CN107397972A - 一种动物皮脱细胞基质敷料的制备方法以及所得的敷料 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种动物皮脱细胞基质敷料的制备方法，将动物皮的断层皮片经过病毒灭活步骤、脱脂步骤、脱毛步骤以及脱细胞步骤制得，其中，脱细胞步骤包括多次冻融步骤以及所述多次冻融步骤之后的脱细胞溶液脱细胞步骤。本发明还提供了由所述制备方法制得的动物皮脱细胞基质敷料。本发明提供的制备方法采用了物理法与化学法相结合的脱细胞方法，最大限度保留了细胞外基质的弹性纤维与胶原网状结构，同时抗原去除彻底。本发明制备方法所得的脱细胞真皮基质敷料透水透气，可为创面提供湿润的微环境，显著降低异种的排斥反应，允许细胞再增殖，缩短愈合时间，减少瘢痕的形成，应用方便，可应用于烧烫伤治疗、慢性伤口愈合及糖尿病足治疗等领域。

Description

一种动物皮脱细胞基质敷料的制备方法以及所得的敷料

技术领域

本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种动物皮脱细胞基质敷料的制备方法以及所得的脱细胞基质敷料。

背景技术

诸如烧伤、创伤、褥疮、糖尿病足、下肢溃疡等慢性伤口的愈合与创面修复一直以来是临床面临的重大难题。目前市场常用的高端湿性敷料有水胶体、藻酸盐型填充敷料等。水胶体敷料的缺点在于不适用于渗出液较多的伤口以及有死腔或潜行深度的伤口；藻酸盐型填充敷料的缺点是不适用于干燥结痂伤口。

良好的创面覆盖物可以营造适宜组织修复的微环境。因此，近些年研究者一直在寻求一种更优良的创面敷料。1985年，Heck等在The Journal ofTrauma上报道应用异体真皮作为自体表皮的真皮支架，两者复合后移植于烧伤切痂创面，获得了良好的创面修复的效果，并有效抑制瘢痕增生。1995年，Livesey等首先报道了脱细胞真皮基质的制备方法。以往常见的脱细胞方法主要有化学法(如碱法、高低渗法)，去垢剂法(如离子去垢剂、非离子去垢剂、两性离子去垢剂)，生物学方法-酶法(如核酸酶、胰酶、中性蛋白酶)，溶剂法(如醇类、丙酮、TBP)，物理学及其他方法(如压力、电穿孔、灌注法、组织梯度压力、超临界流体、搅拌)。通常的制备方法包括采用胰蛋白酶和EDTA去表皮、TritonX 100(中性蛋白酶/曲拉通)和高渗盐水或十二烷基硫酸钠(SDS)脱细胞、戊二醛交联等。脱细胞真皮基质敷料去除了表皮和细胞成分，保留了细胞外基质的弹性纤维与胶原网状支架，免疫原性大大降低，成纤维细胞顺着真皮基质的规则结构进行重建，避免了纤维混乱无序的排列，因而避免了瘢痕的形成。

已有的脱细胞真皮基质敷料主要存在以下问题：去抗原不彻底，移植后易产生免疫排斥反应；DNA/RNA的去除没有引起足够重视；处理过度，过多的采用生物试剂与有机试剂对脱细胞真皮基质的胶原纤维结构与性能产生不良影响。

中国专利CN 103520773B公开了一种用于皮肤移植的脱细胞真皮材料，通过反复冻融处理以脱除细胞，降低真皮的免疫原性。研究发现，冻融技术仅能将细胞破碎，并不能有效脱除。由此可见，细胞脱除问题，目前仍是制约脱细胞真皮基质应用的重要课题。

发明内容

为克服现有脱细胞真皮基质在制备以及应用中存在的缺陷，本发明的目的是提供一种动物皮脱细胞基质敷料的制备方法。

本发明的另一目的是提供一种动物皮脱细胞基质敷料。

本发明提供的动物皮脱细胞基质敷料的制备方法包括将动物皮的断层皮片经过病毒灭活步骤、脱脂步骤、脱毛步骤以及脱细胞步骤制得，其中，所述脱细胞步骤包括多次冻融步骤以及所述多次冻融步骤之后的脱细胞溶液脱细胞步骤，其中，所述冻融步骤中，冷冻温度为-70℃～-90℃，冷冻时间为5～15小时；所述脱细胞溶液脱细胞步骤中，所述脱细胞溶液包含质量浓度为0.01％～0.2％的胰酶、质量浓度为0.1％～1.0％的硫酸铵以及质量浓度为0.01％～0.2％的脱脂剂，所述断层皮片与所述脱细胞溶液的质量比为1:6～1:10。

本发明提供的制备方法中，所述脱细胞溶液包含质量浓度为0.01％～0.09％的胰酶、质量浓度为0.5％～1.0％的硫酸铵以及质量浓度为0.05％～0.15％的脱脂剂。所述断层皮片浸泡于所述脱细胞溶液中10～60分钟。

本发明提供的制备方法中，所述脱脂剂选自平平加、Triton X-100、十二烷基氨基丙酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚中的一种。

本发明提供的制备方法中，所述多次冻融步骤于所述病毒灭活步骤之前进行，或穿插于所述病毒灭活步骤、脱脂步骤、脱毛步骤之间进行。

本发明提供的制备方法中，所述病毒灭活步骤为将所述断层皮片置于病毒灭活溶液中浸泡10～60分钟，所述断层皮片与所述病毒灭活溶液的质量比为1:6～1:10，所述病毒灭活溶液包含质量浓度为0.01％～0.2％的过氧乙酸和质量浓度为0.1％～1.0％的氯化钠，优选地，所述病毒灭活溶液包含质量浓度为0.01％～0.07％的过氧乙酸和质量浓度为0.1％～0.5％的氯化钠。

本发明提供的制备方法中，所述脱脂步骤为将所述断层皮片置于脱脂溶液中10～60分钟，所述断层皮片与所述脱脂溶液的质量比为1:6～1:10，所述脱脂溶液包含质量浓度为0.1％～1.0％的纯碱、质量浓度为0.1％～1.0％的烧碱以及质量浓度为0.01％～0.2％的脱脂剂，优选地，所述脱脂溶液包含质量浓度为0.1％～0.5％的纯碱、质量浓度为0.1％～0.7％的烧碱以及质量浓度为0.01％～0.07％的脱脂剂；其中，所述脱脂剂选自平平加、Triton X-100、十二烷基氨基丙酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚中的一种。

本发明提供的制备方法中，所述脱毛步骤为将所述断层皮片置于质量浓度为1.5％～6.0％的Na₂S溶液中10～60分钟，所述断层皮片与所述脱脂溶液的质量比为1:6～1:10，优选地，所述Na₂S溶液的质量浓度为1.5％～3.0％。

本发明提供的制备方法中，当所述断层皮片包含表皮层时，所述制备方法还包括去除表皮步骤，其为将所述断层皮片置于质量浓度为1.0％～5.0％的醋酸溶液中10～30分钟；优选地，所述去除表皮步骤在所述多次冻融步骤之后进行。

本发明提供的制备方法中，所述制备方法还包括去除DNA/RNA步骤，其为将所述断层皮片置于DNA酶溶液和RNA酶溶液中浸泡20～60分钟。

本发明提供的制备方法中，所述制备方法在所述脱细胞步骤之后还包括冷冻干燥步骤以及灭菌步骤，其中，所述灭菌步骤采用剂量为15～30KGy/h的⁶⁰Co辐照灭菌。

本发明提供的动物皮脱细胞基质敷料，采用以上技术方案任一项所述的制备方法制得。

本发明提供的制备方法具有以下优点：

(1)首次将物理法的冻融工艺与化学法的去抗原工艺进行结合，既可以最大限度地保留胶原纤维束的结构完整性，又可以最大限度地去除其抗原性，从而降低了对其性能的影响，结合病毒灭活工艺，可以降低病毒(如猪内源性逆转录病毒)传播的风险，安全性更高。

(2)动物皮脱细胞后获得的细胞外基质(EDM)，尤其是Ⅰ型胶原和少量Ⅲ型胶原组成的胶原纤维束构成的三维多孔支架结构，可以作为皮肤再生修复的生物模板，对受者的干细胞和生长因子的亲和性好。

(3)所得基质敷料中，真皮层的浅层乳突层和深层网状层都得到了较好的处理，都保留了完整的胶原纤维三维结构以及排列规整性。

综上所述，本发明提供的制备方法以新鲜动物皮为原料，保留了胶原纤维束及其形成的三维结构，通过反复冻融、病毒灭活、脱脂、脱毛、脱细胞等工艺技术，制备得到了低免疫原性的脱细胞真皮基质敷料，制备中使用的化学试剂浓度降低、性质温和，最大限度保留了细胞外基质的弹性纤维与胶原网状结构，同时抗原去除彻底。本发明制备方法所得的脱细胞真皮基质敷料透水透气，可为创面提供湿润的微环境，显著降低异种的排斥反应，允许细胞再增殖，缩短愈合时间，减少瘢痕的形成，应用方便，可应用于烧烫伤治疗、慢性伤口愈合及糖尿病足治疗等领域。

附图说明

图1示出了本发明制备方法两种实施方式的流程图。

图2示出了猪脱细胞真皮基质敷料的外观图(a:干性，b:湿性)。

图3示出了文献(中国专利ZL 201210060674.1)中报道的脱细胞猪皮的HE染色切片扫描图。

图4示出了本发明制得的猪真皮基质敷料的HE染色切片扫描图。

图5示出了本发明制得的猪真皮基质敷料的SEM图。

图6示出了本发明制得的猪真皮基质敷料横截面的SEM图。

图7示出了本发明制得的猪真皮基质敷料不同试样的载荷-位移曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种动物皮脱细胞基质敷料的制备方法，将动物皮的断层皮片经过病毒灭活步骤、脱脂步骤、脱毛步骤以及脱细胞步骤制得，所述脱细胞步骤包括多次冻融步骤以及所述多次冻融步骤之后的脱细胞溶液脱细胞步骤，其中，所述冻融步骤中，冷冻温度为-70℃～-90℃，冷冻时间为5～15小时；所述脱细胞溶液脱细胞步骤中，所述脱细胞溶液包含质量浓度为0.01％～0.2％的胰酶、质量浓度为0.1％～1.0％的硫酸铵以及质量浓度为0.01％～0.2％的脱脂剂，所述断层皮片与所述脱细胞溶液的质量比为1:6～1:10。

现有的脱细胞方法包括物理方法与化学方法，物理方法一般为通过物理作用脱细胞，而化学方法则是通过化学试剂与细胞作用而使之被脱除，两种方法的作用原理完全不同。本发明发明人在实验中发现，现有的冻融工艺并不能起到脱细胞的作用，所得的基质敷料抗原性仍然较高，安全性低，但是，冻融工艺可以使细胞内形成冰粒并使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞破碎，破碎后的细胞与未经破碎的细胞相比更加容易去除，采用低浓度的化学试剂即可脱去，而且，低浓度的化学试剂也不会对冻融工艺形成的胶原纤维结构造成破坏，因此可以使得到的脱细胞真皮基质敷料具备理想的微观结构以及低抗原性。

在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，所述动物皮优选为常见的哺乳动物皮，如人尸体皮肤、猪皮、牛皮等，更优选低成本的猪皮。

在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，所述脱细胞溶液包含质量浓度为0.01％～0.09％的胰酶、质量浓度为0.5％～1.0％的硫酸铵以及质量浓度为0.5％～0.15％的脱脂剂。

在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，所述脱脂剂可选用本领域使用的任意种类，包括但不限于平平加、Triton X-100、十二烷基氨基丙酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚等。

在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，断层皮片浸泡于脱细胞溶液中10～60分钟，也可根据脱细胞效果简单调整。

在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，所述多次冻融步骤的次数可以根据原材料断层皮片的情况进行调整，一般可以为3～10次，优选可以为3～5次。

在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，所述多次冻融步骤可以于所述病毒灭活步骤之前进行，也可以穿插于所述病毒灭活步骤、脱脂步骤、脱毛步骤之间进行，如图1的流程图所示。在一个优选的实施方式中，多次冻融步骤在病毒灭活步骤之前进行，即流程2所示制备流程。

在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，所述病毒灭活步骤为将所述断层皮片置于病毒灭活溶液中浸泡10～60分钟，也可浸泡10～15分钟，所述断层皮片与所述病毒灭活溶液的质量比为1:6～1:10，所述病毒灭活溶液包含质量浓度为0.01％～0.2％的过氧乙酸和质量浓度为0.1％～1.0％的氯化钠，优选地，所述病毒灭活溶液包含质量浓度为0.01％～0.07％的过氧乙酸和质量浓度为0.1％～0.5％的氯化钠。

在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，所述脱脂步骤为将所述断层皮片置于脱脂溶液中10～60分钟，所述断层皮片与所述脱脂溶液的质量比为1:6～1:10，所述脱脂溶液包含质量浓度为0.1％～1.0％的纯碱、质量浓度为0.1％～1.0％的烧碱以及质量浓度为0.01％～0.2％的脱脂剂，优选地，所述脱脂溶液包含质量浓度为0.1％～0.5％的纯碱、质量浓度为0.1％～0.7％的烧碱以及质量浓度为0.01％～0.07％的脱脂剂。其中，所述脱脂剂可选用本领域使用的任意种类，包括但不限于平平加、TritonX-100、十二烷基氨基丙酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚中的一种。

在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，所述脱毛步骤为将所述断层皮片置于质量浓度为1.5％～6.0％的Na₂S溶液中10～60分钟，所述断层皮片与所述脱脂溶液的质量比为1:6～1:10。相对于现有技术常用的脱毛试剂，使用Na₂S溶液进行断层皮片的脱毛步骤，利用Na₂S还原破坏角蛋白的双硫键，从而破坏角质蛋白分子的结构稳定性，在碱性条件下将角蛋白的肽键水解成分子量较小的肽或氨基酸，使具有抗原性的毛、毛根屑、毛囊、表皮被溶解而除去，因此在脱毛的同时也可以进一步去除表皮，去抗原更彻底。在一个优选的实施方式中，Na₂S溶液的质量浓度可以为1.5％～3.0％。

在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，当所述断层皮片包含表皮层时，所述制备方法还包括去除表皮步骤，其为将所述断层皮片置于质量浓度为1.0％～5.0％的醋酸溶液中10～30分钟，醋酸溶液浓度也可为1.0％～2.0％，必要时，醋酸溶液浸泡后还包括钝性刮除所述表皮层的处理步骤，优选地，所述去除表皮步骤在所述多次冻融步骤之后进行。醋酸溶液浸泡可以有效促进去表皮。

在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，所述制备方法还包括去除DNA/RNA步骤，其为将所述断层皮片置于DNA酶溶液和RNA酶溶液中浸泡20～60分钟，优选30～60分钟，通常，用于本发明制备方法的DNA酶溶液和RNA酶溶液配置成8～12mg/ml的浓度(DNA酶、RNA酶的浓度皆为此范围)，优选配置成10mg/ml的浓度。该步骤可采用本领域常见的处理步骤，由于脱细胞步骤也有去除DNA/RNA的作用，因此在检验DNA/RNA残留量合格的情况下可省略此步骤。如需采用该步骤，一般在可脱细胞溶液脱细胞步骤之前进行，也可穿插至其他处理步骤间。

在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，所述制备方法在所述脱细胞步骤之后还包括冷冻干燥步骤以及灭菌步骤，其中，冷冻干燥步骤、灭菌步骤可以采用本领域常见的处理步骤。在一个优选的实施方式中，灭菌步骤可采用辐照灭菌，优选采用剂量为15～30KGy/h的⁶⁰Co辐照灭菌。

在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，所述制备方法在各个处理步骤间隙还包含清洗步骤，可以采用本领域常见的处理步骤。在一个优选的实施方式中，可先使用纯化水进行清洗，然后再进行超声清洗，超声清洗可辅助溶解细胞以及移除细胞残留碎片。

本发明还提供了一种动物皮脱细胞基质敷料，采用本发明所述制备方法制得。

本发明制备出的动物皮脱细胞基质敷料，其天然的三维结构有利于成纤维细胞及血管内皮细胞的长入，创面血管垂直长入真皮基质，完成血管化与基质重建过程，达到最终治疗目的。可应用于烧伤(主要是深二度以下的烧伤)、褥疮、糖尿病足等慢性伤口创面的覆盖治疗。

在根据本发明的制备方法的一个具体实施例中，可包括以下制备步骤：

本发明基质敷料的制备方法包括以下具体步骤：

1、选材

原料选自新鲜的无病毒感染的动物皮，如尸体皮肤、猪皮、牛皮等。例如，可选择从种猪繁育、养殖、屠宰、分割均具有可追溯性的生猪屠宰企业作为猪皮原料的供应商，并选取检验检疫合格的猪的皮作为敷料原材料，必要时需进行血相学检查且各项指标为阴性时方可使用。以下步骤以猪皮为例，本发明并不限于此。

2、运输及保存

猪皮运输过程中应放置在洁净的保温箱中，并用干冰、冰壶或冰袋降温，在12小时之内完成整理、清洗并放入-20℃至-196℃的超低温冰箱或液氮罐中保存，作为优选实施例，课放入-80℃超低温冰箱中。

3、取皮

将猪皮取出后放入装有常温纯化水的容器内浸泡至完全解冻，并用鼓式取皮器或电动取皮器制成0.1～5mm的断层皮片。断层皮片的厚度可选择0.2mm、0.4mm、0.6mm、0.8mm和1.0mm；断层皮片分为带有表皮的皮片和不带表皮的真皮层(网状层)皮片。

4、预处理

钝性去除按步骤3所获得的断层皮片的脂肪，经纯化水清洗后，置于-80℃超低温冰箱中进行深低温冷冻5小时以上，作为优选实施例，深低温冷冻时间选择15小时。

5、反复冻融

从超低温冰箱中取出皮片，并放入装有常温纯化水的容器中浸泡至完全解冻，此时完成了一次冻融过程。再将融化的皮片放入-80℃冰箱冷冻5小时以上，如此反复冻融3～5次。

6、去除表皮

将含有表皮层的皮片使用1％～5％(优选1％～2％)的醋酸溶液浸泡10～30分钟，取出后用纯化水进行彻底清洗，并锐性刮除猪皮的表皮，注意保留基底膜。对于只含有真皮层(网状层)的皮片不需进行此步骤，而直接进入下一步骤。

7、病毒灭活

配制病毒灭活溶液，具体为质量浓度为0.01％～0.2％(优选0.01％～0.07％)的过氧乙酸和质量浓度为0.1％～1.0％(优选0.1％～0.5％)的氯化钠组合溶液，将皮片放入上述溶液中浸泡10～60分钟(优选10～15分钟)，皮片与病毒灭活溶液的质量比应小于1:6。

8、清洗

磁力搅拌下用纯化水清洗10～30分钟，再超声清洗10～30分钟。

9、脱脂

配制脱脂溶液，具体为质量浓度为0.1％～1.0％(优选0.1％～0.5％)的纯碱、质量浓度为0.1％～1.0％(优选0.1％～0.5％)的烧碱和质量浓度为0.01％～0.2％(优选0.01％～0.07％)的平平加(或Triton X-100、十二烷基氨基丙酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚其中的一种)，将病毒灭活后的皮片放入上述脱脂溶液中脱脂10～60分钟(优选10～15分钟)，皮片与脱脂溶液的质量比应小于1:6。

10、清洗

磁力搅拌下用纯化水清洗10～30分钟，再超声清洗10～30分钟。

11、脱毛

配制脱毛溶液，具体为质量浓度为1.5％～6.0％(优选1.5％～3.0％)的Na₂S溶液，将脱脂后的动物皮放入上述脱毛溶液中脱毛10～60分钟(优选10～15分钟)，皮片与脱毛溶液的质量比应小于1:6。

12、清洗

磁力搅拌下用纯化水清洗10～30分钟，再超声清洗10～30分钟。

13、去除DNA/RNA

配置成8～12mg/ml(优选10mg/ml)的DNA酶溶液和RNA酶溶液，并将皮片放入其中并浸泡20～60分钟(优选30～60分钟)。在检验DNA及RNA残留量合格的情况下，可以不进行此步骤。

14、清洗

磁力搅拌下用纯化水清洗10～30分钟，再超声清洗10～30分钟。

15、脱细胞

配制脱细胞溶液，具体为质量浓度为0.01％～0.2％(优选0.01％～0.07％)的胰酶、质量浓度为0.1％～1.0％(优选0.1％～0.5％)的硫酸铵、质量浓度为0.01％～0.2％(优选0.01％～0.07％)的平平加(或Triton X-100、十二烷基氨基丙酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚其中的一种)，将脱毛后的动物皮放入上述脱细胞溶液中脱细胞10～60分钟(优选10～15分钟)，材料与脱细胞溶液的质量比应小于1:6。

16、清洗

磁力搅拌下用纯化水清洗10～30分钟，在超声清洗10～30分钟。

17、冷冻干燥

将制备好的脱细胞真皮基质敷料放入冷冻干燥机中干燥24～72小时。

18、包装并辐照灭菌

按规格尺寸进行裁剪，包装后经剂量为15～30KGy/h的⁶⁰Co辐照灭菌，即为成品。

在根据本发明的制备方法的另一个具体实施例中，反复冻融工艺也可在上述步骤6至步骤14之间交替进行。

下面通过实施例对本发明进行详细说明，以使本发明的特征和优点更清楚。但应该指出，实施例用于理解本发明的构思，本发明的范围并不仅仅局限于本文中所列出的实施例。

如没有特别说明，实施例所使用的原料均为市售产品、所使用的操作均为本领域的常规操作。

实施例1

用取皮机取厚度为0.6mm的尸体皮片，钝性刮除外部脂肪，于纯化水中清洗5次，每次10分钟。经纯化水清洗后，置于-80℃超低温冰箱中进行深低温冷冻5小时。从超低温冰箱中取出皮片，并放入装有常温纯化水的容器中浸泡至完全解冻，此时完成了一次冻融过程。再将融化的皮片放入-80℃冰箱冷冻5小时，如此反复冻融4次。然后加入5％的醋酸溶液浸泡20分钟，取出后再用纯化水进行彻底清洗，钝性刮除表皮，保留基底膜。将上述尸体皮片放入质量浓度为0.06％过氧乙酸和质量浓度为0.5％的氯化钠组合溶液中病毒灭活40分钟，材料与病毒灭活溶液的质量比为1:7，磁力搅拌清洗20分钟，超声清洗20分钟。将病毒灭活后的尸体皮片加入质量浓度为0.4％的纯碱、质量浓度为0.7％的烧碱和质量浓度为0.01％的平平加组合溶液中脱脂40分钟，材料与脱脂溶液的质量比为1:7，磁力搅拌清洗20分钟，超声清洗20分钟。将脱脂后的尸体皮片放入质量浓度为2％的Na₂S溶液中脱毛40分钟，材料与脱毛溶液的质量比为1:7，磁力搅拌清洗20分钟，超声清洗20分钟。将脱毛后的尸体皮片放入质量浓度为0.09％的胰酶、质量浓度为1.0％的硫酸铵、质量浓度为0.15％的平平加组合溶液中脱细胞40分钟，材料与脱细胞溶液的质量比为1:7，磁力搅拌清洗20分钟，超声清洗20分钟。将制备好的同种异体脱细胞真皮敷料放入冷冻干燥机中干燥48小时。包装并辐照灭菌：裁剪、包装、经剂量为25KGy/h的⁶⁰Co辐照灭菌，即为成品。

实施例2

选用健康的猪，屠宰后用取皮机取厚度为0.3mm的断层皮片，钝性刮除外部脂肪，于纯化水中清洗3次，每次15分钟。经纯化水清洗后，置于-80℃超低温冰箱中进行深低温冷冻15小时。从超低温冰箱中取出皮片，并放入装有常温纯化水的容器中浸泡至完全解冻，此时完成了一次冻融过程。再将融化的皮片放入-80℃冰箱冷冻15小时，如此反复冻融3次。然后加入2％的醋酸溶液浸泡30分钟，取出后再用纯化水进行彻底清洗，钝性刮除表皮，保留基底膜。将上述猪皮放入质量浓度为0.05％过氧乙酸和质量浓度为0.6％的氯化钠组合溶液中病毒灭活20分钟，材料与病毒灭活溶液的质量比为1:8，磁力搅拌清洗10分钟，超声清洗10分钟。将病毒灭活后的猪皮加入质量浓度为0.5％的纯碱、质量浓度为0.5％的烧碱和质量浓度为0.06％的Triton X-100组合溶液中脱脂20分钟，材料与脱脂溶液的质量比为1:8，磁力搅拌清洗10分钟，超声清洗10分钟。将脱脂后的猪皮放入质量浓度为5％的Na₂S溶液中脱毛20分钟，材料与脱毛溶液的质量比为1:8，磁力搅拌清洗10分钟，超声清洗10分钟。将脱毛后的猪皮放入质量浓度为0.07％的胰酶、质量浓度为0.5％的硫酸铵、质量浓度为0.1％的脂肪醇聚氧乙烯醚组合溶液中脱细胞20分钟，材料与脱细胞溶液的质量比为1:8，磁力搅拌清洗10分钟，超声清洗10分钟。将制备好的脱细胞猪皮敷料放入冷冻干燥机中干燥72小时。包装并辐照灭菌：裁剪、打孔、包装、经剂量为30KGy/h的⁶⁰Co辐照灭菌，即为成品。

实施例3

选用健康的猪，屠宰后用取皮机取厚度为0.5mm的断层皮片，钝性刮除外部脂肪，于纯化水中清洗3次，每次10分钟。经纯化水清洗后，置于-80℃超低温冰箱中进行深低温冷冻10小时。从超低温冰箱中取出皮片，并放入装有常温纯化水的容器中浸泡至完全解冻，此时完成了一次冻融过程。再将融化的皮片放入-80℃冰箱冷冻10小时，如此反复冻融5次。然后加入4％的醋酸溶液浸泡20分钟，取出后再用纯化水进行彻底清洗，钝性刮除表皮，保留基底膜。将上述猪皮放入质量浓度为0.03％过氧乙酸和质量浓度为0.5％的氯化钠组合溶液中病毒灭活60分钟，材料与病毒灭活溶液的质量比为1:7，磁力搅拌清洗15分钟，超声清洗15分钟。将病毒灭活后的猪皮加入质量浓度为0.4％的纯碱、质量浓度为0.7％的烧碱和质量浓度为0.06％的十二烷基氨基丙酸钠组合溶液中脱脂60分钟，材料与脱脂溶液的质量比为1:7，磁力搅拌清洗15分钟，超声清洗15分钟。将脱脂后的猪皮放入质量浓度为3％的Na₂S溶液中脱毛60分钟，材料与脱毛溶液的质量比为1:7，磁力搅拌清洗15分钟，超声清洗15分钟。将脱毛后的猪皮放入质量浓度为0.06％的胰酶、质量浓度为0.8％的硫酸铵、质量浓度为0.12％的平平加组合溶液中，材料与脱细胞溶液的质量比为1:7，磁力搅拌清洗15分钟，超声清洗15分钟。将制备好的脱细胞猪皮敷料放入冷冻干燥机中干燥48小时。包装并辐照灭菌：裁剪、打孔、包装、经剂量为15KGy/h的⁶⁰Co辐照灭菌，即为成品。

实施例4

选用健康的猪，屠宰后用取皮机取厚度为0.5mm的断层皮片，钝性刮除外部脂肪，于纯化水中清洗3次，每次10分钟。选取不带表皮的真皮层(网状层)皮片，经纯化水清洗后，置于-80℃超低温冰箱中进行深低温冷冻10小时。从超低温冰箱中取出皮片，并放入装有常温纯化水的容器中浸泡至完全解冻，此时完成了一次冻融过程。再将融化的皮片放入-80℃冰箱冷冻10小时，如此反复冻融5次。将上述猪皮放入质量浓度为0.2％过氧乙酸和质量浓度为1.0％的氯化钠组合溶液中病毒灭活40分钟，材料与病毒灭活溶液的质量比为1:6，磁力搅拌清洗15分钟，超声清洗15分钟。将病毒灭活后的猪皮加入质量浓度为1.0％的纯碱、质量浓度为1.0％的烧碱和质量浓度为0.2％的十二烷基氨基丙酸钠组合溶液中脱脂60分钟，材料与脱脂溶液的质量比为1:6，磁力搅拌清洗15分钟，超声清洗15分钟。将脱脂后的猪皮放入质量浓度为1.5％的Na₂S溶液中脱毛60分钟，材料与脱毛溶液的质量比为1:6，磁力搅拌清洗10分钟，超声清洗10分钟。然后将猪皮放入质量浓度为0.2％的胰酶、质量浓度为0.3％的硫酸铵、质量浓度为0.2％的平平加组合溶液中，材料与脱细胞溶液的质量比为1:6，磁力搅拌清洗15分钟，超声清洗15分钟。将制备好的脱细胞猪皮敷料放入冷冻干燥机中干燥48小时。包装并辐照灭菌：裁剪、打孔、包装、经剂量为15KGy/h的⁶⁰Co辐照灭菌，即为成品。

实施例5

选用健康的猪，屠宰后用取皮机取厚度为0.5mm的断层皮片，钝性刮除外部脂肪，于纯化水中清洗3次，每次10分钟。经纯化水清洗后，置于-80℃超低温冰箱中进行深低温冷冻10小时。从超低温冰箱中取出皮片，并放入装有常温纯化水的容器中浸泡至完全解冻，此时完成了一次冻融过程。再将融化的皮片放入-80℃冰箱冷冻10小时，如此反复冻融5次。然后加入1％的醋酸溶液浸泡20分钟，取出后再用纯化水进行彻底清洗，钝性刮除表皮，保留基底膜。将上述猪皮放入质量浓度为0.01％过氧乙酸和质量浓度为0.1％的氯化钠组合溶液中病毒灭活10分钟，材料与病毒灭活溶液的质量比为1:10，磁力搅拌清洗15分钟，超声清洗15分钟。将病毒灭活后的猪皮加入质量浓度为0.1％的纯碱、质量浓度为0.1％的烧碱和质量浓度为0.1％的十二烷基氨基丙酸钠组合溶液中脱脂10分钟，材料与脱脂溶液的质量比为1:10，磁力搅拌清洗15分钟，超声清洗15分钟。将猪皮放入质量浓度为6.0％的Na₂S溶液中脱毛10分钟，材料与脱毛溶液的质量比为1:10，磁力搅拌清洗10分钟，超声清洗10分钟。然后将脱毛后的皮片放入酶溶液中，酶溶液为10mg/ml的DNA酶溶液和RNA酶溶液，并在其中浸泡30分钟，磁力搅拌下用纯化水清洗20分钟，再超声清洗20分钟。然后将猪皮放入质量浓度为0.01％的胰酶、质量浓度为0.1％的硫酸铵、质量浓度为0.01％的平平加组合溶液中，材料与脱细胞溶液的质量比为1:10，磁力搅拌清洗15分钟，超声清洗15分钟。将制备好的脱细胞猪皮敷料放入冷冻干燥机中干燥48小时。包装并辐照灭菌：裁剪、打孔、包装、经剂量为15KGy/h的⁶⁰Co辐照灭菌，即为成品。

测试例

1、如图2所示，本发明制备方法制得的动物皮脱细胞基质敷料的外观照片。

2、如图3所示，中国专利ZL 201210060674.1报道的脱细胞猪皮中残留的细胞较多(其中的黑点)，如图4所示，本发明制备方法制得的动物皮脱细胞基质敷料则无任何细胞残留，去抗原性更加彻底，应用安全性更高。

3、如图5、6所示，本发明制备方法制得的动物皮脱细胞基质敷料具备纳米级的微观结构，保留了完整的胶原纤维三维结构以及排列规整性，可以作为真皮再生的模板。

4、用万能拉力试验机对本发明制备的动物皮脱细胞基质敷料进行抗拉强度测试，得到基质敷料的载荷-位移曲线，图7为0.3mm厚度的脱细胞真皮基质敷料的载荷-位移曲线，包括了辐照前和辐照后的样品(辐照前、辐照后各2个试样)，辐照前，其抗拉强度的平均值为18.99Mpa；辐照后，其抗拉强度的平均值为11.86Mpa，均大于4.0MPa。

根据现有技术里的记载，脱细胞真皮基质敷料的力学性能较差，通常需通过化学改性剂提高机械性能，而使用本发明的方法得到的敷料，在没有任何化学改性剂的情况下得到了很高的抗拉强度。

除非特别限定，本发明所用术语均为本领域技术人员通常理解的含义。

本发明所描述的实施方式仅出于示例性目的，并非用以限制本发明的保护范围，本领域技术人员可在本发明的范围内作出各种其他替换、改变和改进，因而，本发明不限于上述实施方式，而仅由权利要求限定。

Claims (11)

1.一种动物皮脱细胞基质敷料的制备方法，将动物皮的断层皮片经过病毒灭活步骤、脱脂步骤、脱毛步骤以及脱细胞步骤制得，其特征在于，所述脱细胞步骤包括多次冻融步骤以及所述多次冻融步骤之后的脱细胞溶液脱细胞步骤，其中，所述冻融步骤中，冷冻温度为-70℃～-90℃，冷冻时间为5～15小时；所述脱细胞溶液脱细胞步骤中，所述脱细胞溶液包含质量浓度为0.01％～0.2％的胰酶、质量浓度为0.1％～1.0％的硫酸铵以及质量浓度为0.01％～0.2％的脱脂剂，所述断层皮片与所述脱细胞溶液的质量比为1:6～1:10。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脱细胞溶液包含质量浓度为0.01％～0.09％的胰酶、质量浓度为0.5％～1.0％的硫酸铵以及质量浓度为0.05％～0.15％的脱脂剂；所述断层皮片浸泡于所述脱细胞溶液中10～60分钟。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述脱脂剂选自平平加、Triton X-100、十二烷基氨基丙酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚中的一种。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多次冻融步骤于所述病毒灭活步骤之前进行，或穿插于所述病毒灭活步骤、脱脂步骤、脱毛步骤之间进行。

5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述病毒灭活步骤为将所述断层皮片置于病毒灭活溶液中浸泡10～60分钟，所述断层皮片与所述病毒灭活溶液的质量比为1:6～1:10，所述病毒灭活溶液包含质量浓度为0.01％～0.2％的过氧乙酸和质量浓度为0.1％～1.0％的氯化钠，优选地，所述病毒灭活溶液包含质量浓度为0.01％～0.07％的过氧乙酸和质量浓度为0.1％～0.5％的氯化钠。

6.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述脱脂步骤为将所述断层皮片置于脱脂溶液中10～60分钟，所述断层皮片与所述脱脂溶液的质量比为1:6～1:10，所述脱脂溶液包含质量浓度为0.1％～1.0％的纯碱、质量浓度为0.1％～1.0％的烧碱以及质量浓度为0.01％～0.2％的脱脂剂，优选地，所述脱脂溶液包含质量浓度为0.1％～0.5％的纯碱、质量浓度为0.1％～0.7％的烧碱以及质量浓度为0.01％～0.07％的脱脂剂；其中，所述脱脂剂选自平平加、Triton X-100、十二烷基氨基丙酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚中的一种。

7.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述脱毛步骤为将所述断层皮片置于质量浓度为1.5％～6.0％的Na₂S溶液中10～60分钟，所述断层皮片与所述脱脂溶液的质量比为1:6～1:10，优选地，所述Na₂S溶液的质量浓度为1.5％～3.0％。

8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，当所述断层皮片包含表皮层时，所述制备方法还包括去除表皮步骤，其为将所述断层皮片置于质量浓度为1.0％～5.0％的醋酸溶液中10～30分钟；优选地，所述去除表皮步骤在所述多次冻融步骤之后进行。

9.根据权利要求1-8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括去除DNA/RNA步骤，其为将所述断层皮片置于DNA酶溶液和RNA酶溶液中浸泡20～60分钟。

10.根据权利要求1-9任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法在所述脱细胞步骤之后还包括冷冻干燥步骤以及灭菌步骤，其中，所述灭菌步骤采用剂量为15～30KGy/h的⁶⁰Co辐照灭菌。

11.一种动物皮脱细胞基质敷料，其特征在于，采用权利要求1-10任一项所述制备方法制得。