CN107583109B - 一种真皮深层填充物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种真皮深层填充物的制备方法，属于医用材料技术领域。具体包括如下步骤：以分娩后的羊膜为原料，经胰蛋白酶联合Triton X‑100脱细胞处理后，再在液氮冷冻条件下，用高速研磨仪研磨成颗粒碎片，钴60辐照消毒，得到羊膜颗粒；将脐带间充质干细胞接种于羊膜颗粒上，联合培养8～10h，得到干细胞‑羊膜颗粒混合物，再取离体的血液样品，制备富含血小板的血浆，即PRP；临用前，向干细胞‑羊膜颗粒混合物中加入PRP，得到PRP‑干细胞‑羊膜颗粒三者混合物，即真皮深层填充物。本发明提供的真皮深层填充物集真皮颗粒填充、干细胞滋养、PRP营养为一体的复合填充物，该三者混合物用于真皮的深层填充后，能使使用者达到皮肤润泽、细腻光滑、皱纹减少的美容效果。

Description

一种真皮深层填充物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医用材料技术领域，特别是涉及一种真皮深层填充物及其制备方法和应用。

背景技术

注射型颗粒状真皮深层填充物，有一定的直径(一般不超过200μm)，注入到真皮深层能产生填充支持作用。市场上的天然和人工合成的颗粒状物包括自体脂肪颗粒、Cymetra、Artecoll和Radiesse，其中，自体脂肪颗粒是将吸取的脂肪研磨成细小的颗粒；Cymetra是源自尸体的皮肤，经脱细胞处理后，再研磨成颗粒形式；Artecoll是一种聚甲基丙烯酸甲酯材料形成的直径为40-60μm的微球颗粒；Radiesse是羟基磷灰石制成的直径为40μm的微球颗粒。

迄今为止，市场上天然的颗粒状填充物，主要有组织脱细胞基质，包括皮肤和自体脂肪，存在植入后吸收快等问题，而干细胞在植入后，同样面临被降解吞噬，植入率低等缺陷，PRP在美容中，多数是作为辅助制剂联合其他美容填充物发挥作用的。以上三者在美容方面的单独应用都有不足之处。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的一个目的是提供一种真皮深层填充物的制备方法，具体包括如下步骤：

S1：以分娩时的羊膜为原料，经胰蛋白酶联合Triton X-100的脱细胞处理后，得到的脱细胞羊膜，冻干保存；

S2：在液氮冷冻条件下，将S1得到的脱细胞羊膜用高速研磨仪进行研磨，得到颗粒碎片，并对得到的颗粒碎片用钴60辐照消毒，得到羊膜颗粒；

S3：羊膜颗粒用无菌水浸泡24h，将脐带间充质干细胞接种于所述羊膜颗粒上，联合培养8～10h，使脐带间充质干细胞附着在羊膜颗粒表面形成类似于微球的形式，得到干细胞-羊膜颗粒混合物，混合物过150μm筛网，最终得到的干细胞-羊膜颗粒混合物用生理盐水重悬；

S4：取离体的新鲜血液样品，通过离心法，获得富含血小板的血浆，即PRP，于4℃保存，一周内使用；

S5：临用前，向干细胞-羊膜颗粒混合物中加入S4制得的PRP，得到PRP-干细胞-羊膜颗粒三者混合物，即为所述真皮深层填充物。

优选地，所述颗粒碎片粒径分布为50-200μm。

更优选地，S3中，所述脐带间充质干细胞的接种量为：每1mg羊膜颗粒接种1×10⁵个细胞。

更优选地，S5中，PRP与干细胞-羊膜颗粒混合物的添加比例为：每1mL PRP加入含有2×10⁶个细胞的干细胞-羊膜颗粒混合物。

本发明的第二个目的是提供一种上述方法制备的真皮深层填充物。

本发明的第三个目的是提供该真皮深层填充物在制备真皮植入美容产品中的应用。

优选地，所述美容产品为面部美容产品。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明以分娩时的羊膜为原料，制成含有天然胶原蛋白的羊膜颗粒，使干细胞在体外附着在以天然胶原基质为主的支架上，形成干细胞-羊膜颗粒结构，辅以富含血小板的血浆(PRP)中血小板接触胶原后产生的凝集效应和释放营养因子等功能，形成干细胞-羊膜颗粒-PRP三者混合物，羊膜颗粒在制备过程中，负载了细胞因子和营养物质，可以实现植入体内后的缓释功能。

(2)本发明提供的真皮深层填充物中，羊膜颗粒可以为细胞提供支架，大大提高了干细胞的存活率和生存状态；干细胞在植入部位也会被诱导成为纤维细胞，分泌胶原，弥补被降解的羊膜颗粒；PRP中血小板在凝集过程中释放的大量生长因子，可以促进植入的细胞增殖和分化，还使得羊膜颗粒在植入后能成凝胶状态，减少植入后的流动性，抵抗降解。为此，干细胞-羊膜颗粒-PRP三者混合物是集真皮颗粒填充、干细胞滋养、PRP营养为一体的复合填充物，该三者混合物用于真皮的深层填充后，能使顾客达到皮肤润泽、细腻光滑、皱纹减少的美容效果。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。

除非另有定义，下文中所用是的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。除非另有特别说明，本发明以下各实施例中用到的各种原料、试剂、仪器和设备均可通过合法途径在市场购买得到或者通过现有方法制备得到。

本发明中的主要原料之一分娩时的羊膜，羊膜位于胎盘的最内层，是一种透明的薄膜，来源于产后即获得的胎盘，含有大量不同的胶原，以及纤维粘连蛋白、层粘连蛋白。羊膜的生物相容性极佳，被当做“移植的基底膜”用于烧伤、创面修复等。本发明中的主要原料之二是脐带间充质干细胞，脐带间充质干细胞属于间充质干细胞，有强大的抗炎、抗免疫排斥、促增殖、促修复等功能，同时，脐带间充质干细胞很容易被诱导分化成为相应的组织细胞。脐带间充质干细胞来源于新生儿脐带，几乎没有免疫原性，医学上曾被用于类风湿性关节炎、白血病、难治性贫血的治疗。富含血小板的血浆(PRP)，是全血通过2步离心形成血小板沉淀，并用少量血浆重悬而得到。其去除了全血中的红细胞和白细胞成分，富集的血小板浓度达到原浓度的3-4倍。血小板在接触一些促凝因子时，会引发血小板聚集，并脱颗粒而释放大量的生长因子。为此，PRP在组织损伤修复、创面修复方面有广泛的应用，PRP在美容方面，由于其富含多种营养因子，可以促进成纤维细胞分泌胶原，以及血管化，所以有很好的营养、嫩肤作用。

由于羊膜颗粒的主要成分是胶原，而胶原本身就是一种很有效的内源性促凝因子，当PRP中的血小板与羊膜颗粒接触后，会在很短的时间内激活血浆中的纤维蛋白原等物质，形成结块，并将羊膜颗粒网织于其中。为此，在注射前，临时将PRP与细胞-羊膜颗粒混合，可以使羊膜颗粒在植入部位形成凝胶状而固化，有效防止降解，延长植入时间，而且PRP释放的大量因子可以更好的滋养植入的细胞，提高细胞的存活率。

本发明以上述三种物质为主要原料，通过细胞-载体联合治疗的方式，将细胞与载体共培养，使得细胞融合入载体内部，以增强植入细胞的存活率，下面就以具体的示例对本发明的技术方案进行详细的举例说明。

实施例1

本实施例一种真皮深层填充物的制备方法，具体包括如下步骤：

S1：以分娩时的羊膜为原料，在含有0.25％胰酶+0.05％Triton X-100的混合液中振荡6h，进行脱细胞处理，再用双蒸水洗涤12h，去除其中的Triton X-100，将处理好的羊膜进行冻干保存；

S2：在液氮冷冻条件下，将上述得到的脱细胞羊膜用高速研磨仪进行研磨，得到细小的颗粒碎片，粒径分布为50-200μm，并对得到的颗粒碎片用剂量为6KGy的钴60辐照消毒30min，得到羊膜颗粒；

S3：羊膜颗粒用无菌水浸泡24h，在无菌条件下，每100mg羊膜颗粒用1mL无菌水溶解，振荡混匀后，静置24h，将上述羊膜颗粒水溶液5000rpm离心5min，弃去上清，得到羊膜颗粒沉淀，将脐带间充质干细胞按每1mg羊膜颗粒接种10⁵个细胞的比例，接种于该羊膜颗粒上，并联合培养9h，使脐带间充质干细胞附着在羊膜颗粒表面形成类似于微球的形式，得到干细胞-羊膜颗粒混合物，混合物过150μm筛网以去除粒径较大的颗粒，过筛后的滤液经过800rpm离心5min，最终得到的干细胞-羊膜颗粒混合物沉淀用1-2mL生理盐水重悬；

S4：取患者离体的血液20mL，得到离体血液样品，通过2次离心法，加入1mL抗凝剂混匀，230g离心5min，溶液分为含有血小板血浆的上清和红细胞沉淀，弃去沉淀，取上清进行2200g离心10min，得到血小板沉淀和血浆，弃去3/4体积的血清，用剩余的1/4体积的血浆重悬血小板，获得富含血小板的血浆，即PRP，于4℃保存，一周内使用；

S5：临用前，向干细胞-羊膜颗粒混合物中加入上述制得的PRP，比例为每1mL PRP加到含有2×10⁶个细胞的干细胞-羊膜颗粒混合物中，得到PRP-干细胞-羊膜颗粒三者混合物，即为真皮深层填充物。

上述实施例制备得到的真皮深层填充物，可应用于真皮植入美容产品，用于真皮的深层填充后，能使顾客达到皮肤润泽、细腻光滑、皱纹减少的美容效果。需要说明的是，使用时，PRP-干细胞-羊膜颗粒三者混合物一经形成，必须立即注射入面部的皮下部位。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，其保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (6)

1.一种真皮深层填充物，其特征在于，由以下步骤制备而成：

S1：以分娩后的羊膜为原料，经胰蛋白酶联合Triton X-100的脱细胞处理后，得到的脱细胞羊膜，冻干保存；

S2：在液氮冷冻条件下，将S1得到的脱细胞羊膜用高速研磨仪进行研磨，得到颗粒碎片，并对得到的颗粒碎片用钴60辐照消毒，得到羊膜颗粒；

S3：羊膜颗粒用无菌水浸泡24h，将脐带间充质干细胞接种于所述羊膜颗粒上，联合培养8～10h，使脐带间充质干细胞附着在羊膜颗粒表面形成类似于微球的形式，得到干细胞-羊膜颗粒混合物，混合物过150μm筛网，最终得到的干细胞-羊膜颗粒混合物用生理盐水重悬；

S4：取离体的新鲜血液样品，通过离心法，获得富含血小板的血浆，即PRP，于4℃保存，一周内使用；

S5：临用前，向干细胞-羊膜颗粒混合物中加入S4制得的PRP，得到PRP-干细胞-羊膜颗粒三者混合物，即为所述真皮深层填充物。

2.根据权利要求1所述的真皮深层填充物，其特征在于，所述颗粒碎片粒径分布为50-200μm。

3.根据权利要求2所述的真皮深层填充物，其特征在于，S3中，所述脐带间充质干细胞的接种量为：每1mg羊膜颗粒接种1×10⁵个脐带间充质干细胞。

4.根据权利要求2所述的真皮深层填充物，其特征在于，S5中，PRP与干细胞-羊膜颗粒混合物的添加比例为：1mL PRP加到含有2×10⁶个细胞的干细胞-羊膜颗粒混合物中。

5.根据权利要求1-4任一所述的真皮深层填充物在制备真皮植入美容产品中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述美容产品为面部美容产品。