CN101366975B - 脱细胞小肠粘膜下层生物材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种脱细胞小肠粘膜下层生物材料的制备方法，本发明的步骤包括，前置处理、脱细胞处理、酶处理、膜状产品和微粒产品的制备；与现有产品相比，本发明具有较高的生物活性和生物相容性，无明显免疫排斥反应，对细胞无毒性；具有一定的机械强度和韧性，其形状大小及厚度易于改变，便于临床缝合固定；同时制备方法具有原料来源不受限制，无细胞成分残留，能有效灭活病毒，不产生伦理道德问题的优点。所制备的产品适用于修复机体组织缺损、作为组织充填材料、用于颜面部凹陷畸形的修复、充当组织加强物替代筋膜、修复膜性缺损和营养不良及感染创面、做为生物支架材料、作为可注射用的充填材料等生物医学工程领域。
Description
技术领域
本发明属于组织工程的生物材料技术领域，具体涉及一种脱细胞小肠粘膜下层生物材料的制备方法。
背景技术
细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)是各种组织器官的主要组织成分，构成了各种组织器官的三维结构和营养物质的储存，是细胞赖以生存、活动和变化的场所，在多种组织器官的修复中发挥着重要的作用。小肠粘膜下层(Small intestinal submucosa，SIS)来源于小肠，是一种天然的细胞外基质生物材料，主要由I、III型纤维胶原蛋白构成，含有少量的IV、V型胶原蛋白，还包含有氨基葡聚糖和糖蛋白等，所含的氨基葡聚糖主要包括透明质酸、肝素、硫酸乙酸肝素、硫酸软骨素A和硫酸皮肤素。由于SIS为天然结缔组织复杂的成分结构，作为异体移植物植入体内，不会引起明显的免疫排斥反应，是一种理想的生物支架材料。
把SIS用作支架材料已有较为广泛的研究，其在体内能引导和支持宿主细胞生长，逐渐完全降解，适合作为组织工程的支架材料；已在神经、膀胱、血管、肌腱、腹壁等组织缺损的修复中，表现出独特的优势。
SIS中还含有多种生长因子，在创伤愈合的早期阶段可以为组织再生创造合适的微环境，即使经过脱细胞处理的SIS仍含有这些生长因子，如FGF-2和TGF-β。这些生长因子在组织的修复和重构中有着重要的促进作用，这是其它细胞外基质材料和人工聚合物(如胶原、壳聚糖、聚乳酸和聚羟基乙酸)所不能比拟的。
国外已经有多种商品化的SIS出现，如Surgisis，Restore等产品。这些产品的问题在于脱细胞方法不完善，例如Surgisis的处理方法仅使用低浓度过氧乙酸处理，细胞残留较多，脱细胞效果欠佳，使用中会引发机体的免疫排斥反应；Restore为十层SIS叠加而成，使得以上问题更为突出，经检测其DNA残留很高；并对存在于细胞外基质中的天然抗原成分(如α-gal)也未考虑去除。最终使目前的脱细胞SIS产品仍然存在有较大的免疫排斥反应，植入体内后仅成为临时性替代物，难以在体内长期存活；另外，目前的技术方法未充分考虑如何有效去除SIS携带的病毒，存在有病毒感染的潜在危险；在冻干处理上也未考虑产品中蛋白质活性的保护，使得SIS内所包含的生长因子不能发挥作用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提出一种脱细胞小肠粘膜下层生物材料的制备方法，使制备的脱细胞小肠粘膜下层具有良好的机械强度、较高的生物活性和生物相容性，无明显免疫排斥反应，对细胞无毒性，同时制备方法具有原料来源不受限制，脱细胞效果好，无细胞残留，能有效灭活病毒，去除抗原成分，保护产品中蛋白质活性的优点。
本发明脱细胞小肠粘膜下层生物材料的制备方法是按以下步骤操作：
1).前置处理：将哺乳动物的空肠用水冲洗干净，切成片段，置于含有过氧乙酸和乙醇的水溶液中浸泡消毒不低于1小时，用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗；刮除小肠粘膜、肌层和浆膜，用PBS漂洗干净，获得粘膜下层；其中，所述过氧乙酸的终浓度(V/V)为0.1～0.5％，乙醇的终浓度(V/V)为2～10％；
2).脱细胞处理：将前置处理后的小肠粘膜下层置入0.1～1M的NaOH溶液中，于2～8℃条件下浸泡8分钟以上，达到溶解细胞、灭活病毒的目的，用PBS漂洗至中性；
3).酶处理：将脱细胞后的粘膜下层置入含有DNA酶和α-半乳糖苷酶的混合溶液中，于36±2℃条件下浸泡25分钟以上，去除残留的DNA和α-gal天然抗原成分，降低免疫原性，用PBS漂洗干净；其中，所述DNA酶的终浓度为30～50U/ml，α-半乳糖苷酶的终浓度为10～25U/ml；
4).脱细胞小肠粘膜下层膜状产品的制备：将酶处理后的粘膜下层浸泡于冷冻保护液中25分钟以上，再铺展后经冷冻干燥形成膜状产品，灭菌消毒；所述的冷冻保护液为Hanks平衡盐溶液中加有1～10％葡聚糖、1～10％蔗糖、1～10％聚维酮、2～6％棉子糖(均为重量比)；所述的膜状产品可以是单层或是多层叠加而成；
5).脱细胞小肠粘膜下层微粒产品的制备：可将冷冻干燥后的脱细胞小肠粘膜下层膜状产品在液氮冷冻条件下使其发脆，机械粉碎成50～500μm的脱细胞小肠粘膜下层微粒产品，灭菌消毒。
本发明制备的脱细胞小肠粘膜下层生物材料的临床作用有：(1)修复机体软组织缺损(疝、瘘等)；(2)作为组织充填材料而使局部丰满；(3)用于颜面部凹陷畸形的修复，如颞部、颊部凹陷；(4)充当组织加强物，替代筋膜，修复膜性缺损、营养不良和感染创面；(5)做为生物支架材料用于其他组织工程器官的制备，如组织工程化角膜、组织工程化耳鼓膜、组织工程化肌腱、组织工程化牙周膜、组织工程化周围神经等；(6)脱细胞小肠粘膜下层的微粒产品能作为可注射型的充填材料用于修补机体深部缺损。
本发明制备的脱细胞小肠粘膜下层生物材料的制备方法具有易于操作、原料来源不受限制，无细胞残留，能有效灭活病毒，减少了化学物质的残留、提高了产品的生物相容性、有效地去除了病毒、可以保护产品中的蛋白质活性的优点。所制备的脱细胞小肠粘膜下层生物材料与现有产品相比，具有较高的生物活性和生物相容性，无明显免疫排斥反应，对细胞无毒性；具有一定的机械强度和韧性，其形状大小及厚度易于改变，便于临床缝合固定，可覆盖创面、充填软组织缺损、促进创周细胞的生长和增殖，植入体内可逐渐被机体细胞所改建、吸收，最终完成创面修复功能；而且去除了活细胞成分和异种组织的α-gal天然抗原成分，显著降低了异种组织所导致的免疫排斥反应；并且还可形成微粒化的可注射型产品，用于充填机体深部缺损，便于临床应用；也可做为生物支架材料用于其他组织修补材料的制备。
具体实施方式
以下结合实例详细说明本发明技术方案的具体实施方式。
实例1、
1).前置处理：将猪空肠去除肠道内容物，用蒸馏水冲洗干净，切成所需片段，将其置于含有0.2％过氧乙酸和10％乙醇的水溶液中浸泡消毒1小时，用PBS漂洗干净；机械刮除小肠粘膜、肌层和浆膜，用PBS漂洗干净，获得小肠粘膜下层；
2).脱细胞处理：将前置处理的小肠粘膜下层置入0.5M的NaOH溶液中，于6±2℃条件下浸泡20分钟，用PBS漂洗至中性；
3).酶处理：将脱细胞的粘膜下层置入含有40U/ml DNA酶和10U/mlα-半乳糖苷酶的混合溶液中，于35℃条件下浸泡1小时，用PBS漂洗干净；
4).脱细胞小肠粘膜下层膜状产品的制备：将酶处理后的粘膜下层浸泡于冷冻保护液中30分钟，冷冻保护液为Hanks平衡盐溶液中加有1％葡聚糖、2％蔗糖、4％聚维酮、2％棉子糖(均为重量比)；再将粘膜下层十层叠加铺展，经真空冷冻干燥后形成脱细胞小肠粘膜下层膜状产品，环氧乙烷灭菌消毒。
本实例制备的脱细胞小肠粘膜下层膜状产品具有机械强度高、生物相容性好的特点，可用于修补机体组织的缺损。
实例2、
1).前置处理：将牛空肠去除肠道内容物，用蒸馏水冲洗干净，切成所需片段，将其置于含有0.4％过氧乙酸和5％乙醇的水溶液中浸泡消毒2小时，用PBS漂洗干净；将粘膜下层片段铺在平台上机械刮除小肠粘膜、肌层和浆膜，用PBS漂洗干净，获得小肠粘膜下层；
2).脱细胞处理：将前置处理后的小肠粘膜下层置入1M的NaOH溶液中，于4±2℃条件下浸泡30分钟，用PBS漂洗至中性；
3).酶处理：将脱细胞的小肠粘膜下层置入含有50U/ml DNA酶和20U/mlα-半乳糖苷酶的混合溶液中，于37℃下浸泡30分钟，用PBS漂洗干净；
4).脱细胞小肠粘膜下层微粒产品的制备：将酶处理后的粘膜下层浸泡于冷冻保护液中30分钟，冷冻保护液为Hanks平衡盐溶液中加有5％葡聚糖、10％蔗糖、8％聚维酮、6％棉子糖(均为重量比)，再经冷冻干燥后在液氮冷冻条件下，用高速旋转粉碎机(德国Fritsch公司)粉碎成100μm左右的脱细胞小肠粘膜下层微粒产品，钴60灭菌消毒。
本实例所制备的脱细胞小肠粘膜下层微粒产品具有方便临床应用、能作为可注射的充填材料用于修补深部机体缺损的特点。
Claims (2)
1.一种脱细胞小肠粘膜下层生物材料的制备方法，其特征在于，是按以下步骤操作：
1).前置处理：将哺乳动物空肠用水冲洗干净，切成片段，置于含有过氧乙酸和乙醇的水溶液中浸泡不低于1小时，用磷酸盐缓冲液漂洗；刮除小肠粘膜、肌层和浆膜，用PBS漂洗干净，获得粘膜下层；所述过氧乙酸的体积终浓度为0.1％～0.5％，所述乙醇的体积终浓度为2％～10％；
2).脱细胞处理：将前置处理后的粘膜下层置入0.1M～1M的NaOH溶液中于2～8℃条件下浸泡8分钟以上，用PBS漂洗至中性；
3).酶处理：将脱细胞后的粘膜下层置入含有DNA酶和α-半乳糖苷酶的混合溶液中，于36±2℃条件下浸泡25分钟以上，用PBS漂洗干净；所述混合溶液中DNA酶的终浓度为30～50U/ml，α-半乳糖苷酶的终浓度为10～25U/ml；
4).脱细胞小肠粘膜下层膜状产品的制备：将酶处理后的粘膜下层于冷冻保护液中浸泡25分钟以上，再铺展后经冷冻干燥形成脱细胞小肠粘膜下层生物材料的膜状产品，灭菌消毒；所述的冷冻保护液是在Hanks平衡盐溶液中按重量比加有1～10％葡聚糖、1～10％蔗糖、1～10％聚维酮和2～6％棉子糖。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将经冷冻干燥后的膜状产品在液氮冷冻条件下，机械粉碎成50μm～500μm的脱细胞小肠粘膜下层生物材料的微粒产品，灭菌消毒。
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