CN108355172A - 一种软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质及其制备方法和应用 - Google Patents

一种软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质及其制备方法和应用，属于医用材料领域。所述脱细胞罗非鱼皮仿生基质是以罗非鱼皮为原料经特殊处理而成；所述软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质的制备方法包括原料前处理、粗整理、脱细胞、再整理、保存液预处理、成型等工艺步骤。本发明方法制得的软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质天然网络结构完整、柔韧性好，是低免疫原性的仿生细胞外基质支架材料；具有良好的生物功能和力学性能，可用于多种软组织修复如烧烫伤创面、溃疡创面、疝气修补、硬脑膜修补、尿道/膀胱/盆底重建、牙周组织修复、粘膜组织修复等。

Description

一种软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质及其制备方法和应用。
背景技术
软组织损伤修复是常见的创伤外科病症，病因致伤因素多样，是许多临床科室急需解决的棘手问题。传统治疗方法预后质量不高且易发创面感染等并发症，严重时甚至致残或致死。此外，有些需用组织工程手段修复的软组织损伤受限于材料的缺乏或费用昂贵等，难以作为常见临床路径普遍推广。软组织损伤的修复问题已成为研究热点之一。
常见软组织修复材料包括高分子材料、生物材料以及合成材料等多种类型，但迄今为止，脱细胞基质(Acellulardermalmatrix，ADM)仍是最为接近机体组织生理性结构和功能的生物型创伤修复产品，由于具有天然的仿生结构，其组织相容性和组织诱导性极为突出。脱细胞猪皮、牛皮已被开发成医疗制品成功应用于临床难愈性创面的修复，其促进组织再生和创面愈合的功能也已得到临床证实，但由于存在疯牛病(牛)、蓝耳病(猪)等人畜共患病毒传播的风险，已被列为国家药监总局列入最高风险等级的产品予以严密监控。此外，由于宗教信仰等问题，猪、牛源性的医疗产品在以色列以及其他伊斯兰国家、地区不能进入临床应用，这些区域由于软组织损伤的致残率和死亡率极高。
鱼皮在水产品加工中作为废弃资源处理，每年废弃量达数万吨之多。鱼皮的结构与哺乳动物皮肤类似，但鱼的病毒传播风险远低于陆地动物，可有效规避宗教伦理壁垒，因此，脱细胞鱼皮基质有望替代陆地动物脱细胞基质成为软组织修复的理想仿生基质材料。罗非鱼是我国四大淡水鱼之一，每年产量上百万吨，而鱼皮约占5％。罗非鱼皮中胶原蛋白含量约为20.65％，是制备鱼胶原蛋白的主要原料，业已证实，罗非鱼皮源性的鱼胶原蛋白可有效促进创面愈合及组织再生，已作为新型胶原蛋白用于多种组织工程技术的研究。2017年5月，巴西塞阿拉联邦大学的研究人员首次将罗非鱼皮用于Ⅱ、Ⅲ度烧伤创面的人体治疗，效果显著。他们将罗非鱼皮清洗、去腥、灭菌后，直接覆盖于烧伤创面并以纱布固定，10天后解开纱布并去除罗非鱼皮，入组的56例患者均表现出良好的皮肤修复效果，且治疗过程中疼痛度降低，治疗费用更是显著降低了75％，极为适用于经济不发达地区。研究人员认为，罗非鱼皮中Ⅰ型胶原蛋白含量很高，可长时间保持创面湿润，不仅可减轻疼痛、促进愈合，而且大幅度减少换药次数，大大降低了治疗费用。我国学者也有过用罗非鱼皮胶原蛋白治疗大鼠皮肤损伤的报道，证实其对于软组织损伤修复具有良好的促进和诱导作用，但没有罗非鱼皮直接用于人体软组织修复的研究或报道。
在巴西报道的人体临床应用中，罗非鱼皮优异的软组织修复功能及临床有效性业已得到证实，且该方法成本低廉、无宗教壁垒，具备在全球范围内普遍推广的基础。然而，该报道中所用的罗非鱼皮仅进行了简单的去鳞、去冗余、去腥及灭菌处理，未去除免疫原性较强的细胞，仍存在致敏或免疫排斥的可能，存在临床使用安全性的隐患；所用的罗非鱼皮仍保留了大量色素等组份，使得每片鱼皮差异性极大，难以进行质量控制或风险监控，不能作为规模化生产的医疗产品进行市场销售。我们团队已在罗非鱼皮明胶、胶原蛋白、多肽等的制备及产业化领域具有丰富经验，对脱细胞罗非鱼皮仿生基质的制备也有突破性进展。对罗非鱼皮进行脱细胞、脱色素处理后，其仿生三维结构得以良好保持而免疫原性物质基本去除，大大提高了临床使用的安全性，此外，经本发明处理的脱细胞罗非鱼皮仿生基质材料工艺稳定性好、质量风险可控、力学性能和生物功能保持良好，能满足CFDA对于组织工程产品的安全性和有效性要求，有望作为医疗产品进行成果转化并大规模化应用于临床
本发明选用罗非鱼皮作为原材料，提供了一种软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质材料的制备方法，在工艺过程无有机试剂或其他污染源的引入，可有效控制热原、细菌等污染风险，工艺简单稳定且重复性强。本发明制备的脱细胞罗非鱼皮仿生基质材料有效保留了三维天然结构，可为细胞或组织的再生提供仿生微环境；同时又去除了可能导致免疫反应的细胞、色素等，大大提高了临床使用安全性。本发明制备的脱细胞罗非鱼皮仿生基质材料具有良好的力学强度、吸水性、柔韧性和渗透性，可用于多种软组织修复如烧烫伤创面、溃疡创面、疝气修补、硬脑膜修补、尿道/膀胱/盆底重建、牙周组织修复、粘膜组织修复等。
发明内容
本发明为解决现有技术中的上述问题，提供了一种软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质及其制备方法和应用，其目的在于，避免陆地动物源性生物材料病毒传播风险、降低宗教伦理风险；采用该方法制备的价格低廉而生物安全性、相容性和力学性能等良好的脱细胞罗非鱼皮仿生基质材料，尤其适用于软组织修复。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个方面是提供一种软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质的制备方法，其主要技术方案是以罗非鱼皮为原料，然后经脱细胞处理后制得可用于软组织再生修复的仿生基质材料。
进一步地，本发明软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质的制备方法，具体按如下步骤处理：
(1)罗非鱼皮预处理：将新鲜罗非鱼皮清洗、去除冗余组织及杂质；
(2)预处理：4℃下，对步骤(1)预处理后的罗非鱼皮进行粗整理清除部分冗余；
(3)微结构保护：4℃下，以料液比1:5-1:20(w/w)的磷酸盐缓冲液(0.05-0.2M，pH7.0-7.4)搅拌2-4h后排除废液；以上步骤重复1-3次；
(4)清洗：4℃下，以料液比1:5-1:20(w/w)的2％-5％NaCl溶液搅拌2h后排除废液；
(5)初次脱细胞处理：将上述罗非鱼皮平铺于经干烤灭菌的托盘中，迅速置于-40℃冷冻2-4h，于洁净条件下解冻，如此反复冻融处理2-4次；
(6)微结构再保护：4℃下，以料液比1:5-1:20(w/w)的磷酸盐缓冲液(0.05-0.2M，pH7.0-7.4)搅拌2-4h后排除废液；以上步骤重复1-2次；
(7)二次脱细胞处理：4℃下，以料液比1:5-1:20(w/w)的脱细胞溶液搅拌处理8-18h，对罗非鱼皮进行再整理清除上述处理过程形成的部分冗余组织；4℃下，以料液比1:5-1:20(w/w)的生理缓冲液清洗2-4次，每次0.5-4h；
(8)清洗：4℃下，以料液比1:5-1:20(w/w)的2％-5％NaCl溶液搅拌2h后排除废液；
(9)保护液预处理及加工成型：4℃下，将制备的脱细胞罗非鱼皮仿生基质浸泡于料液比1:5-1:20(w/w)的保护液中，缓慢搅拌1-4h；并加工成型，制得脱细胞罗非鱼皮仿生基质，包装；
(10)最终灭菌得成品：将所得包装完好的干态或湿态脱细胞罗非鱼皮仿生基质最终灭菌，可得成品。
进一步优选地，步骤(1)中所述罗非鱼皮为新鲜剥离的材料，其来源有可追溯性且符合检疫要求；即所述罗非鱼皮为新鲜宰杀后立即低温冻存，来源可追溯且满足动物检疫要求。
进一步优选地，步骤(1)所述罗非鱼皮预处理的具体工艺为：将新鲜罗非鱼皮刮除残余鳞片及冗余肌肉等组织，采用4℃去离子水多次冲洗除尽残余血液，并根据不同解剖部位裁切成合适尺寸，迅速置于-40℃冷冻，使用前取出于室温下流水解冻。
进一步优选地，步骤(1)-(10)中各制备过程控温在4℃左右，料液比1:5-1:20。
进一步优选地，步骤(2)中所述粗整理清除部分冗余的具体工艺为：4℃下，以料液比1:5-1:20(w/w)的2％-5％NaCl溶液搅拌1-4h后排除废液，重复2-4次；以料液比1:5-1:20(w/w)的柠檬酸(0.005-0.05mol/L)处理0.5-2h。
进一步优选地，步骤(3)和步骤(6)中所述磷酸盐缓冲液为PBS缓冲液、Hank’s缓冲液、D-Hank’s缓冲液中的一种。
进一步优选地，步骤(7)中所述脱细胞溶液为0.5-4％脱氧胆酸钠、0.1-1％十二烷基硫酸钠、0.1-1％Triton X-100、烷基糖苷、0.05-5μg/ml胰蛋白酶或胃蛋白酶或DipaseⅡ的一种或几种。
进一步优选地，步骤(9)中所述保护液为生理缓冲液、细胞培养液、组织保存液、透明质酸溶液、壳聚糖溶液、右旋糖酐溶液、甘油等的一种或几种。
进一步优选地，步骤(9)中所述加工成型方式包括湿态法或干态法：湿态法为将浸润保护液的脱细胞罗非鱼皮仿生基质直接装袋、封口后灭菌；干态法则将浸润保护液的脱细胞罗非鱼皮仿生基质先冷冻干燥，再装袋、封口、灭菌。
本发明的第二个方面是提供一种如上述所述方法制备的软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质。
本发明的第三个方面是提供一种如上述所述的软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质的应用，所述软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质在烧烫伤创面修复、溃疡创面、疝气修补、硬脑膜修补、尿道/膀胱/盆底重建、牙周组织修复、粘膜组织修复中的应用。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，本发明提供的软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质的制备方法优点在于：
(1)有效利用我国资源丰富的水产加工废弃物罗非鱼皮，经特殊加工制备脱细胞仿生基质用于软组织修复，不仅可以回避陆地动物源性脱细胞基质材料的病毒传播风险，而且可以规避宗教壁垒，还可大幅度降低医疗成本，具有很好的产业化市场潜力；
(2)所制备的脱细胞罗非鱼皮仿生基质有效保留了天然三维结构，细胞和色素脱除率高，无腥味或异味，大大降低了免疫原性风险；该仿生基质的干态和湿态力学强度均较高，可满足临床不同操作的要求；
(3)所提供的制备工艺没有引入有机溶剂，对热原及微生物也进行了有效控制，可有效提高生物安全性和相容性；经该工艺处理的罗非鱼皮具有良好的质量稳定性和批间稳定性，便于风险控制和规模化生产，可形成医疗产品用于医学临床。
附图说明
图1为本发明一种软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质的制备方法的工艺流程图；
图2为采用本发明方法制得的脱细胞罗非鱼皮仿生基质的表观图片；
图3为采用本发明方法制得的脱细胞罗非鱼皮仿生基质的扫描电镜图片，显示有秩的天然多孔支架结构；
图4为采用本发明方法制得的脱细胞罗非鱼皮仿生基质的HE染色图片，基本无细胞残留。
具体实施方式
如图1所示的工艺流程图，本发明的目的在于，提供了一种软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质的制备方法，其主要技术方案是以罗非鱼皮为原料，然后经脱细胞处理后制得可用于软组织再生修复的仿生基质材料，包括原料前处理、粗整理、脱细胞、再整理、保存液预处理、成型等工艺步骤。以避免陆地动物源性生物材料病毒传播风险、降低宗教伦理风险；采用该方法制备的价格低廉而生物安全性、相容性和力学性能等良好的脱细胞罗非鱼皮仿生基质材料，尤其适用于软组织修复。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例1软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质的制备
1)罗非鱼皮预处理：新鲜罗非鱼皮刮除残余鳞片及冗余肌肉等组织，4℃去离子水多次冲洗除尽残余血液；根据不同解剖部位裁切成合适尺寸，迅速置于-40℃冷冻，使用前取出于室温下流水解冻；
2)预处理：4℃下，以料液比1:20(w/w)的3.5％NaCl溶液搅拌1h后排除废液，重复2次；以料液比1:20(w/w)的柠檬酸溶液(0.005mol/L)处理2h；对罗非鱼皮进行粗整理清除部分冗余；
3)微结构保护：4℃下，以料液比1:20(w/w)的PBS缓冲液(0.1M，pH7.4)搅拌2h后排除废液；以上步骤重复2次；
4)清洗：4℃下，以料液比1:20(w/w)的3.5％NaCl溶液搅拌4h后排除废液；
5)初次脱细胞处理：将上述罗非鱼皮平铺于经干烤灭菌的托盘中，迅速置于-40℃冷冻2h,于洁净条件下解冻，如此反复冻融处理4次；
6)微结构再保护：4℃下，以料液比1:20(w/w)的PBS缓冲液(0.1M，pH7.4)搅拌2h后排除废液；以上步骤重复2；
7)二次脱细胞处理：4℃下，以料液比1:20(w/w)的2％脱氧胆酸钠(含硫酸庆大霉素50μg/ml)搅拌处理12h，对罗非鱼皮进行再整理清除上述处理过程形成的部分冗余组织；4℃下，以料液比1:20(w/w)的Hank’s缓冲液清洗3次，每次0.5h；
8)清洗：4℃下，以料液比1:20(w/w)的3.5％NaCl溶液搅拌4h后排除废液；
9)保护液预处理及加工成型：4℃下，将制备的脱细胞罗非鱼皮仿生基质浸泡于料液比1:20(w/w)的0.5％透明质酸钠溶液中，缓慢搅拌2h，冷冻干燥，再装袋、封口；
10)最终灭菌得成品：将所得包装完好的干态脱细胞罗非鱼皮仿生基质辐照灭菌，可得成品。
实施例2软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质的制备
1)罗非鱼皮预处理：同实施例1；
2)预处理：4℃下，以料液比1:10(w/w)的5％NaCl溶液搅拌2h后排除废液，重复2次；以料液比1:10(w/w)的柠檬酸溶液(0.01mol/L)处理2h；对罗非鱼皮进行粗整理清除部分冗余；
3)微结构保护：4℃下，以料液比1:10(w/w)的PBS缓冲液(0.2M，pH7.0)搅拌2h后排除废液；以上步骤重复2次；
4)清洗：4℃下，以料液比1:10(w/w)的5％NaCl溶液搅拌4h后排除废液；
5)初次脱细胞处理：将上述罗非鱼皮平铺于经干烤灭菌的托盘中，迅速置于-40℃冷冻4h,于洁净条件下解冻，如此反复冻融处理3次；
6)微结构再保护：4℃下，以料液比1:10(w/w)的PBS缓冲液(0.2M，pH7.0)搅拌2h后排除废液；以上步骤重复1次；
7)二次脱细胞处理：4℃下，以料液比1:10(w/w)的2％脱氧胆酸钠(含硫酸庆大霉素50μg/ml)搅拌处理16h，排除废液后，生理盐水冲洗；20℃下，以料液比1:10(w/w)的胰蛋白酶溶液(0.5μg/ml,以pH8.0Tric-HCl缓冲液体系配制，含硫酸庆大霉素50μg/ml)，搅拌处理18h；4℃下，以料液比1:10(w/w)的Hank’s缓冲液清洗3次，每次1h；
8)清洗：4℃下，以料液比1:10(w/w)的5％NaCl溶液搅拌4h后排除废液；
9)保护液预处理及加工成型：4℃下，将制备的脱细胞罗非鱼皮仿生基质浸泡于料液比1:10(w/w)的0.5％透明质酸钠溶液中，缓慢搅拌4h，装袋、封口；
10)最终灭菌得成品：将所得包装完好的湿态脱细胞罗非鱼皮仿生基质辐照灭菌，可得成品。
实施例3软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质的制备
1)罗非鱼皮预处理：同实施例1；
2)预处理：同实施例2；
3)微结构保护：4℃下，以料液比1:10(w/w)的D-Hank’s缓冲液(pH7.2)搅拌2h后排除废液；以上步骤重复2次；
4)清洗：4℃下，以料液比1:10(w/w)的4％NaCl溶液搅拌4h后排除废液；
5)初次脱细胞处理：同实施例1；
6)微结构再保护：4℃下，以料液比1:10(w/w)的D-Hank’s缓冲液(pH7.2)搅拌2h后排除废液；以上步骤重复2次；
7)二次脱细胞处理：4℃下，以料液比1:10(w/w)的1％脱氧胆酸钠(含硫酸庆大霉素50μg/ml)搅拌处理18h，排除废液后，生理盐水冲洗；以料液比1:10(w/w)的0.5％十二烷基磺酸钠(含硫酸庆大霉素50μg/ml)搅拌处理4h，对罗非鱼皮进行再整理清除上述处理过程形成的部分冗余组织；4℃下，以料液比1:10(w/w)的Hank’s缓冲液清洗3次，每次1h；
8)清洗：4℃下，以料液比1:10(w/w)的4％NaCl溶液搅拌4h后排除废液；
9)保护液预处理及加工成型：4℃下，将制备的脱细胞罗非鱼皮仿生基质浸泡于料液比1:10(w/w)的DMEM细胞培养液中，缓慢搅拌4h，装袋、封口；
10)最终灭菌得成品：同实施例2。
实施例4软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质的制备
1)罗非鱼皮预处理：同实施例1；
2)预处理：4℃下，以料液比1:8(w/w)的5％NaCl溶液搅拌2h后排除废液，重复2次；以料液比1:8(w/w)的柠檬酸溶液(0.05mol/L)处理2h；对罗非鱼皮进行粗整理清除部分冗余；
3)微结构保护：4℃下，以料液比1:8(w/w)的PBS缓冲液(0.2M，pH7.0)搅拌1h后排除废液；以上步骤重复2次；
4)清洗：4℃下，以料液比1:8(w/w)的5％NaCl溶液搅拌4h后排除废液；
5)初次脱细胞处理：同实施例2；
6)微结构再保护：4℃下，以料液比1:8(w/w)的PBS缓冲液(0.2M，pH7.0)搅拌1h后排除废液；以上步骤重复2次；
7)二次脱细胞处理：4℃下，以料液比1:8(w/w)的4％脱氧胆酸钠(含硫酸庆大霉素50μg/ml)搅拌处理6h，排除废液后，生理盐水冲洗；4℃下，以料液比1:8(w/w)的Hank’s缓冲液清洗3次，每次1h；4℃下，以料液比1:8(w/w)的1％TritonX-100溶液(含硫酸庆大霉素50μg/ml)，搅拌处理12h；4℃下，以料液比1:8(w/w)的Hank’s缓冲液清洗3次，每次1h；
8)清洗：4℃下，以料液比1:8(w/w)的5％NaCl溶液搅拌4h后排除废液；
9)保护液预处理及加工成型：4℃下，将制备的脱细胞罗非鱼皮仿生基质浸泡于料液比1:8(w/w)的Hank’s缓冲液中，缓慢搅拌2h，冷冻干燥，装袋、封口；
10)最终灭菌得成品：电子束辐照灭菌，得最终成品。
实施例5软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质的制备
1)罗非鱼皮预处理：同实施例1；
2)预处理：同实施例4；
3)微结构保护：同实施例4；
4)清洗：同实施例4；
5)初次脱细胞处理：同实施例1；
6)微结构再保护：4℃下，以料液比1:8(w/w)的2％脱氧胆酸钠-0.1％烷基糖苷(含硫酸庆大霉素50μg/ml)搅拌处理18h，其余同实施例4；
7)二次脱细胞处理：料液比1：8，其余同实施例2；
8)清洗：同实施例4；
9)保护液预处理及加工成型：4℃下，将制备的脱细胞罗非鱼皮仿生基质浸泡于料液比1:8(w/w)的甘油中，缓慢搅拌4h，装袋、封口；
10)最终灭菌得成品：辐照灭菌，得最终成品。
对上述实施例1制得的软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质材料进行扫描电镜观察三维结构、组织切片并HE染色后判断结构及细胞脱去情况，并根据GB/T16886相关标准的要求对其吸水倍数、亲水性、吸水膨胀率、撕裂强度及渗透率等进行检测。
如图2-4的检测结果显示，所制备的脱细胞罗非鱼皮仿生基质具有天然的仿生三维多孔结构，便于细胞的迁入及增殖，该方法制备的脱细胞罗非鱼皮几乎无细胞残留，免疫原性低。吸水倍数约为10左右，吸水膨胀率高达29左右，证实其具有良好的湿性延展性，便于大面积创面的覆盖。该脱细胞罗非鱼皮仿生基质亲水性良好，作为创伤修复材料可有效吸收创面血液或体液，其亲水界面便于细胞的粘附和组织再生。其干态和湿态的撕裂强度均大于10MPa，应变更是高达180％，表明其干态和湿态均具有良好的拉伸性和柔韧性，用于软组织修复的材料顺应性优异。渗透率实验结果证实，该方法制备的脱细胞罗非鱼皮仿生基质液体渗透率可达7.76mS/cm，具有良好的渗透性，可提供良好的液体-营养交换介质也便于创面处的气液交换，可有效避免因材料下方液体凝集引发的感染或炎症风险。上述检测结果表明，本发明制备的脱细胞罗非鱼皮仿生基质是一种理想的组织再生修复材料和天然支架材料，临床潜力巨大。
本发明分别将上述其他实施例所得的脱细胞罗非鱼皮仿生基质材料进行上述相关检测，所得结果均与应用实施例1相似。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质的制备方法，其特征在于，以罗非鱼皮为原料，经脱细胞处理后制得可用于软组织再生修复的仿生基质材料。
2.根据权利要求1所述的软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质的制备方法，其特征在于，按如下步骤处理：
(1)罗非鱼皮预处理：将新鲜罗非鱼皮清洗、去除冗余组织及杂质；
(2)预处理：4℃下，对步骤(1)预处理后的罗非鱼皮进行粗整理清除部分冗余；
(3)微结构保护：4℃下，以料液比1:5-1:20(w/w)的磷酸盐缓冲液(0.05-0.2M，pH7.0-7.4)搅拌2-4h后排除废液；以上步骤重复1-3次；
(4)清洗：4℃下，以料液比1:5-1:20(w/w)的2％-5％NaCl溶液搅拌2h后排除废液；
(5)初次脱细胞处理：将上述罗非鱼皮平铺于经干烤灭菌的托盘中，迅速置于-40℃冷冻2-4h，于洁净条件下解冻，如此反复冻融处理2-4次；
(6)微结构再保护：4℃下，以料液比1:5-1:20(w/w)的磷酸盐缓冲液(0.05-0.2M，pH7.0-7.4)搅拌2-4h后排除废液；以上步骤重复1-2次；
(7)二次脱细胞处理：4℃下，以料液比1:5-1:20(w/w)的脱细胞溶液搅拌处理8-18h，对罗非鱼皮进行再整理清除上述处理过程形成的部分冗余组织；4℃下，以料液比1:5-1:20(w/w)的生理缓冲液清洗2-4次，每次0.5-4h；
(8)清洗：4℃下，以料液比1:5-1:20(w/w)的2％-5％NaCl溶液搅拌2h后排除废液；
(9)保护液预处理及加工成型：4℃下，将制备的脱细胞罗非鱼皮仿生基质浸泡于料液比1:5-1:20(w/w)的保护液中，缓慢搅拌1-4h；并加工成型，制得脱细胞罗非鱼皮仿生基质，包装；
(10)最终灭菌得成品：将所得包装完好的干态或湿态脱细胞罗非鱼皮仿生基质最终灭菌，可得成品。
3.根据权利要求2所述的软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述罗非鱼皮为新鲜剥离的材料，其来源有可追溯性且符合检疫要求。
4.根据权利要求2所述的软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述罗非鱼皮预处理的具体工艺为：将新鲜罗非鱼皮刮除残余鳞片及冗余肌肉等组织，采用4℃去离子水多次冲洗除尽残余血液，并根据不同解剖部位裁切成合适尺寸，迅速置于-40℃冷冻，使用前取出于室温下流水解冻。
5.根据权利要求2所述的软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述粗整理清除部分冗余的具体工艺为：4℃下，以料液比1:5-1:20(w/w)的2％-5％NaCl溶液搅拌1-4h后排除废液，重复2-4次；以料液比1:5-1:20(w/w)的柠檬酸(0.005-0.05mol/L)处理0.5-2h。
6.根据权利要求2所述的软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质的制备方法，步骤(3)和步骤(6)中所述磷酸盐缓冲液为PBS缓冲液、Hank’s缓冲液、D-Hank’s缓冲液中的一种。
7.根据权利要求2所述的软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质的制备方法，其特征在于，步骤(7)中所述脱细胞溶液为0.5-4％脱氧胆酸钠、0.1-1％十二烷基硫酸钠、0.1-1％Triton X-100、烷基糖苷、0.05-5μg/ml胰蛋白酶或胃蛋白酶或DipaseⅡ的一种或几种。
8.根据权利要求2所述的软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质的制备方法，其特征在于，步骤(9)中所述保护液为生理缓冲液、细胞培养液、组织保存液、透明质酸溶液、壳聚糖溶液、右旋糖酐溶液、甘油等的一种或几种。
9.一种如权利要求1-8任一项所述方法制备的软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质。
10.一种如权利要求9所述的软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质的应用，其特征在于，所述软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质在烧烫伤创面修复、溃疡创面、疝气修补、硬脑膜修补、尿道/膀胱/盆底重建、牙周组织修复、粘膜组织修复中的应用。
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