CN103785065A

CN103785065A - 一种软骨再生支架材料的制备方法

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Publication number: CN103785065A
Application number: CN201410036743.4A
Authority: CN
Inventors: 陈德夫; 田伟; 孙磊; 牛睿
Original assignee: BEIJING DAQING BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Beijing Kejian Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2014-01-24
Filing date: 2014-01-24
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2034-01-24
Also published as: CN103785065B

Abstract

本发明提供一种软骨再生支架材料的制备方法，其是以死亡动物新鲜的背部、面部或臀部皮肤为原料，经深低温处理、脱毛、病毒灭活、脱细胞、结构重塑、交联、冻干、再修饰及灭菌等处理工艺得到成品。采用本发明方法制备的软骨再生支架材料可用于促进软骨细胞贴附和生长，促进关节软骨损伤的愈合。本品属于一种天然细胞外基质成分，有利于细胞的吸附、增殖和分化，并具有一定的力学强度，可作为组织填充物而长期存在于体内；并且具有较好的组织亲和性和相容性，可诱导软骨细胞向其中生长，从而重建软骨，促进软骨细胞贴附和生长，促进关节软骨损伤的愈合，修复关节缺损，是一种有效修复关节软骨缺损的新型再生支架材料。

Description

一种软骨再生支架材料的制备方法

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，具体地说，涉及一种软骨再生支架材料的制备方法。

背景技术

在骨科领域中，关节软骨缺损是十分常见的疾病。关节软骨损伤的修复治疗一直是骨科领域的一个难题。目前临床上大多采用人工膝关节置换来治疗软骨缺损。人工关节置换术易导致一些并发症，如易松动，需要翻修，成本过高，导致过度医疗。因此，进一步研发能够实现内源性组织再生的软骨支架修复材料，提高国内医疗水平和相关的治疗效果，降低国内的医疗费用，成为临床软骨再生支架材料领域的一个重要方向。

再生支架修复技术，是软骨组织工程和再生医学研究内容之一，是近几十年来兴起的一种修复软骨缺损的方法。全国每年关节软骨损伤患者约为3000万人，常规的方法对治疗相关疾病存在一定局限，且费用高昂，每个患者采用相关技术治疗的费用约为2-3万元以上。

目前的软骨组织工程和再生医学技术材料按照手术方式和设计理念可分为三代，第一代技术以骨膜或其他细胞载体复合软骨细胞修复软骨缺损，手术方式为清除软骨，但不破坏软骨下骨，这种技术的细胞主要来源于后期复合或滑膜迁徙而来，组织工程化软骨（修复材料）营养供应主要靠滑膜液供给。第二代技术的支架材料或载体材料具有一定活性或诱导功能，这种支架可以复合骨髓基质干细胞，并且可以使复合的骨髓基质干细胞向软骨细胞分化，同时这种支架材料还可以诱导其他来源细胞形成软骨；这种组织工程软骨较第一代组织工程软骨成软骨能力更强，但是手术依然采用了不破坏软骨下骨的植入方式。第三代技术为无细胞支架材料技术，该类支架材料在具有适当的结构和降解性能的同时具有很好的诱导功能，同时第三类技术材料关键是改变手术植入方式，在清除软骨病变的同时，以钻孔和磨消的方式打破软骨下骨，让支架材料与软骨下骨的细胞相接触，这种设计理念主要在于支架材料不但可以收纳来源于滑膜的干细胞，同时可以吸附大量的来源于软骨下骨存在的各类细胞，充分利用人体自体的再生能力，免去体外培养细胞的复杂工序以及由其带来的高昂成本及相应的风险。

目前上市的软骨再生复合材料机械强度均不高，且降解周期偏快，不能起到支架材料的效果。而作为生物衍生材料来源的软骨再生支架材料，因具有明显的优势，受到越来越多的关注。ZL201110099363.1中公开了一种软骨修复支架材料的制备方法，因缺少深低温处理降低免疫原性和病毒灭活的工艺流程，存在潜在的生物安全性风险。

发明内容

本发明的目的是提供一种软骨再生支架材料的制备方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种软骨再生支架材料的制备方法，其是以死亡动物新鲜的背部、面部或臀部皮肤为原料，经深低温处理、脱毛、病毒灭活、脱细胞、结构重塑、交联、冻干、再修饰及灭菌等处理工艺得到成品。

前述的方法，所述动物包括但不限于猪、牛、马、羊等新生动物个体。

前述的方法，深低温处理的工艺包括但不限于低温冷冻或反复冻融以降低免疫原性。所述深低温冷冻的条件为：-200℃～-10℃冷冻1～90天，优选-196℃～-80℃，冷冻10～60天。反复冻融的条件为：-200℃～-10℃冷冻1～90天，反复冻融2-3次，优选-196℃～-80℃，冷冻10～60天，反复冻融2-3次。

前述的方法，脱毛工艺使用质量百分含量为2～10%的溶剂I浸泡处理0.5～24h；所述溶剂I包括但不限于巯基乙酸、Na₂S、胰蛋白酶、胃蛋白酶溶液等。

前述的方法，病毒灭活采用低浓度过氧乙酸-乙醇溶液、乙醇溶液、过氧化氢溶液、碱溶液或含吐温80的磷酸三丁酯溶液等中的任一种溶液通过浸泡处理以灭活病毒。其中，采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡法灭活病毒，溶液中过氧乙酸的质量百分含量为0.05～0.2%，乙醇的质量百分含量为0.15～0.6%，浸泡温度为4～40℃，病毒灭活时间为1～2h；或采用含吐温80的磷酸三丁酯溶液进行浸泡处理，溶液中磷酸三丁酯和吐温80的质量百分含量分别为0.1-0.5%和1-2%，浸泡温度为24℃，灭活时间为5-10h。

前述的方法，脱细胞工艺在20-40℃的恒温条件下在超声波清洗器中进行，使用溶剂II浸泡处理2～16h；所述溶剂II中胰蛋白酶、胃蛋白酶、十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚（曲拉通X-100）的质量百分含量分别为0.03%-1%、0.01-0.25%和0.1-1%。

前述的方法，结构重塑工艺使用质量百分含量为0.03%-1%的胰蛋白酶溶液浸泡处理0.5～8h。

前述的方法，交联工艺使用质量百分含量为0.1～5%的溶剂III浸泡处理0.5～4h；所述溶剂III包括但不限于甲醛、戊二醛、京尼平、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺等的水溶液。

前述的方法，再修饰工艺具体为：将经过交联处理后的材料进行冻干，然后浸泡于质量百分含量为0.01～1%的溶剂IV中0.5～2h；所述溶剂IV为硫酸软骨素、透明质酸钠、软骨细胞生长因子溶液等中的一种或多种。

前述的方法，灭菌处理工艺包括但不限于伽马射线辐照灭菌、高能电子束灭菌及环氧乙烷灭菌等灭菌方式。

本发明提供的一种软骨再生支架材料的制备方法，采用动物或人的真皮基质，通过脱细胞、改建、交联、冻干、表面修饰等处理工艺得到成品。该材料具有很好的生物相容性及降解性，具有适宜软骨生长的多孔结构，孔隙均匀，相互连通，同时保留了大部分真皮基质中的生长因子并在材料中适当的复合有利软骨再生的成分或生长因子，有利于软骨的再生修复。

软骨再生支架材料以人或动物的真皮基质为原料，优选15-35岁人尸体皮肤或新生小猪、小牛、小马、小羊的皮肤。优选上述动物背部、面部或臀部的皮肤。经过深低温处理、脱毛、病毒灭活、脱细胞、结构重塑、交联、冻干、再修饰、灭菌等处理工艺得到成品。

深低温处理：可采用深低温冷冻，或反复冻融以降低免疫原性。

脱毛工艺：可以使用物理方法，如使用巯基乙酸、Na₂S、胰蛋白酶、胃蛋白酶等浸泡材料。浓度范围为2～10%，处理时间为0.5～24h，优选浓度为8%的Na₂S溶液，处理2h。

病毒灭活：采用低浓度过氧乙酸-乙醇溶液、乙醇溶液、过氧化氢溶液、碱溶液或含吐温80的磷酸三丁酯溶液中的任一种溶液浸泡灭活病毒。其中，优选过氧乙酸-乙醇溶液浸泡法，过氧乙酸浓度范围优选质量百分含量为0.05～0.2%，乙醇浓度范围优选质量百分含量为0.15～0.6%，病毒灭活时间优选1～2h，温度范围优选为4～40℃。或采用含吐温80的磷酸三丁酯溶液进行浸泡处理，溶液中磷酸三丁酯和吐温80的质量百分含量分别为0.1-0.5%和1-2%，浸泡温度为24℃，灭活时间为5-10h。

病毒灭活后用纯化水、生理盐水或pH值6-8的磷酸盐缓冲液清洗2～8次，每次5～30min，清洗后检测清洗液的pH值，当pH达到6.5-7.5时达到清洗终点，清洗方案优选磷酸盐缓冲液清洗8次，每次20min。

脱细胞工艺：包括物理方法处理，如快速冷冻、超声；化学方法处理，如过氧乙酸、乙二胺四乙酸、乙二醇双四乙酸、十二烷基硫酸钠（SDS）、脱氧胆酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚等；酶法处理，如胰蛋白酶、核酸酶、半乳糖苷酶等。具体脱细胞方案有很多种，可以选用上述方法及试剂中的一种或一种以上混合使用，试剂使用顺序、浓度和作用时间上存在差异，但目标一致，即以最温和的方式实现彻底脱细胞并同时最大限度保留细胞外基质中的生物活性成分。脱细胞方案优选使用：胰蛋白酶、十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚等中的任一种，或它们混合溶液；最优选十二烷基硫酸钠溶液。所用浓度范围为0.01～10%，优选浓度0.02%。所用时间为2～16h，优选为4h。脱细胞工艺在可振荡的恒温超声波清洗器中进行。

脱细胞处理后用纯化水、生理盐水或pH值6-8的磷酸盐缓冲液清洗2～12次，每次5～30min，清洗后检测清洗液的pH值，当pH达到6.5-7.5时达到清洗终点，清洗方案优选磷酸盐缓冲液清洗12次，每次20min。

结构重塑：使用胰蛋白酶或胃蛋白酶或二者联用，浓度范围0.1～1%，处理时间为0.5～8h。优选使用浓度为0.5%的胰蛋白酶处理3h。

交联：使用甲醛、戊二醛、京尼平、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺（EDC）、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等的水溶液。溶液浓度范围为0.1～5%，处理时间为0.5～4h。优选使用浓度为0.5-1%的戊二醛处理1-2h。

交联处理后用纯化水、生理盐水或pH值6-8的磷酸盐缓冲液清洗2～20次，每次5～30min，清洗后检测清洗液的pH值，当pH达到6.5-7.5时达到清洗终点，清洗方案优选磷酸盐缓冲液清洗15次，每次20min。

再修饰：将上述材料冻干处理后浸泡于硫酸软骨素、透明质酸钠、软骨细胞生长因子的一种或一种以上的混合溶液中。浓度范围为0.01%～1%，浸泡时间为0.5～2h。优选使用浓度为0.01%的软骨生长因子溶液浸泡1h。

上述产品进行冻干处理后灭菌包装：可以采用伽马射线辐照灭菌、高能电子束灭菌及环氧乙烷灭菌，优选环氧乙烷灭菌。灭菌后，产品在通风干燥的室温放置二周以上，才可以使用。使用特卫强等材料进行双层无菌包装。

采用本发明方法制备的软骨再生支架材料可用于促进软骨细胞贴附和生长，促进关节软骨损伤的愈合。本品属于一种天然细胞外基质成分，有利于细胞的吸附、增殖和分化，并具有一定的力学强度，可作为组织填充物而长期存在于体内；并且具有较好的组织亲和性和相容性，可诱导软骨细胞向其中生长，从而重建软骨，促进软骨细胞贴附和生长，促进关节软骨损伤的愈合，修复关节缺损，是一种有效修复关节软骨缺损的新型再生支架材料。

本发明具有以下优点：

（一）原料进行病毒灭活处理。

（二）材料经过一系列去抗原、脱细胞处理保证生物安全性。

（三）交联处理得到具有一定机械强度的如软骨再生支架材料。

（四）材料复合硫酸软骨素、透明质酸钠、软骨细胞生长因子等生物活性物质促进软骨再生。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1新型软骨再生支架材料及其制备方法

取出生后不久死亡的小牛面部皮肤全层，置于-80℃冰箱中，冻存处理30天。然后取出，复温后，进行脱毛。

脱毛工艺使用新鲜配置的浓度为8%的Na₂S溶液，处理2h。

用过氧乙酸-乙醇溶液灭活病毒，过氧乙酸的质量百分含量为0.05%，乙醇的质量百分含量为0.15%，病毒灭活时间2h，温度为24℃。

病毒灭活后用生理盐水清洗8次，每次20min，清洗后检测清洗液的pH值，当pH达到6.5-7.5时即为清洗终点。

脱细胞工艺：用浓度为0.02%的十二烷基硫酸钠溶液浸泡材料，所用时间为4h。脱细胞工艺在清洗槽内可振荡的恒温超声波清洗器中进行。

脱细胞处理后生理盐水清洗8次，每次20min，清洗后检测清洗液的pH值，当pH达到6.5-7.5时达到清洗终点。

结构重塑：使用胰蛋白酶，使用浓度为0.5%，处理3h。

交联：使用戊二醛，优选浓度为1%，处理时间为2h。

交联处理后用生理盐水清洗20次，每次20min，清洗后检测清洗液的pH值，当pH达到6.5-7.5时即为清洗终点。

再修饰：将上述材料冻干处理后浸泡于质量百分含量为0.1%的硫酸软骨素溶液中2h。

上述产品进行冻干处理后灭菌包装：可以采用伽马射线辐照灭菌，采用特卫强等材料进行双层无菌包装。

实施例2新型软骨再生支架材料及其制备方法

取出生后不久死亡的乳猪背部皮肤全层，置于-196℃液氮中，冻存处理4天。然后取出，复温后，进行脱毛。

脱毛工艺使用新鲜配置的浓度为0.5%的胰蛋白酶溶液，处理18h。

用质量百分含量为0.15%的乙醇溶液灭活病毒4h，温度为24℃。

病毒灭活后用纯化水溶液清洗5次，每次15min，清洗后检测清洗液的pH值，当pH达到6.5-7.5时即为清洗终点。

脱细胞工艺：用浓度为0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液浸泡材料，所用时间为6h。脱细胞工艺在清洗槽内可振荡的恒温超声波清洗器中进行。

脱细胞处理后用生理盐水清洗8次，每次20min，清洗后检测清洗液的pH值，当pH达到6.5-7.5时即为清洗终点。

结构重塑：使用浓度为0.5%的胰蛋白酶处理3h。

交联：使用浓度为0.2%的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺（EDC），处理时间为4h。

交联处理后用pH值6-8的磷酸缓冲溶液清洗20次，每次20min，清洗后检测清洗液的pH值，当pH达到6.5-7.5时即为清洗终点。

再修饰：将上述材料冻干处理后浸泡于浓度为0.01%的软骨生长因子溶液中1h。

上述产品进行冻干处理后灭菌包装：可以采用环氧乙烷灭菌，灭菌后产品在通风干燥的室温环境中放置二周以上，采用特卫强等材料进行双层无菌包装。

实施例3新型软骨再生支架材料及其制备方法

取出生后不久死亡的小马臀部皮肤全层，-20℃，冻存60天。然后取出，复温后，用7%巯基乙酸脱毛处理2小时后用纯化水溶液清洗5次，每次10min。

用磷酸三丁酯加表面活性剂吐温80进行病毒灭活，病毒灭活液中磷酸三丁酯质量百分含量为0.3%，吐温80质量百分含量为1%，处理温度为24℃，灭活时间为6小时。

脱细胞工艺：用浓度为0.3%的胰蛋白酶浸泡材料12h。脱细胞工艺在清洗槽内可振荡的37℃恒温超声波清洗器中进行。

脱细胞处理后用pH值6-8的磷酸缓冲溶液清洗10次，每次30min，清洗后检测清洗液的pH值，当pH达到6.5-7.5时即为清洗终点。

交联：使用浓度为1%京尼平，处理时间为6h。

交联处理后用0.9%的氯化钠溶液清洗12次，每次15min，清洗后检测清洗液的pH值，当pH达到6.5-7.5时即为清洗终点。

再修饰：将上述材料冻干处理后浸泡于浓度为0.5%的透明质酸钠溶液中5h。

上述产品进行冻干处理后灭菌包装：可以采用高能电子束灭菌，采用特卫强等材料进行双层无菌包装。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种软骨再生支架材料的制备方法，其特征在于，以死亡动物新鲜的背部、面部或臀部皮肤为原料，经深低温处理、脱毛、病毒灭活、脱细胞、结构重塑、交联、冻干、再修饰及灭菌处理工艺得到成品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述动物包括但不限于猪、牛、马、羊的新生个体。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，深低温处理的工艺包括但不限于深低温冷冻或反复冻融以降低免疫原性；所述深低温冷冻的条件为：-200℃～-10℃冷冻1～90天；反复冻融的条件为：-200℃～-10℃冷冻1～90天，反复冻融2～3次。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，脱毛工艺使用质量百分含量为2～10%的溶剂I浸泡处理0.5～24h；所述溶剂I包括但不限于巯基乙酸、Na₂S、胰蛋白酶、胃蛋白酶溶液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，病毒灭活采用低浓度过氧乙酸-乙醇溶液、乙醇溶液、过氧化氢溶液、碱溶液或含吐温80的磷酸三丁酯溶液中的任一种溶液通过浸泡处理以灭活病毒。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡法灭活病毒，溶液中过氧乙酸的质量百分含量为0.05～0.2%，乙醇的质量百分含量为0.15～0.6%，浸泡温度为4～40℃，病毒灭活时间为1～2h；或采用含吐温80的磷酸三丁酯溶液进行浸泡处理，溶液中磷酸三丁酯和吐温80的质量百分含量分别为0.1～0.5%和1～2%，浸泡温度为24℃，灭活时间为5～10h。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，脱细胞工艺在温度为20-40℃的超声波清洗器中进行，使用溶剂II浸泡处理2～16h；所述溶剂II中胰蛋白酶、十二烷基硫酸钠和聚乙二醇辛基苯基醚的质量百分含量分别为0.03～1%、0.01～0.25%和0.1～1%；结构重塑工艺使用质量百分含量为0.03～1%的胰蛋白酶溶液浸泡处理0.5～8h。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，交联工艺使用质量百分含量为0.1～5%的溶剂III浸泡处理0.5～4h；所述溶剂III包括但不限于甲醛、戊二醛、京尼平、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，再修饰工艺具体为：将经过交联处理后的材料进行冻干，然后浸泡于质量百分含量为0.01～1%的溶剂IV中0.5～2h；所述溶剂IV为硫酸软骨素、透明质酸钠、软骨细胞生长因子溶液中的一种或多种。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，灭菌处理工艺包括但不限于伽马射线辐照灭菌、高能电子束灭菌及环氧乙烷灭菌。