CN110946879A - 一种包含疏松层的脱细胞生物羊膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种包含疏松层的脱细胞生物羊膜及其制备方法，属于生物羊膜及制备工艺领域。本发明提供的包含疏松层的包含疏松层的脱细胞生物羊膜的制备方法，经过了脱细胞、病毒灭活等步骤，在保证其安全性的前提下，该羊膜产品的天然结构完整的保留，并且使其疏松层也完整的保留，并且疏松层内不含细胞，最大限度的保留其抗炎和修复的生长因子的生物活性，减少这些生长因子的流失，从而使其修复和抗炎功能大大提高，使其在治疗皮肤损伤修复和抗炎的作用上较一般的脱细胞羊膜制品的疗效更好，降低了其免疫原反应，并且经过了病毒灭活，提高了安全性，保障了该羊膜在临床上使用的安全性，并且效果好。

Description

一种包含疏松层的脱细胞生物羊膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物羊膜及制备工艺领域，具体而言，涉及一种包含疏松层的脱细胞生物羊膜及其制备方法。
背景技术
人羊膜来源于胎盘的最内层，主要由上皮细胞层、基底膜、致密层、纤维母细胞层及海绵层组成，上皮细胞层为单层上皮细胞，基底膜主要成分为Ⅲ型胶原、Ⅳ型胶原及非胶原成分(laminin，nidogen，fibronectin)，利于细胞粘附；致密层为网状纤维结构组成之一，含有Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原组成束状结构，以及Ⅴ型胶原、Ⅵ胶原组成细丝状结构，束状结构有利于维持羊膜机械性能，而细丝状结构与基底膜连接；纤维母细胞层为疏松胶原网状结构，并含有纤维母细胞以及非胶原成分(糖蛋白)，通常也被叫作疏松层。海绵层为非纤维的网状结构，含有Ⅲ型胶原、蛋白聚糖以及糖蛋白。
新鲜羊膜和冷藏羊膜总确实能最大程度保留各种胶原和活性因子成分，但这类羊膜未经病毒灭活、脱细胞等处理，存在病毒传播和免疫原性等安全隐患，并且完整的新鲜羊膜含有的成分复杂，一些结构或者成分可能阻碍羊膜的功效，在临床应用的效果不一定就好；现有的经过病毒灭活、脱细胞、去垢等处理后的羊膜一般只包含基底膜和致密层，因为疏松层结构疏松，在处理的过程中容易被破坏去掉，并且其促进细胞增殖和抗炎的一些因子损失大，使其修复和抗炎效果大大降低。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种脱细胞生物羊膜，该生物羊膜完整的保留了其疏松层结构，能大幅度提高羊膜的抗炎功能。
本发明的第二目的在于提供一种包含疏松层的脱细胞生物羊膜的制备方法，该方法能通过简单的步骤、较短的时间、温和的条件制备得到脱细胞生物羊膜。
为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：
一种包含疏松层的脱细胞生物羊膜，脱细胞生物羊膜的结构包括基底膜、致密层、疏松层。
一种包含疏松层的脱细胞生物羊膜的制备方法，包括以下步骤：
用过氧乙酸-氯化钠溶液对经清洗的生物羊膜进行病毒灭活，得到灭活羊膜；
用生理盐水震荡清洗灭活羊膜并震荡清洗，用碳酸氢钠溶液复洗，得到复洗羊膜；
将蛋白酶液和复洗羊膜混合孵育，并纯净水震荡清洗，并用去垢液震荡清洗后，制备得到脱细胞生物羊膜。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明提供的包含疏松层的脱细胞生物羊膜的制备方法，经过了脱细胞、病毒灭活等步骤，在保证其安全性的前提下，该羊膜产品的天然结构完整的保留，并且使其疏松层也完整的保留，并且疏松层内不含细胞，最大限度的保留其抗炎和修复的生长因子的生物活性，减少这些生长因子的流失，从而使其修复和抗炎功能大大提高，使其在治疗皮肤损伤修复和抗炎的作用上较一般的脱细胞羊膜制品的疗效更好，降低了其免疫原反应，并且经过了病毒灭活，提高了安全性，保障了该羊膜在临床上使用的安全性，并且效果好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实验例1提供的脱细胞前羊膜组织显微结果图；
图2为本发明实验例1提供的脱细胞后羊膜组织显微结果图；
图3为本发明实验例1提供的脱细胞后羊膜组织切片显微观察图；
图4为本发明实验例1提供的新鲜羊膜切片显微观察图；
图5为本发明实验例1提供的细胞因子含量比较结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种包含疏松层的脱细胞生物羊膜及其制备方法进行具体说明。
一种包含疏松层的脱细胞生物羊膜，脱细胞生物羊膜的结构包括基底膜、致密层、疏松层。
一种如上述的包含疏松层的脱细胞生物羊膜的制备方法，包括以下步骤：
用过氧乙酸-氯化钠溶液对经清洗的生物羊膜进行病毒灭活，得到灭活羊膜；
用生理盐水震荡清洗灭活羊膜并震荡清洗，用碳酸氢钠溶液复洗，得到复洗羊膜；
将蛋白酶液和复洗羊膜混合孵育，并纯净水震荡清洗，并用去垢液震荡清洗后，制备得到脱细胞生物羊膜。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，病毒灭活前还包括使用生理盐水清洗新鲜剥离得到的羊膜，然后用过氧乙酸-氯化钠溶液室温震荡净化12-16min。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，过氧乙酸-氯化钠溶液中过氧乙酸含量为0.1％，氯化钠为0.8-1.2mol/L。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，过氧乙酸-氯化钠溶液的添加量为1.7-2.4mL/cm2。
采用过氧乙酸能很好的对羊膜进行病毒灭活，效果好，时间短，并且还能去除羊膜上的一些难以清洗的血迹和杂质残留，并且通过该试剂处理的羊膜再使用胰蛋白酶进行脱细胞有利于在较短的时间内脱细胞效果更好。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，用生理盐水震荡清洗2-3次后，用0.5％-10％的碳酸氢钠溶液清洗。
由于采用了过氧乙酸进行处理，使得处理后的羊膜呈酸性，即使使用0.9％氯化钠清洗液清洗后也偏酸性，而胰蛋白酶的最适pH在8左右，偏碱性，这样就会大大降低胰蛋白酶的效果，使得胰蛋白酶效果差，脱细胞不完全，因此最后一次采用NaHCO3溶液进行清洗，能使羊膜的pH刚好在8-9左右，使得胰蛋白酶的效果大大增强，利于羊膜的脱细胞，并且该试剂不会破坏羊膜天然组织结构及生物活性因子的流失。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，蛋白酶液为胰蛋白酶液，胰蛋白酶液的浓度为0.25％-0.4％。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，胰蛋白酶液的加入量为0.17-0.24mL/cm2，然后35-39℃孵育150-220min。
现有技术中，大多采用胰蛋白酶溶液进行脱细胞时，基本上是把羊膜浸泡到胰蛋白酶溶液中，并且作用时间长，这样虽然能达到脱细胞的效果，但是使用的胰蛋白酶溶液多，增加了成本，并且在脱细胞的同时容易破坏羊膜的胶原和纤维结构，使得制备的羊膜的疏松层被去掉，羊膜内的生物活性因子损失大。本发明按照该比例添加的胰蛋白酶溶液，用量少，能减少对羊膜的破坏。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，去垢液为0.08％-0.13％的Triton X-100，去垢液的添加量为1.7-2.4mL/cm2。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，加入去垢液后在35-40℃条件下震荡清洗5-6h，然后纯净水震荡清洗2-5次。
脱细胞后对羊膜进行去垢，采用该去垢液能很好地对羊膜内的脂类等杂质进行去除，在上述脱细胞后，有可能还残留有核酸，该去垢液进行去垢的同时能把残留的核酸清理干净，保正了脱细胞的完全。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种包含疏松层的脱细胞生物羊膜的制备方法，通过本方法能制备得到保留了疏松层的脱细胞生物羊膜，包括以下步骤：
1.1用生理盐水在室温下清洗新鲜剥离下来的羊膜2次；
1.2清洗后以1.7mL/cm2的比例加入过氧乙酸含量为0.1％，氯化钠为0.8mol/L的过氧乙酸-氯化钠溶液作为净化液进行病毒灭活，并室温震荡净化16min；
1.3病毒灭活后用生理盐水室温震荡清洗2次，用0.5％的碳酸氢钠溶液复洗，得到复洗羊膜；
1.4用0.25％的胰蛋白酶液作以0.17mL/cm2的用量与复洗羊膜混合并在35℃条件下孵育150min，用纯净水震荡清洗3次；
1.5以1.7mL/cm2的添加量，加入0.08％的Triton X-100作为去垢液，加入后在35℃条件震荡清洗5h，再用纯净水震荡清洗2次，得到脱细胞生物羊膜。
实施例2
本实施例提供一种包含疏松层的脱细胞生物羊膜的制备方法，通过本方法能制备得到保留了疏松层结构的脱细胞生物羊膜，包括以下步骤：
1.1用生理盐水在室温下清洗新鲜剥离下来的羊膜3次；
1.2清洗后以1.7mL/cm2的比例加入过氧乙酸含量为0.1％，氯化钠为1.2mol/L的过氧乙酸-氯化钠溶液作为净化液进行病毒灭活，并室温震荡净化12min；
1.3病毒灭活后用生理盐水室温震荡清洗3次，用10％的碳酸氢钠溶液复洗，得到复洗羊膜；
1.4用0.4％的胰蛋白酶液作以0.24mL/cm2的用量与复洗羊膜混合并在39℃条件下孵育220min，用纯净水震荡清洗3次；
1.5以2.4mL/cm2的添加量，加入0.13％的Triton X-100作为去垢液，加入后在40℃条件震荡清洗6h，再用纯净水震荡清洗5次，得到脱细胞生物羊膜。
实施例3
本实施例提供一种包含疏松层的脱细胞生物羊膜的制备方法，通过本方法能制备得到保留了疏松层结构的脱细胞生物羊膜，包括以下步骤：
1.1用生理盐水在室温下清洗新鲜剥离下来的羊膜3次；
1.2清洗后以2.0mL/cm2的比例加入过氧乙酸含量为0.1％，氯化钠为1.0mol/L的过氧乙酸-氯化钠溶液作为净化液进行病毒灭活，并室温震荡净化15min；
1.3病毒灭活后用生理盐水室温震荡清洗3次，用6％的碳酸氢钠溶液复洗，得到复洗羊膜；
1.4用0.3％的胰蛋白酶液作以0.2mL/cm2的用量与复洗羊膜混合并在37℃条件下孵育180min，用纯净水震荡清洗3次；
1.5以2mL/cm2的添加量，加入0.1％的Triton X-100作为去垢液，加入后在37℃条件震荡清洗6h，再用纯净水震荡清洗3次，得到脱细胞生物羊膜。
实施例4
本实施例提供一种包含疏松层的脱细胞生物羊膜的制备方法，通过本方法能制备得到保留了疏松层结构的脱细胞生物羊膜，包括以下步骤：
1.1用生理盐水在室温下清洗新鲜剥离下来的羊膜3次；
1.2清洗后以2.0mL/cm2的比例加入过氧乙酸含量为0.1％，氯化钠为1.0mol/L的过氧乙酸-氯化钠溶液作为净化液进行病毒灭活，并室温震荡净化15min；
1.3病毒灭活后用生理盐水室温震荡清洗3次，用4％的碳酸氢钠溶液复洗，得到复洗羊膜；
1.4用0.35％的胰蛋白酶液作以0.2mL/cm2的用量与复洗羊膜混合并在37℃条件下孵育180min，用纯净水震荡清洗3次；
1.5以2mL/cm2的添加量，加入0.1％的Triton X-100作为去垢液，加入后在37℃条件震荡清洗6h，再用纯净水震荡清洗3次，得到脱细胞生物羊膜。
实验例
本实验例对实施例3制备得到的脱细胞生物羊膜进行多项生物技术指标的评价。
脱细胞检测
通过HE染色观察脱细胞前后的细胞含量，实验步骤如下：
1.1分别取脱细胞前和脱细胞后的羊膜组织投入苏木精染液中对细胞核进行染色6min，然后使用清水漂洗3min；
1.2然后分别加入分化液进行分色30s，再使用清水漂洗3min；
1.3对上述分色后的羊膜组织分别加入返蓝液返蓝几秒钟，再再使用清水漂洗3min；
1.4对上述返蓝后的羊膜组织分别加入伊红染液3min，对细胞质和细胞间质进行染色，再使用清水漂洗3min；
1.4最后把上述处理后的羊膜组织平铺在载玻片上，置于显微镜下观察结果。
结果如图1和图2所示，从图1可以看出，未脱细胞的样本中，含有大量的细胞；而图2中脱细胞样本中，并无细胞残留。
羊膜组织切片结构观察
2.1分别取脱细胞前和脱细胞后的羊膜组织投入预先配好的固定液中(10％福尔马林，Bouin氏固定液等)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构；
2.2固定成功后，将组织放入包埋盒中，流水冲洗30min；再用酒精脱水，然后用二甲苯进行透明处理；
2.3将透明的组织置于融化的石蜡中，包埋完成后能冷却凝固；
2.4对包埋的组织进行切片；
2.5用二甲苯脱去石蜡加入蒸馏水后放入苏木精水溶液中染色数分钟；
2.6酸水及氨水中分色，各数秒钟，流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻，入70％和90％酒精中脱水各10分钟；
2.7入酒精伊红染色液染色2-3分钟，染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明；
2.8将已透明的切片滴上树胶，盖上盖玻片封固；并进行显微观察拍照。
结果如图3和图4所示，图4是未经处理的新鲜羊膜，从图3可以看出，通过本发明提供的制备方法制备得到的脱细胞生物羊膜包括有基底膜、致密层和疏松层，并且其天然组织结构基本未被破坏。可以看出，经病毒灭活、脱细胞、去垢等处理后仍能保留羊膜的疏松层结构。
过氧乙酸病毒灭活效果评价
将浸泡染毒后的羊膜原材料经0.1％过氧乙酸-1mol/LNaCl净化液，室温震荡净化15min，样品中的PPV和sindbis滴度均降至检测限1.3logs以下，PPV滴度下降值≧4.0logs,sindbis滴度下降值≧4.7logs。因此可以看出使用0.1％过氧乙酸-1mol/LNaCl净化液，室温震荡净化15min能够达到病毒灭活的效果。
细胞活性因子的测量
通过测定新鲜的未经脱细胞的人羊膜和结果脱细胞的人羊膜的表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF-β-11)、血管内皮生长因子(VEGF)的含量，查看本处理方法对相关细胞因子的含量的影响。
从图5中可以看出，本发明的脱细胞羊膜中个细胞因子的含量和新鲜羊膜组比，各生长因子含量无明显差异，说明本方法处理后，并不会影响各种细胞因子的含量，能保持细胞因子的含量的稳定。
综上所述，本发明实施例提供的包含疏松层的脱细胞生物羊膜的制备方法，经过了病毒灭活、脱细胞、去垢等处理，降低了其免疫原反应，并且经过了病毒灭活，提高了安全性，保障了该羊膜在临床上使用的安全性，并且效果好；制备方法工艺简单，条件温和，脱细胞完全，能完全的把上皮细胞层的细胞和纤维母细胞层的细胞脱掉，使其保留基底膜、致密层、疏松层结构，并且活性因子也能最大限度的保留下来。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种包含疏松层的脱细胞生物羊膜，其特征在于，所述脱细胞生物羊膜的结构包括基底膜、致密层、疏松层。
2.一种如权利要求1所述的包含疏松层的脱细胞生物羊膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
用过氧乙酸-氯化钠溶液对经清洗的生物羊膜进行病毒灭活，得到灭活羊膜；
用生理盐水震荡清洗所述灭活羊膜并震荡清洗，用碳酸氢钠溶液复洗，得到复洗羊膜；
将蛋白酶液和所述复洗羊膜混合孵育，并纯净水震荡清洗，并用去垢液震荡清洗后，制备得到脱细胞生物羊膜。
3.根据权利要求2所述的包含疏松层的脱细胞生物羊膜的制备方法，其特征在于，所述病毒灭活前还包括使用生理盐水清洗新鲜剥离得到的羊膜，然后用所述过氧乙酸-氯化钠溶液室温震荡净化12-16min。
4.根据权利要求3所述的包含疏松层的脱细胞生物羊膜的制备方法，其特征在于，所述过氧乙酸-氯化钠溶液中过氧乙酸含量为0.1％，氯化钠为0.8-1.2mol/L。
5.根据权利要求4所述的包含疏松层的脱细胞生物羊膜的制备方法，其特征在于，所述过氧乙酸-氯化钠溶液的添加量为1.7-2.4mL/cm2。
6.根据权利要求2所述的包含疏松层的脱细胞生物羊膜的制备方法，其特征在于，用所述生理盐水震荡清洗2-3次后，用0.5％-10％的碳酸氢钠溶液清洗。
7.根据权利要求2所述的包含疏松层的脱细胞生物羊膜的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶液为胰蛋白酶液，所述胰蛋白酶液的浓度为0.25％-0.4％。
8.根据权利要求7所述的包含疏松层的脱细胞生物羊膜的制备方法，其特征在于，所述胰蛋白酶液的加入量为0.17-0.24mL/cm2，然后35-39℃孵育150-220min。
9.根据权利要求2所述的包含疏松层的脱细胞生物羊膜的制备方法，其特征在于，所述去垢液为0.08％-0.13％的Triton X-100，所述去垢液的添加量为1.7-2.4mL/cm2。
10.根据权利要求9所述的包含疏松层的脱细胞生物羊膜的制备方法，其特征在于，加入所述去垢液后在35-40℃条件下震荡清洗5-6h，然后纯净水震荡清洗2-5次。
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