겐 침착/ 섬유연결 조직 |
0 | 최소 | 약함 | 보통 | 보통 |
| 섬유 피막 형성 | 0 | 좁은 띠 | 보통 두께의 띠 | 두꺼운 띠 | 광범위한 띠 |
| 지방 침윤 | 0 | 섬유 형성과 연관된 지방의 최소 양 | 지방 및 섬유 형성의 몇몇 층들 | 이식 부위에 대한 지방 세포들의 연장되고 넓은 축적 | 이식을 완전히 둘러싸는 광범위한 지방 |
| 섬유 삼출물들 | 0 | 최소 | 약함 | 보통 | 뚜렷함 |
| 무기화 | 0 | 최소 | 약함 | 보통 | 뚜렷함 |
| 육아종 | 0 | 최소 | 약함 | 보통 | 뚜렷함 |
| 출혈 | 0 | 최소 | 약함 | 보통 | 뚜렷함 |
| 이물 부스러기 | 0 | 최소 | 약함 | 보통 | 뚜렷함 |
표 40은 ISO 10993-6 하에서의 평가를 위해 수집된 샘플들의 세부 사항들이다.
| 동물 식별 번호 | 그룹 |
슬라이드
식별 번호 |
염색 | 설명 |
| VCUGQ | 1 | HE VCUGQ | HE | 시험 샘플 HE |
| MT VCUGQ | MT | 시험 샘플 MT | ||
| CD31 VCUGQ | CD31 | 시험 샘플 CD31 | ||
| CD45 VCUGQ | CD45 | 시험 샘플 CD45 | ||
| 음성 VCUGQ | 음성 대조군 | 동물 내에 이식됨, 일차 없음, 헤마톡실린으로 색원체 및 대비 염색된 경우로서 DAB로 염색된 슬라이드 | ||
| XFYBE | 2 | HE XFYBE | HE | 시험 샘플 HE |
| MT XFYBE | MT | 시험 샘플 MT | ||
| CD31 XFYBE | CD31 | 시험 샘플 CD31 | ||
| CD45 XFYBE | CD45 | 시험 샘플 CD45 | ||
| 음성 XFYBE | 음성 대조군 | 동물 내에 이식됨, 일차 없음, 헤마톡실린으로 색원체 및 대비 염색된 경우로서 DAB로 염색된 슬라이드 | ||
| UTNAP | 3 | HE UTNAP | HE | 시험 샘플 HE |
| MT UTNAP | MT | 시험 샘플 MT | ||
| CD31 UTNAP | CD31 | 시험 샘플 CD31 | ||
| CD45 UTNAP | CD45 | 시험 샘플 CD45 | ||
| 음성 UTNAP | 음성 대조군 | 동물 내에 이식됨, 일차 없음, 헤마톡실린으로 색원체 및 대비 염색된 경우로서 DAB로 염색된 슬라이드 | ||
| LZNVU | 4 | LZNVU | HE | 시험 샘플 HE |
| LZNVU | MT | 시험 샘플 MT | ||
| LZNVU | CD31 | 시험 샘플 CD31 | ||
| LZNVU | CD45 | 시험 샘플 CD45 | ||
| 음성 LZNVU | 음성 대조군 | 물 내에 이식됨, 일차 없음, 헤마톡실린으로 색원체 및 대비 염색된 경우로서 DAB로 염색된 슬라이드 | ||
| 음성 대조군 |
Rb CD31 | CD31 | 분말, 동물에 이식되지 않음, 염색(CD31)에 사용된 일차 및 이차 항체들 | |
| Rb CD45 | CD45 | 분말, 동물에 이식되지 않음, 염색(CD45)에 사용된 일차 및 이차 항체들 |
표 40에서 확인되는 각각의 상기 그룹들에 대한 ISO 10993-6 하의 평가의 결과들을 다음 표 41 내지 표 43에 나타낸다.
| 파라미터들 | 슬라이드 식별 | 평균 | SD | No. | |
| VCUGC | |||||
| 섹션 a | |||||
| 1 | 2 | ||||
| 다형핵 세포들 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 림프구들 | 3 | 3 | 3.00 | 0.00 | 2 |
| 혈장 세포들 | 1 | 1 | 1.00 | 0.00 | 2 |
| 대식세포들 | 3 | 3 | 3.00 | 0.00 | 2 |
| 거대 세포들 | 4 | 4 | 4.00 | 0.00 | 2 |
| 괴사 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 소계(X2) | 22 | 22 | 22.00 | 0.00 | 2 |
| 혈관 신생 | 3 | 3 | 3.00 | 0.00 | 2 |
| 콜라겐 침착/섬유연결 조직 | 1 | 1 | 1.00 | 0.00 | 2 |
| 지방 침착 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 소계 | 4 | 4 | 4.00 | 0.00 | 2 |
| 합계 | 26 | 26 | 26.00 | 0.00 | 2 |
| 그룹별 합계 | 52 | - | - | - | |
| 그룹별 평균 b | 26.0 | - | - | - | |
| 섬유 피막형성 | 1 | 1 | 1.00 | 0.00 | 2 |
| 섬유소 분비물들 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 무기질 침착 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 육아종 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 출혈 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 이물 부스러기 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 조사된 부위들의 번호 | 1 | 1 | - | - | 2 |
| 파라미터들 | 슬라이드 식별 | 평균 | SD | No. | |
| XFYBE | |||||
| 섹션 a | |||||
| 1 | 2 | ||||
| 다형핵 세포들 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 림프구들 | 2 | 2 | 2.00 | 0.00 | 2 |
| 혈장 세포들 | 1 | 1 | 1.00 | 0.00 | 2 |
| 대식세포들 | 2 | 3 | 2.50 | 0.71 | 2 |
| 거대 세포들 | 3 | 3 | 3.00 | 0.00 | 2 |
| 괴사 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 소계(X2) | 16 | 18 | 17.00 | 1.41 | 2 |
| 혈관 신생 | 2 | 2 | 2.00 | 0.00 | 2 |
| 콜라겐 침착/섬유연결 조직 | 2 | 2 | 2.00 | 0.00 | 2 |
| 지방 침착 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 소계 | 4 | 4 | 4.00 | 0.00 | 2 |
| 합계 | 20 | 22 | 21.00 | 1.41 | 2 |
| 그룹별 합계 | 42 | - | - | - | |
| 그룹별 평균 b | 21.0 | - | - | - | |
| 섬유 피막형성 | 1 | 1 | 1.00 | 0.00 | 2 |
| 섬유소 분비물들 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 무기질 침착 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 육아종 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 출혈 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 이물 부스러기 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 조사된 부위들의 번호 | 1 | 1 | - | - | 2 |
| 파라미터들 | 슬라이드 식별 | 평균 | SD | No. | |
| UTNAP | |||||
| 섹션 a | |||||
| 1 | 2 | ||||
| 다형핵 세포들 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 림프구들 | 3 | 3 | 3.00 | 0.00 | 2 |
| 혈장 세포들 | 1 | 1 | 1.00 | 0.00 | 2 |
| 대식세포들 | 2 | 3 | 2.50 | 0.71 | 2 |
| 거대 세포들 | 4 | 4 | 4.00 | 0.00 | 2 |
| 괴사들 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 소계(X2) | 20 | 22 | 21.00 | 1.41 | 2 |
| 혈관 신생 | 3 | 3 | 3.00 | 0.00 | 2 |
| 콜라겐 침착/섬유연결 조직 | 1 | 1 | 1.00 | 0.00 | 2 |
| 지방 침착 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 소계 | 4 | 4 | 4.00 | 0.00 | 2 |
| 합계 | 24 | 26 | 25.00 | 1.41 | 2 |
| 그룹별 합계 | 50 | - | - | - | |
| 그룹별 평균 b | 25.0 | - | - | - | |
| 섬유 피막형성 | 1 | 1 | 1.00 | 0.00 | 2 |
| 섬유소 분비물들 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 무기질 침착 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 육아종 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 출혈 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 이물 부스러기 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 조사된 부위들의 번호 | 1 | 1 | - | - | 2 |
| 파라미터들 | 슬라이드 식별 | 평균 | SD | No. | |
| LZNVU | |||||
| 섹션 a | |||||
| 1 | 2 | ||||
| 다형핵 세포들 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 림프구들 | 3 | 3 | 3.00 | 0.00 | 2 |
| 혈장 세포들 | 1 | 1 | 1.00 | 0.00 | 2 |
| 대식세포들 | 2 | 2 | 2.00 | 0.00 | 2 |
| 거대 세포들 | 2 | 2 | 2.00 | 0.00 | 2 |
| 괴사들 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 소계(X2) | 16 | 16 | 16.00 | 0.00 | 2 |
| 혈관 신생 | 2 | 2 | 2.00 | 0.00 | 2 |
| 콜라겐 침착/섬유연결 조직 | 1 | 1 | 1.00 | 0.00 | 2 |
| 지방 침착 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 소계 | 3 | 3 | 3.00 | 0.00 | 2 |
| 합계 | 19 | 19 | 19.00 | 0.00 | 2 |
| 그룹별 합계 | 38 | - | - | - | |
| 그룹별 평균 b | 19.0 | - | - | - | |
| 섬유 피막형성 | 1 | 1 | 1.00 | 0.00 | 2 |
| 섬유소 분비물들 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 무기질 침착 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 육아종 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 출혈 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 이물 부스러기 | 0 | 0 | 0.00 | 0.00 | 2 |
| 조사된 부위들의 번호 | 1 | 1 | - | - | 2 |
각 샘플 그룹의 다양한 파라미터들의 평균들의 요약이 다음 표 45에 도시된다.
|
그룹 1
n＝2 |
그룹 2
n＝2 |
그룹 3
n＝2 |
그룹 4
n＝2 |
||
| 림프구들 | 평균±SD | 3.00±0.00 | 2.00±0.00 | 3.00±0.00 | 3.00±0.00 |
| 혈장 세포들 | 평균±SD | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 |
| 대식 세포들 | 평균±SD | 3.00±0.00 | 2.50±0.71 | 2.50±0.71 | 2.00±0.00 |
| 거대 세포들 | 평균±SD | 4.00±0.00 | 3.00±0.00 | 4.00±0.00 | 2.00±0.00 |
| 혈관 신생 | 평균±SD | 3.00±0.00 | 2.00±0.00 | 3.00±0.00 | 2.00±0.00 |
| 콜라겐 침착/섬유연결 조직 | 평균±SD | 1.00±0.00 | 2.00±0.00 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 |
| 섬유 피막 형성 | 평균±SD | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 |
도시한 바와 같이, 다형핵 세포들, 괴사, 지방 침착, 섬유소 분비물들, 무기질 침착, 육아종, 출혈 또는 이물 부스러기는 상기 그룹 1, 그룹 2, 그룹 3 및 그룹 4의 이식 부위들 중에서 어떠한 것에서도 볼 수 없었다.상기 그룹 1, 상기 그룹 2 및 상기 그룹 3 테스트 이식들에 대한 조직 반응은 높은 동력 구역 및 최소 콜라겐 침착/섬유연결 조직 당 림프구들과 대식 세포들의 심한 침윤물들에 대한 6의 침윤, 1 내지 5의 혈장 세포들, 그리고 농축된 거대 세포들의 심한 침윤물로 특징지어졌다.
상기 테스트 그룹들에서, 상기 재흡수/분해 테스트 제형 입자들은 상기 거대 세포들 내에서 관찰되었거나, 대식 세포들로 둘러싸였던 반면, 상기 림프구들 및 혈장 세포들은 이식들의 주변에서 대부분 볼 수 있었다.
섬유 연결 조작의 좁은 띠로 특징지어지는 최소 섬유 피막 형성은 상기 그룹 1, 상기 그룹 2 및 상기 그룹 3의 시험 이식 부위들을 둘러싸는 것으로 관찰되었다.
그룹 4 대조군 이식 부위들 내의 조직 반응은 높은 동력 구역 및 최소 콜라겐 침착/섬유연결 조직 당 림프구들의 심한 침윤들에 대한 6의 침윤, 1 내지 5의 혈장 세포들, 6 내지 10의 대식 세포들 그리고 3 내지 5의 거대 세포들에 의해 특징지어졌다. 상기 대조군에서, 염증 세포들이 상기 대조군 항목 미세구들을 둘러싸는 것으로 보였다.
지지 섬유모세포 구조들을 가지는 4-7의 모세 혈관들로 특징지어지는 혈관 신생은 그룹 2 시험 및 그룹 4 대조군 이식 부위들에서 볼 수 있었던 반면에 지지 구조들을 가지는 모세 혈관들의 넓은 띠들이 그룹 1 및 그룹 3 시험 이식 부위들에서 관찰되었다.
염증 반응은 상기 그룹 2 시험 및 그룹 4 대조군 이식들 보다 상기 그룹 1 및 그룹 3 시험 이식들에서 약간 높게 나타났었다. 비록 상기 염증 반응이 상기 ISO 10993-6 점수 평가에 상당히 기초하였지만, 상기 그룹 2 시험 이식은 비자극성인 것으로 간주되었고, 상기 그룹 1 및 그룹 3 시험 이식들은 상기 그룹 4 대조군과 비교할 때에 약간 자극성이었던 것으로 간주되었다. 상기 제형들의 자극성의 요약을 다음 표 46에 나타낸다.
| 그룹 | 평균 | 자극성/반응성 상태 | ||
| 시험 | 그룹 1 | 26.0 | 7.0 | 약간 자극성 |
| 시험 | 그룹 2 | 21.0 | 2.0 | 비자극성 |
| 시험 | 그룹 3 | 25.0 | 6.0 | 약간 자극성 |
| 대조군 | 그룹 4 | 19.0 | - | - |
전반적으로, 상기 그룹들 모두는 염증 반응들(대부분의 거대 세포들, 림프구들 및 대식 세포들을 포함)을 가져왔고, 괴사, 지방 침윤, 섬유소 삼출물, 무기화, 육아종, 출혈 또는 이물 부스러기는 없었다. 상기 ISO 10993-6 점수 평가에 기초하여, 상기 그룹 2 시험 이식은 비자극성으로 간주되었지만, 상기 그룹 1 및 그룹 3 시험 이식들은 상기 그룹 4 대조군 이식과 비교할 때에 약간 자극성으로 간주되었다.
주사 크기 측정들
주사된 더말 필러의 체적에 의해 형성된 범프들의 크기는 각각의 상기 제형들에 대해서 뿐만 아니라 상업적으로 입수 가능한 벨라필 더말 필러를 사용한 시험에 대해서도 모니터되었다. 대체로 타원 형상인 주사들이 캘리퍼스를 이용하여 둘의 직교하는 직경들의 길이 및 높이(상기 피부에 직교하는)를 기록함으로써 모니터되었다. 상기 측정들은 평면 내의 면적뿐만 아니라 타원 체적에 대한 추정을 계산하는 데 이용되었다.
각 주사 범프의 높이의 변화는 시간에 걸친 상기 제형들에 대한 정규화된 퍼센티지 감소들이 도 95에 도시되는 바와 같이 나타났으며, 여기서 상기 콜라겐 제형은 흑색 라인이고, 상기 HA 제형은 적색 라인이며, 상기 식염수 제형은 청색 라인이고, 상기 벨라필 제형은 보라색 라인이다.
도시한 바와 같이, 상기 콜라겐 및 HA 제형들은 궁극적으로 정점 지속된 크기의 점차적인 감소를 나타내었던 반면, 상기 식염수 제형은 예상된 바와 같이 높이의 빠른 감소를 나타내었다. 벨라필 더말 필러 주사의 높이는 상기 콜라겐 및 HA 제형들과 유사하게 정점지속까지 점차 감소되었다.
상기 주사 범프들의 크기의 감소가 입자 분해를 나타내지는 않았던 점에 유의한다. 앞서의 조직학적 평가는 상기 입자들이 온전하게 남았던 것을 보여주었다. 오히려, 상기 크기의 감소는 운반체의 재흡수, 상기 물질의 치밀화, 측부 방향으로의 상기 제형의 팽창 및/또는 시간에 대한 상기 랫의 질량의 증가에 기인할 수 있다.
실험예 28-본 발명의 더말 필러들의 추가 체내 연구들
추가 체내 시험이 머서리화 사과 물질을 포함하는 본 발명의 더말 필러 제형들을 이용하여 수행되었다.
넷의 제형들이 테스트되었다. 즉, 제1 제형(Mer100)은 머서리화 사과만으로 구성되었고, 제2 제형(20Mer80Sal)은 0.9% 식염수 용액 내의 20% 머서리화 사과로 구성되었으며, 제3 제형(20Mer80Col)은 3.5% 콜라겐 용액 내의 20% 머서리화 사과로 구성되었고, 제4 제형(20Mer80Reg)은 용해되고 재생된 셀룰로오스 내의 20% 머서리화 사과를 포함하였다. 각각의 상기 제형들은 또한 0.3% 리도카인을 포함하였다.
상기 셀룰로오스는 탈세포화 사과 물질을 LiCl 및 디메틸 아세트아미드(DMAc)의 용액으로 용해시켜 제조되었다. 상기 용해된 셀룰로오스는 이후에 용매 교환을 통해 "재생되었고", 머서리화 사과와 혼합되었다.
각각의 상기 제형들은 넷의 시간들에서 둘의 랫들에 주사되었다. 각 제형에 대해, 하나의 랫은 12주 후에 주사되었고, 다른 하나는 1년 후에 주사되었다. 각각의 상기 주사 체적들은 600㎕의 제형을 포함하였다. 상기 제형들의 주사 이후에 형성된 범프들은 12주 동안은 매주 및 이후에는 매월 측정되었다. 상기 범프 크기들은 캘리퍼스를 이용하여 앞서 여기에 설명한 바와 같이 측정되었다.
결과들
관찰 상으로, 상기 20Mer80Sal 및 20Mer80Col 주사 버프들이 상기 Mer100 제형의 경우보다 작았던 점에 유의하였다. 또한, 상기 20Mer80Reg 주사 범프들은 상기 테스트된 제형들 중에서 가장 경직되었다.
시간에 걸친 각각의 상기 제형들의 주사 범프들의 높이의 변화가 도 96에 도시된다. 비교를 위해, 실험예 27의 높이 변화 결과들이 포함되며, 여기서 DFAAC는 실험예 27의 콜라겐 제형을 가리키고, DFAAHA는 실험예 27의 HA 제형을 가리킨다, DFAAS는 실험예 27의 식염수 제형을 가리키며, DFBF는 벨라필 더말 필러를 가리킨다.
도시한 바와 같이, 머서리화 사과를 포함하는 각각의 상기 제형들은 대체로 궁극적인 정점지속까지 높이의 감소를 나타내었다.
상기 주사된 제형들eh 조직학적으로 분석되었다. 상기 주사된 제형들은 실험예 27에서 앞서 설명한 바와 같이 HE, MT, CD45, CD31 및 베르회프 염색으로 염색되었으며, 현미경 하에서 분석되었다. 200㎛의 척도로 결과들이 도 97에 도시된다. 조직학적 분석들의 수행자에 의해 취해진 유의 사항들을 다음 표 47에 나타낸다.
| 그룹 | HE | MT | CD31 | CD45 | 베르회프 |
| MerAA | 필러 물질, 적은 혈관들, 거대 세포들 희귀 | 필러 물질을 둘러싸는 콜라겐의 미세한 띠들 | 적은 분산되고 잘 형성된 작은 BV들 | 세포질 홍조; 진성 염색 없음 | 주변부에서 뚜렷한 일부 BV들 |
| MerAA | 필러 물질, 보다 많은 혈관들, BRNBP에 비해 보다 많은 거대 세포들 | 필러 물질 및 일부 혈관들을 둘러싸는 콜라겐의 미세한 띠들 | BRNBP에 비해 보다 잘 형성된 작은 BV들 | 세포질 홍조?; 드문 림프구 염색 | 주변부에서 뚜렷한 일부 BV들 |
| MerAA | 필러 물질, 분산된 혈관들, 분산된 거대 세포들 | 필러 물질 및 일부 혈관들을 둘러싸는 콜라겐의 미세한 띠들 | JCFDE와 유사 | 세포질 홍조; 진성 염색 없음 | 주변부에서 뚜렷한 일부 BV들 |
| Mer20Sal80 | 분산된 혈관들이 있는 필러 물질 및 간헐적인 거대 세포들 | 필러 물질 및 적은혈관들을 둘러싸는 콜라겐의 미세한 띠들 | 뚜렷한 분산되고 작은 잘 형성된 BV들 | 세포질 홍조; 진성 염색 없음 | BV들 주변의 일부 엘라스틴 |
| Mer20Sal80 | 분산된 혈관들이 있는 필러 물질 및 간헐적인 거대 세포들 | 필러 물질 및 적은혈관들을 둘러싸는 콜라겐의 미세한 띠들 | 뚜렷한 분산되고 작은 잘 형성된 BV들 | 세포질 홍조; 진성 염색 없음 | BV들 주변의 일부 엘라스틴 |
| Mer20Sal80 | 분산된 혈관들이 있는 필러 물질 및 간헐적인 거대 세포들 | 필러 물질 및 적은혈관들을 둘러싸는 콜라겐의 미세한 띠들 | 뚜렷하고 분산된 작은 잘 형성된 BV들 | 세포질 홍조; 진성 염색 없음 | BV들 주변의 일부 엘라스틴 |
| Mer20Col80 | 필러 물질, 분산된 혈관들, 적은 거대 세포들 | 대부분 주변부의 콜라겐의 두꺼운 띠들, 필러 물질 내에 중심성이고 일부 혈관들 주위의 미세한 띠들 | 뚜렷하고 잘 형성된 작은 BV들 | 홍조; 림프구들의 진성 염색 없음 | 주변부에서 뚜렷한 일부 BV들 |
| Mer20Col80 | 표피 아래로 치밀한 콜라겐 | 표피 아래의 콜라겐 | 보기에 너무 낮은 동력?; 적은 BV들이 가시적? | V 낮은 동력; 염색 없음 | NA |
| Mer20Col80 | 필러 물질, 콜라겐의 넓은 띠들, 분산된 거대 세포들 및 혈관들 | 필러 물질 내에 중심성의 뚜렷한 콜라겐의 넓은 띠들 | 뚜렷한 몇몇 작은 혈액 BV들이 | 세포질 홍조; 진성 염색 없음 | 몇몇 BV들을 염색하는 일부 진성 |
| Mer20Reg80 | 풍부한 중심의 필러 물질, 주변부의 분산된 혈관들 및 거대 세포들 | 대부분 주변부에서 뚜렷한 콜라겐의 미세한 띠들 | 뚜렷한 몇몇 작은 잘 형성된 BV들 | 세포질 홍조; 진성 염색 없음 | BV들 주변의 일부 엘라스틴 |
| Mer20Reg80 | 풍부한 중심의 필러 물질, 주변부의 분산된 혈관들 및 거대 세포들 | 대부분 주변부에서 뚜렷한 콜라겐의 미세한 띠들 | 주변부에서 분산되고 잘 형성된 작은BV들 | 세포질 홍조; 진성 염색 없음 | BV들 주변의 일부 엘라스틴 |
| Mer20Reg80 | 풍부한 중심의 필러 물질, 주변부의 혈관들 및 적은 거대 세포들 | 대부분 주변부에서 미세하고 좁은 띠들의 콜라겐 | 주변부에서 뚜렷한 잘 형성된 혈관들 | 세포질 홍조; 진성 염색 없음 | BV들 주변의 일부 엘라스틴 |
대체로, 상기 조직학적 분석들은 상기 머서리화 사과를 이용한 제형들이 실험예 27에서 조사된 제형들과 비교할 경우에 감소된 염증 반응을 나타내었던 것을 보여준다. 또한, 머서리화 사과를 이용한 상기 제형들은 생체 적합성이고, 혈관 제형을 제시하였으며, 세포외 기질 침착을 가졌던 것으로 입증되었다.또한, 상기 20Mer80Reg 제형이 그 주변부에 국부화된 세포 침습을 가졌던 점에 유의한다. 특정한 이론에 의해 구속되지 않고, 상기 20Mer80Reg 제형에 대한 상기 세포 침습의 국부화는 얽히고 용해되며 재생된 셀룰로오스 폴리머들의 작은 구멍 크기에 기인할 수 있는 것으로 여겨진다.
실험예 29-본 발명의 더말 필러들 내의 SDS 함량의 추가 정량화
본 연구는 실험예 22의 결과들에 따라 구성되는 본 발명의 더말 필러들 내의 잔여 SDS의 양을 보다 특성화하기 위해 수행되었다.
실험예 22에서 발전된 표준 곡선 및 개괄된 프로세스를 이용하여, 추가 샘플들이 분광 광도법을 이용하여 분석되었다. 사용된 샘플들은 5 사과들의 가치의 물질(5AA), 10 사과들의 가치의 물질(10AA), 또는 15 사과들의 가치의 물질(15AA)을 가졌다.
표 48은 0.1% SDS 내에서의 72시간의 배양 후에 상기 5AA, 10AA 및 15AA 샘플들로부터의 비커 용액들(1：10으로 희석됨)의 SDS 정량화의 결과들을 나타낸다.
| 판독(499㎚) | 블랭크 | 0.01% SDS 용액 | 5AA 샘플 | 10AA 샘플 | 15AA 샘플 |
| 샘플 1 | 0.136 | 0.387 | 0.395 | 0.359 | 0.346 |
| 샘플 2 | 0.128 | 0.391 | 0.390 | 0.361 | 0.348 |
| 샘플 3 | 0.126 | 0.385 | 0.389 | 0.364 | 0.349 |
| 평균 | 0.130± 0.005 |
0.388± 0.003 |
0.391± 0.003 |
0.361± 0.003 |
0.348± 0.003 |
| 보정 | 0.000± 0.007 |
0.258± 0.006 |
0.261± 0.006 |
0.231± 0.006 |
0.218± 0.006 |
| 표준 곡선으로부터의 % SDS | 0.000 | 0.011 | 0.011 | 0.010 | 0.009 |
표 49는 상기 탈세포화 프로세스 이후의 상기 5AA, 10AA 및 15AA 샘플들로부터의 액상(희석되지 않음)의 SDS 정량화를 나타낸다.
| 판독(499㎚) | 블랭크 | 5AA 샘플 | 10AA 샘플 | 15AA 샘플 |
| 샘플 1 | 0.132 | 0.203 | 0.315 | 0.282 |
| 샘플 2 | 0.134 | 0.196 | 0.314 | 0.28 |
| 샘플 3 | 0.125 | 0.196 | 0.324 | 0.275 |
| 샘플 4 | 0.137 | 0.195 | 0.306 | 0.269 |
| 샘플 5 | 0.135 | 0.201 | 0.308 | 0.271 |
| 샘플 6 | 0.141 | 0.197 | 0.309 | 0.261 |
| 평균 | 0.134±0.005 | 0.198±0.003 | 0.313±0.007 | 0.273±0.008 |
| 보정 | 0.000±0.008 | 0.064±0.006 | 0.179±0.008 | 0.139±0.009 |
| 표준 곡선으로부터의 % SDS | 0.000±0.001 | 0.003±0.001 | 0.008±0.001 | 0.006±0.001 |
따라서 도시한 바와 같이, 상기 샘플들의 SDS 함량은 충분히 낮았으며, 이는 실험예 22의 발견들을 지지한다. 또한, 상기 SDS 함량은 복수의 원심 분리 및 세척 단계들로 인해 머서리화 과정들 동안에 더 감소될 것이다.하나 또는 그 이상의 예시적인 실시예들이 앞서 실험예들을 통해 설명되었다. 해당 기술 분야의 숙련자라면 수많은 변형들과 변경들이 다음의 특허 청구 범위에 정의되는 바와 같은 본 발명의 범주를 벗어나지 않고 이루어질 수 있는 점을 이해할 수 있을 것이다.
참조 문헌들
1. Huh, J. B 등의 "Effects of PMMA and Cross-Linked Dextran Filler for Soft Tissue Augmentation in Rats"(Int. J. Mol. Sci. 16, 28523(2015)).
2. Hillel, A. T. 등의 "Validation of a Small Animal Model for Soft Tissue Filler Characterization. Dermatologic Surg."(38, 471(2012)).
3. Cena, R. B. 등의 "Effects of Crosslinked Dextran in Hydroxylpropyl Methylcellulose on Soft Tissue Augmentation in Rats"(J. Biomed. Mater. Res. -Part B Appl. Biomater. 102, 131(2014)).
4. Lee, Y. B. 등의 "Histology of a Novel Injectable Filler (Polymethylmethacrylate and Cross-Linked Dextran in Hydroxypropyl Methylcellulose) in a Rat Model"(J. Cosmet. Laser Ther. 16, 191(2014)).
5. Lemperle, G.; Morhenn, V. B.; Pestonjamasp, V.; Gallo, R. L.의 "Migration Studies and Histology of Injectable Microspheres of Different Sizes in Mice"(Plast. Reconstr. Surg. 113, 1380(2004)).
6. Lemperle 등의 "ArteFill Permanent Injectable for Soft Tissue Augmentation： I. Mechanism of Action and Injection Techniques"(Aesth Plast Surg. 34, 264(2010)).
7. Luebberding 등의 "Critical Appraisal of the Safety of dermal fillers： A Primer for Clinicians"(Curr Derm Rep 2, 150(2013)).
8. Frazer, R.Q. 등의 "PMMA： An essential material in medicine and dentistry. J. Long Term Effect Med"(Implants. 15, 629(2005)).
9. Hickey, R. 등의 "Customizing the Shape and Microenvironment Biochemistry of Biocompatible Macroscopic Plant-Derived Cellulose Scaffolds"(ACS Biomater. Sci. Eng. 4, 3726(2018).
10. 국제 공개 특허 WO2017/136950호(발명의 명칭： "Decellularised Cell Wall Structures from Plants and Fungus and Use Thereof as Scaffold Materials").
11. Nguyen 등의 "Cosmetic Medicine： Facial Resurfacing and Injectable"(Plast Reconstr Surg. 129, 142e(2012)).
12. Luebberding 등의 "Critical Appraisal of the Safety of dermal fillers： A Primer for Clinicians"(Curr Derm Rep. 2, 150(2013)).
여기서와 본문에서 언급되는 모든 참조 문헌들은 그 개시 사항들이 본원에 전체적으로 참조로 포함된다.
Claims (104)
- 조직의 세포 물질들 및 핵산들이 제거된 탈세포화(decellularized) 식물 또는 균류 조직을 포함하는 비재흡수성 더말 필러(dermal filler).
- 제1항에 있어서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 키틴(chitin)계, 키토산(chitosan)계, 리그노셀룰로오스(lignocellulosic)계, 또는 셀룰로오스계인 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 식물의 잎 구조, 뿌리, 과육(flesh), 하이판시움(hypanthium) 또는 펄프(pulp) 구조들로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 상추, 당근, 사과, 배, 또는 이들의 임의의 결합으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 균질화되는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 건조되고, 분쇄가 수행되며, 선택적으로 재구성되거나 재수화되는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 단일의 구조 세포들의 크기 또는 보다 작은 입자들로 분해되는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 더말 필러는 히드로겔(hydrogel), 기질, 또는 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직을 위한 운반체 유체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제8항에 있어서, 상기 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체는 PBS, 식염수, 히알루론산(hyaluronic acid)(교차 결합되거나 교차 결합되지 않음), 알긴산염(alginate), 콜라겐(collagen), 플루론산(pluronic acid)(예를 들어, 플루로닉(Pluronic) F 127), 한천(agar), 아가로오스(agarose), 피브린(fibrin), 칼슘 히드록시아파타이트(calcium hydroxyapatite), 폴리(Poly)-L-젖산(lactic acid), 자가 지방(autologous fat), 실리콘(silicone), 덱스트란(dextran), 메틸셀룰로오스(methylcellulose), 용해되고 재생된 셀룰로오스, 또는 이들의 임의의 결합들을 포함하는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 더말 필러는 건조되거나, 수화되는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 더말 필러는 리도카인(lidocaine) 또는 다른 마취제를 포함하는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 불규칙한 3D 형상들 및/또는 구형이 아닌 얇은 플레이크(flake)와 같은 구조들을 가지는 입자들로 분해되는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제12항에 있어서, 상기 플레이크와 같은 구조들은 약 0.01㎛ 내지 약 100㎛, 예를 들면, 약 0.1㎛의 두께를 가지는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 세포 또는 세포들에 의해 포식되지 않기 위해 충분히 큰 크기를 가지는 입자들로 분해되며, 바람직하게는 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 적어도 약 20㎛의 크기, 직경, 또는 최소 페렛(feret) 직경을 가지는 입자들로 분해될 수 있는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 20㎛ 내지 약 1000㎛ 이내의 크기, 직경, 또는 페렛 직경을 가지는 입자들로 분해되는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 200㎛ 보다 작은 크기, 직경, 또는 최대 페렛 직경을 가지는 입자들로 분해되는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 20㎛ 내지 약 200㎛의 범위 이내의 크기, 직경, 또는 페렛 직경 분포를 가지는 입자들로 분해되는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 30㎛ 내지 약 100㎛ 이내의 피크를 갖는 입자 크기, 직경, 또는 페렛 직경을 가지는 입자들로 분해되는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 30㎛ 내지 약 100㎛의 범위 이내의 평균 입자 크기, 직경, 또는 페렛 직경을 가지는 입자들로 분해되는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 300㎛ 보다 작은 크기, 직경, 또는 최대 페렛 직경을 가지는 입자들로 분해되는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제15항 및 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 100㎛ 내지 약 300㎛의 범위 이내의 크기, 직경, 또는 페렛 직경 분포를 가지는 입자들로 분해되는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제15항, 제20항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 100㎛ 내지 약 300㎛ 이내의 피크를 갖는 입자 크기, 직경, 또는 페렛 직경 분포를 가지는 입자들로 분해되는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제15항 및 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 100㎛ 내지 약 300㎛의 범위 이내의 평균 입자 크기, 직경, 또는 페렛 직경을 가지는 입자들로 분해되는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 200㎛2 내지 약 3000㎛2의 범위 이내, 또는 약 200㎛2 내지 약 300㎛2의 범위 이내의 평균 투영 입자 면적을 가지는 입자들로 분해되거나, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 0.1㎛-1 내지 100㎛-1의 체적 비율까지의 표면적을 가지는 입자들로 분해되거나, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 4 x 105입자들/㎖ 내지 약 7 x 109입자들/㎖의 충전 밀도를 가지는 입자들로 분해되거나, 이들의 임의의 결합들로 분해되는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 약 500,000cp 보다 작은 점도를 가지는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제25항에 있어서, 약 100,000cp 내지 약 200,000cp의 범위 이내의 점도를 가지는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 살균되는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 더말 필러는 살균되는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제27항 또는 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 살균은 감마 살균(gamma sterilization)에 이루어지는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서. 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 머서리화되는(mercerized) 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제30항에 있어서, 상기 머서리화는 수산화나트륨 및 과산화수소로의 가열에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 더말 필러는 피부 아래 주사, 깊은 피부 주사, 피하 주사(예를 들어, 피하 지방 주사), 또는 이들의 임의의 결합들을 위해 조제되는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 주사기 또는 주사 장치 내에 제공되는 것을 특징으로 하는 더말 필러.
- 연조직 필러로서나 재건 수술을 위해 또는 이들 모두를 위한 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 더말 필러의 용도.
- 필요로 하는 대상의 미용 외관(cosmetic appearance)을 개선하기 위한 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 더말 필러의 용도.
- 필요로 하는 대상에서 조직 체적을 증가시키거나, 주름들을 펴거나, 또는 이들 모두를 위한 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 더말 필러의 용도.
- 필요로 하는 대상에서 미용 외관을 개선하거나, 조직 체적을 증가시키거나, 주름들을 펴거나, 또는 이들의 임의의 결합들을 위한 방법에 있어서,
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 더말 필러를 필요로 하는 영역에 투여하거나 주사하는 단계를 포함하며,
이에 따라 상기 대상의 미용 외관을 개선하거나, 조직 체적을 증가시키거나, 주름들을 펴거나, 또는 이들의 임의의 결합들을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항의 용도, 혹은 제37항의 방법에 있어서, 상기 대상의 고유 세포들은 상기 더말 필러에 침윤되는 것을 특징으로 하는 용도 또는 방법.
- 제34항 내지 제36항 또는 제38항 중 어느 한 항의 용도, 혹은 제37항 또는 제38항의 방법에 있어서, 상기 더말 필러는 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직이 상기 대상 내에 실질적으로 온전하게 남도록 비재흡수성인 것을 특징으로 하는 용도 또는 방법.
- 제34항 내지 제36항, 제38항 또는 제39항 중 어느 한 항의 용도, 혹은 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항의 방법에 있어서, 상기 더말 필러는 이에 대한 하나 또는 그 이상의 효소들의 첨가를 통해 분해될 수 있는 것을 특징으로 하는 용도 또는 방법.
- 제40항의 용도, 또는 제40항의 방법에 있어서, 상기 식물 또는 균류 조직은 셀룰로오스계이며, 상기 하나 또는 그 이상의 효소들은 셀룰라아제(cellulase)를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제41항의 용도, 또는 제41항의 방법에 있어서, 상기 셀룰라아제는 트리코데르마 종(Trichoderma sp.)으로부터의 셀룰라아제인 것을 특징으로 하는 용도.
- 비재흡수성 더말 필러를 제조하기 위한 방법에 있어서,
식물 또는 균류 조직을 제공하는 단계;
조직의 세포 물질들 및 핵산들이 제거된 입자들을 제공하도록 상기 식물 또는 균류 조직을 탈세포화하고, 크기를 감소시키는 단계; 및
선택적으로 상기 입자들을 살균하는 단계를 포함하며,
이에 따라 상기 비재흡수성 더말 필러를 제공하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제43항에 있어서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 키틴계, 키토산계, 리그노셀룰로오스계, 또는 셀룰로오스계인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 식물의 잎 구조, 뿌리, 과육, 하이판시움 또는 펄프 구조들로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 상추, 당근, 사과, 배, 또는 이들의 임의의 결합으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 상기 입자들을 제공하기 위한 기계적 크기 감소를 포함하며, 선택적으로 상기 기계적 크기 감소는 건조되거나, 냉동 건조되거나, 또는 동결 건조된 물질들에 대해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제47항에 있어서, 상기 기계적 크기 감소는 상기 입자들을 제공하도록 상기 탈세포화하는 단계 이전 또는 이후에 상기 식물 또는 균류 조직을 압쇄(crushing), 압출(extrusion), 분쇄(grinding), 제분(milling), 초음파처리(ultrasonication), 전기방사(electrospinning), 화학적 용해(chemical dissolution), 효소 파괴(enzymatic breakdown), 또는 전단(shearing)하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 상기 탈세포화하는 단계 이전 또는 이후에 상기 식물 또는 균류 조직을 건조시키는 단계, 상기 입자들을 제공하도록 상기 건조된 식물 또는 균류 조직에 기계적 크기 감소를 수행하는 단계, 그리고 선택적으로, 상기 입자들을 재구성(reconstituting)하는 단계, 재현탁(resuspending)하는 단계, 또는 재수화(rehydrating)하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 단일의 구조 세포들, 또는 보다 작은 크기의 입자들을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체로 상기 입자들을 조제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제51항에 있어서, 상기 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체는 PBS, 식염수, 히알루론산(교차 결합되거나 교차 결합되지 않음), 알긴산염, 콜라겐, 플루론산(예를 들어, 플루로닉 F 127), 한천, 아가로오스, 피브린, 칼슘 히드록시아파타이트, 폴리-L-젖산, 자가 지방, 실리콘, 덱스트란, 메틸셀룰로오스, 재생된 셀룰로오스, 또는 이들의 임의의 결합들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 더말 필러는 건조되거나, 수화된 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 리도카인 또는 다른 마취제로 조제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 불규칙한 3D 형상들 및/또는 구형이 아닌 얇은 플레이크와 같은 구조들을 가지는 입자들을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제55항에 있어서, 상기 플레이크와 같은 구조들은 약 0.01㎛ 내지 약 100㎛, 예를 들면, 약 0.1㎛의 두께를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 목표 크기를 가지는 입자들, 목표 크기 범위 이내의 입자들, 또는 목표 크기 분포를 가지는 입자들을 얻기 위해 압출, 여과, 원심 분리, 또는 다른 크기 분리를 수행하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 세포 또는 세포들에 의해 포식되지 않기 위해 충분히 큰 크기를 가지는 입자들을 제공하며, 바람직하게는 상기 크기를 감소시키는 단계는 적어도 약 20㎛의 크기, 직경, 또는 최소 페렛 직경을 가지는 입자들을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 약 20㎛ 내지 약 1000㎛의 범위 이내의 크기, 직경, 또는 페렛 직경을 가지는 입자들을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 약 200㎛ 보다 작은 크기, 직경, 또는 최대 페렛 직경을 가지는 입자들을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 약 20㎛ 내지 약 200㎛의 범위 이내의 크기, 직경, 또는 페렛 직경 분포를 가지는 입자들을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 약 30㎛ 내지 약 100㎛ 이내의 피크를 갖는 입자 크기, 직경, 또는 페렛 직경 분포를 가지는 입자들을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 약 30㎛ 내지 약 100㎛의 범위 이내의 평균 입자 크기, 직경, 또는 페렛 직경을 가지는 입자들을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 약 300㎛ 보다 작은 크기, 직경, 또는 최대 페렛 직경을 가지는 입자들을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제59항 및 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 약 100㎛ 내지 약 300㎛의 범위 이내의 크기, 직경, 또는 페렛 직경 분포를 가지는 입자들을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제59항, 제64항 및 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 약 100㎛ 내지 약 300㎛ 이내의 피크를 갖는 입자 크기, 직경, 또는 페렛 직경 분포를 가지는 입자들을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제59항 및 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 약 100㎛ 내지 약 300㎛의 범위 이내의 평균 입자 크기, 직경, 또는 페렛 직경을 가지는 입자들을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 약 200㎛2 내지 약 3000㎛2의 범위 이내, 또는 약 200㎛2 내지 약 300㎛2의 범위 이내의 평균 투영 입자 면적을 가지는 입자들을 제공하며, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 0.1㎛-1 내지 100㎛-1의 표면적 대 체적 비율을 가지는 입자들로 분해되거나, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 약 4 x 105입자들/㎖ 내지 약 7 x 109입자들/㎖의 충전 밀도를 가지는 입자들로 분해되거나, 이들의 임의의 결합들로 분해되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 상위 임계값 크기 아래의 입자들을 얻기 위해 동시에 필터를 통해 결과적인 입자들을 통과시키면서 분쇄하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제69항에 있어서, 하위 임계값 크기보다 작은 입자들을 제거하고, 상기 하위 임계값 크기보다 큰 입자들을 얻기 위해 여과, 분별 또는 평형 원심 분리, 또는 체가름(sieving)하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제69항 또는 제70항에 있어서, 상기 여과 또는 체가름하는 단계는 자동화된 습식 체를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크기를 감소시키는 단계는 목표 크기를 가지는 입자들, 목표 크기 범위 이내의 입자들, 또는 목표 크기 분포를 가지는 입자들을 얻기 위해 분별 또는 평형 원심 분리를 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 주사기 또는 용기(vessel)에 물 또는 완충액(예를 들어, 식염수)과 같은 유체 내의 입자들을 적재하고, 제2 주사기 또는 용기에 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체를 적재하여 상기 입자들을 상기 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체로 조제하는 단계를 더 포함하며, 상기 제1 및 제2 주사기들 또는 용기들은 유체 연통되고, 상기 주사기들 또는 용기들의 내용물들을 상기 제1 및 제2 주사기들 또는 용기들 사이에서 전후로 통과시켜 혼합하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 크기 배제 혼합기(size exclusion mixer)를 이용하여 상기 입자들을 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체와 혼합시켜 상기 입자들을 상기 히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체로 조제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제74항에 있어서, 상기 크기 배제 혼합기는 정적 혼합기(static mixer)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 탈세포화하는 단계 이전 또는 이후에 상기 식물 또는 균류 조직을 살균하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 더말 필러를 살균하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제76항 또는 제77항에 있어서, 상기 살균은 감마 살균에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제76항 또는 제77항에 있어서, 상기 살균은 고압 살균(autoclaving)에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제76항 또는 제77항에 있어서, 상기 살균은 복수의 살균 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제80항에 있어서, 첫 번째 살균 단계는 열처리를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 식물 또는 균류 조직을 머서리화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제82항에 있어서, 상기 머서리화하는 단계는 상기 탈세포화하는 단계 이후에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제82항 또는 제83항에 있어서, 상기 머서리화하는 단계는 염기 및 과산화물로의 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직의 처리를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제84항에 있어서, 상기 염기는 수산화물(hydroxide) 염기인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제84항 또는 제85항에 있어서, 상기 과산화물은 과산화수소인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제84항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 머서리화하는 단계는 가열하면서 수성 수산화나트륨 용액 및 과산화수소로의 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직의 처리를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제87항에 있어서, 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직은 상기 과산화수소가 반응에 첨가되지 이전에 제1 기간 동안 상기 수성 수산화나트륨 용액으로 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제84항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 과산화물은 30% 내지 50% 수성 과산화수소 보존 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제89항에 있어서, 상기 수성 과산화수소 보존 용액은 500g의 탈세포화 식물 또는 균류 조직 당 적어도 약 75㎖의 양으로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제89항에 있어서, 상기 수성 과산화수소 보존 용액의 첨가 이후에 상기 탈세포화 식물 또는 균류 조직, 상기 염기 및 상기 수성 과산화수소 보존 용액의 혼합물의 과산화물의 농도는 약 1% 내지 약 5%인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제84항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염기는 1M 수산화나트륨 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제92항에 있어서, 상기 1M 수산화나트륨 용액은 500g의 탈세포화 식물 또는 균류 조직 당 약 2500㎖의 양으로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제84항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 중화(neutralization) 처리들로 pH를 중화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제94항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 중화 단계들은 수성 HCl 용액으로의 처리를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제82항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 머서리화하는 단계는 약 80℃까지의 가열로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제82항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 머서리화하는 단계는 적어도 약 30분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 피부 아래 주사, 깊은 피부 주사, 피하 주사(예를 들어, 피하 지방 주사), 또는 이들의 임의의 결합들을 위해 상기 더말 필러를 조제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제43항 내지 제98항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 더말 필러.
- 제99항에 있어서, 상기 더말 필러는 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 더말 필러인 것을 특징으로 더말 필러.
- 제99항에 또는 제100항에 있어서, 상기 더말 필러의 약 0.1% 내지 약 5% 또는 그 보다 적은 입자들은 약 20㎛ 보다 작은 페렛 직경 또는 최소 페렛 직경을 가지는 것을 특징으로 더말 필러.
- 제99항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 더말 필러의 약 0.5% 보다 적은 입자들은 약 20㎛ 보다 작은 페렛 직경 또는 최소 페렛 직경을 가지는 것을 특징으로 더말 필러.
- 제99항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 더말 필러의 약 0.1% 내지 약 5% 보다 적은(약 0.5%보다 적은 것과 같이), 또는 그 보다 적은 입자들은 대상의 세포 또는 세포들에 의해 포식되기 위해 충분히 작은 크기를 가지는 것을 특징으로 더말 필러.
- 키트에 있어서,
제1항-제33항 및 제94항-제103항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 더말 필러;
히드로겔, 기질, 또는 운반체 유체;
PBS, 식염수, 히알루론산(교차 결합되거나 교차 결합되지 않음), 알긴산염, 콜라겐, 플루론산(예를 들어, 플루로닉 F 127), 한천, 아가로오스, 피브린, 칼슘 히드록시아파타이트, 폴리-L-젖산, 자가 지방, 실리콘, 덱스트란, 메틸셀룰로오스, 용해되고 재생된 셀룰로오스, 또는 이들의 임의의 결합들;
리도카인 또는 다른 마취제;
하나 또는 그 이상의 주사기들, 또는 다른 주사 장치;
둘 또는 그 이상의 주사기들을 위한 루어락(leur-lock) 접합 또는 연결기;
제34항 내지 제42항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 용도 또는 방법을 수행하기 위한 지시들;
하나 또는 그 이상의 탈세포화 시약들;
하나 또는 그 이상의 컨테이너들, 패키지들, 또는 용기들;
주사를 위한 하나 또는 그 이상의 완충제들, 물, 또는 식염수;
바람직한 영역 또는 위치에 더말 필러를 용해시키기 위한 시약 또는 효소(예를 들어, 셀룰라아제); 또는
이들의 임의의 결합들 중에서 어느 하나 또는 그 이상을 포함하는 것을 특징으로 더말 키트.
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