CN116832217A - 一种改良的脱细胞生物网膜制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种改良的脱细胞生物网膜制备方法，涉及生物网膜制备领域。该改良的脱细胞生物网膜制备方法，包括前处理：取新鲜猪大网膜，PBS冲洗干净；脱细胞及脱水处理：将洗净的大网膜放入冻干机进行冻干，冻干程序：‑40℃5小时，‑25℃2小时，‑10℃2小时，4℃4小时，25℃8小时。(冻干温度以及冻干时间都可以更改)。冻干过程可以有效脱细胞，并最大程度地保留ECM成分。该改良的脱细胞生物网膜制备方法，传统反复冻融法进行脱细胞处理，其所需周期太长，而且对ECM成分损伤比较大，可以用冻干的步骤来代替，脱水及灭活细胞效果更好，而且更好地保留ECM组分，如胶原蛋白及糖胺聚糖。
Description
技术领域
本发明涉及从网膜中提取脂肪的方法、脱细胞的网膜的制备方法以及脱细胞的网膜在组织修复和组织工程中的应用。
背景技术
脱细胞基质生物材料是用适当的方法将组织/器官进行脱细胞处理，去除组织中可能引起排斥反应的细胞及其他抗原分子，保留三维结构和功能蛋白，具有生物诱导功能,可以在体内/体外形成特定的功能化组织，可用于组织损伤修复/重建的一种新型生物材料。
目前应用较多的脱细胞生物材料主要是异种去细胞基质，这类天然生物材料的原材料主要来源于动物小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、胃粘膜下层、心包膜、羊膜、腹膜及真皮层。
脱细胞基质生物材料广泛应用于医药领域，相比不可吸收材料或者传统的高分子材料，它具有诱导组织再生的能力，因此被认为是理想的组织修复材料。
但动物源性生物材料也存在一些风险，一方面在于其携带的外源残留DNA、脂肪等免疫原性物质，在植入人体后可能会引起免疫反应，另一方面在于其处理过程中用到的试剂容易破坏细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的三维结构，使其在体内失去了诱导组织再生的能力。
α-Gal表位是导致灵长类动物超急性排斥反应的最主要原因，它存在于除东半球灵长类和人类以外的所有哺乳动物的细胞表面。
在人体内，抗α-Gal抗原的天然抗体约占循环免疫球蛋白(IgM和IgA)的1～3％。这些抗Gal抗体与α-Gal表位结合，容易导致移植组织或器官的失败。因此，α-Gal表位的存在是动物-人组织器官异种移植的第一道屏障。
动物源性生物材料处理工艺的难点在于，如何在去除动物组织携带的免疫原性物质的同时，尽可能的降低对ECM的破坏。因此，如何清除免疫原性物质，提高生物材料结构稳定性，提升生物活性成分的保留，这是目前制备脱细胞生物材料的研究重点。
细胞外基质(ECM)是结缔组织的重要结构成分。ECM主要包括胶原蛋白、非胶原蛋白、糖胺聚糖等。胶原蛋白是构成ECM骨架的重要成分，它具有良好的生物相容性；胶原蛋白还具有可降解的生物学特性，能够在体内一定时间内分解成易于吸收的小分子和短肽；胶原蛋白与其它生物活性组分在一起使用，具有协同效应，易于细胞在胶原材料表面粘附、增殖生长，因此，胶原分子作为组织修复的支架材料中重要成分，具有其它成分无法替代的优越性。糖胺聚糖对动物源ECM生物学性能起着至关重要的作用，可赋予ECM材料及产品优异的生物活性，其具有保持疏松结缔组织中的水分、调节多种阳离子在组织中的分布、在一定程度上促进机体创伤愈合等优点。
由细胞精制的ECM产生了一些微环境，这些细胞和其他细胞通过区分或保持其区分状态对这些微环境作出反应。ECM提供了细胞组织所附着的基底。基于组织的ECM生物材料和装置用于各种医疗应用，如心脏瓣膜、猪SIS、人类皮肤和牛心包膜。然而，由于缺乏血管生成的血管轨道，脱细胞组织用作再生医学的组织工程支架的应用范围受到限制，而血管轨道对于组织长入以及种子细胞的生存能力和功能是很重要的。在脱细胞处理中保持血管轨道的高度血管化的组织总会在本领域受到青睐。
大网膜是用于覆盖腹腔内器官的最大的腹膜折叠。大网膜高度血管化，通常薄且有弹性，并总是含有一些脂肪。因此，大网膜已用于临床应用，如肠道手术、胸段食管手术、慢性非愈合性皮肤创伤、疝和骨盆底修复、膀胱修复等。
由于脱细胞的网膜的血管腔可以用作新生血管的轨道，因此网膜是临床应用理想的材料。然而，本领域传统的网膜脱细胞方法为反复冻融，以及与不同脱水溶剂接触后脱水，再与脱脂溶剂接触进行脱脂，整体流程对ECM损伤严重。此外，传统方法没有对α-Gal抗原进行针对性处理，α-Gal抗原的高残留会导致人异种移植的失败。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种改良的脱细胞生物网膜制备方法。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种改良的脱细胞生物网膜制备方法，包括如下步骤：
前处理：取新鲜猪大网膜，PBS冲洗干净；
脱细胞及脱水处理：将洗净的大网膜放入冻干机进行冻干，冻干程序：-40℃5小时，-25℃2小时，-10℃2小时，4℃4小时，25℃8小时，(冻干温度以及冻干时间都可以更改)，冻干过程可以有效脱细胞，并最大程度地保留ECM成分；
脱脂处理：将冻干后的网膜放入60/40(v/v)己烷:丙酮溶液中孵育24小时(三次换液)，完成脱脂；
再水化处理：脱脂后组织100％乙醇清洗30min，4℃70％乙醇孵育过夜。
脱细胞处理：组织经PBS冲洗4次，0.25％Trypsin-EDTA孵育过夜，PBS彻底清洗组织，1.5MNaCl孵育24h(三次换液)，随后，50×10-3MTris(pH8.0)，1％triton-X100(Sigma)溶液冲洗1h；
α-Gal抗原去除：将网膜切成5cm×5cm的尺寸，组织经无菌生理盐水清洗后，在26℃的条件下用纯化的重组α-半乳糖苷酶在PBS中处理20小时，浓度为20u/L，网膜大样本量处理时，可以在23°条件下，用α-半乳糖苷酶以50-150u/L的浓度处理24小时，PBS配制；
灭菌：钴60辐照灭菌。
优选的，所述取新鲜猪大网膜，PBS冲洗干净，放入冻干机进行冻干，冻干程序：-65℃4小时，-45℃4小时，-25℃2小时，-10℃2小时，4℃4小时，25℃8小时，总时长为24小时。
优选的，所述60/40(v/v)己烷:丙酮溶液中孵育24小时(三次换液)，完成脱脂。
脱脂后组织100％乙醇清洗30min，4℃70％乙醇孵育过夜，组织经PBS(pH7.4)冲洗4次，0.25％Trypsin-EDTA孵育(BiologicalIndustries)过夜，PBS彻底清洗组织，1.5MNaCl孵育24h(三次换液)，随后，50×10-3MTris(pH8.0)，1％triton-X100(Sigma)溶液冲洗1h；
优选的，所述脱细胞大网膜用PBS冲洗，然后用双蒸水保存或者并冻干保存。
本发明公开了一种改良的脱细胞生物网膜制备方法，其具备的有益效果如下：
1、该改良的脱细胞生物网膜制备方法，传统反复冻融法进行脱细胞处理，其所需周期太长，而且对ECM成分损伤比较大，可以用冻干的步骤来代替，冻干的目的是为了给大网膜脱水并灭活大部分细胞，相较于传统的用冷冻解冻三个循环，用时更少，操作更简单，脱水及灭活细胞效果更好，而且更好地保留ECM组分，如胶原蛋白及糖胺聚糖。
2、该改良的脱细胞生物网膜制备方法，传统脱细胞方法没有进行α-抗原去除，α-Gal抗原的高残留容易导致人异种移植的失败，影响其在医学领域的应用。本实验加入了α-Gal抗原去除步骤，降低了猪脱细胞网膜基质应用于人的免疫排斥风险。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明天狼猩红染色冻干处理和常规处理的脱细胞大网膜对比图；
图2为本发明阿利新蓝染色冻干处理和常规处理的脱细胞大网膜对比图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请实施例通过提供一种改良的脱细胞生物网膜制备方法。
为了更好的理解上述技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。
本发明实施例公开一种改良的脱细胞生物网膜制备方法，包括包括如下步骤：
前处理：取新鲜猪大网膜，PBS冲洗干净；
脱细胞及脱水处理：将洗净的大网膜放入冻干机进行冻干，冻干程序：-40℃5小时，-25℃2小时，-10℃2小时，4℃4小时，25℃8小时。(冻干温度以及冻干时间都可以更改)。冻干过程可以有效脱细胞，并最大程度地保留ECM成分；
脱脂处理：将冻干后的网膜放入60/40(v/v)己烷:丙酮溶液中孵育24小时(三次换液)，完成脱脂；
再水化处理：脱脂后组织100％乙醇清洗30min，4℃70％乙醇孵育过夜。
脱细胞处理：组织经PBS冲洗4次，0.25％Trypsin-EDTA孵育过夜。PBS彻底清洗组织，1.5MNaCl孵育24h(三次换液)，随后，50×10-3MTris(pH8.0)，1％triton-X100(Sigma)溶液冲洗1h；
α-Gal抗原去除：将网膜切成5cm×5cm的尺寸，组织经无菌生理盐水清洗后，在26℃的条件下用纯化的重组α-半乳糖苷酶在PBS中处理20小时，浓度为20u/L。网膜大样本量处理时，可以在23°条件下，用α-半乳糖苷酶以50-150u/L的浓度处理24小时，PBS配制；
灭菌：钴60辐照灭菌。
所述取新鲜猪大网膜，PBS冲洗干净，放入冻干机进行冻干，冻干程序：-65℃4小时，-45℃4小时，-25℃2小时，-10℃2小时，4℃4小时，25℃8小时。总时长为24小时。
所述60/40(v/v)己烷:丙酮溶液中孵育24小时(三次换液)，完成脱脂。
脱脂后组织100％乙醇清洗30min，4℃70％乙醇孵育过夜。组织经PBS(pH7.4)冲洗4次，0.25％Trypsin-EDTA孵育(BiologicalIndustries)过夜。PBS彻底清洗组织，1.5MNaCl孵育24h(三次换液)，随后，50×10-3MTris(pH8.0)，1％triton-X100(Sigma)溶液冲洗1h；
所述脱细胞大网膜用PBS冲洗，然后用双蒸水保存或者并冻干保存。
以下是一对冻干处理和常规处理的脱细胞大网膜实施例的天狼猩红染色和阿利新蓝染色结果。
天狼猩红是一种阴离子强酸染料,易与胶原纤维中的碱性基团反应。可使胶原纤维特异性地着染为猩红色，使得胶原纤维图像识别效果良好，并且胶原越粗着色越红。因此图片上的红色信号平均光密度值越高代表胶原纤维保留的越多。
阿利新蓝(Alcian)又称爱先蓝或阿尔辛蓝等，是一种类铜钛花青共轭染料，该染料分子中带正电荷的盐键和酸性黏液物质中带负电荷的酸性基团结合呈蓝色。pH值为2.5时，组织内的羧基电离，带有一个负电荷，与阿利新蓝中的阳离子形成盐键，使带有羧基的组织(如蛋白多糖/透明质酸以及上皮酸性黏蛋白)染色，因此可以反应处脱细胞大网膜中蛋白多糖等成分的保留情况。图片上的蓝色信号平均光密度值越高代表蛋白多糖保留的越多。
IOD:IntegratedOpticalDensity，整合光密度值；MOD：MeanOptical Density,平均光密度值(MOD＝IOD/area)；
工作原理：
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (4)
1.一种改良的脱细胞生物网膜制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
前处理：取新鲜猪大网膜，PBS冲洗干净；
脱细胞及脱水处理：将洗净的大网膜放入冻干机进行冻干，冻干程序：-40℃5小时，-25℃2小时，-10℃2小时，4℃4小时，25℃8小时，(冻干温度以及冻干时间都可以更改)，冻干过程可以有效脱细胞，并最大程度地保留ECM成分；
脱脂处理：将冻干后的网膜放入60/40(v/v)己烷:丙酮溶液中孵育24小时(三次换液)，完成脱脂；
再水化处理：脱脂后组织100％乙醇清洗30min，4℃70％乙醇孵育过夜；
脱细胞处理：组织经PBS冲洗4次，0.25％Trypsin-EDTA孵育过夜，PBS彻底清洗组织，1.5MNaCl孵育24h(三次换液)，随后，50×10-3MTris(pH8.0)，1％triton-X100(Sigma)溶液冲洗1h；
α-Gal抗原去除：将网膜切成5cm×5cm的尺寸，组织经无菌生理盐水清洗后，在26℃的条件下用纯化的重组α-半乳糖苷酶在PBS中处理20小时，浓度为20u/L，网膜大样本量处理时，可以在23°条件下，用α-半乳糖苷酶以50-150u/L的浓度处理24小时，PBS配制；
灭菌：钴60辐照灭菌。
2.根据权利要求1所述的一种改良的脱细胞生物网膜制备方法，其特征在于：所述取新鲜猪大网膜，PBS冲洗干净，放入冻干机进行冻干，冻干程序：-65℃4小时，-45℃4小时，-25℃2小时，-10℃2小时，4℃4小时，25℃8小时，总时长为24小时。
3.根据权利要求1所述的一种改良的脱细胞生物网膜制备方法，其特征在于：所述60/40(v/v)己烷:丙酮溶液中孵育24小时(三次换液)，完成脱脂；
脱脂后组织100％乙醇清洗30min，4℃70％乙醇孵育过夜，组织经PBS(pH7.4)冲洗4次，0.25％Trypsin-EDTA孵育(BiologicalIndustries)过夜，PBS彻底清洗组织，1.5MNaCl孵育24h(三次换液)，随后，50×10-3MTris(pH8.0)，1％triton-X100(Sigma)溶液冲洗1h。
4.根据权利要求1所述的一种改良的脱细胞生物网膜制备方法，其特征在于：所述脱细胞大网膜用PBS冲洗，然后用双蒸水保存或者并冻干保存。
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