CN104189950A - 一种羊膜生物制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种羊膜生物制剂及其制备方法，该羊膜生物制剂采用人及动物脱细胞羊膜上覆盖富血小板因子血浆制剂，经冻干辐照后低温冷藏保存，用于临床皮肤损伤的修复治疗。该羊膜生物制剂能显著提高创伤的愈合时间，减轻创面的疤痕形成，是一种极有临床应用前景的可产业化的生物制剂。

Description

一种羊膜生物制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及医用生物材料技术，具体涉及一种羊膜生物制剂及其制备方法。

背景技术

脱细胞羊膜作为一种医用生物材料已被广泛应用，但是在实验中我们发现单独使用脱细胞羊膜治疗皮肤损伤（如机械性外伤、溃疡），在炎症反应期可加速创面愈合，但是与对照组相比，最终的愈合时间没有显著的提高。 

申请号为201310508091.5的专利公开了一种生物羊膜及其制备方法，该生物羊膜采用了胶原复合膜，但是胶原具有一定的免疫原性，容易引起机体的过敏反应，副作用明显。

发明内容

针对于现有技术存在的问题，本发明的一个目的是提供一种羊膜生物制剂，解决现有的羊膜制剂易引起过敏反应及难以显著缩短创伤愈合时间的问题。

本发明的另一个目的是提供一种羊膜生物制剂的制备方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种羊膜生物制剂，由脱细胞羊膜和富血小板因子血浆制剂组合制成。

上述羊膜生物制剂的制备方法，包括：

分别制备脱细胞羊膜和富血小板因子血浆制剂；

将脱细胞羊膜的光滑面向下平铺于0.22~0.45μm聚偏氟乙烯膜上，再将富血小板因子血浆制剂覆盖在脱细胞羊膜的粗糙面上，在-60~-40℃下预冻2~8小时，然后在-70~-80℃下冷阱冷冻干燥24~30小时，制得羊膜生物制剂，将制得的冻干羊膜生物制剂，按临床需求，裁剪为不同规格，1cm×1cm~5cm×10cm，分装密封，环氧乙烷灭菌，置于4℃，冷藏保存备用。

优选地，脱细胞羊膜与富血小板因子血浆制剂的比例为每平方米脱细胞羊膜上覆盖0.2~0.5ml富血小板因子血浆制剂。

优选地，脱细胞羊膜是通过以下方法制备得到：

    1）用无菌磷酸盐缓冲液清洗胎盘去除血液成分，将羊膜从胎盘绒毛膜上分离，再用PBS冲洗3次，然后浸泡于1%Triton-100溶液中18~24小时；

2）浸泡步骤1）制得的羊膜于0.25%胰蛋白酶中，于37℃下恒温酶解2~4小时；

3）浸泡步骤2）制得的羊膜于1~2升PBS中，在8~12℃，转速为180~200 rpm下震摇18~24小时，制得脱细胞羊膜。

优选地，富血小板因子血浆制剂的制备方法为：

参照专利申请号为201310042567.0的专利申请文件所公开的一种自体富血小板因子血浆PFRP制剂的制备方法来制备富血小板因子血浆制剂，具体为：

1）采用受体或供体全血，利用离心加冻融方式制备得到受体或供体富血小板因子血浆PFRP；

2）将富血小板因子血浆PFRP与生物支架按照体积比为1:3~3:1混合，制得富血小板因子血浆制剂；生物支架为注射级透明质酸钠。

本发明提供的制备方法制备的羊膜生物制剂具有以下有益效果：

1）将脱细胞羊膜和富血小板因子血浆制剂联合制得的该羊膜生物制剂能显著提高创伤的愈合时间，减轻创面的疤痕形成，是一种极有临床应用前景的可产业化的生物制剂。

    2）本发明中的富血小板因子血浆制剂，其生物支架采用注射级别的透明质酸钠，无免疫原性，具有缓释和生物支架功能；并且该富血小板因子血浆中含有多种生长因子，除bFGF和EGF外，还含有VEGF、PDGF、IGF等生长因子，是一个天然组合的组织细胞修复制剂，能有效地刺激机体的内环境发挥免疫调节和组织修复作用。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的脱细胞羊膜的形态图。

其中，图A为显微镜下观察的脱细胞羊膜组织学图片，经HE染色后的脱细胞羊膜，可以看出该羊膜中含有大量胶原物质，无细胞残留；

图B为脱细胞羊膜经包埋切片后的基质结构照片，可以看出，该羊膜的上皮细胞层、成纤维细胞层均被除去，仅保留了基膜层和致密层；

图C为扫描电镜下观察的脱细胞羊膜的一面的结构照片，可以看出，该脱细胞羊膜的一面为纵横交错的网状纤维结构，不含坏死组织，基质成分完整，三维结构清晰；

图D为扫面电镜下观察的脱细胞羊膜的另一面的结构照片，可以看出，该脱细胞羊膜的另一面为致密纤维结构，无细胞残留。

图2为采用正常培养基浸出液、25%、50%、100%三种浓度的本发明实施例1制备脱细胞羊膜浸出液培养72 小时后的细胞毒性评价表。

图3为采用正常培养基浸出液、PE 膜浸出液、三批次本发明实施例1、实施例2及实施例3制备的脱细胞羊膜的100%浸出液及5%苯酚培养72 小时后的细胞毒性评价表。

图4-A为烫伤溃疡皮肤损伤模型创面愈合率图；

图4-B为烫伤溃疡皮肤损伤模型创面愈合周期测定图。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合附图及具体实施例，对本申请作进一步地详细说明。

实施例1

一种羊膜生物制剂，由以下配比的原料组成：

脱细胞羊膜1cm²：富血小板因子血浆制剂0.2ml；

上述羊膜生物制剂是通过以下制备得到：

1、制备脱细胞羊膜：

取健康人及动物胎膜，用无菌磷酸盐缓冲液PBS洗净胎膜表面的血迹，将羊膜自绒毛膜剥离后再用PBS冲洗3次，用1%Triton-100浸泡24小时；

用PBS反复冲洗后，滴加0.25%胰蛋白酶（含有0.01% EDTA）浸润羊膜，并于37℃恒温孵化箱中酶解4小时；

再用1~2升PBS浸泡羊膜，在恒温振荡培养箱以10℃，转速200 rpm充分震摇24小时，制得脱细胞羊膜，参见图1和图2，图1为该实施例制备的脱细胞羊膜的形态图；图2为采用正常培养基浸出液、25%、50%、100%三种浓度的该实施例制备的脱细胞羊膜浸出液培养72 小时后的细胞毒性评价表；从该毒性评价表中可以看出三种浓度的脱细胞羊膜浸出液均无细胞毒性。

2、制备富血小板因子血浆制剂：该富血小板因子血浆的制备过程参照申请号为201310042567.0的专利中所公开的内容，即

采用受体或供体全血，利用离心加冻融方式制备得到受/供体富血小板因子血浆PFRP；

将富血小板因子血浆PFRP与生物支架按照体积比为1:2混合，制得富血小板因子血浆制剂；生物支架采用注射级别的透明质酸钠。

3、制备羊膜生物制剂

将脱细胞羊膜的光滑面向下平铺于0.45μm聚偏氟乙烯膜上，该脱细胞羊膜的粗糙面上覆盖富血小板因子血浆制剂，在-40℃预冻8小时，-70℃下冷阱冷冻干燥24小时，制得羊膜生物制剂；根据临床需求，裁剪为2cm×3cm，分装密封，环氧乙烷灭菌，置于4℃下，冷藏保存备用。

参见图4-A和图4-B，图4-A为烫伤溃疡皮肤损伤模型创面愈合率图；图4-B为烫伤溃疡皮肤损伤模型创面愈合周期测定图。

从上图中可以看出，单用脱细胞羊膜在炎性反应期与对照组相比，创面愈合率有所改善，但最终的愈合周期，与对照组相比，没有明显的提高；采用该实施例制备的羊膜生物制剂治疗溃疡损伤，与对照组相比无论是创面愈合率还是创面愈合周期，都得到显著的改善。

实施例2

一种羊膜生物制剂，由以下配比的原料组成：

脱细胞羊膜1cm²：富血小板因子血浆制剂0.3ml；

上述羊膜生物制剂是通过以下制备得到：

1、制备脱细胞羊膜：

取健康人及动物羊膜，用PBS冲洗3次，再用1%Triton-100浸泡18小时；

用PBS反复冲洗后，滴加0.25%胰蛋白酶（含有0.01% EDTA）浸润羊膜，并于37℃恒温孵化箱中酶解2小时；

再用1~2升PBS浸泡羊膜，在恒温振荡培养箱以12℃，转速180 rpm充分震摇18小时，制得脱细胞羊膜。

2、制备富血小板因子血浆制剂：该富血小板因子血浆的制备过程参照申请号为201310042567.0的专利中所公开的内容，即

采用受/供体全血，利用离心加冻融方式制备得到受/供体富血小板因子血浆PFRP；

将富血小板因子血浆PFRP与生物支架按照体积比为1:1混合，制得富血小板因子血浆制剂;生物支架采用注射级别的透明质酸钠。

3、制备羊膜生物制剂

将脱细胞羊膜的光滑面向下平铺于0.22μm聚偏氟乙烯膜上，并于该脱细胞羊膜的粗糙面上覆盖富血小板因子血浆制剂，在-60℃预冻2小时，-75℃下冷阱冷冻干燥30小时；

根据临床需求，裁剪为不同规格，5cm×10cm，分装密封，环氧乙烷灭菌，置于4℃下，冷藏保存备用。    

实施例3

一种羊膜生物制剂，由以下配比的原料组成：

脱细胞羊膜1cm²：富血小板因子血浆制剂0.5ml；

上述羊膜生物制剂是通过以下制备得到：

1、制备脱细胞羊膜：

用无菌磷酸盐缓冲液PBS洗净胎膜表面的血迹，将羊膜自绒毛膜剥离后再用PBS冲洗3次，用1%Triton-100浸泡20小时；

用PBS反复冲洗后，滴加0.25%胰蛋白酶（含有0.01% EDTA）浸润羊膜，并于37℃恒温孵化箱中酶解3小时；

再用1~2升PBS浸泡羊膜，在恒温振荡培养箱以8℃，转速190 rpm充分震摇20小时，制得脱细胞羊膜。

2、制备富血小板因子血浆制剂：该富血小板因子血浆的制备过程参照申请号为201310042567.0的专利中所公开的内容，即

采用受体或供体全血，利用离心加冻融方式制备得到受体或供体富血小板因子血浆PFRP；

将富血小板因子血浆PFRP与生物支架按照体积比为1:3混合，制得富血小板因子血浆制剂。生物支架采用注射级别的透明质酸钠。

3、制备羊膜生物制剂

将脱细胞羊膜的光滑面向下平铺于0.35μm聚偏氟乙烯膜上，并于该脱细胞羊膜的粗糙面上覆盖富血小板因子血浆制剂，在-55℃预冻6小时，-80℃下冷阱冷冻干燥28小时；

根据临床需求，裁剪为不同规格，3cm×3cm，分装密封，环氧乙烷灭菌，置于4℃下，冷藏保存备用。

参见图3，图3为采用正常培养基浸出液、PE 膜浸出液、三批次本发明实施例1、实施例2及实施例3制备的脱细胞羊膜的100%浸出液及5%苯酚培养72 小时后的细胞毒性评价表；从该毒性评价表中可以看出，三批次本发明实施例1、实施例2及实施例3制备的脱细胞羊膜的100%浸出液均无细胞毒性。 

以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

Claims (5)

1.一种羊膜生物制剂，其特征是，由脱细胞羊膜和富血小板因子血浆制剂组合制成。

2.一种权利要求1所述的羊膜生物制剂的制备方法，其特征是，包括：

分别制备脱细胞羊膜和富血小板因子血浆制剂；

将所述脱细胞羊膜的光滑面向下平铺于0.22~0.45μm聚偏氟乙烯膜上，再将所述富血小板因子血浆制剂覆盖在脱细胞羊膜的粗糙面上，在-60~-40℃下预冻2~8小时，然后在-70~-80℃下冷阱冷冻干燥24~30小时，制得所述羊膜生物制剂。

3.根据权利要求2所述的羊膜生物制剂的制备方法，其特征是：脱细胞羊膜与富血小板因子血浆制剂的比例为每平方米脱细胞羊膜上覆盖0.2~0.5ml富血小板因子血浆制剂。

4.根据权利要求2所述的羊膜生物制剂的制备方法，其特征是，所述脱细胞羊膜是通过以下方法制备得到：

    1）用无菌磷酸盐缓冲液清洗胎盘去除血液成分，将羊膜从胎盘绒毛膜上分离，再用PBS冲洗3次，然后浸泡于1%Triton-100溶液中18~24小时；

2）浸泡步骤1）制得的羊膜于0.25%胰蛋白酶中，于37℃下恒温酶解2~4小时；

3）浸泡步骤2）制得的羊膜于1~2升PBS中，在8~12℃，转速为180~200 rpm下震摇18~24小时，制得所述脱细胞羊膜。

5.根据权利要求2所述的羊膜生物制剂的制备方法，其特征是，所述富血小板因子血浆制剂是通过以下方法制备得到：

1）采用受体或供体全血，利用离心加冻融方式制备得到受体或供体富血小板因子血浆PFRP；

2）将所述富血小板因子血浆PFRP与生物支架按照体积比为1:3~3:1混合，制得所述富血小板因子血浆制剂；所述生物支架为注射级透明质酸钠。